Способ получения лекарственного средства коллализин&αχιρχ;, лиофилизата для приготовления раствора для местного и парентерального применения для лечения фибропролиферативных заболеваний


C12N1/00 - Микроорганизмы, например простейшие; их композиции (лекарственные препараты, содержащие материал из микроорганизмов A61K 35/66; приготовление лекарственных составов, содержащих бактериальные антигены или антитела, например бактериальных вакцин A61K 39/00); способы размножения, содержания или консервирования микроорганизмов или их композиций; способы приготовления или выделения композиций, содержащих микроорганизмы; питательные среды

Владельцы патента RU 2687973:

Федеральное государственное унитарное предприятие "Санкт-Петербургский научно-исследовательский институт вакцин и сывороток и предприятие по производству бактерийных препаратов" Федерального медико-биологического агентства России (ФГУП СПбНИИВС ФМБА России) (RU)

Изобретение относится к биотехнологии и медицине, в частности к промышленной технологии получения ферментного препарата Коллализин® для использования в медицинских целях. Способ получения Коллализина® путем культивирования продуцента Clostridium histolyticum в анаэробных условиях на питательной среде Рамона с последующим отделением микробной массы путем фильтрации, при этом для культивирования используют продуцент Clostridium histolyticum 468 или продуцент Clostridium histolyticum SK В-8362, а отделение микробной массы проводят с помощью каскада глубинных фильтров с диаметром пор от 3,0-0,8 до 0,3-0,1 мкм с исключением попадания культуры в нативный раствор, применяя номинальную и абсолютную стерилизующую фильтрацию нативного раствора с дальнейшей ультрафильтрацией, концентрированием и хроматографической очисткой на основе сорбента Sephacryl S-100. Применение Коллализина® для лечения фибропролиферативных заболеваний. Вышеописанный способ получения позволяет получить препарат, обладающий высокой коллагеназной активностью и сохраняющий стабильность всех показателей качества в течение установленного срока годности 2 года. 2 н. и 4 з.п. ф-лы, 1 ил., 1 пр.

 

Известен способ получения коллагеназы путем культивирования штамма Clostridium histolyticum 468 в казеиново-соево-пепсиновой среде. Культивирование проводили в ферментере объемом 160 л в течение 72 ч при 37°С в среде следующего состава (г/л): гидролизат казеина и соевого шрота - 969, NaH2PO4 - 1,5, K2НРO4 - 1,5, пиридоксин - 0,0020, рибофлавин - 0,0020, тиамина бромид - 0,0020, фолиевая кислота - 0,0020, пантотенат кальция - 0,0020, никотиновая кислота - 0,0020, липоевая кислота - 0,0020, биотин - 0,0010. Фермент очищали и концентрировали на ультрафильтрационных мембранах с порогом задержания веществ по молекулярной массе 50 кДа, полученный концентрат лиофильно высушивали. Активность 1 мг готового препарата составляла 0,20-0,25 ед. лейцина за 20 мин инкубации в реакционной смеси (патент RU 2180002 опубликован в 2002 г., с 17.05.2011 патент прекратил действие). Недостатком данного способа является сложность использования данной питательной среды в промышленных масштабах, а именно в необходимости предварительной подготовки соевого шрота, а также в использовании дорогостоящих витаминов и необходимости многократной отмывки коллагеназы.

Описан еще один способ получения коллагеназы путем культивирования С. histolyticum (патент WO 2007/089851 А2). В отличии от нашей технологии очистка препарата ведется с использованием ультрафильтрации с размером пор 10 кДа, что позволяет отделить только олигопептиды и небольшие белки. Другим отличием является применение ионообменной хроматографии на колонке с Q-Sepharose HP. Это более дорогой способ, по сравнению с предложенной нами гель-фильтрацией, которая более эффективно разделяет белки по молекулярной массе, что особенно важно при получении высокомолекулярных белков, таких как коллагеназа.

В 2017 году ФГУП СПбНИИВС ФМБА России разработан способ получения Коолализина® в виде высокоочищенного препарата с высокой активностью комплекса коллагеназ, основанный на культивировании Clostridium histolyticum 468 или оригинального продуцента Clostridium histolyticum SK В-8362 на среде Рамона с последующим усовершенсвованием технологии выделения, концентрирования и очистки фракций, содержащих коллагеназы. По сравнению с ранее использованными способами получения препарата коллагеназы путем культивирования продуцента Clostridium histolyticum штамм 468 на бульоне Рамона с добавлением 1% (по объему) глюкозы с последующим осаждением 60% сульфатом аммония и очисткой методом гельфильтрации на колонке, заполненной сефадексом G-100 (Авторское свидетельство 694534, кл. С12D 13/10, 1979) культуральная жидкость подвергается очистке через каскад глубинных фильтров с диаметром пор от 3,0-0,8 до 0,3-0,1 мкм. С целью исключения попадания клеток культуры в нативный раствор введена дополнительная номинальная и абсолютная фильтрация через стерилизующие фильтры 0,2 мкм. Все это в комплексе позволяет получать нативный раствор освобожденный от бактериальной массы с минимальными потерями по коллагеназной активности и исключает риск попадания культуры в нативный раствор. Выделение и концентрирование фермента методом тангенциальной ультрафильтрации нативного раствора исключает стадию высаливания белков сульфатом аммония. Концентрирование проводят в 15 раз от исходного объема с одновременным разделением продукта на мембранах 50 кДа на необходимые фракции белков. Замена стадии высаливания белков на ультрафильтрацию значительно сокращает время основных технологических и вспомогательных операций с 26 часов до 2-3 часов, а также исключает использование в производством процессе аммонийной соли серной кислоты, с необходимостью последующего отделения ее от целевого белка центрифугированием. Использование мембран в 50 кДа позволяет получать продукт с отсечением балластных веществ (липидов, нуклеиновых кислот, низкомолекулярных комплексов), а также значительно осветлять раствор концентрата коллагеназ.

Дополнительная микрофильтрация концентрата через фильтр 0,45 мкм и очистка гель-хроматографией с применением современного сорбента Sephacryl S-100, позволяет получать высокоочищенный препарат, содержащий комплекс коллагеназ с высокой активностью. Включение стадии фильтрации через мембранные фильтры 0,45 мкм значительно снижает биологическую нагрузку на сорбент при хроматографической очистке, а замена геля Sephadex G-100 на современный Sephacryl S-100 позволило увеличить скорость фильтрации в 10 раз. Очищенный концентрат коллагеназ подвергают концентрированию в 10 раз на кассете с отсечением 5 кДа. На рисунке представлены результаты электрофореза белков коллагеназ в промежуточных продуктах на различных стадиях очистки и в лиофилизированном препарате. Как видно из данных, представленных на рисунке 1, все проведенные мероприятия при постадийном подходе к усовершенствованию технологии позволили получить высокоочищенный препарат при сохранении высокой коллагеназной активности.

Пример получения Коллализина®.

Для получения данного препарата культивируют штамм Clostridium histolyticum 468 или оригинальный продуцент Clostridium histolyticum SK В-8362. Запаянную пробирку со штаммом культуры на полужидком агаре вскрывают и ее содержимое пипеткой переносят в 10 пробирок (по 1,0 мл в каждую), содержащих среду Рамона, предварительно прогретой до 60-70°С. Пробирки с культурой выдерживают в термостате при температуре (37±1)°С в течение (24±2) ч. По истечении времени путем визуального контроля и микроскопии отбирают пробирки с наиболее хорошим ростом чистой культуры. Отобранные образцы культуры пересевают на пробирки с 20 мл среды Рамона, предварительно прогретые до 60-70°С из расчета 5 мл культуры на 1 пробирку. Пробирки с внесенной культурой выдерживают в термостате при температуре (37±1)°С в течение (24±2) ч. Полученный посевной материал используют для получения культуральной жидкости. В качестве питательной среды используют бульон Рамона, содержащий пептон Рамона, мясной экстракт 1:1, натрий хлористый, кровь говяжью сухую, воду очищенную.

Стерильный бульон Рамона, содержащей глюкозу в оптимальной для выращивания культуры концентрации, перед посевом подогревают до температуры 60-70°С и засевают посевной материал. Питательную среду с культурой выдерживают при температуре (37±1)°С при оптимальной длительности культивирования, обеспечивающем синтез фермента с максимальной коллагеназной активностью. По окончании процесса биосинтеза фермента производят отбор проб для микроскопии и определения коллагеназной активности качественной реакцией (измеряют оптическую плотность фильтрата лизированного коллагена при длине волны 510 нм).

Нативный раствор получают отделением микробной массы из культуральной жидкости с помощью фильтрации через каскад глубинных фильтров с диаметром пор от 3,0-0,8 до 0,3-0,1 мкм. Попадание клеток культуры в продукт исключает использование капсул для номинальной и абсолютной стерилизации (0,2 мкм).

Полученный фильтрат подают на установку тангенциальной фильтрации с кассетами 50 кДа. К раствору добавляют двукратный объем воды для инъекций, доводят значение рН до 7,18 при помощи 1 М NaOH и концентрируют на ультрафильтрационной установке при помощи мембран с размером пор 50 к Да в 15 раз от исходного объема. В полученном концентрате контролируют содержание белка по методу Лоури и по методу Бредфорда, коллагеназную активность, чистоту целевого белка.

Предварительную очистку проводят методом микрофильтрации на мембранах с размером пор 0,45 мкм.

Полученный концентрат, содержащий смесь коллагеназ, очищают методом гель-фильтрации на хроматографической колонке, размером 108*950 мм заполненной сорбентом на основе Sephacryl S-100. Элюцию проводят фосфатно-буферным раствором (рН 7,2±0,2). Концентрат подают со скоростью 4,0-6,0 л/ч, при температуре (5±3)°С. Начало сбора фракций определяют по результатам измерений оптической плотности элюата при длине волны 280 нм. Сбор осуществляют до начала выхода пигмента. Очищенный препарат, содержащий смесь высокоактивных коллагеназ, подвергают концентрированию на ультрафильтрационной установке при помощи мембран с размером пор 5 кДа в 10 раз от исходного объема, затем стерилизуют с использованием мембранных фильтров с размером пор 0,2 мкм. Разливают в ампулы или флаконы и лиофильно высушивают.

Способ позволяет получить препарат, обладающий коллагеназной активностью равной не менее 10000 КЕ в ампуле или флаконе и сохраняющий стабильность всех показателей качества в течение установленного срока годности (2 года).

1. Способ получения Коллализина® путем культивирования продуцента Clostridium histolyticum в анаэробных условиях на питательной среде Рамона с последующим отделением микробной массы путем фильтрации, отличающийся тем, что для культивирования используют продуцент Clostridium histolyticum 468 или продуцент Clostridium histolyticum SK В-8362, а отделение микробной массы проводят с помощью каскада глубинных фильтров с диаметром пор от 3,0 - 0,8 до 0,3 - 0,1 мкм с исключением попадания культуры в нативный раствор, применяя номинальную и абсолютную стерилизующую фильтрацию нативного раствора с дальнейшей ультрафильтрацией, концентрированием и хроматографической очисткой на основе сорбента Sephacryl S-100.

2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что коллагеназу очищают и концентрируют в 15 раз, применяя тангенциальную ультрафильтрацию с кассетами 50 кДа.

3. Способ по п. 1 или п. 2, отличающийся тем, что вводят стадию микрофильтрации с размером пор 0,45 мкм концентрата коллагеназ перед подачей на хроматографическую колонку.

4. Способ по п. 1, отличающийся тем, что использование сорбента Sephacryl S-100 увеличивает скорость фильтрации в 10 раз.

5. Способ по п. 1 или 2, отличающийся тем, что добавляют стадию концентрирования очищенного концентрата коллагеназ в 10 раз на ультрафильтрационной установке с применением кассет 5 кДа.

6. Применение Коллализина®, полученного способом по п.1, для лечения фибропролиферативных заболеваний.



 

Похожие патенты:

Группа изобретений относится к оптическому устройству, устройству детектирования и способу, использующему волновод, которые можно использовать в областях биозондирования и секвенирования нуклеиновых кислот.

Изобретение относится к области медицины. Предложен способ диагностики у детей астено-вегетативного синдрома в условиях экспозиции алюминием.

Изобретение относится к области биотехнологии, молекулярной биологии и медицины. Предложено применение по меньшей мере одной микроРНК, представляющей собой miR-124, в качестве биомаркера вирусной инфекции, или эффективности терапевтического лечения указанной вирусной инфекции.

Изобретение относится к технике исследования механических свойств материалов. Способ включает в себя подготовку стерильной плотной питательной среды (СППС, представляющей собой водный раствор с рН 7,2±0,3, содержащий 13-19 г/л агар-агара + 8-12 г/л сахарозы + 1,3-1,9 г/л NH4NO3 + 0,4-0,6 г/л KH2PO4 + 0,4-0,6 г/л NaH2PO4 + 0,6-0,8 г/л (NH4)2SO4 + 0,18-0,22 г/л Mg(NO3)2 + 0,05-0,07 г/л FeCl3 + 0,018-0,022 г/л CaCl2), подготовку плотной питательной среды с тестовыми микроорганизмами (МППС, состоящей из СППС с выращенной на ее поверхности сплошной колонией Rhodotorula sp.

Изобретение относится к области медицины, в частности к молекулярной онкологии, и предназначено для прогнозирования развития метастазов в печени у больных раком толстой кишки.

Изобретение относится к области биотехнологии и медицины. Описан способ выявления в крови больных циркулирующих мишеней, ассоциированных с определенным диагнозом.
Изобретение относится к ветеринарии, а именно к способу изготовления эритроцитарного диагностикума для диагностики пуллороза-тифа птиц. Способ включает получение бактериальной массы Salmonella gallinarum pullorum, выделение из нее антигенной фракции, Обработку бактериальной массы поверхностно-активным веществом с добавлением соды или щелочи в дистиллированной воде при 93-96°C с дальнейшей сенсебилизацией формалинизированных эритроцитов, их очисткой и получением целевого продукта в виде 10%-ной суспензии.

Изобретение относится к области биотехнологии, биохимии, молекулярной биологии, микробиологии и медицине. Предложен ДНК-чип и набор для идентификации генетических детерминант резистентности микроорганизмов - возбудителей инфекций, приводящих к нарушению репродуктивных функций человека: Treponema pallidum, Neisseria gonorrhoeae, Chlamydia trachomatis, Mycoplasma genitalium, Mycoplasma hominis, Gardnerella vaginalis, Ureaplasma parvum, Ureaplasma urealiticum, Atopobium vaginae, Enterococcus faecalis, Trichomonas vaginalis, Escherichia coli, Mobiluncus mulieris, Streptococcus anginosus, Fusobacterium nucleatum, Staphylococcus epidermidis, Bacteroides fragilis, к антимикробным препаратам, включающим антибиотики пенициллинового ряда, цефалоспорины, тетрациклины, фторхинолоны, макролиды, нитроимидазолы, спектиномицин.

Изобретение относится к биотехнологии. Описан способ обнаружения генетических факторов (генов), определяющих функционирование ДНК-структур клетки - теломер, обуславливающих, в свою очередь, продолжительность жизни клетки эукариот.

Группа изобретений относится к медицине и касается иммобилизованного белкового материала, содержащего носитель и по меньшей мере один белок, иммобилизованный на носителе.

Настоящее изобретение относится к рекомбинантным дрожжам, имеющим пониженную активность пируватдекарбоксилазы, в геном которых вставлена:- одна или более нуклеиновых кислот, кодирующих ацетолактатсинтазу или ALS,- одна или более нуклеиновых кислот, кодирующих ацетолактатдекарбоксилазу или ALD, и- одна или более копий нуклеиновых кислот, кодирующих NADH-оксидазу или NOXE..

Изобретение относится к области биотехнологии, конкретно к получению вариантов дизинтегрина, и может быть использовано в медицине для лечения связанного с интегрином заболевания, выбранного из возрастной макулярной дегенерации, диабетической ретинопатии, роговичных неоваскуляризирующих заболеваний, индуцированной ишемией неоваскуляризированной ретинопатии, высокой миопии, ретинопатии недоношенных, метастатической меланомы, метастатического рака предстательной железы, метастатического рака молочной железы, колоректального рака, рака печени, рака яичников, рака шейки матки, рака поджелудочной железы, немелкоклеточного рака легких и мультиформной глиобластомы.

Группа изобретений относится к области биотехнологии. Предложен генетически конструируемый микроорганизм, способный преобразовывать холестерин, аналоги и производные холестерина в предшественники стероидных гормонов, где указанный микроорганизм содержит по меньшей мере одну последовательность ДНК, кодирующую цитохром P450 эукариотического происхождения, экзогенную последовательность ДНК, кодирующую Adx, и экзогенную последовательность ДНК, кодирующую AdR, и где указанный микроорганизм представляет собой Bacillus megaterium.

Изобретение относится к технологиям использования сорбентов, применяемых в том числе для медицинских целей, а именно для экстракорпоральной терапии больных с сепсисом с использованием сорбции биологических жидкостей.

Предложены жидкая или сухая гранулированная композиция молокосвертывающего фермента аспарагиновой протеазы, а также их применение. Композиция молокосвертывающего фермента аспарагиновой протеазы содержит (i) молокосвертывающий фермент аспарагиновую протеазу с активностью от 25 IMCU (Международных молокосвертывающих единиц)/г композиции до 30000 IMCU/г композиции; (ii) полимер в концентрации от 50 млн-1 до 2500 млн-1 (масс./масс.) и (iii) соль в концентрации от 1 до 350 г/кг.

Группа изобретений относится к области биотехнологии. Предложен выделенный вариант полипептида химозина, включающий изменение в положении 117 относительно последовательности бычьего химозина, где указанный вариант имеет активность химозина, а исходный полипептид по меньшей мере на 90% идентичен зрелому полипептиду верблюжьего химозина.

Группа изобретений относится к области биотехнологии. Предложен вариант пируватдегидрогеназы, содержащий по меньшей мере одну аминокислотную замену в области аминокислот в положениях 190-205 или в области аминокислот в положениях 415-440 SEQ ID NO: 1.

Изобретение относится к области биотехнологии, в частности к трансформированной клетке для экспрессии цис-пренилтрансферазы и рецептора Nogo-B, полученной посредством введения в клетку кодирующего гена, кодирующего цис-пренилтрансферазу, и гена, кодирующего рецептор Nogo-B.

Изобретение относится к биотехнологии. Предложены клетка-хозяин E.coli для получения анти-VEGF антитела или антигенсвязывающего фрагмента анти-VEGF, свободных от ошибки включения норлейцина, клетка-хозяин E.coli для получения антитела против фактора D или антигенсвязывающего фрагмента против фактора D, свободных от ошибки включения норлейцина, и Клетка-хозяин E.coli для получения анти-МЕТ антитела или антигенсвязывающего фрагмента анти-МЕТ, свободных от ошибки включения норлейцина.

Изобретение относится к области биохимии, в частности к белку, придающему растению устойчивость к фенокси-ауксину, гену, кодирующему вышеуказанный белок, а также к экспрессионной кассете и вектору, содержащим вышеуказанный ген.

Изобретение относится к биотехнологии. Предложен способ удаления ДНК клетки-хозяина из ферментационного бульона.

Изобретение относится к биотехнологии и медицине, в частности к промышленной технологии получения ферментного препарата Коллализин® для использования в медицинских целях. Способ получения Коллализина® путем культивирования продуцента Clostridium histolyticum в анаэробных условиях на питательной среде Рамона с последующим отделением микробной массы путем фильтрации, при этом для культивирования используют продуцент Clostridium histolyticum 468 или продуцент Clostridium histolyticum SK В-8362, а отделение микробной массы проводят с помощью каскада глубинных фильтров с диаметром пор от 3,0-0,8 до 0,3-0,1 мкм с исключением попадания культуры в нативный раствор, применяя номинальную и абсолютную стерилизующую фильтрацию нативного раствора с дальнейшей ультрафильтрацией, концентрированием и хроматографической очисткой на основе сорбента Sephacryl S-100. Применение Коллализина® для лечения фибропролиферативных заболеваний. Вышеописанный способ получения позволяет получить препарат, обладающий высокой коллагеназной активностью и сохраняющий стабильность всех показателей качества в течение установленного срока годности 2 года. 2 н. и 4 з.п. ф-лы, 1 ил., 1 пр.

Наверх