Антитела к hpa-1a

Изобретение относится к области биохимии. Описана группа изобретений, включающая выделенное антитело, которое специфически связывается с HPA-1a, молекулу нуклеиновой кислоты, кодирующую вышеуказанное антитело, композицию для связывания НРА-1а, способ получения антитела, способ детектирования НРА-1а, включающий приведение композиции в контакт с антителом, способ анализа для определения присутствия или отсутствия НРА-1а в образце, применение вышеуказанного антитела в качестве эталонного стандарта для количественной оценки антител к НРА-1а в образце, способ лечения или профилактики аллоиммунной тромбоцитопении плода и новорожденных (FNAIT), применение вышеуказанного антитела в производстве лекарственного средства для лечения или профилактики FNAIT. Изобретение расширяет арсенал средств для связывания с HPA-1a. 9 н. и 16 з.п. ф-лы, 14 ил., 4 табл., 4 пр.

 

Настоящее изобретение относится в целом к области антител, в частности к антителам к HPA-1a (тромбоцитарному антигену-1a человека). Настоящее изобретение также относится к композициям и иммуноконъюгатам, содержащим указанные антитела, и к способам получения указанных антител. Настоящее изобретение также относится к способам детектирования присутствия или отсутствия HPA-1a в образце и к способам лечения, профилактики и диагностики FNAIT (аллоиммунной тромбоцитопении плода и новорожденных).

Тромбоцитарные аллоантигены человека HPA-1a и HPA-1b определяются однонуклеотидной мутацией, которая приводит к замене лейцина пролином в положении 33 β3-цепи интегрина тромбоцитов αIIbβ3 (гликопротеин IIbIIIa). Носителей лейцина в положении 33 β-цепи интегрина определяют как HPA-1a-положительных, а гомозиготных носителей пролина в положении 33 β-цепи интегрина определяют как HPA-1a-отрицательных (HPA-1bb).

Около 2% европеоидов являются гомозиготными по HPA-1b (Р33). Женщины с этим фенотипом могут подвергаться иммунизации HPA-1a при беременности, если плод имеет аллотип HPA-1a, унаследованный от отца.

Несовпадение аллоантигенов HPA-1 матери и плода может привести к иммунизации матери с последующей выработкой антител IgG к HPA-1a. Указанные антитела могут проникать через плаценту, связываться с тромбоцитами плода и ускорять разрушение тромбоцитов, вызывая FNAIT. FNAIT является серьезным осложнением развития плода и новорожденных. Антитела к HPA-1a вызывают большую часть (85-90%) случаев FNAIT, и часто вовлечены в патофизиологию посттрансфузионной пурпуры (ПТП) и развитие устойчивости к переливанию тромбоцитарной массы.

Материнские антитела к HPA-1a, которые вырабатываются во время несовместимой беременности, могут проникать через плаценту и вызывать FNAIT у плода при первой беременности (т.е. у плода, который вынашивается во время иммунизации матери). У таких плодов тяжелая тромбоцитопения может развиться на очень ранних этапах беременности. Во время первой несовместимой беременности FNAIT часто не детектируется вплоть до момента рождения, когда у новорожденного проявляются классические симптомы тромбоцитопении.

Помимо негативного влияния на первую несовместимую беременность, вероятность рецидива FNAIT при последующих несовместимых беременностях (т.е. беременностях, при которых мать, которая была иммунизирована аллоантигеном HPA-1 во время первой беременности, снова беременна HPA-1a-положительным плодом) оценивается в более чем 80%. Иммунизация аллоантигеном НРА-1a также может возникнуть при родах, это означает, что последующая несовместимая беременность может быть сопряжена с риском развития FNAIT, даже если первый плод/новорожденный не пострадал.

В настоящее время не существует безопасной и эффективной стратегии лечения или предотвращения FNAIT. Более того, это состояние часто не выявляется до момента рождения ребенка с тяжелой тромбоцитопенией. Следовательно, эффективный контроль FNAIT будет зависеть от введения общего скрининга для выявления беременностей, входящих в группу риска, а также разработки способов профилактики и новых подходов к лечению.

В отношении гемолитической болезни плода и новорожденного (HDFN, ГБН), связанного с беременностью нарушения, которое вызвано антителами, взаимодействующими с аллоантигеном эритроцитов плода, эффективная профилактика на основе антител рутинно используется в течение многих десятилетий. Большое проспективное скрининговое исследование, проведенное в Норвегии, выявило, что иммунизация аллоантигеном НРА-1a может произойти при родах, и, следовательно, как и в случае с HDFN, профилактика с использованием антител к HPA-1a может предотвратить FNAIT. Помимо этого, результаты экспериментов, проведенных с использованием мышиной модели FNAIT, позволили предположить, что иммунизацию аллоантигеном HPA-1a можно предотвратить путем введения НРА-1a-специфичных антител при родах. В связи с вышеупомянутыми результатами в настоящее время проводятся клинические исследования с целью проверки способности гипериммунных IgG к HPA-1a, выделенных из плазмы донорской крови, предотвращать иммунизацию аллоантигеном НРА-1a при беременности. Гипериммунные IgG к HPA-1a представляют собой IgG, выделенные у женщин, которые были иммунизированы аллоантигеном HPA-1а при беременности.

Авторы настоящего изобретения полагают, что рекомбинантные моноклональные антитела (МАТ) являются подходящим источником антител к HPA-1a для возможной профилактики или терапии FNAIT. В отличие от препаратов IgG, выделенных из плазмы донорской крови, моноклональные антитела могут быть получены практически в неограниченных количествах, специфичность и функция МАТ могут быть детально изучены, и терапевтическая доза может быть определена более точно, что обеспечивает большую степень воспроизводимости при лечении. Моноклональные антитела к HPA-1a также будут иметь большое значение в качестве реагента для скрининга для установления HPA-1a-положительного или HPA-1a-отрицательного статуса женщин.

Описанные в литературе рекомбинантные моноклональные антитела, специфичные в отношении НРА-1a человека, были разработаны из фрагментов антител, выделенных с помощью фагового дисплея. Было высказано предположение, что антитела со случайным образом спаренными in vitro тяжелыми и легкими цепями (например, антитела, полученные с помощью фагового дисплея), могут представлять собой чужеродные белки или могут быть аутореактивными и, следовательно, с большей вероятностью вызовут нежелательные иммунные реакции у реципиентов.

Существует несколько МАТ, которые связываются с HPA-1a. Два указанных моноклональных антитела были получены у мышей с помощью стандартной гибридомной технологии. Одно из них, клон LK-4, позволяет отличать антиген HPA-1a от антигена НРА-1b на экстрактах тромбоцитов, но не в том случае, когда указанные антигены присутствуют на интактных тромбоцитах, тогда как второе МАТ, SZ21, связывается с HPA-1a на интактных тромбоцитах. Однако моноклональное антитело SZ21 также детектируемо связывается с HPA-1а-отрицательными тромбоцитами при использовании повышенных концентраций антитела.

В данной области техники необходимы новые, предпочтительно улучшенные, агенты, такие как антитела, которые могут быть использованы для лечения, профилактики и диагностики FNAIT и для детектирования присутствия или отсутствия (т.е. скрининга) аллоантигена HPA-1a у субъекта.

Авторы настоящего изобретения выявили моноклональные антитела, которые специфично связываются с HPA-1a. Используя B-клетки от HPA-bb-положительной женщины, которая была иммунизирована в связи с беременностью HPA-1a-положительным ребенком, авторы настоящего изобретения получили клональную линию B-клеток, созданную с помощью EBV-трансформации B-клеток памяти, и отобрали отдельные B-клетки, которые вырабатывали антитела к HPA-1a. Авторы настоящего изобретения также получили рекомбинантные варианты указанных антител. Антитела, созданные авторами настоящего изобретения, обладают полезными свойствами, которые делают их подходящими агентами для упомянутых выше вариантов применения.

Соответственно, согласно первому аспекту настоящего изобретения предложено выделенное антитело, которое специфично связывается с HPA-1a и которое содержит по меньшей мере одну вариабельную область тяжелой цепи, которая содержит три гипервариабельных участка (CDR), и по меньшей мере одну вариабельную область легкой цепи, которая содержит три CDR, причем указанная вариабельная область легкой цепи содержит:

(a) CDR1 вариабельной области легкой цепи (VL), который содержит аминокислотную последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 8, или последовательность, по существу гомологичную указанной последовательности,

(b) CDR2 VL, который содержит аминокислотную последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 9, или последовательность, по существу гомологичную указанной последовательности, и

(с) CDR3 VL, который содержит аминокислотную последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 10, или последовательность, по существу гомологичную указанной последовательности; и

указанная вариабельная область тяжелой цепи содержит:

(d) CDR1 вариабельной области тяжелой цепи (VH), который содержит аминокислотную последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 5, или последовательность, по существу гомологичную указанной последовательности,

(e) CDR2 VH, который содержит аминокислотную последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 6, или последовательность, по существу гомологичную указанной последовательности, и

(f) CDR3 VH, который содержит аминокислотную последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 7, или последовательность, по существу гомологичную указанной последовательности.

Согласно предпочтительному варианту реализации настоящего изобретения предложено антитело, которое специфично связывается с HPA-1a и которое содержит:

область VL, которая содержит CDR1 VL, содержащий последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 8, CDR2 VL, содержащий последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 9, и CDR3 VL, содержащий последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 10, и

область VH, которая содержит CDR1 VH, содержащий последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 5, CDR2 VH, содержащий последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 6, и CDR3 VH, содержащий последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 7.

Согласно некоторым предпочтительным вариантам реализации настоящего изобретения предложено антитело, которое специфично связывается с HPA-1a, содержащее область VH, которая содержит аминокислотную последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 3, или последовательность, по существу гомологичную указанной последовательности, и/или область VL, которая содержит аминокислотную последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 4, или последовательность, по существу гомологичную указанной последовательности.

Согласно другим предпочтительным вариантам реализации изобретении предложено антитело, которое специфично связывается с HPA-1a, содержащее домен VH, который содержит аминокислотную последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 3, и домен VL, который содержит аминокислотную последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 4.

Другие предпочтительные варианты реализации настоящего изобретения представляют собой полноразмерные формы IgG (например, IgG1 или IgG3) антител, описанных в настоящей заявке. Следовательно, согласно предпочтительному варианту реализации настоящего изобретения предложено антитело, которое специфично связывается с HPA-1a, содержащее тяжелую цепь, которая содержит аминокислотную последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 21, или последовательность, по существу гомологичную указанной последовательности, и/или легкую цепь, которая содержит аминокислотную последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 22, или последовательность, по существу гомологичную указанной последовательности. Согласно другому предпочтительному варианту реализации настоящего изобретения предложено антитело, которое специфично связывается с HPA-1a, содержащее тяжелую цепь, которая содержит аминокислотную последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 25, или последовательность, по существу гомологичную указанной последовательности, и/или легкую цепь, которая содержит аминокислотную последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 26, или последовательность, по существу гомологичную указанной последовательности.

Согласно особенно предпочтительному варианту реализации настоящего изобретения антитело содержит тяжелую цепь, которая содержит аминокислотную последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 21, и легкую цепь, которая содержит аминокислотную последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 22.

Согласно другому особенно предпочтительному варианту реализации настоящего изобретения антитело содержит тяжелую цепь, которая содержит аминокислотную последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 25, и легкую цепь, которая содержит аминокислотную последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 26.

В качестве примера настоящего изобретения представлено моноклональное антитело D18BL26.4 (см. раздел примеров, также называемого в настоящей заявке «26.4»). Домены CDR, домены VH и VL и полноразмерные цепи IgG антитела 26.4 приведены в таблице 1. Антитела, содержащие указанные домены CDR, домены VH и VL или цепи IgG (или последовательности, по существу гомологичные указанным последовательностям), представляют собой предпочтительные аспекты настоящего изобретения. Антитело 26.4, включая его рекомбинантные варианты, представляет собой предпочтительный вариант реализации настоящего изобретения.

В настоящем изобретении также предложены связывающие белки, которые специфично связываются с HPA-1a и которые содержат антитело согласно настоящему изобретению.

В настоящей заявке термин «который специфично связывается с HPA-1a», применительно к антителам или фрагментам антител согласно настоящему изобретению, означает антитела или антигенсвязывающие фрагменты, которые способны связываться с аллоантигеном HPA-1a и которые не вступают в перекрестные реакции с аллоантигеном HPA-1b (т.е. не проявляют значительного связывания с аллоантигеном HPA-1b). Антитело 26.4, описанное в настоящей заявке для примера, представляет собой пример антитела, которое специфично связывается с HPA-1a.

Согласно одному варианту реализации настоящего изобретения антитело согласно настоящему изобретению не вступает в перекрестную реакцию с HPA-1b при применении в концентрации от 10 мкг/мл до 20 мкг/мл в виде IgG (например, 10 мкг/мл или 20 мкг/мл), например, в анализе для оценки связывания с антигеном HPA-1b в исследовании методом поверхностного плазмонного резонанса (например, в исследовании, описанном в примере 1). Антитела, которые являются лишь псевдоспецифичными в отношении HPA-1a, не рассматриваются как специфично связывающиеся с HPA-1a в соответствии с настоящим изобретением.

Безусловно, что антитело, которое «специфично связывается с HPA-1a» в соответствии с настоящим изобретением, не вступает в перекрестную реакцию с другими антигенами HPA или антигенами, отличными от HPA.

Некоторые примеры по существу гомологичных последовательностей представляют собой последовательности, которые по меньшей мере на 70% идентичны раскрытым аминокислотным последовательностям.

Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения антитела согласно настоящему изобретению, которые специфично связываются с HPA-1a, содержат по меньшей мере одну вариабельную область легкой цепи, которая содержит область аминокислотной последовательности, которая по меньшей мере приблизительно на 70% или 75%, более предпочтительно по меньшей мере приблизительно на 80%, более предпочтительно по меньшей мере приблизительно на 85%, более предпочтительно по меньшей мере приблизительно на 90% или 95% и наиболее предпочтительно по меньшей мере приблизительно на 97%, 98% или 99% идентична аминокислотной последовательности, приведенной в SEQ ID NO: 4; и/или по меньшей мере одну вариабельную область тяжелой цепи, которая содержит область аминокислотной последовательности, которая по меньшей мере приблизительно на 70% или 75%, более предпочтительно по меньшей мере приблизительно на 80%, более предпочтительно по меньшей мере приблизительно на 85%, более предпочтительно по меньшей мере приблизительно на 90% или 95% и наиболее предпочтительно по меньшей мере примерно на 97%, 98% или 99% идентична аминокислотной последовательности, приведенной в SEQ ID NO: 3.

Другие предпочтительные примеры по существу гомологичных последовательностей включают последовательности, содержащие консервативные замены аминокислот в аминокислотных последовательностях, раскрытых в настоящем изобретении.

Другие предпочтительные примеры по существу гомологичных последовательностей включают последовательности, содержащие 1, 2 или 3, предпочтительно 1 или 2, измененных аминокислот в одной или более из участков CDR, раскрытых в настоящем изобретении. Такие изменения могут представлять собой консервативные или неконсервативные замены аминокислот или их смесь.

Во всех указанных вариантах реализации настоящего изобретения предпочтительные изменения представляют собой консервативные замены аминокислот.

Согласно предпочтительному варианту реализации настоящего изобретения предложено выделенное антитело, которое специфично связывается с HPA-1a и содержит по меньшей мере одну вариабельную область тяжелой цепи, которая содержит три CDR, и по меньшей мере одну вариабельную область легкой цепи, которая содержит три CDR, причем указанная вариабельная область легкой цепи содержит:

(a) CDR1 вариабельной области легкой цепи (VL), который содержит аминокислотную последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 8, или последовательность, по существу гомологичную указанной последовательности,

(b) CDR2 VL, который содержит аминокислотную последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 9, или последовательность, по существу гомологичную указанной последовательности, и

(с) CDR3 VL, который содержит аминокислотную последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 10, или последовательность, по существу гомологичную указанной последовательности; и

причем указанная вариабельная область тяжелой цепи содержит:

(d) CDR1 вариабельной области тяжелой цепи (VH), который содержит аминокислотную последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 5, или последовательность, по существу гомологичную указанной последовательности,

(e) CDR2 VH, который содержит аминокислотную последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 6, или последовательность, по существу гомологичную указанной последовательности, и

(f) CDR3 VH, который содержит аминокислотную последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 7, или последовательность, по существу гомологичную указанной последовательности; и

в котором указанная по существу гомологичная последовательность представляет собой последовательность, содержащую 1, 2 или 3 замены аминокислот по сравнению с указанной последовательностью CDR, или в котором указанная по существу гомологичная последовательность представляет собой последовательность, содержащую консервативные замены аминокислот по сравнению с указанной последовательностью CDR.

Согласно другому предпочтительному варианту реализации настоящего изобретения предложено антитело, которое специфично связывается с HPA-1a, в котором вариабельная область легкой цепи содержит аминокислотную последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 4, или последовательность, которая по меньшей мере на 80% идентична указанной последовательности, и/или в котором вариабельная область тяжелой цепи содержит аминокислотную последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 3, или последовательность, которая по меньшей мере на 80% идентична указанной последовательности.

Во всех вариантах реализации настоящего изобретения антитела, содержащие по существу гомологичные последовательности, сохраняют способность специфично связываться с HPA-1a и предпочтительно сохраняют одно или более других свойств, описанных в настоящей заявке, более предпочтительно все свойства, описанные в отношении антитела 26.4.

Другие примеры по существу гомологичных аминокислотных последовательностей в соответствии с настоящим изобретением описаны в другом месте настоящего документа.

Участки CDR антител согласно настоящему изобретению предпочтительно разделены соответствующими каркасными участками, такими как те, которые присутствуют в природных антителах и/или эффективных модифицированных антителах. Следовательно, VH, VL и отдельные последовательности CDR согласно настоящему изобретению предпочтительно содержатся в или включены в соответствующий каркас или остов, чтобы обеспечить связывание с антигеном. Подходящие последовательности или каркасные участки могут соответствовать природным каркасным участкам, FR1, FR2, FR3 и/или FR4, по ситуации, и образовать в результате соответствующий остов, или могут соответствовать консенсусным каркасным участкам, например, выявленным путем сравнения различных природных каркасных участков. В другом варианте могут быть использованы остовы или каркасы, полученные не из антител, например, каркасы Т-клеточных рецепторов.

Соответствующие последовательности, которые можно применять для каркасных участков, хорошо известны и описаны в данной области техники, и любой из них может быть использован. Предпочтительные последовательности для каркасных участков представляют собой один или более каркасных участков, составляющих домены VH и/или VL согласно настоящему изобретению, т.е. один или более каркасных участков антитела 26.4, описанных в таблице 1, или каркасных участков, которые по существу гомологичны указанным каркасным участкам, и в частности участки каркаса, которые обеспечивают поддержание антигенной специфичности, например, участки каркаса, которые обеспечивают по существу аналогичную или аналогичную трехмерную структуру антитела. Согласно некоторым предпочтительным вариантам реализации настоящего изобретения все четыре участка каркаса (FR) вариабельной области легкой цепи (SEQ ID NO: 15, 16, 17 и 18) и/или вариабельной области тяжелой цепи (SEQ ID NO: 11, 12, 13 и 14), в зависимости от обстоятельств, или FR, которые по существу гомологичны указанным каркасным участкам, присутствуют в антителах согласно настоящему изобретению.

Не желая быть связанными какой-либо конкретной теорией, авторы настоящего изобретения полагают, что хорошей системой отбора антител к HPA-1a, которые можно применять в клинических условиях, является использование селективного механизма в иммунном ответе на HPA-1a у НРА-1a-отрицательных индивидуумов, т.е. иммунном ответе на HPA-1a у HPA-1a-отрицательных индивидуумов, которые стали иммунизированными при несовместимой беременности (беременности HPA-1a-положительным плодом). B-клетки памяти, отбираемые при таких ответах, должны иметь рецепторы, которые хорошо реагируют с HPA-1a, но не вступают в реакцию с аллогенными антигенами НРА-1b (т.е. «аутоантигенами»). Следовательно, антитела, выбранные из B-клеток памяти такого индивидуума, как ожидается, будут высоко специфичны в отношении HPA-1a и не будут вступать в перекрестную реакцию с HPA-1b (который отличается от HPA-1a полиморфизмом единственной аминокислоты). Помимо этого, поскольку антитело, выбранное с помощью указанной системы, отбирают естественным способом (т.е. с помощью иммунной системы человека), это означает, что при использовании в клинических условиях должен быть снижен риск анафилаксии, аутореактивности и/или токсичности, и/или антитело не должно быстро выводится из кровотока, по сравнению, например, с антителом, выбранным in vitro из библиотеки (например, с помощью фагового дисплея). Антитела согласно настоящему изобретению основаны на антителе 26.4, которое было выбрано аналогичным способом. Антитело 26.4 было получено из отдельной B-клетки НРА-1a-отрицательной женщины, которая была иммунизирована аллоантигеном НРА-1a при беременности.

Соответственно, предпочтительно антитела согласно настоящему изобретению имеют низкий риск возникновения анафилаксии и/или токсичности при использовании в клинических условиях. В предпочтительном варианте антитела согласно настоящему изобретению не являются аутореактивными. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения антитела согласно настоящему изобретению не выводятся быстро из кровотока.

Как было описано выше, антитела согласно настоящему изобретению специфично связываются с HPA-1a. В предпочтительном варианте антитела связываются с HPA-1a на интактных тромбоцитах. Способы анализов для установления того, связываются ли антитела к HPA-1a на интактных НРА-1a-положительных тромбоцитах, включают, но не ограничиваются ими, метод проточной цитометрии (например, проточной цитометрии цельной крови) или анализ MAIPA (иммобилизация моноклональных антител на антигенах тромбоцитов). Подходящие способы анализов методом проточной цитометрии и MAIPA описаны в примерах.

Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения антитела согласно настоящему изобретению способны связываться с очищенными формами белков, несущих HPA-1a или HPA-1a. Как было описано выше, антиген HPA-1a присутствует в тромбоцитарном интегрине αIIbβ3 (гликопротеин IIbIIIa). В предпочтительном варианте антитела согласно настоящему изобретению способны связываться с очищенным тромбоцитарным интегрином αIIbβ3 от НРА-1a-положительных индивидуумов. Способы очистки тромбоцитарного интегрина αIIbβ3 известны в данной области техники, также известны способы определения способности антитела связываться с очищенным белком. Например, в примере 1 описан способ очистки (выделения) тромбоцитарного интегрина αIIbβ3 из тромбоцитов. В примере 1 также описано, как поверхностный плазмонный резонанс может быть использован для исследования связывания очищенных форм белков, несущих HPA-1a или HPA-1a. Предпочтительные антитела остаются по меньшей мере на 50% связанными с очищенным и иммобилизованным тромбоцитарным интегрином αIIbβ3 от НРА-1a-положительных индивидуумов в конце периода диссоциации в исследовании методом поверхностного плазмонного резонанса. В предпочтительном варианте по меньшей мере 60%, по меньшей мере 70%, по меньшей мере 80% или по меньшей мере 90% антител остаются связанными в конце периода диссоциации в исследовании методом поверхностного плазмонного резонанса. Например, от приблизительно 50% до приблизительно 80% антител остаются связанными. Предпочтительный период ассоциации в указанном исследовании методом поверхностного плазмонного резонанса составляет 120 секунд. Предпочтительный период диссоциации в указанном исследовании методом поверхностного плазмонного резонанса составляет 120 секунд. Особенно предпочтительное исследование методом поверхностного плазмонного резонанса описано в примере 1.

Интегрин αVβ3 представляет собой другой гетеродимер, содержащий интегрин β3 (рецептор витронектина). αVβ3 экспрессируется на клетках трофобласта плода. Интегрин αVβ3 на клетках трофобласта плода, полученных от НРА-1a-положительного индивидуума (например, индивидуума, гомозиготного по НРА-1a), или выделенный у такого индивидуума, содержит антиген HPA-1a. Следовательно, антитела, которые специфично связываются с интегрином αVβ3 от НРА-1a-положительных индивидуумов, рассматриваются как антитела, которые специфично связываются с HPA-1a в соответствии с настоящим изобретением.

Фетальные трофобласты, которые выстилают поверхности контакта тканей матери и плода, постоянно высвобождаются в материнский кровоток во время беременности. Следовательно, HPA-1a-положительные трофобласты плода представляют собой источник HPA-1a для аллоиммунизации женщины во время несовместимой беременности, т.е. беременности, при которой мать является HPA-1a-отрицательной и плод является HPA-1a-положительным. Известно, что некоторые женщины становятся иммунизированными к HPA-1a на ранних этапах беременности, когда иммунизация тромбоцитами плода является маловероятной вследствие начальной стадии развития клеток крови плода. В таких случаях интегрин αVβ3, содержащий антиген HPA-1a, является потенциальным иммуногеном. Следовательно, предпочтительными являются антитела согласно настоящему изобретению, которые способны связываться с интегрином αVβ3, содержащим антиген HPA-1a.

Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения антитела согласно настоящему изобретению способны связываться с антигеном НРА-1a на интактных трофобластах плода.

Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения антитела согласно настоящему изобретению способны связываться с очищенным интегрином αVβ3 от НРА-1a-положительных индивидуумов. Способы очистки интегрина αVβ3 известны в данной области техники, также известны способы определения способности антитела связываться с очищенным белком. Например, в примере 1 описан способ очистки (выделения) интегрина αVβ3 из плаценты человека.

В примере 1 также описан способ применения поверхностного плазмонного резонанса для исследования связывания очищенных форм белков, несущих HPA-1a или HPA-1b. Предпочтительные антитела остаются по меньшей мере на 35% связанными с очищенным и иммобилизованным интегрином αVβ3 от НРА-1a-положительных индивидуумов в конце периода диссоциации в исследовании методом поверхностного плазмонного резонанса. В предпочтительном варианте по меньшей мере 40%, по меньшей мере 45%, по меньшей мере 50%, по меньшей мере 55%, по меньшей мере 60% или по меньшей мере 65% антител остаются связанными в конце периода диссоциации в исследовании методом поверхностного плазмонного резонанса. Например, от 35% до 70% антител остаются связанными. Предпочтительный период ассоциации в указанном исследовании методом поверхностного плазмонного резонанса составляет 120 секунд. Предпочтительный период диссоциации в указанном исследовании методом поверхностного плазмонного резонанса составляет 120 секунд. Подходящие величины плотности антигена (лиганда) на чипе, используемом в поверхностном плазмонном резонансе, известны в данной области техники и могут быть легко установлены (например, те, которые писаны в примере 1). Особенно предпочтительное исследование методом поверхностного плазмонного резонанса описано в примере 1.

Предпочтительно в экспериментах, выполненных методом поверхностного плазмонного резонанса, антитела согласно настоящему изобретению диссоциируют от очищенного и иммобилизованного интегрина αVβ3 от HPA-1a-положительных индивидуумов медленнее, чем антитело B2G1 (Griffin H, Ouwehand W., Blood. 1995; 86(12):4430-6). Например, антитела согласно настоящему изобретению диссоциируют приблизительно на 10%, приблизительно на 20%, приблизительно на 30%, приблизительно на 40%, приблизительно на 50%, приблизительно на 60%, приблизительно на 70%, приблизительно на 80%, приблизительно на 90% или приблизительно на 100% медленнее, чем антитело B2G1 (например, медленнее на величину от приблизительно 50% до приблизительно 100%).

Предпочтительно в экспериментах, выполненных методом поверхностного плазмонного резонанса, антитела согласно настоящему изобретению имеют более высокую связывающую способность в отношении интегрина αVβ3 от HPA-1a-положительных индивидуумов, чем антитело B2G1. Предпочтительно, величина связывания по меньшей мере на 10%, по меньшей мере на 20%, по меньшей мере на 30%, по меньшей мере на 40%, по меньшей мере на 50%, по меньшей мере на 60% или по меньшей мере на 70% выше, чем для антитела B2G1 (например, выше на величину от приблизительно 10% до приблизительно 70%). Связывание представляют в виде значения единиц отклика (RU) в конце фазы ассоциации.

Аминокислотные последовательности вариабельной области тяжелой цепи и вариабельной области легкой цепи B2G1 приведены ниже:

Вариабельная область тяжелой цепи B2G1 (SEQ ID NO: 27)

QVQLVQSGAEVKRPGAAVKVSCKASGYRFTGHYMHWVRQAPGQGLEWMGWINPNSGGTSYAQKFQGRVTMTRDTSISTAYMEMTRLRYDDTAVYYCAAGGLGGYYYYAMNIWGQGTTVTVSS

Вариабельная область легкой цепи B2G1 (SEQ ID NO: 28)

QSALTQPASVSGSPGQSITISCTGTSSDVGGYNYVSWYQQHPGKAPKLMIYEVSNRPSGVSNRFSGSKSGNTASLTISGLQAEDEADYYCSSYTSSSTWVFGGGTKLTVL

Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения антитела согласно настоящему изобретению обладают способностью ингибировать связывание антитела к HPA-1a, SZ21, с интегрином αVβ3 (соотв. генотипу НРА-1aa). Ингибирование связывания не обязательно означает полное блокирование связывания, ингибирование включает значительное или измеримое уменьшение связывания. В предпочтительном варианте способность ингибировать связывание антитела к HPA-1a, SZ21, с интегрином αVβ3 зависит от дозы антитела, т.е. при увеличении концентрации антитела согласно настоящему изобретению увеличивается ингибирование связывания антитела к HPA-1a, SZ21, с интегрином αVβ3. Подходящие способы анализов для оценки способности указанного антитела ингибировать связывание антитела к HPA-1a, SZ21, с интегрином αVβ3 известны в данной области техники. В соответствующих исследованиях интегрин αVβ3 может быть получен из лизата клеток из линии клеток трофобласта (например, линии клеток TCL-1, Lewis MP, et al., (1996), Placenta 17: 137-46). Особенно подходящим способом анализов является исследование ингибирования связывания антитела методом проточной цитометрии, например, исследование ингибирования связывания антитела методом проточной цитометрии, описанное в примере 1.

Согласно предпочтительным вариантам реализации настоящего изобретения антитела согласно настоящему изобретению обладают повышенной способностью ингибировать связывание антитела к HPA-1a, SZ21, с интегрином αVβ3 (соотв. генотипу НРА-1aa), по сравнению со способностью антитела B2G1 ингибировать связывание антитела к HPA-1a, SZ21, с интегрином αVβ3 (соотв. генотипу HPA-1aa). Другими словами, в некоторых вариантах реализации настоящего изобретения антитела согласно настоящему изобретению являются более эффективными, чем антитело B2G1 в ингибировании связывания антитела к HPA-1a, SZ21, с интегрином αVβ3 (соотв. генотипу НРА-1aa). Например, в некоторых вариантах реализации настоящего изобретения, антитела согласно настоящему изобретению, при использовании в количестве 12,5 нг-200 нг (например, 12,5 нг, 25 нг, 50 нг, 100 нг или 200 нг), обладают повышенной способностью ингибировать связывание антитела к HPA-1a, SZ21, с интегрином αVβ3 (соотв. генотипу НРА-1aa), по сравнению со способностью антитела B2G1 (использованного в аналогичном количестве/концентрации) ингибировать связывание антитела к HPA-1a, SZ21, с интегрином αVβ3 (соотв. генотипу НРА-1aa). Как правило, антитела используют в фиксированном объеме 200 мкл, поэтому указанные выше количества 12,5 нг, 25 нг, 50 нг, 100 нг и 200 нг соответствуют концентрации 62,5 нг/мл, 125 нг/мл, 250 нг/мл, 500 нг/мл и 1000 нг/мл, соответственно. Повышенная связывающая способность является достоверной, и степень ингибирования под действием предпочтительных антител аналогична таковой для антитела 26.4, например, как показано на фигуре 5F). Предпочтительные антитела по меньшей мере на 20%, предпочтительно по меньшей мере на 30%, более предпочтительно по меньшей мере на 40 или 50% эффективнее (в любой из указанных выше концентраций) ингибируют связывание SZ21 с интегрином αVβ3, чем антитело B2G1.

Аминокислотные последовательности вариабельной области тяжелой цепи и вариабельной области легкой цепи SZ21 приведены ниже:

Вариабельная область тяжелой цепи SZ21 (номер доступа в Genebank AF354053) (SEQ ID NO: 29)

LQESGPELVNPGASMKISCKASGYSFTGYTMNWVKQSHGKNLEWIGLINPYHGGSSYNQKFKGKATLTVDKSSSTAYMELLSLTSEDSAVYFCARRDANYVFFFDYWGQGTTVT

Вариабельная область легкой цепи SZ21 (номер доступа в Genebank AF354054) (SEQ ID NO: 30)

ELTQSPALMSASPGEKVTMTCSASSGVSYIHWYQQKSGTSPKRWIYDTSKLASGVPARFSGSGSGTSYSLTISSMEAEDAATYYCQQWSSKPPTFGGGTKLE

Согласно предпочтительным вариантам реализации настоящего изобретения антитела согласно настоящему изобретению способны индуцировать фагоцитоз НРА-1a-положительных тромбоцитов. Не желая быть связанными какой-либо теорией, авторы настоящего изобретения полагают, что антитела действуют путем связывания с HPA-1a на тромбоцитах и сенсибилизации/опсонизации связанных тромбоцитов для последующего уничтожения фагоцитами (например, моноцитами). Следовательно, считается, что способность индуцировать фагоцитоз HPA-1a-положительных тромбоцитов особенно важна в контексте профилактики FNAIT. В предпочтительном варианте антитела согласно настоящему изобретению индуцируют фагоцитоз НРА-1a-положительных тромбоцитов в зависимости от концентрации, причем при увеличении используемых концентраций антител наблюдается усиление фагоцитоза. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения антитела согласно настоящему изобретению способны индуцировать фагоцитоз при применении в концентрации по меньшей мере 0,05 мкг/мл, например, в концентрации в диапазоне от 0,05 мкг/мл до 50 мкг/мл, предпочтительно в концентрации от приблизительно 0,1 мкг/мл до приблизительно 10 мкг/мл. Согласно предпочтительным вариантам реализации настоящего изобретения антитела индуцируют по меньшей мере 20% фагоцитоз тромбоцитов, например, по меньшей мере 30%, по меньшей мере 40%, по меньшей мере 50%, по меньшей мере 60%, по меньшей мере 70%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 90% фагоцитоз или 100% фагоцитоз (например, фагоцитоз на величину от приблизительно 30% до приблизительно 90%). Например, согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения антитела в соответствии с настоящим изобретением способны индуцировать приблизительно 90% фагоцитоз тромбоцитов, гомозиготных по НРА-1a, при применении в концентрации 10 мкг/мл. В предпочтительном варианте антитела согласно настоящему изобретению не индуцируют фагоцитоз НРА-1a-отрицательных тромбоцитов. Способы оценки фагоцитоза тромбоцитов известны в данной области техники, и подходящий способ исследования описан в примере 1. Процентное значение фагоцитоза может представлять собой % моноцитов, содержащих интернализированные тромбоциты, например, в исследовании, описанном в примере 1. Количественное исследование, описанное в примере 1, является предпочтительным исследованием для оценки способности антител согласно настоящему изобретению индуцировать фагоцитоз.

Предпочтительно антитела согласно настоящему изобретению не ингибируют агрегацию тромбоцитов HPA-1bb (например, менее чем 10% ингибирование при концентрации антитела 12 мкг/мл). В предпочтительном варианте антитела согласно настоящему изобретению не ингибируют в значительной степени агрегацию тромбоцитов HPA-1ab (например, ингибирование составляет не более чем 30%, предпочтительно не более чем 20% при концентрации антитела 12 мкг/мл). Отсутствие значительной ингибиторной активности означает, что антитела не будут препятствовать функционированию материнских и фетальных тромбоцитов. Антитела согласно настоящему изобретению предпочтительно также не будут оказывать активирующего действия на НРА-1а-положительные тромбоциты (например, при концентрации антитела 12 мкг/мл).

Способы оценки влияния на агрегацию тромбоцитов известны в данной области техники, и подходящий способ исследования описан в примере 1. Количественное исследование, описанное в примере 1, является предпочтительным исследованием для оценки способности антител согласно настоящему изобретению ингибировать агрегацию тромбоцитов.

Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения антитела согласно настоящему изобретению способны ингибировать связывание материнского поликлонального IgG к HPA-1a с тромбоцитами, гомозиготными по НРА-1a. В одном указанном варианте реализации настоящего изобретения антитело предпочтительно представляет собой фрагмент F(аb')₂ антитела 26.4. В предпочтительном варианте ингибирование составляет по меньшей мере 60%, по меньшей мере 65%, по меньшей мере 70%, по меньшей мере 75%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95% или 100%. Например, ингибирование может составлять 65%-100%. Ингибирование можно оценить с использованием исследования с помощью MAIPA, например, как описано в примере 3 в настоящей заявке.

В тексте настоящей заявки термины в единственном числе означают «по меньшей мере один», «по меньшей мере первый», «один или более» или «множество» указанных компонентов или этапов, за исключением случаев, когда после упомянутых терминов конкретно указан верхний предел. Следовательно, в настоящей заявке термин «антитело» означает «по меньшей мере первое антитело». Рабочие пределы и параметры комбинаций, как и количества любого отдельного агента, будут известны специалистам в данной области техники в свете настоящего описания.

Молекулы нуклеиновых кислот, содержащие нуклеотидные последовательности, которые кодируют антитела согласно настоящему изобретению, определенные в настоящем документе, или их части или фрагменты, или молекулы нуклеиновых кислот, которые по существу гомологичны указанным молекулам, представляют собой другие дополнительные аспекты настоящего изобретения. Предпочтительная нуклеиновая кислота представляет собой нуклеиновую кислоту, кодирующую тяжелую цепь антитела (например, те, которые кодируют SEQ ID NO: 21 и 25, такие как SEQ ID NO: 19 и SEQ ID NO: 23, соответственно), или нуклеиновые кислоты, кодирующие легкую цепь антитела (например, те, которые кодируют SEQ ID NO: 22 и 26, такие как SEQ ID NO: 20 и 24). Другие предпочтительные молекулы нуклеиновых кислот представляют собой те, которые кодируют область VH антитела согласно настоящему изобретению (например, те, которые кодируют последовательность SEQ ID NO: 3, такие как SEQ ID NO: 1). Другие предпочтительные молекулы нуклеиновых кислот представляют собой те, которые кодируют область VL антитела согласно настоящему изобретению (например, те, которые кодируют последовательность SEQ ID NO: 4, такие как SEQ ID NO: 2).

В настоящей заявке термин «по существу гомологичный» в отношении аминокислотой последовательности или последовательности нуклеиновой кислоты включает последовательности, которые по меньшей мере на 70% или 75%, предпочтительно по меньшей мере на 80%, и еще более предпочтительно по меньшей мере на 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентичны раскрытой аминокислотной последовательности или последовательности нуклеиновой. По существу гомологичные последовательности согласно настоящему изобретению, следовательно, содержат одно или более изменений оснований или аминокислот (добавления, замены, вставки или делеции) по сравнению с последовательностями согласно настоящему изобретению. В отношении аминокислотного состава предпочтительные по существу гомологичные последовательности содержат до 5, например, только 1, 2, 3, 4 или 5, предпочтительно 1, 2 или 3, более предпочтительно 1 или 2 измененные аминокислоты в одном или более из каркасных участков и/или в одной или более CDR, составляющих последовательности согласно настоящему изобретению. Указанные изменения могут затрагивать консервативные или неконсервативные аминокислоты. В предпочтительном варианте указанные изменения представляют собой консервативные замены аминокислот.

Термин «по существу гомологичный» также включает модификации или химические эквиваленты аминокислотной и нуклеотидной последовательности согласно настоящему изобретению, которые выполняют по существу ту же функцию, что и белки или молекулы нуклеиновых кислот согласно настоящему изобретению, по существу аналогичным способом. Например, любое по существу гомологичное антитело должно сохранять способность связываться с HPA-1a, как описано выше. В предпочтительном варианте любое по существу гомологичное антитело должно сохранять одну или более из функциональных возможностей исходного антитела.

Предпочтительно любое по существу гомологичное антитело должно сохранять способность специфично связываться с тем же эпитопом HPA-1a, который распознается рассматриваемым антителом, например, тем же эпитопом, который распознается доменами CDR согласно настоящему изобретению или доменами VH и VL согласно настоящему изобретению, описанными в настоящей заявке. Связывание с тем же самым эпитопом/антигеном может быть легко исследовано методами, хорошо известными и описанными в данной области техники, например, с использованием исследования связывания, например, исследования конкурентного связывания. Сохранение других функциональных свойств также может быть легко исследовано методами, хорошо известными и описанными в данной области техники.

Следовательно, специалист в данной области техники поймет, что анализы связывания могут быть использованы для определения того, имеют ли «по существу гомологичные» антитела ту же специфичность связывания, что и антитела и фрагменты антител согласно настоящему изобретению, например, исследования связывания, такие как способы анализов методом ИФА или BIAcore могут быть легко применяться для установления того, могут ли указанные «по существу гомологичные» антитела связываться с HPA-1a. Как указано ниже, исследование конкурентного связывания может быть использовано для определения того, сохраняют ли «по существу гомологичные» антитела способность специфично связываться по существу с тем же эпитопом HPA-1a, что и эпитоп, распознаваемый антителами согласно настоящему изобретению (например, 26.4), или способность конкурировать с одним или более из различных антител согласно настоящему изобретению (например, 26.4). Описанный ниже способ является лишь одним примером подходящего анализа конкурентного связывания. Специалисту будут известны другие подходящие способы и варианты.

Типичный анализ исследование конкурентного связывания включает оценку связывания различных эффективных концентраций антитела согласно настоящему изобретению с HPA-1a в присутствии различных концентраций исследуемого антитела (например, по существу гомологичного антитела). Затем может быть проведена оценка величины ингибирования связывания, вызываемого исследуемым антителом. Усиление конкуренции исследуемого антитела при увеличении его концентраций с антителом согласно настоящему изобретению (т.е. увеличение концентраций исследуемого антитела приводит к соответствующему уменьшению количества антитела согласно настоящему изобретению, которое связывается с HPA-1a) является свидетельством связывания с по существу аналогичным эпитопом. В предпочтительном варианте исследуемое антитело значительно снижает количество антитела согласно настоящему изобретению, которое связывается с HPA-1a. В предпочтительном варианте исследуемое антитело уменьшает количество антитела согласно настоящему изобретению, которое связывается с HPA-1a, по меньшей мере приблизительно на 95%. Анализы на основе методов твердофазного ИФА и проточной цитометрии подходят для оценки ингибирования связывания в указанном исследовании конкурентного связывания, однако другие подходящие способы будут хорошо известны специалисту в данной области техники.

По существу гомологичные последовательности белков согласно настоящему изобретению включают, но не ограничиваются ими, консервативные замены аминокислот, или, например, изменения, которые не влияют на домены VH, VL или CDR антител, например, антител, в которых добавлены последовательности меток или другие компоненты, которые не вовлечены в связывание антигена, или изменения для преобразования одного типа или формата молекулы антитела или фрагмента в другой тип или формат молекулы антитела или фрагмента (например, преобразование Fab в scFv или наоборот), или преобразование молекулы антитела в определенный класс или подкласс молекулы антитела (например, преобразование молекулы антитела в IgG или его подкласс, например, IgG1 или IgG3).

В настоящей заявке термин «консервативная замена аминокислоты» относится к замене, при которой остаток аминокислоты заменен остатком другой аминокислоты, имеющей сходную боковую цепь. Семейства остатков аминокислот, имеющих сходные боковые цепи, были определены в данной области техники, включая основные боковые цепи (например, лизин, аргинин, гистидин), кислотные боковые цепи (например, аспарагиновая кислота, глутаминовая кислота), незаряженные полярные боковые цепи (например, глицин, аспарагин, глутамин, серин, треонин, тирозин, цистеин), неполярные боковые цепи (например, глицин, цистеин, аланин, валин, лейцин, изолейцин, пролин, фенилаланин, метионин, триптофан), бета-разветвленные боковые цепи (например, треонин, валин, изолейцин) и ароматические боковые цепи (например, тирозин, фенилаланин, триптофан, гистидин).

Гомология может быть оценена любым удобным способом. Однако для определения степени гомологии между последовательностями можно применять компьютерные программы, которые выполняют множественные выравнивания последовательностей, например, Clustal W (Thompson, Higgins, Gibson, Nucleic Acids Res., 22:4673-4680, 1994). Если необходимо, алгоритм Clustal W может быть использован вместе с оценочной матрицей BLOSUM 62 (Henikoff and Henikoff, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:10915–10919, 1992), штрафом на внесение делеции 10 и штрафом на продолжение делеции 0,1, так, что достигается самый высокий порядок совпадения двух последовательностей, причем по меньшей мере 50% от общей длины одной из последовательностей участвуют в выравнивании. Другие способы, которые могут быть использованы для выравнивания последовательностей, включают способ выравнивания, описанный Needleman and Wunsch (Needleman and Wunsch, J. Mol. Biol., 48:443, 1970), пересмотренный Smith and Waterman (Smith and Waterman, Adv. Appl. Math., 2:482, 1981), так, что достигается самый высокий порядок совпадения двух последовательностей и определяется число идентичных аминокислот между двумя последовательностями. Другие способы расчета процента идентичности двух аминокислотных последовательностей обычно известны в данной области техники и включают, например, те, которые описаны Carillo and Lipton (Carillo and Lipton, SIAM J. Applied Math., 48:1073, 1988), и те, которые описаны в Computational Molecular Biology, Lesk, e.d. Oxford University Press, New York, 1988, Biocomputing: Informatics and Genomics Projects.

Как правило, для таких расчетов будут использованы компьютерные программы. Для этой цели также можно применять программы, которые сравнивают и выравнивают пары последовательностей, такие как ALIGN (Myers and Miller, CABIOS, 4:11-17, 1988), FASTA (Pearson and Lipman, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85:2444-2448, 1988; Pearson, Methods in Enzymology, 183:63-98, 1990) и «gapped BLAST» (Altschul et al., Nucleic Acids Res., 25:3389-3402, 1997), BLASTP, BLASTN или GCG (Devereux, Haeberli, Smithies, Nucleic Acids Res., 12:387, 1984). Кроме того, сервер Дали в Европейском институте биоинформатики обеспечивает алгоритм выравнивания белковых последовательностей на основе структуры (Holm, Trends in Biochemical Sciences, 20:478-480, 1995; Holm, J. Mol. Biol., 233:123-38, 1993; Holm, Nucleic Acid Res., 26:316-9, 1998).

Чтобы обеспечить эталонную точку, последовательности в соответствии с настоящим изобретением, имеющие 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% гомологии, идентичности последовательностей и т.д., могут быть определены с использованием программы ALIGN с параметрами по умолчанию (например, доступной в Интернете на сетевом сервере GENESTREAM, IGH, Монпелье, Франция).

В последующем описании композиций, иммуноконъюгатов, фармацевтических препаратов, комбинаций, коктейлей, наборов, первого и второго вариантов медицинского применения и всех способов в соответствии с настоящим изобретением, термины «антитело» и «иммуноконъюгат», или антигенсвязывающий участок или его фрагмент, если иное не оговорено особо или не ясно из научной терминологии, относятся к различным антителам к HPA-1a, а также к конкретному антителу 26.4.

В настоящей заявке термины «антитело» и «иммуноглобулин» относятся в целом к любому иммунологическому связывающему агенту, который содержит антигенсвязывающий домен (например, антигенсвязывающий домен человека), включая поликлональные и моноклональные антитела. В зависимости от типа константной области в тяжелых цепях полноразмерные антитела относят к одному из пяти основных классов: IgA, IgD, IgE, IgG, IgM, и антитела согласно настоящему изобретению могут принадлежать любому из этих классов. Некоторые из указанных классов дополнительно разделены на подклассы или изотипы, такие как IgG1, IgG2, IgG3, IgG4 и т. п. Константные области тяжелой цепи, которые соответствуют различным классам иммуноглобулинов, называются α, δ, ε, γ и μ, соответственно. Структуры субъединиц и трехмерные конфигурации различных классов иммуноглобулинов хорошо известны.

В целом, в случае применения в настоящем изобретении полноразмерных антител, а не антигенсвязывающих участков, предпочтительными являются IgG и/или IgM, поскольку они являются наиболее распространенными антителами в физиологических условиях и их легче всего получить в лабораторных условиях. Особенно предпочтительными являются антитела IgG1 и IgG3.

«Легкие цепи» антител млекопитающих отнесены к одному из двух четко различающихся типов: каппа (κ) и лямбда (λ), на основании аминокислотных последовательностей их константных доменов и некоторых аминокислот в каркасных участках их вариабельных областей.

Специалисты в данной области техники поймут, что иммунологические связывающие реагенты, которые включены в термин «антитело», распространяются на все антитела человека и их антигенсвязывающие фрагменты, включая полноразмерные антитела, димерные, тримерные и многомерные антитела; биспецифичные антитела; химерные антитела; рекомбинантные и модифицированные антитела и их фрагменты.

Соответственно, термин «антитело», используется для обозначения любой антитело-подобной молекулы, которая содержит антигенсвязывающий участок, и указанный термин включает фрагменты антител, которые содержат антигенсвязывающий домен, такие как Fab', Fab, F(аb')₂, однодоменные антитела (DAB), димер TandAbs, Fv, scFv (одноцепочечный Fv), dsFv, ds-scFv, Fd, линейные антитела, минитела, диатела, биспецифичные фрагменты антител, битела, тритела (гибридные белки scFv-Fab, биспецифичные или триспецифичные, соответственно); sc-диатело; каппа (ламбда) тела (гибридные белки scFv-CL); BiTE (биспецифичные антитела, которые активируют Т-клетки, тандемы scFv-scFv для привлечения Т-клеток); DVD-Ig (антитело с двойной вариабельной областью, биспецифичный вариант); SIP (малый иммуноглобулин, разновидность минитела); SMIP («малый модульный иммунофармацевтический» димер scFv-Fc; DART (ds-стабилизированное диатело «Dual Affinity ReTargeting»); малые миметики антител, содержащие один или более CDR, и т. п. Согласно одному предпочтительному варианту реализации настоящего изобретения фрагмент антитела представляет собой фрагмент F(аb')₂.

Методики получения и использования различных конструкций и фрагментов на основе антител хорошо известны в данной области техники. Диатела, в частности, подробно описаны в ЕР 404097 и WO 93/11161; а линейные антитела подробно описаны в данной области техники.

В настоящей заявке термин «участок, определяющий комплементарность, тяжелой цепи» («CDR тяжелой цепи») относится к гипервариабельным участкам вариабельной области тяжелой цепи (домена VH) молекулы антитела. Вариабельная область тяжелой цепи содержит три CDR, называемых CDR1 тяжелой цепи, CDR2 тяжелой цепи и CDR3 тяжелой цепи, в направлении от амино-конца к карбокси-концу. Вариабельная область тяжелой цепи также содержит четыре каркасных участка (FR1, FR2, FR3 и FR4, в направлении от амино-конца к карбокси-концу). Указанные каркасные участки разделяют CDR.

В настоящей заявке термин «вариабельная область тяжелой цепи» (домен VH) относится к вариабельной области тяжелой цепи молекулы антитела.

В настоящей заявке термин «участок, определяющий комплементарность, легкой цепи» («CDR легкой цепи») относится к гипервариабельным участкам в вариабельной области легкой цепи (домена VL) молекулы антитела. Вариабельные области легкой цепи содержат три CDR, называемых CDR1 легкой цепи, CDR2 легкой цепи и CDR3 легкой цепи, в направлении от амино-конца к карбокси-концу. Вариабельная область легкой цепи также содержит четыре каркасных участка (FR1, FR2, FR3 и FR4, в направлении от амино-конца к карбокси-концу). Указанные каркасные участки разделяют CDR.

В настоящей заявке термин «вариабельная область легкой цепи» (домен VL), относится к вариабельной области легкой цепи молекулы антитела.

Антитела могут быть фрагментированы с использованием обычных методик. Например, фрагменты F(аb')₂ могут быть получены путем обработки антитела пепсином. Полученный фрагмент F(аb')₂ может быть обработан для восстановления дисульфидных мостиков с получением фрагментов Fab'. Расщепление папаином может привести к образованию фрагментов Fab. Фрагменты Fab, Fab' и F(аb')₂, scFv, Fv, dsFv, Fd, dAbs, TandAbs, ds-scFv, димеры, минитела, диатела, биспецифичные фрагменты антител и другие фрагменты также могут быть синтезированы с помощью рекомбинантных методик или могут быть синтезированы химически. Способы получения фрагментов антител хорошо известны и описаны в данной области техники.

Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения антитело или фрагмент антитела согласно настоящему изобретению содержит полную константную область тяжелой цепи, такую как константная область IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1, IgA2, IgE, IgM или IgD, или ее часть. В предпочтительном варианте константная область тяжелой цепи представляет собой константную область тяжелой цепи IgG1 или IgG3 или ее часть. Помимо этого антитело или фрагмент антитела может содержать полную константную область легкой каппа-цепи или ее часть, либо полную константную область легкой лямбда-цепи или ее часть. Указанные полные константные области или их части могут быть получены природным путем или могут быть полностью или частично синтетическими. Соответствующие последовательности указанных константных областей хорошо известны и описаны в данной области техники. В том случае, если полноразмерный аналог константных областей из тяжелых и легких цепей включен в антитело согласно настоящему изобретению, такие антитела обычно называют в настоящей заявке «полноразмерные» антитела или «полные» антитела.

Антитела или фрагменты антител могут быть получены природным путем или могут быть полностью или частично синтетическими. Следовательно, антитело может быть получено из любого соответствующего источника, например, рекомбинантных источников и/или получено из трансгенных животных или трансгенных растений, или из яиц с использованием технологии IgY. Следовательно, молекулы антитела могут быть получены in vitro или в условиях in vivo.

В предпочтительном варианте антитело или фрагмент антитела содержит вариабельную область легкой цепи антитела (VL), которая содержит три домена CDR, и вариабельную область тяжелой цепи антитела (VH), которая содержит три домена CDR. Указанные VL и VH обычно образуют антигенсвязывающий сайт.

Фрагмент «Fv» представляет собой минимальный фрагмент антитела, который содержит полный антигенраспознающий и антигенсвязывающий сайт. Указанная область содержит димер одной вариабельной области тяжелой цепи и одной вариабельной области легкой цепи, прочно соединенных нековалентными связями. Именно в этой конфигурации три гипервариабельных участка (CDR) каждой вариабельной области взаимодействуют с образованием антигенсвязывающего сайта на поверхности димера VH-VL. Совместно шесть гипервариабельных участков (CDR) придают антителу специфичность связывания антигена.

Однако в данной области техники подробно описано, что присутствие трех CDR из вариабельной области легкой цепи и трех CDR из вариабельной области тяжелой цепи антитела не является необходимым для связывания антигена. Следовательно, известно, что конструкции, размер которых меньше размера вышеупомянутого классического фрагмента антитела, являются эффективными.

Например, антитела верблюдовых имеют обширный антигенсвязывающий репертуар, но лишены легких цепей. Также результаты, полученные с использованием однодоменных антител, содержащих только домены VH или только домены VL, свидетельствуют о том, что указанные домены могут связываться с антигеном с высокой аффинностью. Следовательно, три CDR могут эффективно связывать антиген.

Следовательно, несмотря на то, что предпочтительные антитела согласно настоящему изобретению могут состоять из шести участков CDR (три из легкой цепи и три из тяжелой цепи), антитела, содержащие менее шести участков CDR (например, 3 участки CDR), включены в объем настоящего изобретения. Антитела, содержащие CDR только из тяжелой или легкой цепи, также включены в объем настоящего изобретения.

Предпочтительные участки CDR легкой цепи для применения в комбинации с указанными участкам CDR тяжелой цепи описаны в настоящей заявке в других местах. Однако в настоящем изобретении также предложены другие вариабельные области легкой цепи, которые содержат три CDR, для применения в комбинации с вариабельными областями тяжелой цепи согласно настоящему изобретению. Соответствующие вариабельные области легкой цепи, которые можно применять в комбинации с вариабельными областями тяжелой цепи согласно настоящему изобретению и которые обеспечивают антитело, которое связывается с HPA-1a, могут быть легко выявлены специалистом в данной области техники.

Например, вариабельную область тяжелой цепи согласно настоящему изобретению можно комбинировать с отдельной вариабельной областью легкой цепи или репертуаром вариабельных областей легкой цепи, и полученные антитела могут быть исследованы для оценки связывания с HPA-1a.

При необходимости, аналогичные способы могут быть использованы для выявления альтернативных вариабельных областей тяжелой цепи для применения в комбинации с предпочтительными вариабельными областями легкой цепи согласно настоящему изобретению.

Следовательно, в другом аспекте настоящего изобретения предложено выделенное антитело, которое специфично связывается с HPA-1a и которое содержит по меньшей мере одну вариабельную область тяжелой цепи, которая содержит три CDR, и по меньшей мере одну вариабельную область легкой цепи, которая содержит три CDR, причем указанная вариабельная область легкой цепи содержит:

(a) CDR1 вариабельной области легкой цепи (VL), который содержит аминокислотную последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 8, или последовательность, по существу гомологичную указанной последовательности,

(b) CDR2 VL, который содержит аминокислотную последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 9, или последовательность, по существу гомологичную указанной последовательности, и

(с) CDR3 VL, который содержит аминокислотную последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 10, или последовательность, по существу гомологичную указанной последовательности.

По существу гомологичные последовательности определены в другом месте настоящего документа. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения по существу гомологичная последовательность представляет собой последовательность, содержащую 1, 2 или 3 замены аминокислот по сравнению с указанной последовательностью CDR, или по существу гомологичная последовательность представляет собой последовательность, содержащую консервативные замены аминокислот в указанной последовательности CDR. Другие отличительные признаки и свойства других аспектов настоящего изобретения применимы, с соответствующими изменениями, к указанному аспекту настоящего изобретения.

Согласно некоторым вариантам реализации антитело содержит область VL, которая содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 4, или последовательность, по существу гомологичную указанной последовательности (например, последовательность, имеющую по меньшей мере 80% идентичность указанной последовательности). Согласно предпочтительным вариантам реализации настоящего изобретения домен VL содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 4.

Согласно другому аспекту настоящего изобретения предложено выделенное антитело, которое специфично связывается с HPA-1a и которое содержит по меньшей мере одну вариабельную область тяжелой цепи, которая содержит три CDR, и по меньшей мере одну вариабельную область легкой цепи, которая содержит три CDR, причем указанная вариабельная область тяжелой цепи содержит:

(a) CDR1 вариабельной области тяжелой цепи (VH), который содержит аминокислотную последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 5, или последовательность, по существу гомологичную указанной последовательности,

(b) CDR2 VH, который содержит аминокислотную последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 6, или последовательность, по существу гомологичную указанной последовательности, и

(с) CDR3 VH, который содержит аминокислотную последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 7, или последовательность, по существу гомологичную указанной последовательности.

По существу гомологичные последовательности определены в другом месте настоящего документа. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения по существу гомологичная последовательность представляет собой последовательность, содержащую 1, 2 или 3 замены аминокислот по сравнению с указанной последовательностью CDR, или по существу гомологичная последовательность представляет собой последовательность, содержащую консервативные замены аминокислот в указанной последовательности CDR. Другие отличительные признаки и свойства других аспектов настоящего изобретения применимы, с соответствующими изменениями, к указанному аспекту настоящего изобретения.

Согласно некоторым вариантам реализации антитело содержит область VH, которая содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 3, или последовательность, по существу гомологичную указанной последовательности (например, последовательность, имеющую по меньшей мере 80% идентичность указанной последовательности). Согласно предпочтительным вариантам реализации настоящего изобретения домен VH содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 3.

Согласно другому аспекту настоящего изобретения предложено антитело, предпочтительно выделенное антитело, более предпочтительно антитело человека, которое специфично связывается с HPA-1a и которое способно конкурировать (т.е. связываться с аналогичным или по существу аналогичным эпитопом) с антителом 26.4 (т.е. антителом, содержащим VL, содержащую последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 4, и VH, содержащую последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 3), как описано в настоящей заявке, или которое способно конкурировать с антителом, содержащим CDR, аналогичные таковым в антителе 26.4, т.е. с антителом, содержащим последовательности CDR VL, приведенные в SEQ ID NO: 8, 9 и 10, и последовательности CDR VH, приведенные в SEQ ID NO: 5, 6 и 7, за связывание с HPA-1a. Другие отличительные признаки и свойства других аспектов настоящего изобретения применимы, с соответствующими изменениями, к указанному аспекту настоящего изобретения.

Связывание с аналогичным эпитопом/антигеном может быть легко исследовано методами, хорошо известными и описанными в данной области техники, например, с использованием анализов связывания, таких как исследование конкурентного ингибирования. Следовательно, специалист в данной области техники поймет, что анализы связывания могут быть использованы для выявления других антител и фрагментов антител со специфичностью связывания, которая близка к таковой для антител и фрагментов антител согласно настоящему изобретению. Подходящие методы анализа связывания обсуждаются в данном описании в другом месте.

Согласно некоторым вариантам реализации антитело согласно настоящему изобретению представляет собой антитело к HPA-1a типа II. Следовательно, в некоторых вариантах реализации антитело согласно настоящему изобретению связывается с эпитопом на интегрине β₃, который определяется не только доменом PSI (плексин/семафорин/интегрин) интегрина β₃. Согласно некоторым вариантам реализации эпитоп на интегрине β₃, с которым связываются антитела согласно настоящему изобретению, содержит остатки домена PSI (плексин/семафорин/интегрин) и, помимо этого, содержит остатки гибридного домена и/или домена(ов) эпидермального фактора роста (EGF) интегрина β₃. Согласно некоторым вариантам реализации эпитоп на интегрине β₃, с которым связываются антитела согласно настоящему изобретению, содержит остатки гибридного домена и/или домена(ов) эпидермального фактора роста (ЭФР) интегрина β₃. Подходящее исследование для выявления доменов на интегрине β₃, которые связаны с антителом, описано в примере 4.

Предпочтительно способности и свойства, описанные выше, наблюдаются на измеримом или значимом уровне, и более предпочтительно на статистически значимом уровне, по сравнению с соответствующими контрольными уровнями. Соответствующие уровни значимости обсуждаются в другом месте настоящего документа. Более предпочтительно одна или более из описанных выше способностей и свойств наблюдаются на уровне, который измеримо лучше, или более предпочтительно, значительно лучше, по сравнению со способностями, наблюдаемыми для антител, уже известных в данной области техники.

В любом статистическом анализе, упомянутом в настоящей заявке, предпочтительно статистически значимое различие с соответствующим контролем имеет значение вероятности <0,1, предпочтительно <0,05, более предпочтительно <0,01. Соответствующие способы определения статистической значимости хорошо известны и описаны в данной области техники, и любой из них может быть использован.

Согласно другим предпочтительным вариантам реализации предложены антитела второго поколения, которые обладают улучшенными или превосходящими свойствами по сравнению с исходным антителом к HPA-1a, таким как 26.4.

Сравнения с целью выявления эффективных антител второго поколения могут быть легко проведены и оценены количественно, например, с использованием одного или более из различных анализов, подробно описанных в настоящей заявке или в данной области техники. В объем настоящего изобретения включены антитела второго поколения, которые имеют биологическое свойство или активность, улучшенные по меньшей мере приблизительно в 2 раза, в 5 раз, 10 раз, 20 раз, и предпочтительно по меньшей мере приблизительно в 50 раз, по сравнению с антителами к HPA-1a согласно настоящему изобретению, как описано на примере антитела 26.4.

Антитело, связывающий белок и молекулы нуклеиновых кислот согласно настоящему изобретению обычно представляют собой «выделенные» или «очищенные» молекулы, поскольку они отличаются от любых аналогичных компонентов, которые могут присутствовать in situ в организме человека или животного, или образце ткани, полученном из организма человека или животного. Последовательности могут, однако, соответствовать или быть по существу гомологичными последовательностям, которые обнаруживаются в организме человека или животного. Следовательно, в настоящей заявке термин «выделенный» или «очищенный», применительно к молекулам или последовательностям нуклеиновых кислот и белкам или полипептидам, например, антителам, относится к указанным молекулам, выделенным, очищенным или по существу не содержащим компонентов естественной среды, например, выделенным или очищенным из организма человека или животного (если они действительно встречаются в природе), или относится к указанным молекулам, если они получены с помощью технологического способа, то есть включает рекомбинантные и синтетические молекулы.

Следовательно, применительно к молекуле белка или полипептида, такой как CDR 1, 2 и 3 легкой цепи, CDR 1, 2 и 3 тяжелой цепи, вариабельные области легкой цепи, вариабельные области тяжелой цепи и связывающие белки или антитела согласно настоящему изобретению, включая полноразмерные антитела, термин «выделенный» или «очищенный» обычно относится к белку, по существу не содержащему клеточного материала или других белков из источника, из которого он получен. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения, в частности, в случае если белок должен быть введен человеку или животным, подходящие выделенные или очищенные белки по существу не содержат культуральной среды при получении с помощью рекомбинантных методик, или химических предшественников или других химических веществ, при получении с помощью химического синтеза.

В настоящей заявке термин «последовательность нуклеиновой кислоты» или «молекула нуклеиновой кислоты» относится к последовательности нуклеозидных или нуклеотидных мономеров, состоящей из природных оснований, сахаров и связей между сахарами (остов). Термин также включает модифицированные или замещенные последовательности, содержащие неприродные мономеры, или их части. Последовательности нуклеиновых кислот согласно настоящему изобретению могут представлять собой последовательности дезоксирибонуклеиновой кислоты (ДНК) или последовательности рибонуклеиновой кислоты (РНК) и могут включать природные основания, включая аденин, гуанин, цитозин, тимидин и урацил. Последовательности могут также содержать модифицированные основания. Примеры таких модифицированных оснований включают аза- и деаза- производные аденина, гуанина, цитозина, тимидина и урацила; а также ксантин и гипоксантин. Молекулы нуклеиновых кислот могут быть двухцепочечными или одноцепочечными. Молекулы нуклеиновых кислот могут быть полностью или частично синтетическими или рекомбинантными.

Согласно предпочтительным вариантам реализации настоящего изобретения антитела согласно настоящему изобретению представляют собой антитела человека, более предпочтительно полностью человеческие антитела.

В настоящей заявке термин «человеческий»(«человека»), применительно к молекулам антител и связывающим белкам, в первую очередь относится к антителам и связывающим белкам, содержащим вариабельные области (например, области VH, VL, CDR или FR) и необязательно константные области антитела, выделенные или полученные из репертуара человека или полученные или соответствующие последовательностям, обнаруженным у человека, например, в зародышевой линии или соматических клетках человека. Антитело 26.4 является примером такой молекулы антитела человека, в котором вариабельные области соответствуют последовательностям, обнаруженным у человека.

В настоящей заявке термин «фрагмент» относится к фрагментам, имеющим биологическую значимость, например, фрагментам, которые участвуют в связывании антигена, например, образуют часть сайта связывания антигена, и/или способствуют ингибированию или уменьшению функции антигена HPA-1a. Некоторые предпочтительные фрагменты содержат вариабельную область тяжелой цепи (домен VH), и/или вариабельную область легкой цепи (домен VL) антител согласно настоящему изобретению.

Специалист в данной области техники поймет, что белки и полипептиды согласно настоящему изобретению, такие как CDR легкой и тяжелой цепей, вариабельные области легкой и тяжелой цепей, антитела, фрагменты антител и иммуноконъюгаты, могут быть получены любым из нескольких способов, которые хорошо известны и описаны в данной области техники, но наиболее предпочтительно получены с использованием рекомбинантных способов.

Фрагменты нуклеиновых кислот, кодирующие вариабельные области легкой и тяжелой цепей антител согласно настоящему изобретению, могут быть получены или изготовлены любым подходящим способом, например, путем клонирования или синтеза.

После получения фрагментов нуклеиновых кислот, кодирующих вариабельные области легкой и тяжелой цепей антител согласно настоящему изобретению, указанные фрагменты могут быть подвергнуты дополнительным манипуляциям с помощью стандартных методик рекомбинантных ДНК, например, для преобразования фрагментов вариабельной области в полноразмерные антитела с соответствующими доменами константных областей, или в конкретные форматы фрагментов антител, обсуждаемых в данном описании, например, фрагменты Fab, фрагменты scFv и т.д. Как правило, или в в рамках этой дополнительной процедуры осуществления манипуляций, фрагменты нуклеиновых кислот, кодирующих молекулы антител согласно настоящему изобретению обычно встраивают в соответствующий вектор экспрессии чтобы облегчить получение антител согласно настоящему изобретению.

Подходящие векторы экспрессии включают, но не ограничиваются ими, космиды, плазмиды или модифицированные вирусы (например, дефектные по репликации ретровирусы, аденовирусы и аденоассоциированные вирусы), при условии, что вектор совместим с клеткой-хозяином. Векторы экспрессии являются «подходящими для трансформации клетки-хозяина», это означает, что векторы экспрессии содержат молекулу нуклеиновой кислоты согласно настоящему изобретению и регуляторные последовательности, выбранные на основе клеток-хозяев, которые будут использованы для экспрессии, которые функционально связаны с молекулой нуклеиновой кислоты. Функционально связанный означает, что нуклеиновая кислота связана с регуляторными последовательностями таким способом, который обеспечивает экспрессию нуклеиновой кислоты.

Следовательно, в объем настоящего изобретения включен рекомбинантный вектор экспрессии, содержащий молекулу нуклеиновой кислоты согласно настоящему изобретению или ее фрагмент, а также необходимые регуляторные последовательности для транскрипции и трансляции последовательности белка, кодируемого молекулой нуклеиновой кислоты согласно настоящему изобретению.

Подходящие регуляторные последовательности могут быть получены из различных источников, включая гены бактерий, грибков, вирусов, млекопитающих или насекомых, и хорошо известны в данной области техники. Выбор соответствующих регуляторных последовательностей зависит от выбранной клетки-хозяина, описанной ниже, и может быть легко осуществлен специалистом в данной области техники. Примеры подходящих регуляторных последовательностей включают: промотор и энхансер транскрипции или последовательность связывания РНК-полимеразы, последовательность связывания рибосом, включая сигнал инициации трансляции. Помимо этого, в зависимости от выбранной клетки-хозяина и используемого вектора, в вектор экспрессии могут быть включены другие последовательности, такие как сайт инициации репликации, дополнительные сайты рестрикции ДНК, энхансеры и последовательности для индукции транскрипции.

Рекомбинантные векторы экспрессии согласно настоящему изобретению могут также содержать селективный маркерный ген, который облегчает отбор клеток-хозяев, трансформированных или трансфецированных рекомбинантной молекулой согласно настоящему изобретению.

Рекомбинантные векторы экспрессии также могут содержать гены, которые кодируют гибридный фрагмент, который обеспечивает повышенную экспрессию рекомбинантного белка; повышенную растворимость рекомбинантного белка; и облегчает очистку рекомбинантного белка-мишени, играя роль лиганда при аффинной очистке (например, могут присутствовать соответствующие «метки», обеспечивающие очистку и/или выявление, например, полигистидиновые метки или Myc-метки).

Рекомбинантные векторы экспрессии могут быть введены в клетки-хозяева для получения трансформированной клетки-хозяина. Термины «трансформированный с использованием», «трансфецированный с использованием», «трансформация» и «трансфекция» включают введение нуклеиновой кислоты (например, вектора) в клетку с помощью одного из многих возможных способов, известных в данной области техники. Подходящие способы трансформации и трансфекции клеток-хозяев можно найти в Sambrook et al., 1989 (Sambrook, Fritsch and Maniatis, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Ed., Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989) и других лабораторных учебниках.

Подходящие клетки-хозяева включают широкий спектр эукариотических клеток-хозяев и прокариотических клеток. Например, белки согласно настоящему изобретению могут быть экспрессированы в дрожжевых клетках или клетках млекопитающих. Особенно предпочтительными являются клетки линии НЕК293E. Помимо этого белки согласно настоящему изобретению могут быть экспрессированы в прокариотических клетках, таких как клетки Escherichia coli.

Информация, содержащаяся в настоящем документе, позволяет легко реализовать промоторы, терминаторы и способы введения векторов экспрессии соответствующего типа в клетки растений, птиц и насекомых.

Согласно другому варианту белки согласно настоящему изобретению также могут быть экспрессированы в трансгенных животных, отличных от человека, таких как крысы, кролики, овцы и свиньи.

Белки согласно настоящему изобретению также могут быть получены с помощью химического синтеза с использованием способов химического синтеза белков, хорошо известных в данной области техники, таких как твердофазный синтез.

N-концевые или C-концевые гибридные белки, содержащие антитела и белки согласно настоящему изобретению, конъюгированные с другими молекулами, такими как белки, могут быть получены путем гибридизации с помощью рекомбинантных методик. Полученные гибридные белки содержат антитело или белок согласно настоящему изобретению, гибридизованный с выбранным белком или маркерным белком, или белковой меткой, описанной в настоящей заявке. Антитела и белки согласно настоящему изобретению также могут быть конъюгированы с другими белками с помощью известных методик. Например, белки могут быть соединены с использованием гетеробифункциональных тиолсодержащих линкеров, описанных в публикации WO 90/10457, N-сукцинимидил-3-2-пиридилтиопропионата или N-сукцинимидил-5-тиоацетата.

Согласно другому аспекту предложена экспрессионная конструкция или вектор экспрессии, содержащий один или более фрагментов нуклеиновых кислот или сегментов, или молекул согласно настоящему изобретению. В предпочтительном варианте конструкции или векторы экспрессии являются рекомбинантными. В предпочтительном варианте подходящие конструкции или векторы дополнительно содержат необходимые регуляторные последовательности для транскрипции и трансляции последовательности белка, кодируемого молекулой нуклеиновой кислоты согласно настоящему изобретению.

Согласно другому аспекту предложена клетка-хозяин или вирус, содержащий одну или более экспрессионных конструкций или векторы экспрессии согласно настоящему изобретению. В настоящем изобретении также предложены клетки-хозяева или вирусы, содержащие одну или более молекул нуклеиновой кислоты согласно настоящему изобретению. Согласно другому аспекту настоящее изобретение относится к клетке-хозяину или вирусу, экспрессирующему антитело согласно настоящему изобретению. Подходящие клетки-хозяева включают, но не ограничиваются ими, клетки линии HEK293E.

Согласно другому аспекту настоящего изобретения предложен способ получения антитела согласно настоящему изобретению, включающий этап культивирования клеток-хозяев согласно настоящему изобретению. Предпочтительные способы включают этапы: (i) культивирования клетки-хозяина, содержащей один или более из рекомбинантных векторов для экспрессии или одну или более последовательностей нуклеиновых кислот согласно настоящему изобретению, в условиях, подходящих для экспрессии кодируемого антитела или белка; и необязательно (ii) выделение или получение антитела или белка из клетки-хозяина или ростовой среды/супернатанта. Подходящие способы получения также могут включать этап очистки антитела или белкового продукта и/или изготовление композиции антитела или продукта, содержащей по меньшей мере один дополнительный компонент, такой как фармацевтически приемлемый носитель или вспомогательное вещество.

В вариантах реализации, в соответствии с которыми антитело или белок согласно настоящему изобретению состоит более чем из одной полипептидной цепи (например, некоторых фрагментов, таких как фрагменты Fab), все полипептиды предпочтительно экспрессируются в клетке-хозяине с одного и того же или другого вектора для экспрессии, так, что полноразмерные белки, например, связывающие белки согласно настоящему изобретению, могут собираться в клетке-хозяине и могут быть выделены или очищены из нее.

Согласно другому аспекту настоящего изобретения предложен способ связывания HPA-1a, включающий приведение композиции, содержащей HPA-1a, в контакт с антителом согласно настоящему изобретению или его иммуноконъюгатом.

Согласно другому аспекту настоящего изобретения предложен способ детектирования HPA-1a, включающий приведение композиции, предположительно содержащей HPA-1a, в контакт с антителом согласно настоящему изобретению или его иммуноконъюгатом в условиях, которые эффективно обеспечивают образование комплексов HPA-1a/антитело, и детектирование комплексов, образованных указанным способом.

Антитела согласно настоящему изобретению также можно применять для получения дополнительных антител, которые связываются с HPA-1a. Подходящий способ применения включает, например, добавление, делецию, замену или вставку одной или более аминокислот в аминокислотную последовательность исходного антитела с образованием нового антитела, причем указанное исходное антитело представляет собой одно из антител согласно настоящему изобретению, определенных в другом месте настоящего документа, и исследование полученного нового антитела для выявления антител, которые связываются с HPA-1a. Указанные способы могут быть использованы для образования нескольких новых антител, все из которых могут быть исследованы для определения их способности связываться с HPA-1a. В предпочтительном варианте добавление, делеция, замена или вставка одной или более аминокислот происходит в одном или более участках CDR.

Подходящая модификация или мутация исходного антитела может быть осуществлена любым подходящим способом с использованием методик, хорошо известных и описанных в данной области техники, например, с помощью способов случайного или направленного мутагенеза. В случае необходимости использования направленного мутагенеза, одна из стратегий выявления соответствующих остатков для мутагенеза заключается в установлении кристаллической структуры комплекса связывающий белок-антиген, например, комплекса Ab-Ag, чтобы выявить ключевые остатки, вовлеченные в связывание антигена. Впоследствии эти остатки могут быть мутированы для усиления взаимодействия. В другом варианте один или более остатков аминокислот могут быть подвергнуты направленному мутагенезу, с последующей оценкой влияния на связывание с HPA-1a.

Случайный мутагенез можно осуществлять любым подходящим способом, например, с помощью подверженной ошибкам ПЦР, перегруппировки цепей или мутаторных штаммов E.coli.

Следовательно, один или более доменов VH согласно настоящему изобретению могут быть объединены с одним доменом VL или репертуаром доменов VL из любого подходящего источника, и полученные новые антитела могут быть исследованы для выявления антител, специфичных в отношении HPA-1a. Напротив, один или более доменов VL согласно настоящему изобретению могут быть объединены с одним доменом VH или репертуаром доменов VH из любого подходящего источника, и полученные новые антитела могут быть исследованы для выявления антител, которые связываются с HPA-1a.

Аналогичным образом, один или более, или предпочтительно все три CDR из доменов VH и/или VL согласно настоящему изобретению могут быть привиты в один домен VH и/или VL или репертуар доменов VH и/или VL, в зависимости от конкретного случая, и полученные новые антитела могут быть исследованы для выявления антител, которые связываются с HPA-1a.

Способы осуществления манипуляций с аминокислотами и белковыми доменами, описанные выше, хорошо известны специалисту в данной области техники. Например, подходящие манипуляции можно легко осуществлять с помощью генной инженерии на уровне нуклеиновой кислоты, когда молекулы нуклеиновых кислот, кодирующих соответствующие связывающие белки и их домены, модифицированы так, что аминокислотная последовательность полученного экспрессированного белка в свою очередь модифицирована соответствующим образом.

Новые антитела, полученные с помощью указанных способов, предпочтительно имеют улучшенные функциональные свойства, например, более высокую или улучшенную аффинность (или по меньшей мере эквивалентную аффинность) в отношении HPA-1a, по сравнению с исходным антителом, и могут быть обработаны и использованы аналогичным способом, что и антитела согласно настоящему изобретению, как описано в другом месте настоящего документа (например, для лечения, диагностики, в составе композиций и т.д.). В другом варианте или дополнительно, новые антитела будут иметь одно или более других улучшенных функциональных свойств, описанных в другом месте настоящего документа.

Согласно другому аспекту настоящего изобретения предложены новые антитела, выработанные, полученные или получаемые с помощью указанных способов.

Исследование способности одного или более антител связываться с HPA-1a может быть осуществлено любым подходящим способом, которые хорошо известны и описаны в данной области техники. Подходящие способы описаны также в разделе «примеры».

Согласно настоящему изобретению также предложена гибридома, секретирующая антитело 26.4 (например, гибридома DL18BL26.4H, описанная в разделе примеров). Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения предложено антитело, секретируемое гибридомой (или антитело, которое конкурирует с указанным антителом за связывание с HPA-1a).

В настоящем изобретении также предложен ряд конъюгированных антител и их фрагментов, в которых антитело к HPA-1a функционально присоединено по меньшей мере к одному иному терапевтическому или диагностическому агенту. Термин «иммуноконъюгат» широко используется для определения функциональной связи антитела с другим эффективным агентом и не ограничивается каким-либо одним типом функциональной связи, и в частности не ограничивается химической «конъюгацией». Особенно предпочтительными являются рекомбинантные гибридные белки. При условии, что система доставки или нацеленный агент способны связываться с мишенью, и терапевтический или диагностический агент остается достаточно функциональным после доставки, способ присоединения рассматривается как подходящий.

В настоящем изобретении также предложено антитело, определенное в настоящей заявке, присоединенное к твердому носителю (например, микросфере).

Составы (композиции), содержащие одно или более антител согласно настоящему изобретению в смеси с подходящим разбавителем, носителем или вспомогательным веществом, представляют собой еще один аспект настоящего изобретения. Подходящие композиции могут быть предназначены для фармацевтического применения. Подходящие разбавители, вспомогательные вещества и носители известны специалисту в данной области техники.

Композиции согласно настоящему изобретению могут быть представлены, например, в форме, подходящей для перорального, назального, парентерального, внутривенного, местного или ректального введения.

Активные соединения, определенные в настоящей заявке, могут быть представлены в стандартных фармакологических формах для введения, таких как таблетки, покрытые таблетки, назальные спреи, растворы, эмульсии, липосомы, порошки, капсулы или формы с замедленным высвобождением. Для приготовления указанных форм могут быть использованы стандартные фармацевтические вспомогательные вещества, а также обычные способы получения.

Растворы для инъекций могут быть получены, например, стандартным способом, например, путем добавления консервантов, таких как п-гидроксибензоаты, или стабилизаторов, таких как ЭДТА. Растворы затем заливают во флаконы для инъекций или ампулы.

Назальные спреи могут быть изготовлены так же как и водный раствор, и упакованы в аэрозольные контейнеры с аэрозольным пропеллентом или могут быть снабжены средствами для ручной компрессии.

Фармацевтические композиции (составы) согласно настоящему изобретению предпочтительно вводят парентерально. Парентеральное введение может быть осуществлено путем подкожной, внутримышечной или внутривенной инъекции с помощью шприца, необязательно шприца-ручки. В другом варианте парентеральное введение может быть осуществлено с помощью инфузионного насоса. В другом варианте предложена композиция, которая может быть в виде порошка или жидкости для введения пептида в форме назального или легочного спрея. В другом варианте антитело согласно настоящему изобретению также может быть введено чрескожно, например, из пластыря, необязательно ионтофоретического пластыря, или через слизистую оболочку, например, буккально.

Единицы дозирования, содержащие антитела, предпочтительно содержат 0,1-10 мг, например, 1-5 мг активного агента. Другие подходящие дозы включают, но не ограничиваются ими, дозы, которые достигают концентрации в плазме от 0,1 до 1 МЕ/мл, например, 0,5 МЕ/мл (0,08 мкг/мл). Доза 0,5 МЕ/мл (0,08 мкг/мл) может быть достигнута путем внутривенного введения 2000 МЕ.

Фармацевтические композиции могут дополнительно содержать другие активные ингредиенты, описанные выше применительно к схемам совместного введения.

Согласно другому аспекту настоящего изобретения предложены антитела к HPA-1a, определенные в настоящей заявке, для применения в терапии, в частности, для применения в лечении или профилактике FNAIT. Следовательно, лечение включает профилактическое лечение.

У HPA-1a-отрицательных (т.е. HPA-1bb) женщин антитела к HPA-1a могут вырабатываться в результате иммунизации HPA-1a при несовместимой беременности (т.е. беременности HPA-1a-положительным плодом). Антитела к HPA-1a, которые вырабатываются в организме матери, проникают через плаценту, связываются с тромбоцитами плода и могут ускорить разрушение тромбоцитов, вызывая тем самым FNAIT.

Не желая быть связанными какой-либо теорией, авторы настоящего изобретения полагают, что антитела согласно настоящему изобретению, введенные женщине, иммунизированной аллоантигеном, проникают через плаценту и конкурируют с материнскими антителами к НРА-1a за связывание с тромбоцитами плода, уменьшая тем самым разрушение тромбоцитов и обеспечивая тем самым лечение FNAIT.

Применительно к лечению FNAIT, предпочтительно антитело имеет уменьшенную или устраненную эффекторную функцию. Например, часть Fc иммуноглобулина (Ig), может быть модифицирована (или удалена), чтобы уменьшить/удалить эффекторную функцию. Способы таких модификаций известны в данной области техники. Предпочтительно, применительно к лечению FNAIT, антитело содержит область Fc, которая способствует переносу через плаценту и которая содержит мутации, уменьшающие (или устраняющие) способность антител разрушать тромбоциты (например, как описано в Mathiesen et al., Blood (2013) 122(7):1174-81).

Применительно к лечению FNAIT, некоторые предпочтительные субъекты для введения антитела согласно настоящему изобретению представляют собой тех, кто, как известно, вынашивает плод, который уже страдает FNAIT, что определено, например, путем определения количества тромбоцитов у плода.

Антитела согласно настоящему изобретению также можно применять для предотвращения FNAIT, т.е. можно применять для профилактических видов лечения. Согласно некоторым вариантам реализации профилактических видов лечения антитела согласно настоящему изобретению могут быть введены женщине, которая уже беременна, предпочтительно беременной женщине, которая, как известно, является НРА-1a-отрицательной, более предпочтительно женщине, которая уже беременна несовместимой беременностью (т.е. мать является HPA-1a-отрицательной и плод является HPA-1a-положительным).

Было установлено, что аллоиммунизация HPA-1a также может возникать в связи с родами несовместимого плода (ребенка). Стимуляция HPA-1a при родах может представлять собой первый стимул HPA-1a, который получила мать (т.е. аллоиммунизация может отсутствовать во время беременности). Следовательно, в некоторых вариантах реализации настоящего изобретения антитела согласно настоящему изобретению вводят матери при родах или вскоре после родов, предпочтительно в течение 72 часов с момента родов.

Не желая быть связанными какой-либо теорией, авторы настоящего изобретения полагают, что антитела к HPA-1a согласно настоящему изобретению, введенные матери при родах (или матери, которая подвергается риску аллоиммунизации иным образом), будут связываться с HPA-1a на HPA-1a-положительных тромбоцитах плода (ребенка), которые попадают в кровоток матери, и разрушать HPA-1a-положительные тромбоциты, предотвращая тем самым стимуляцию иммунной системы матери тромбоцитами плода/ребенка, несущими HPA-1a. Соответственно, аллоиммунизация предотвращается, и FNAIT не развивается. Аналогичный механизм предотвращает аллоиммунизацию, вызванную трофобластами плода или другим трофобластным материалом, поступающим в кровоток матери.

Как было описано выше, в некоторых вариантах реализации настоящего изобретения антитела к HPA-1a согласно настоящему изобретению обладают способностью ингибировать связывание антитела к HPA-1a, SZ21, с интегрином αVβ3. Не желая быть связанными какой-либо теорией, авторы настоящего изобретения полагают, что способность антитела согласно настоящему изобретению стабильно связываться с интегрином αVβ3 и ингибировать связывание других антител к HPA-1a с интегрином αVβ3 указывает на то, что такие антитела можно применять в предотвращении аллоиммунизации, вызванной трофобластами плода или другим трофобластным материалом, поступающим в кровоток матери.

В случае предотвращения аллоиммунизации в связи с родами, последующая несовместимая беременность может быть защищена от FNAIT.

Следовательно, согласно другому аспекту настоящего изобретения также предложены антитела к HPA-1a, определенные в настоящей заявке, для применения в предотвращении аллоиммунизации антигеном HPA-1a у субъекта.

В работе Ghevaert et al. (Blood, 122: 313-320 (2013)) обсуждается применение антитела к HPA-1a в лечении и профилактике FNAIT.

Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения, в частности, применительно к профилактике FNAIT, антитела IgG к HPA-1a предпочтительно являются гликозилированными. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения, в частности, применительно к профилактике FNAIT, антитела IgG к HPA-1a предпочтительно являются нефукозилированными (т.е. предпочтительно не модифицированы фукозной группой).

Антитела согласно настоящему изобретению специфично связываются с HPA-1a (т.е. не вступают в перекрестную реакцию с аллоантигеном HPA-1b). Следовательно, антитела согласно настоящему изобретению можно применять для определения того, является ли субъект (предпочтительно субъект женского пола) НРА-1a-положительным или НРА-1a-отрицательным.

Соответственно, согласно другому аспекту настоящего изобретения предложен способ исследования присутствия или отсутствия HPA-1a в образце (предпочтительно образце, содержащем тромбоциты), который был получен от субъекта, причем указанный способ включает этапы:

(a) приведения указанного образца в контакт с антителом согласно настоящему изобретению, которое специфично связывается с HPA-1a; и

(b) исследования присутствия или отсутствия комплексов антитело к HPA-1a/HPA-1a (антиген).

Наличие комплексов антитело к HPA-1a/HPA-1a (антиген) указывает на присутствие HPA-1a в образце. Отсутствие комплексов антитело к HPA-1a/HPA-1a (антиген) указывает на отсутствие HPA-1a в образце. Следовательно, в настоящем изобретении предложен способ фенотипирования НРА-1. Подходящие способы исследования (т.е. определения) присутствия комплексов антитело HPA-1a-HPA-1a (антиген) известны в данной области техники. Согласно одному варианту реализации настоящего изобретения используется проточная цитометрия цельной крови, предпочтительно в подходящих вариантах реализации настоящего изобретения антитело согласно настоящему изобретению (например, в форме IgG₁) конъюгируют с флуоресцентным красителем. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения цельная кровь представляет собой периферическую кровь, предпочтительно полученную от субъектов не более чем за 10 дней до использования. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения проточная цитометрия цельной крови используется в соответствии с экспериментальными примерами согласно настоящему изобретению.

Способ исследования присутствия или отсутствия HPA-1a в образце, описанный выше, можно применять для выявления женщин, которым могут быть полезны способы профилактического лечения, описанные в настоящей заявке.

В нескольких проспективных исследованиях было установлено, что высокие уровни материнских антител к HPA-1a коррелируют с низким количеством тромбоцитов у новорожденных. Следовательно, определение количества антител к HPA-1a можно применять в качестве прогностического фактора степени тромбоцитопении у новорожденных. Используемый в настоящее время эталонный материал для количественного определения антител к HPA-1a был получен Национальным институтом биологических стандартов и контроля (NIBSC). Стандарт NIBSC содержит плазму крови от шести доноров, иммунизированных HPA-1a, и его поставки зависят от присутствия таких доноров. Замена поликлональных сывороток рекомбинантным антителом обеспечит относительно дешевый, стандартизированный, высокоспецифичный и неограниченный источник антител к HPA-1a для использования в качестве контрольного стандартного реагента.

Соответственно, согласно другому аспекту настоящего изобретения предложено применение антитела согласно настоящему изобретению в качестве эталонного стандарта для количественной оценки антител к HPA-1a (вырабатываемых в организме матери) в образце (например, образце цельной крови или плазмы крови). В предпочтительном варианте указанный эталонный стандарт используют в fyfkbpt MAIPA (иммобилизация моноклональных антител на антигенах тромбоцитов) с целью количественной оценки антител к HPA-1a в образце.

Согласно другому варианту настоящего изобретения предложен способ лечения или предотвращения FNAIT, причем указанный способ включает введение пациенту, нуждающемуся в этом, терапевтически или профилактически эффективного количества антитела согласно настоящему изобретению, определенного в настоящей заявке.

Терапевтически или профилактически эффективное количество будет определено на основании клинической оценки и может легко контролироваться.

Согласно другому варианту в настоящем изобретении предложено применение антитела согласно настоящему изобретению, определенного в настоящей заявке, в производстве лекарственного средства для лечения или предотвращения FNAIT.

Субъекты, получавшие лечение в соответствии с настоящим изобретением, предпочтительно, будут являться людьми, более предпочтительно субъектами женского пола (например, беременные женщины).

Композиции и способы применения согласно настоящему изобретению могут быть использованы в комбинации с другими терапевтическими средствами и диагностическими агентами. В отношении биологических агентов, предпочтительно диагностических или терапевтических агентов для использования «в комбинации» с антителом к HPA-1a в соответствии с настоящим изобретением, термин «в комбинации», вкратце, используется для описания ряда вариантов реализации настоящего изобретения. Терминология «в комбинации», если не указано иное или если иное не следует из научной терминологии, соответственно, относится к различным форматам комбинированных композиций, фармацевтических препаратов, коктейлей, наборов, способов и первого и второго видов медицинского применения.

«Комбинированные» варианты реализации настоящего изобретения, соответственно, включают, например, те, в которых антитело к HPA-1a согласно настоящему изобретению представляет собой антитело в чистом виде («голое») и применяется в комбинации с агентом или терапевтическим агентом, который не связан с ним функционално. В других «комбинированных» вариантах реализации настоящего изобретения антитело к HPA-1a согласно настоящему изобретению представляет собой иммуноконъюгат, в котором антитело функционально связано или объединено с агентом или терапевтическим агентом. Функциональное присоединение включает все формы прямого и непрямого присоединения, описанные в настоящей заявке и известные в данной области техники.

В объем настоящего изобретения также включены наборы, содержащие одно или более из антител, иммуноконъюгатов или композиций согласно настоящему изобретению, или одну или более из молекул нуклеиновой кислоты, кодирующих антитело согласно настоящему изобретению, или один или более рекомбинантных векторов для экспрессии, содержащих последовательности нуклеиновых кислот согласно настоящему изобретению, или одну или более клеток-хозяев или вирусы, содержащие рекомбинантные векторы экспрессии или последовательности нуклеиновых кислот согласно настоящему изобретению. В предпочтительном варианте указанные наборы предназначены для использования в способах и способах применениях, описанных в настоящей заявке, например, терапевтических, диагностических или визуализирующих способах, описанных в настоящей заявке, или для применения в анализах или способах in vitro, описанных в настоящей заявке. Антитело в указанных наборах предпочтительно может представлять собой конъюгат антитела, описанного в другом месте настоящего документа, например, может быть конъюгировано с детектируемым фрагментом или может представлять собой иммуноконъюгат. В предпочтительном варианте указанные наборы включают инструкции по использованию компонентов набора, например, в диагностике. В предпочтительном варианте указанные наборы предназначены для диагностики или лечения заболеваний, как описано в другом месте настоящего документа, и необязательно включают инструкции по применению компонентов набора для диагностики или лечения таких заболеваний.

Антитела согласно настоящему изобретению, определенные в настоящей заявке, также можно применять в качестве молекулярных инструментов в соответствии со способами применения и исследованиями in vitro или in vivo. Поскольку антитела содержат антигенсвязывающий сайт, они могут функционировать в качестве членов специфичных связывающихся пар, и указанные молекулы могут быть использованы в любом исследовании, в котором требуется конкретный член связывающейся пары.

Следовательно, согласно другим аспектам настоящего изобретения предложен реагент, который содержит антитело согласно настоящему изобретению, определенное в настоящей заявке, и применение указанных антител в качестве молекулярных инструментов, например, в исследованиях in vitro или in vivo.

ТАБЛИЦА НУКЛЕОТИДНЫХ И АМИНОКИСЛОТНЫХ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ, РАСКРЫТЫХ В НАСТОЯЩЕЙ ЗАЯВКЕ, И ИДЕНТИФИКАЦИОННЫЕ НОМЕРА УКАЗАННЫХ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ (SEQ ID NO)

Все нуклеотидные последовательности указаны в настоящей заявке в направлении от 5'-конца к 3'-концу как принято в данной области техники.

Таблица 1
SEQ ID NO:	Описание	Последовательность
Антитело 26.4
1	Домен VH (п.о.)	caggtacagttgcagcagtcaggtccaggactggtgaagccctcgcagaccctgtcactcacctgtgccatctccggggacagtgtcagcagcaacagtgctgcttggaactggatcaggcagtccccatcgagaggccttgagtggctgggaaggacatacttcaggtccaactggtacaatgattatgcagcatctgtgaaaagtcgaataaccatcaaccaagacacatccaagaaccagctctccctgcagctgaactctgtgactcccgaggacacggctatgtattactgtgcaagagatggggcctggggtggcagcagctggtggccaggccttcctcaccactactactctggtatggacgtctggggccaggggaccacggtcaccgtctcctca
2	Домен VL (п.о.)	gaaattgtgttgacacagtctccagccaccctgtcattgtctccaggggaaagagccaccctctcctgcagggccagtcagagtgttagcagctacttagcctggtaccaacagaagcctggccaggctcccaggctcctcatctatgatgcatccaaaagggccactggcatcccagccaggttcagtggcagtgggtctgggacagacttcagtctcaccatcagaagcctcgagcctgaagattttgcagtttattactgtcaacagcgtagcgactggcagggactcactttcggcggagggaccaaggtggagatcaaa
3	Домен VH (а.к.)	QVQLQQSGPGLVKPSQTLSLTCAISGDSVSSNSAAWNWIRQSPSRGLEWLGRTYFRSNWYNDYAASVKSRITINQDTSKNQLSLQLNSVTPEDTAMYYCARDGAWGGSSWWPGLPHHYYSGMDVWGQGTTVTVSS
4	Домен VL (а.к)	EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVSSYLAWYQQKPGQAPRLLIYDASKRATGIPARFSGSGSGTDFSLTIRSLEPEDFAVYYCQQRSDWQGLT FGGGTKVEIK
5	CDR1 тяжелой цепи	GDSVSSNSAA
6	CDR2 тяжелой цепи	TYFRSNWYN
7	CDR3 тяжелой цепи	ARDGAWGGSSWWPGLPHHYYSGMDV
8	CDR1 легкой цепи	QSVSSY
9	CDR2 легкой цепи	DAS
10	CDR3 легкой цепи	QQRSDWQGLT
11	FR1 тяжелой цепи	QVQLQQSGPGLVKPSQTLSLTCAIS
12	FR2 тяжелой цепи	WNWIRQSPSRGLEWLGR
13	FR3 тяжелой цепи	DYAASVKSRITINQDTSKNQLSLQLNSVTPEDTAMYYC
14	FR4 тяжелой цепи	WGQGTTVTVSS
15	FR1 легкой цепи	EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRAS
16	FR2 легкой цепи	LAWYQQKPGQAPRLLIY
17	FR3 легкой цепи	KRATGIPARFSGSGSGTDFSLTIRSLEPEDFAVYYC
18	FR4 легкой цепи	FGGGTKVEIK
19	Тяжелая цепь IgG1 (п.о.)	CAGGTGCAGCTGCAGCAGTCCGGCCCTGGGCTGGTGAAGCCTAGCCAGACCCTGTCCCTGACATGCGCCATCTCAGGCGACAGCGTGAGCTCCAACTCTGCCGCTTGGAATTGGATTAGACAGAGCCCATCCCGCGGGCTGGAGTGGCTGGGACGGACCTACTTCAGAAGCAACTGGTACAATGACTATGCCGCTTCCGTGAAGTCTCGGATCACCATTAACCAGGATACATCTAAAAATCAGCTGAGTCTGCAGCTGAACTCAGTGACTCCCGAAGACACCGCCATGTACTATTGTGCTAGGGATGGCGCTTGGGGCGGGTCTAGTTGGTGGCCAGGACTGCCCCACCATTACTATAGCGGCATGGACGTGTGGGGACAGGGCACCACAGTGACAGTGTCAAGCGCCAGCACTAAGGGCCCTTCCGTGTTTCCTCTGGCTCCATCCTCTAAATCTACAAGTGGAGGCACTGCCGCTCTGGGGTGTCTGGTGAAGGATTATTTCCCTGAGCCAGTGACTGTGAGTTGGAACTCAGGCGCCCTGACTAGCGGGGTGCACACCTTTCCCGCTGTGCTGCAGAGTTCAGGGCTGTACAGCCTGAGCTCCGTGGTGACCGTGCCTTCTAGTTCACTGGGAACTCAGACCTATATCTGCAACGTGAATCACAAGCCTTCTAATACAAAAGTGGACAAGAAAGTGGAGCCAAAGAGTTGTGATAAAACACATACTTGCCCTCCCTGCCCTGCCCCTGAACTGCTGGGCGGCCCAAGCGTGTTCCTGTTTCCACCCAAGCCCAAAGATACACTGATGATTAGCCGGACTCCGGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAGGATCCTGAAGTGAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAAGTGCATAATGCCAAGACCAAACCACGGGAGGAACAGTACAACTCTACATATAGAGTGGTGAGTGTGCTGACTGTGCTGCACCAGGATTGGCTGAACGGGAAAGAGTATAAGTGCAAAGTGAGCAATAAGGCCCTGCCTGCTCCAATCGAGAAAACCATTTCCAAGGCCAAAGGACAGCCCAGGGAACCTCAGGTGTACACACTGCCCCCTAGTCGCGACGAGCTGACTAAGAACCAGGTGTCTCTGACCTGTCTGGTGAAAGGCTTCTATCCATCCGATATCGCTGTGGAGTGGGAATCTAATGGGCAGCCCGAAAACAATTACAAGACCACACCACCCGTGCTGGACAGCGATGGATCCTTCTTTCTGTATTCAAAGCTGACTGTGGACAAAAGCCGGTGGCAGCAGGGCAACGTGTTTAGCTGTTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAATCATTACACCCAGAAGTCTCTGAGTCTGTCACCCGGGAAATGA
20	Легкая цепь IgG1 (каппа) (п.о.)	GAGATCGTGCTGACTCAGTCTCCAGCCACCCTGTCCCTGTCTCCAGGAGAACGGGCCACTCTGTCTTGCAGAGCTAGTCAGTCAGTGAGCTCCTACCTGGCCTGGTATCAGCAGAAGCCAGGACAGGCTCCCCGGCTGCTGATCTACGACGCCTCCAAAAGGGCTACAGGCATTCCCGCTCGCTTCAGCGGCTCCGGGTCTGGAACAGATTTTTCCCTGACTATCAGAAGCCTGGAGCCTGAAGACTTCGCCGTGTACTATTGCCAGCAGAGATCTGATTGGCAGGGGCTGACCTTTGGCGGGGGAACAAAGGTGGAGATCAAAAGGACCGTGGCCGCTCCAAGCGTGTTCATCTTTCCCCCTAGCGACGAACAGCTGAAGTCAGGGACAGCCAGCGTGGTGTGCCTGCTGAACAATTTCTACCCCCGCGAGGCCAAGGTGCAGTGGAAAGTGGATAACGCTCTGCAGAGTGGAAATTCACAGGAGAGCGTGACTGAACAGGACTCCAAGGATTCTACCTATAGTCTGTCTAGTACCCTGACACTGAGCAAAGCCGACTACGAGAAGCACAAAGTGTATGCTTGCGAAGTGACACATCAGGGCCTGTCAAGCCCTGTGACTAAGAGCTTCAACCGGGGCGAGTGTTGA
21	Тяжелая цепь IgG1 (а.к.)	QVQLQQSGPGLVKPSQTLSLTCAISGDSVSSNSAAWNWIRQSPSRGLEWLGRTYFRSNWYNDYAASVKSRITINQDTSKNQLSLQLNSVTPEDTAMYYCARDGAWGGSSWWPGLPHHYYSGMDVWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
22	Легкая цепь IgG1 (каппа) (а.к.)	EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVSSYLAWYQQKPGQAPRLLIYDASKRATGIPARFSGSGSGTDFSLTIRSLEPEDFAVYYCQQRSDWQGLTFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
23	Тяжелая цепь IgG3 (п.о.)	CAGGTGCAGCTGCAGCAGTCCGGGCCAGGACTGGTGAAACCCTCACAGACACTGAGCCTGACTTGTGCCATCAGTGGCGATTCAGTGAGCTCCAACAGCGCCGCTTGGAATTGGATTAGGCAGAGTCCTTCACGCGGACTGGAATGGCTGGGCCGGACCTACTTCAGATCCAACTGGTACAATGACTATGCCGCCAGCGTGAAGTCCCGGATCACAATTAACCAGGATACTTCCAAAAATCAGCTGTCTCTGCAGCTGAACAGTGTGACCCCAGAGGACACAGCCATGTACTATTGCGCCAGAGATGGGGCTTGGGGCGGGTCTAGTTGGTGGCCAGGCCTGCCCCACCATTACTATAGCGGGATGGACGTGTGGGGACAGGGAACCACAGTGACCGTGAGCAGCGCCTCAACCAAAGGGCCTAGCGTGTTTCCTCTGGCTCCATGCAGCAGGTCCACTTCTGGAGGCACCGCCGCTCTGGGATGTCTGGTGAAGGACTATTTCCCCGAACCTGTGACCGTGTCTTGGAACAGTGGGGCCCTGACCTCTGGAGTGCACACATTTCCCGCTGTGCTGCAGTCCTCTGGACTGTACAGCCTGAGTTCAGTGGTGACCGTGCCAAGCTCCTCTCTGGGCACACAGACTTATACCTGTAACGTGAATCACAAGCCCAGCAATACAAAGGTGGACAAACGGGTGGAGCTGAAAACACCTCTGGGCGATACTACCCATACTTGCCCACGGTGTCCAGAGCCCAAAAGCTGTGACACCCCTCCCCCATGCCCAAGATGTCCTGAACCAAAATCTTGTGATACACCCCCTCCATGCCCTAGGTGTCCCGAGCCTAAGAGTTGTGACACTCCCCCTCCATGTCCTAGATGTCCTGCTCCGGAACTGCTGGGCGGTCCGAGCGTGTTTCTGTTCCCGCCGAAACCGAAAGATACCCTGATGATTAGTCGCACGCCGGAAGTTACCTGCGTGGTTGTGGATGTGAGCCATGAAGACCCGGAAGTTCAGTTTAAATGGTATGTGGATGGTGTTGAAGTGCACAACGCAAAAACCAAACCGCGTGAAGAACAGTACAATAGCACGTTCCGCGTTGTGTCTGTTCTGACCGTGCTGCATCAGGATTGGCTGAACGGCAAAGAATACAAATGTAAAGTTTCTAACAAAGCACTGCCGGCGCCGATTGAAAAAACGATCAGTAAAACCAAGGGTCAGCCGCGTGAACCGCAGGTGTACACCCTGCCGCCGAGCCGTGAAGAAATGACGAAAAACCAAGTTAGTCTGACCTGCCTGGTGAAAGGCTTTTACCCGAGCGATATTGCAGTGGAATGGGAAAGCTCTGGTCAGCCGGAAAACAATTATAATACCACGCCGCCGATGCTGGATAGTGATGGCAGCTTTTTCCTGTATAGTAAACTGACCGTTGATAAAAGCCGTTGGCAGCAGGGTAACATCTTTAGTTGCAGCGTGATGCATGAAGCGCTGCACAATCGCTTCACCCAGAAATCTCTGAGTCTGAGCCCGGGCAAAGGTAAATAA
24	Легкая цепь IgG3 (каппа) (п.о.)	GAGATCGTGCTGACTCAGTCTCCAGCCACCCTGTCCCTGTCTCCAGGAGAACGGGCCACTCTGTCTTGCAGAGCTAGTCAGTCAGTGAGCTCCTACCTGGCCTGGTATCAGCAGAAGCCAGGACAGGCTCCCCGGCTGCTGATCTACGACGCCTCCAAAAGGGCTACAGGCATTCCCGCTCGCTTCAGCGGCTCCGGGTCTGGAACAGATTTTTCCCTGACTATCAGAAGCCTGGAGCCTGAAGACTTCGCCGTGTACTATTGCCAGCAGAGATCTGATTGGCAGGGGCTGACCTTTGGCGGGGGAACAAAGGTGGAGATCAAAAGGACCGTGGCCGCTCCAAGCGTGTTCATCTTTCCCCCTAGCGACGAACAGCTGAAGTCAGGGACAGCCAGCGTGGTGTGCCTGCTGAACAATTTCTACCCCCGCGAGGCCAAGGTGCAGTGGAAAGTGGATAACGCTCTGCAGAGTGGAAATTCACAGGAGAGCGTGACTGAACAGGACTCCAAGGATTCTACCTATAGTCTGTCTAGTACCCTGACACTGAGCAAAGCCGACTACGAGAAGCACAAAGTGTATGCTTGCGAAGTGACACATCAGGGCCTGTCAAGCCCTGTGACTAAGAGCTTCAACCGGGGCGAGTGTTGA
25	Тяжелая цепь IgG3 (а.к.)	QVQLQQSGPGLVKPSQTLSLTCAISGDSVSSNSAAWNWIRQSPSRGLEWLGRTYFRSNWYNDYAASVKSRITINQDTSKNQLSLQLNSVTPEDTAMYYCARDGAWGGSSWWPGLPHHYYSGMDVWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYTCNVNHKPSNTKVDKRVELKTPLGDTTHTCPRCPEPKSCDTPPPCPRCPEPKSCDTPPPCPRCPEPKSCDTPPPCPRCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVQFKWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTFRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKTKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESSGQPENNYNTTPPMLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNIFSCSVMHEALHNRFTQKSLSLSPGKGK
26	Легкая цепь IgG3 (каппа) (а.к.)	EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVSSYLAWYQQKPGQAPRLLIYDASKRATGIPARFSGSGSGTDFSLTIRSLEPEDFAVYYCQQRSDWQGLTFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC

Последовательности нуклеиновых кислот IgG, приведенные в таблице выше, оптимизированы для экспрессии в клетках НЕК.

Настоящее изобретение будет более подробно описано с помощью неограничивающих примеров ниже со ссылкой на следующие чертежи:

Фигура 1. Выделение HPA-1a-специфичных B-лимфобластов. (А) Клетки, положительные по CD22 выделяли путем магнитно-активированной сортировки (MACS) из мононуклеарных клеток периферической крови (МКПК) женщины, иммунизированной аллоантигеном HPA-1a, и помечены FITC-конъюгированными антителами к IgM, IgA и IgD человека. Популяция CD22⁺IgM^-IgD^-IgA^- (пропущенные, 5,6% CD22⁺ B-клеток), IgG⁺ B-клетки памяти, была выявлена и выделена методом проточной цитометрии (FACS). (B) НРА-1a-положительные тромбоциты метили с использованием CFSE, инкубировали с В-лимфобластами из культуры В-лимфобластов, секретирующих антитела к HPA-1a, и связанные с тромбоцитами B-лимфобласты (пропущенные, 2% CD45⁺ В-лимфобласты) были выделены по отдельности с помощью FACS в 96-луночные микропланшеты с U-образным дном. Результаты представляют значения по меньшей мере трех независимых экспериментов.

Фигура 2. Связывание МАТ26.4 с антигенами HPA-1 на интактных тромбоцитах. (A) Связывание 26.4 с тромбоцитами HPA-1aa и HPA-1bb, которое исследовали методом проточной цитометрии. Тромбоциты инкубировали с супернатантом культуральной среды, содержащей 26.4, или средой в качестве отрицательного контроля. FITC-конъюгированные антитела к IgG человека использовали для детектирования IgG, связанных с тромбоцитами. Результаты представлены в виде наложения гистограмм: относительное количество клеток представлено в виде зависимости от интенсивности флуоресценции. (B) Антитело 26.4 исследовали для оценки связывания с тромбоцитами НРА-1aa и НРА-1bb в анализе MAIPA. Нормальную сыворотку использовали в качестве отрицательного контроля. Образцы исследовали в двух повторах. Представлены средние значения оптической плотности после вычитания неспецифичного сигнала. Результаты представляют значения по меньшей мере трех независимых экспериментов. Антитело 26.4, полученное из B-лимфобластов и гибридом, и рекомбинантное антитело 26.4 IgG1 и IgG3 обладали аналогичным действием.

Фигура 3. Нуклеотидная и аминокислотная последовательности МАТ 26.4. V-области тяжелой и легкой цепей сопоставлены с наиболее гомологичными последовательностями зародышевой линии. Исследование проводили с помощью IMGT/V-QUEST.

Фигура 4. Исследование методом поверхностного плазмонного резонанса (SPR) связывания МАТ с антигенами HPA-1. Сенсограммы, полученные при связывании 26.4 IgG1 (а) и SZ21 (b) c αIIbβ3, несущим антигены HPA-1a (черная линия) или HPA-1b (пунктирная линия), иммобилизованным на поверхности сенсорного чипа. Антитела использовали в концентрации 20 мкг/мл.

Фигура 5. Исследование с помощью SPR связывания МАТ с HPA-1a на αIIbβ3 и αVβ3. Сенсограммы, полученные при связывании 26.4 IgG1 (черная линия) и B2G1 (пунктир) с HPA-1a на αIIbβ3 (a) и αVβ3 (b), иммобилизованных на поверхности сенсорного чипа. Образцы МАТ использовали в трех различных концентрациях (20 мкг/мл, 10 мкг/мл и 5 мкг/мл); приведены данные для самой высокой концентрации. Результаты представляют значения двух независимых экспериментов. (с) Относительное связывание 26.4 и B2G1 с HPA-1a на αIIbβ3 и αVβ3. Связывание (RU) в конце периода ассоциации вычисляли по сравнению с 26.4 (величину связывания 26.4 принимали за 100% для каждого интегрина). Приведенные данные представляют собой среднее значение единиц отклика, полученное при впрыскивании трех различных концентраций моноклональных антител (20 мкг/мл, 10 мкг/мл и 5 мкг/мл). (d) Процент 26.4 и B2G1, связанных с HPA-1a на αIIbβ3 и αVβ3 в конце периода диссоциации. Процент антитела, связанного в конце фазы диссоциации, был рассчитан путем деления значения RU в конце периода диссоциации на значение RU в конце периода ассоциации и умножения на 100%. Приведенные данные представляют собой средний процент, рассчитанный из трех различных концентраций для каждого МАТ.

Для того чтобы сравнить способность 26.4 и B2G1 ингибировать связывание МАТ SZ21 с антигеном НРА-1a, гранулы, связанные с интегрином β₃, предварительно инкубировали с различными концентрациями 26.4 или B2G1, и последующее связывание FITC-конъюгированного антитела SZ21 с антигеном НРА-1a оценивали методом проточной цитометрии (e, f). Относительная интенсивность флуоресценции = средняя интенсивность флуоресценции каждого образца (среднее значение ± стандартная ошибка среднего) - средняя интенсивность флуоресценции гранул, связанных с интегрином β3, из лизата тромбоцитов HPA-1bb. Каждый образец исследовали в двух повторах. На представленных графиках приведены результаты четырех независимых экспериментов с использованием гранул, связанных с интегрином β3 из лизата тромбоцитов (e) или из лизата клеток трофобласта (f).

Фигура 6. Влияние МАТ 26.4 на агрегацию тромбоцитов. Образцы крови от НРА-1-генотипированных доноров (n=3 для каждого НРА-1 генотипа) подвергали предварительной инкубации с различными концентрациями 26.4 IgG1 перед добавлением активатора тромбоцитов. Данные по агрегации тромбоцитов для образцов крови, предварительно инкубированных с 26.4, представлены в виде процента от контроля агрегации тромбоцитов.

Фигура 7. Моноцитарный фагоцитоз тромбоцитов, опсонизированных антителаом 26.4. Тромбоциты, полученные от доноров с известным генотипом НРА-1 (n = 3 для каждого генотипа НРА-1), метили CMFDA, сенсибилизировали различными концентрациями 26.4 IgG1 или IgG3, и инкубировали с аутологичными моноцитами. После удаления прикрепившихся тромбоцитов моноциты окрашивали ФЭ-конъюгированными антителами к CD14 и исследовали методом проточной цитометрии. CD14-положительную популяцию пропускали, и процент FITC-положительных моноцитов определяли как фагоцитарную активность (%). Приведенные данные представляют собой среднюю фагоцитарную активность моноцитов от HPA-1a-гомозиготных доноров (фигура 7a) и от HPA-1ab доноров (фигура 7b).

Фигура 8. Типичная гистограмма для фенотипирования HPA-1 методом проточной цитометрии цельной крови с использованием антитела 26.4, конъюгированного с флуоресцентным красителем. Популяция тромбоцитов отсортирована на точечной диаграмме (верхняя панель). Наложение гистограмм показывает типичные результаты для HPA-1a-положительных (заполненный) и HPA-1a-отрицательных тромбоцитов (нижняя панель).

Фигура 9. Препарат МАТ 26.4 имеет линейность и диапазон, сравнимый с коммерчески доступным стандартом NIBSC, поликлональным антителом к HPA-1a. На графиках приведены средние значения оптической плотности для повторных измерений двукратного разведения стандарта NIBSC и предложенных стандартов МАТ 26.4 IgG1 в анализе MAIPA. Линейные участки графиков были использованы для определения активности антител к HPA-1a в образцах.

Фигура 10. Величины активности в отношении HPA-1a образцов А, В, С и D, выраженные в международных единицах на мл (МЕ/мл). Среднее значение активности антитела к НРА-1a для каждого образца и стандартное отклонение (SD) в трех анализах MAIPA рассчитывали, используя NIBSC или моноклональное антитело в качестве стандартов.

Фигура 11. МАТ 26.4 может ингибировать связывание поликлонального IgG к HPA-1a с HPA-1a-гомозиготными тромбоцитами. Тромбоциты НРА-1aa подвергали взаимодействию с различными концентрациями фрагмента F(аb')₂ антитела 26.4 перед добавлением образцов поликлонального IgG к HPA-1a. Связывание IgG к HPA-1a с тромбоцитами измеряли с помощью MAIPA. Величину связывания поликлональных антител, не подвергавшихся ингибированию, принимали в качестве максимального или 100% связывания. Связывание в присутствии фрагмента F(аb')₂ антитела 26.4 представлено в виде процента от максимального связывания. Точки, соединенные черными линиями, представляют собой связывание образцов доноров.

Фигура 12. Реакционная способность мышиных моноклональных антител, специфичных в отношении интегрина β₃, с рекомбинантными пептидами с делецией домена β₃, исследованная методом твердофазного ИФА(ELISA). Представлены типичные результаты двух независимых экспериментов. Подробное описание схемы эксперимента приведено в примере 4.

Фигура 13. Способность моноклональных антител человека, специфичных в отношении HPA-1a, вступать в реакцию с рекомбинантными пептидами с делецией домена β₃, исследованная методом твердофазного ИФА(ELISA). Представлены типичные результаты двух независимых экспериментов. Подробное описание схемы эксперимента приведено в примере 4.

Примеры

Пример 1

Наработка и исследование in vitro нового моноклонального антитела человека, специфичного в отношении HPA-1a

Цель данного исследования заключалась в разработке моноклонального антитела человека, высоко специфичного в отношении HPA-1a, которое будет пригодно для профилактических, терапевтических и скрининговых целей. Существенным преимуществом такого антитела будет высокая аффинность связывания с HPA-1a и минимальная реактивность в отношении аналога НРА-1b. Как описано ниже, полностью человеческое моноклональное антитело было разработано путем иммортализации антигенспецифичных B-клеток памяти от НРА-1a-отрицательной женщины, у которой антитела к HPA-1a начали вырабатываться после иммунизации в связи с несовместимой беременностью (то есть, при которой плод был НРА-1a-положительным).

Материалы и методы

Донорский материал

Периферическую кровь получали от женщины, которая была иммунизирована аллоантигеном HPA-1a при беременности. Она родила двух HPA-1a-положительных детей с тяжелой тромбоцитопенией и подкожными кровоизлияниями. Образец донорской крови брали через 4 недели после родов второго ребенка. Уровень антитела к HPA-1a в плазме крови составил 150 МЕ/мл, согласно результатам количественного измерения путем иммобилизации моноклональных антител на антигенах тромбоцитов (MAIPA) (Kiefel V, Santoso S, Weisheit M, Mueller-Eckhardt C., Blood. 1987;70(6):1722-6).

Выделение В-лимфоцитов памяти

Мононуклеарные клетки периферической крови (МКПК) выделяли с помощью центрифугирования в градиенте плотности с использованием Lymphoprep (Axis-Shield, Данди, Шотландия) в соответствии с инструкциями изготовителя. B-клетки памяти выделяли в соответствии со способом Traggiai et al. (Nat Med. 2004;10(8):871-5). В общих чертах, CD22⁺ клетки, меченые антителом, выделяли с помощью магнитно-активированной сортировки клеток (MACS, Miltenyi Biotech, Германия) и инкубировали с FITC-конъюгированным антителом козы к антителам IgD, IgM и IgA человека (DAKO, Дания). Популяцию клеток CD22⁺ IgD^-IgM^-IgA^-, IgG⁺ B-клетки памяти, выявляли и выделяли с помощью флуоресцентно-активированной сортировки клеток (FACSAria BD Biosciences). Данные проточной цитометрии обрабатывали с помощью программного обеспечения FlowJo (TreeStar, Эшланд, Орегон, США).

Трансформация B-клеток памяти вирусом Эпштейна-Барр (EBV)

Выделенные B-клетки памяти высевали в количестве 400 клеток на лунку в 96-лунучные культуральные планшеты с U-образным дном и культивировали в полной среде (среда Дульбекко, модифицированная по способу Искова (IMDM), 10% ФБС и 100 ед./мл пенициллина, 100 ед./мл стрептомицина) с супернатантом, содержащим EBV, из лимфобластной клеточной линии игрунки B95.8 (номер ATCC: VR-1492) и 0,6 мкг/мл фосфотиоат-CpG, ODN2006, (15) (Integrated DNA technologies, Бельгия) в увлажненной атмосфере при температуре 37 °C, 7,5% СО₂. Через 2 недели культуральные супернатанты исследовали на присутствие HPA-1a-специфичного IgG.

Отбор HPA-1a-специфичных B-лимфобластов

HPA-1a-положительные тромбоциты получали из плазмы, обогащенной тромбоцитами (PRP) (путем осаждения) и метили с использованием эфира карбоксифлуоресцеиндиацетатсукцинимидила (CFSE; Invitrogen, Карлсбад, Калифорния, США). Клетки из B-лимфобластных культур, секретирующих IgG к HPA-1a, окрашивали PerCP-конъюгированным антителом к CD45 (Caltag) и инкубировали с CFSE-мечеными тромбоцитами. НРА-1a-положительные тромбоциты, связывающиеся с В-лимфобластами, сортировали по одной клетке на лунку в 96-луночные культуральные планшеты с U-образным дном с помощью FACS и клонировали в присутствии аллогенных МКПК, обработанных гамма-излучением (10000 клеток на лунку).

Наработка и детектирование гибридом, секретирующих IgG к HPA-1a

Клональные B-лимфобласты гибридизовали с несекретирующей гетеромиеломной клеточной линией мыши-человека K6H6/B5 (номер АТСС: CRL-1823) в соотношении 1:10 с помощью способа перемешивания с использованием полиэтиленгликоля (P7306, Sigma-Aldrich). Гибридные клетки высевали в лунки 48-луночного планшета и культивировали в полноценной среде. Отбор с использованием смеси гипоксантина, аминоптерина и тимидина (HAT, Sigma-Aldrich) начинали через 24 часа после гибридизации клеток и продолжали в течение 7 дней. Супернатанты гибридом подвергали скринингу для выявления IgG к HPA-1a с помощью MAIPA или проточной цитометрии. При использовании MAIPA применяли 50 мкл супернатанта культуры и клон моноклонального антитела мыши к CD61, Y2/51 (Dako, Дания), в качестве захватывающего антитела. При использовании проточной цитометрии 2×10⁶ НРА-1a-положительных тромбоцитов инкубировали с 50 мкл супернатанта культуры клеток, промывали и окрашивали FITC-конъюгированными антителами к IgG человека (Dako, Дания). Положительные культуры дополнительно субклонировали 3 раза, чтобы выделить стабильные гибридомы, секретирующие антитела к HPA-1a. Принадлежность МАТ к определенному подклассу IgG исследовали методом твердофазного ИФА(ELISA). Антитела козы к антителам человека (Caltag) использовали для покрытия планшетов для ИФА (MaxiSorp, Nunc), и биотин-конъюгированные МАТ мыши к IgG1, IgG2, IgG3 и IgG4 человека использовали в качестве детектирующих антител (клоны HP6069, HP6002, HP6047 и HP6025, соответственно, Invitrogen).

Анализ MAIPA

Применяли методику MAIPA, подробно описанную в Killie et al, 2010 (Killie et al. 2010. Quantitative MAIPA: Comparison of different MAIPA protocols. Transfusion and Apheresis Science 43: 149-54). В общих чертах, промытые тромбоциты инкубировали с сывороткой крови человека или МАТ человека с последующей инкубацией с моноклональным антителом к GPIIb-IIIa, клоном Y2/51 (Dako). Тромбоциты затем лизировали, и супернатант добавляли в микропланшет, предварительно покрытый антителом к IgG мыши. Антитела человека, связанные с GPIIb-IIIa, детектировали с помощью меченого антитела к IgG человека и соответствующего субстрата. Стандарт Национального института биологических стандартов и контроля (NIBSC), поликлональное антитело к HPA-1a (Allen D et al. 2005. Collaborative study to establish the first international standard for quantitation of anti-HPA-1a. Vox Sanguinis 89:100-4) использовали для создания линейной калибровочной кривой для количественного определения с помощью MAIPA. Уровни специфичных антител в образцах рассчитывали с использованием линейного уравнения регрессии.

Очистка IgG из супернатанта культуры клеток

Фракцию IgG из супернатанта культуры клеток выделяли путем осаждения 40% сульфатом аммония, затем проводили аффинную хроматографию на белке G (белок G сефароза 4 FastFlow, GE Healthcare). Элюированные IgG подвергали диализу против фосфатно-солевого буфера (ФСБ) и концентрировали с использованием центрифужных фильтрационных устройств Microcon (Ultracel YM-50, Millipore).

Амплификация и секвенирование генов вариабельной области Ig

Общую РНК выделяли из клональных В-лимфобластов с использованием RNeasy Mini Spin (Qiagen, Хилден, Германия). кДНК синтезировали с помощью обратной транскрипции с использованием праймеров, специфичных в отношении константных областей IgG человека. Полученную кДНК использовали в качестве матрицы для полимеразной цепной реакции (ПЦР), чтобы амплифицировать гены вариабельных областей тяжелой цепи и легкой цепи IgG (VH, Vλ и Vκ). Гены амплифицировали в отдельных реакциях ПЦР для отдельных семейств генов тяжелой и легкой цепей, используя смысловой праймер, специфичный в отношении одного из лидерных участков, и антисмысловой праймер для константных областей тяжелых и легких цепей. Продукты ПЦР идентифицировали с использованием 1,5% агарозного геля и клонировали в векторы pCR2.1-TOPO (набор для клонирования ТОРО ТА, Invitrogen) с последующим секвенированием минипрепаратов плазмид (Miniprep kit, QIAGEN). Продукты секвенирования осаждали и исследовали на 3130xl Genetic Analyzer (Applied Biosystems) в коллективном центре секвенирования на факультете медицинских наук, UiT, Арктического университета Норвегии.

Исследование генов и мутаций вариабельной области Ig

Нуклеотидные последовательности исследовали с помощью базы данных Международной информационной системы иммуногенетики (IMGT) генов зародышевой линии человека, используя программу IMGT/V-QUEST, которая доступна на веб-сайте http://www.imgt.org (Brochet X, Lefranc M-P, Giudicelli V. Nucleic Acids Research. 2008;36 (suppl 2):W503-W8). Процесс созревания аффинности (селективное давление антигена) приводит к кластеризации замещающих мутаций (R), в отличие от молчащих (S) мутаций, в пределах гипервариабельных участка (CDR), которые связываются с антигеном. Участки каркаса (FR) поддерживают структуру антитела и накапливают S-мутации, в отличие от R-мутаций. Полиномиальную модель распределения использовали для определения того, увеличивается ли относительная распространенность R-мутаций в CDR и S-мутаций в FR с более высокой скоростью, чем скорость случайного возникновения, предсказанная на основании состава кодонов исходной зародышевой последовательности. Мутации выявляли для каркасных участков (FR) 1, 2 и 3 и гипервариабельных участка (CDR) 1 и 2, и импортировали наряду с зародышевыми последовательностями, соответствующими Ig, в JAVA-апплет в http://www-stat.stanford.edu/immunoglobulin/ для исследования с помощью полиномиальной модели (Lossos IS, et al.. J Immunol. 2000;165(9):5122-6).

Получение рекомбинантных антител IgG1 и IgG3 к HPA-1a

Синтез генов тяжелых и легких цепей антитела 26.4

Гены вариабельной области тяжелой и легкой цепей, кодирующие антитело 26.4, были синтезированы в компании GenScript (Пискатауэй Нью-Джерси, США) с оптимизацией использования кодонов в синтезированных генах для получения высокого уровня экспрессии антитела в клетках человека. Были синтезированы два варианта гена тяжелой цепи 26.4 с использованием константных областей γ1 и γ3 тяжелой цепи. Сайты распознавания ферментами рестрикции Esp3I и EcoRI встраивали во фланкирующие области синтезированных генов для последующего использования в клонировании генов в вектор pFRIDA (модифицированный вектор pLNO - Norderhaug L et al., J Immunol Methods 204: 77-87).

Клонирование генов

Каждый из генов 26.4 поставлялся в векторе pUC57. Вектор pUC57, содержащий синтезированный ген, расщепляли ферментами рестрикции Esp3I и EcoRI (Fermentas, Берлингтон, Канада), и фрагмент ДНК, соответствующий размеру тяжелой или легкой цепей, выделяли с помощью электрофореза в агарозном геле с использованием набора Qiagen Gelelute (Qiagen, Германия). Вектор для клонирования pFRIDA обрабатывали аналогичным образом, путем расщепления ферментами рестрикции Esp3I и EcoRI, с последующим выделением расщепленного вектора с помощью электрофореза в агарозном геле. Расщепленные гены лигировали в линеаризованный вектор с использованием ДНК-лигазы Т4 (NEB, США), и затем трансформировали в компетентные клетки XL-10 GOLD (Stratagene, США). Трансформированные клетки отбирали на агаре для размножения, содержащем ампициллин. Бактериальные колонии отбирали путем размножения в течение 14 часов в жидких средах, содержащих ампициллин, и векторную ДНК выделяли с использованием набора для выделения минипрепаратов плазмид. Наличие правильной вставки в векторной ДНК проверяли с помощью ферментов рестрикции.

Кратковременная трансфекция клеток HEK293E для экспрессии антитела 26.4

Пять миллионов клеток HEK293E добавляли к 25 мл среды DMEM (BE12-614F, Lonza), дополненной 10% ФБС и 4 мМ L-глутамина. Среду, содержащую клетки, переносили в стандартную колбу для клеточных культур (T75) и инкубировали в течение 18 ч в увлажненной атмосфере при 37 °C, 5% СО₂. Смесь для трансфекции готовили путем добавления в пробирку 5 мкг векторной ДНК (0,1 мкг/мл), экспрессирующей желаемую легкую цепь антитела 26.4, 5 мкг векторной ДНК (0,1 мкг/мл), экспрессирующей желаемую тяжелую цепь антитела 26.4 (γ1 или γ3) и 375 мкл RPMI. Смесь подогревали до 80 °C и охлаждали до 4 °C. Одновременно нагревали полиэтиленимин макс (PEI Max, 2 мг/мл; 24765-2, Polysciences Inc.), но охлаждали до комнатной температуры, чтобы предотвратить выпадение в осадок. Отбирали 65 мкл раствора PEI и добавляли к смеси для трансфекции, после этого пробирку инкубировали при комнатной температуре в течение 8 мин. Затем в пробирку вносили среду DMEM (10% ФБС, 4 мМ L-глутамина) (3375 мкл). Среду из колбы для клеточных культур с прикрепленными клетками HEK293E удаляли и заменяли реакционной смесью. Реакционную смесь оставляли для покрытия клеток в течение 2-х часов перед добавлением 25 мл среды DMEM, дополненной 10% ФБС и 4 мМ L-глутамина. Трансфецированные клетки культивировали в течение 2-5 дней перед сбором супернатанта и его исследованием для определения выработки IgG. Концентрацию IgG1 и IgG3 человека в образцах измеряли методом твердофазного ИФА(ELISA), используя антитела козы к Fc IgG человека (Sigma) в качестве покрытия, и ЩФ-конъюгированные антитела козы к Fc IgG человека (Sigma) в качестве антител для детектирования. IgG1 и IgG3 человека (I 5154 и I 5654, соответственно, Sigma) использовали в качестве внутренних стандартов.

Исследование методом поверхностного плазмонного резонанса (SPR)

Технологию SPR использовали для оценки связывающих свойств МАТ (устройство Biacore T200, Biacore AB, Уппсала, Швеция). Интегрин αIIbβ3 выделяли из тромбоцитов НРА-1aa и HPA-1bb с помощью аффинной хроматографии, как описано ранее (Bakchoul T, Meyer O, Agaylan A, Bombard S, Bein G, Sachs UJH, et al. Transfusion. 2007;47(8):1363-8), с использованием колонки с сефарозой (CNBr-активированная сефароза Fast Flow 4, GE Healthcare), связанной с МАТ мыши к β3 (клон АР3, номер АТСС: НВ-242). Интегрин αVβ3 получали от Millipore (каталожный номер CC1018). Интегрин αVβ3 очищали из плаценты человека с помощью аффинной хроматографии с использованием иммобилизованных моноклональных антител к интегрину αVβ3. Экстракт ткани, полученный с помощью обработки детергентом, который наносили на колонку, получали, как описано ранее (Belkin VM, Belkin AM, Koteliansky VE., The Journal of Cell Biology, 1990; 111(5):2159-70). Очищенные интегрины αIIbβ3 (варианты, несущие антиген HPA-1a и HPA-1b) и αVβ3 иммобилизовали на поверхности сенсорного чипа CM5 на трех различных проточных ячейках (FC) при плотности 400, 340 и 480 единиц отклика (RU), соответственно, с использованием стандартных реагентов для связывания аминогрупп. Проточные ячейки, обработанные аналогичными химическими веществами, но не содержащие белка, использовали в качестве эталонной поверхности. Очищенные образцы моноклональных IgG (различные концентрации) впрыскивали на поверхность чипа при скорости потока 30 мкл/мин. Стадия ассоциации составила 120 с последующей стадией диссоциации продолжительностью 120 с. Регенерацию поверхности сенсорного чипа осуществляли с использованием 10 мМ глицин-HCl (рН=1,5). Эксперименты проводили при температуре 25 °C. Собранные данные обрабатывали с помощью программного обеспечения BIAevaluation 2.0.1. Количество иммобилизованного интегрина β₃, доступного для связывания антител, измеряли с помощью впрыскивания МАТ к β₃ (клон SZ21) в концентрации 20 мкг/мл. Величина зарегистрированного сигнала составила приблизительно 80 RU на чипе с иммобилизованным αIIbβ3 (фигура 4b) и 25 RU на чипе с иммобилизованным αVβ3 (данные не представлены). Все химические вещества для экспериментов на устройстве Biacore были приобретены у компании GE Healthcare.

Исследование ингибирования связывания антитела методом проточной цитометрии

Способность МАТ 26.4 ингибировать связывание МАТ SZ21 с эпитопом HPA-1a оценивали с использованием гранул, опосредованно связанных с интегрином β₃, и сопоставляли с величинами для ранее описанного рекомбинантного антитела к HPA-1a, B2G1 (Garner, et al., (2000), British Journal of Haematology 108: 440-7; Griffin H, et al., (1995), Blood 86: 4430-6). Гранулы Dynabeads M-270 Epoxy (Life Technologies) сначала связывали с антителом к интегрину β₃ (клон EPR2417Y, специфичный в отношении C-концевой части интегрина β₃ (Abcam, Кембридж, Англия)), в соответствии с инструкциями изготовителя. Затем гранулы инкубировали с лизатом клеток из линии клеток трофобласта, экспрессирующей интегрин β3 (TCL-1 (Lewis MP, et al. (1996), Placenta 17: 137-46); генотип НРА-1aa) или лизатом тромбоцитов из HPA-1a-положительных тромбоцитов в течение ночи при 4 °C, чтобы обеспечить связывание интегрина β₃ из лизатов клеток. Гранулы промывали буфером RIPA (Sigma) и инкубировали с различными количествами (12,5 нг, 25 нг, 50 нг, 100 нг и 200 нг) 26.4 и B2G1 в буфере RIPA в течение 15 мин при комнатной температуре. Указанные количества антитела инкубировали с гранулами в общем объеме 200 мкл. Концентрации составили, следовательно, 62,5, 125, 250, 500 и 1000 нг/мл, соответственно. После этапа промывки гранулы инкубировали с 5 мкл FITC-конъюгированного МАТ SZ21 (Beckman Coulter) в 200 мкл суспензии гранул в течение 15 мин при комнатной температуре в темноте. После этапа промывки гранулы повторно суспендировали в ФСБ и исследовали методом проточной цитометрии.

Агрегометрия тромбоцитов (многопланшетная)

Импедансную агрегометрию тромбоцитов использовали для оценки влияния МАТ на агрегацию тромбоцитов (многопланшетный анализатор, Roche, Базель, Швейцария). Участники исследования (n=3 для каждого генотипа HPA-1) являлись здоровыми добровольцами с известным генотипом HPA-1, которые не принимали каких-либо лекарственных средств, влияющих на функцию тромбоцитов в течение 10 дней до сбора крови. Образцы цельной крови отбирали с помощью периферической венепункции в 3 мл пробирки, содержащие рекомбинантный гирудин в качестве антикоагулянта. Кровь хранили при комнатной температуре, и измерения проводили в течение 2 ч с момента забора крови. Образцы крови объемом 480 мкл инкубировали с различными концентрациями МАТ (объем 20 мкл) в течение 5 мин перед добавлением активатора тромбоцитов, активированного пептида-агониста рецептора тромбина 6 (TRAP-6). Образцы крови с добавлением 20 мкл буфера ФСБ использовали для определения индивидуальной функции тромбоцитов, индуцированной TRAP-6. Для того чтобы проверить влияние антитела 26.4 на агрегацию тромбоцитов без активатора тромбоцитов, вместо TRAP-6 использовали 0,9% раствор хлорида натрия. Агрегацию непрерывно регистрировали в течение 6 мин в двух независимых ячейках измерения на один тест. Увеличение импеданса вследствие прикрепления тромбоцитов к электродам детектировали и преобразовывали в относительные единицы агрегации (АС), которые представляли в графической форме в виде зависимости от времени. Агрегацию количественно оценивали по площади под кривой (AUC) в единицах агрегации (AU×мин). Количество тромбоцитов в образцах крови измеряли с помощью гематологического анализатора Sysmex XN-1000.

Оценка фагоцитоза тромбоцитов, опосредованного антителами к HPA-1a, с помощью исследования моноцитов

Лейкоцитарную пленку разводили в фосфатно-солевом буфере (ФСБ) в соотношении 1:4 и наслаивали на среду Lymphoprep (Axis-Shield, Данди, Великобритания), и затем центрифугировали в течение 15 мин при 700g без стопора. Суспензию на границе раздела фаз собирали и добавляли 40 мл 0,2% ФСБА (0,2% бычьего сывороточного альбумина в ФСБ). МКПК осаждали центрифугированием при 300 g в течение 6 минут. Тромбоциты осаждали из супернатанта центрифугированием при 2000 g в течение 6 минут и ресуспендировали в 0,2% ФСБА+0,3% ЭДТА. Моноциты выделяли из МКПК с использованием коктейля для обогащения препарата моноцитами человека RosetteSep (StemCell Technologies, Ванкувер, Канада), как описано ранее (Ahlen MT, Husebekk A, Killie MK, Skogen B, Stuge TB. Blood. 2009;113(16):3838-44) и корректировали количество клеток до 2×10⁶ клеток/мл в 10% ФБС-IMDM (BE12-722F, Lonza).

В объеме 1 мл 10⁸ тромбоцитов метили CellTracker Green CMFDA (диацетат 5-хлорметилфлуоресцеина, C7025, Invitrogen) в конечной концентрации 0,25 мкМ в соответствии с инструкциями изготовителя. Количество тромбоцитов, меченых CMFDA, доводили до 2×10⁸/мл в 0,2% ФСБА+0,3% ЭДТА, и 50 мкл инкубировали с различными концентрациями моноклональных IgG человека к HPA-1a в течение 20 мин при комнатной температуре. После промывки в дублирующиеся пробирки добавляли 50 мкл моноцитов, в результате чего общий объем составил 100 мкл и соотношение тромбоцитов и моноцитов составило 100:1, и инкубировали при 37 °C в увлажненной атмосфере 7,5% СО₂ в течение 2 ч. Моноциты осаждали центрифугированием при 300 g и инкубировали с раствором 0,25% трипсина/ЭДТА (T4049, Invitrogen) в течение 2 мин при 37 °C для удаления внеклеточных прикрепившихся тромбоцитов. После этапа промывки клетки окрашивали ФЭ-конъюгированными антителами к CD14 (Invitrogen) и исследовали методом проточной цитометрии. IgG1 и IgG3 человека с нецелевой специфичностью использовали в качестве отрицательных контролей исследования.

Статистическая обработка

Программное обеспечение Sigma Plot, версия 12.5 (Сан-Хосе, Калифорния, США), использовали для представления экспериментальных данных по агрегации и фагоцитозу. Программное обеспечение GrapHPAd Prism 5 (Сан-Диего, Калифорния, США) использовали для представления данных исследования ингибирования связывания антитела методом проточной цитометрии.

Этические стандарты

Исследование было одобрено Региональным комитетом по этике медицинских исследований, Северной Норвегии (одобрение №:2009/1585 и 2013/126/REK). Все добровольцы, которые были донорами образцов крови, подписали письменное информированное согласие (банк крови университетской больницы Северной Норвегии).

Результаты

Моноклональные IgG, специфичные к HPA-1a, получали путем иммортализации HPA-1-специфичных B-клеток памяти

Было высказано предположение, что B-клетки, продуцирующие антитела IgG, специфичные к HPA-1a, могут присутствовать в повышенных количествах в кровотоке женщин, родивших ребенка, страдающего FNAIT, и что антитело, полученное из одной HPA-1a-специфичной B-клетки, может обеспечить неограниченный источник моноклональных антител с указанным видом специфичности. Для того чтобы выделить НРА-1a-специфичные IgG⁺ B-клетки, сначала выделяли МКПК у женщины, иммунизированной аллоантигеном НРА-1a. Кровь отбирали через 4 недели после родов ребенка, страдающего FNAIT. Для обогащения B-клетками, приблизительно 40 миллионов МКПК приводили в контакт с моноклональным антителом, специфичным в отношении универсального маркера B-клеток, CD22, и очищали сенсибилизированные клетки от остальных МКПК с помощью магнитно-активированной сортировки клеток (MACS). Было выделено приблизительно 3 миллиона CD22⁺ B-клеток. Для обогащения популяции IgG⁺ B-клетками, CD22⁺ клетки приводили в контакт с флуороформечеными поликлональными антителами к изотипам IgM, IgA и IgD (IgMAD) человека, и клетки IgMAD^- выделяли с помощью флуоресцентно-активированной сортировки клеток (FACS). Количество клеток IgMAD^- составило 5,6% от CD22⁺ клеток. (фигура 1a). В отдельном эксперименте было показано, что популяция IgMAD^- CD22⁺ клеток состоит в основном из IgG⁺ клеток (данные не приведены). Приблизительно 10⁵ клеток выделяли с помощью FACS. Стратегия выделения НРА-1a-специфичных B-клеток из клеток, выделенных с помощью FACS, заключалась в иммортализации отсортированных клеток путем трансформации вирусом Эпштейна-Барр (EBV), и скрининга трансформированных клеток, вырабатывающих антитела к HPA-1a. В этой связи отсортированные клетки обрабатывали культуральным супернатантом, содержащим EBV в присутствии поликлонального активатора B-клеток памяти, олигонуклеотида CpG (CPG 2006), для усиления трансформации, и распределяли в 240 лунок (приблизительно по 400 клеток на лунку) на планшетах для микротитрования. Через 2 недели 27 культур B-лимфобластов, содержащих НРА-1a-специфичные антитела, выявляли с помощью MAIPA. Через 7 дополнительных дней культивирования только половина культур В-лимфобластов сохранила выработку специфичных антител. Клетки из культуры, секретирующие наибольшее количество антител IgG к HPA-1a, инкубировали с CFSE-мечеными НРА-1a-положительными тромбоцитами. CFSE-положительные лимфобласты, 120 клеток, выделяли индивидуально с помощью FACS (фигура 1b) и размножали в культуре. Следует отметить, что был обнаружен высокий уровень неспецифичного связывания тромбоцитов с НРА-1a-отрицательными В-лимфобластами, использованными в качестве отрицательного контроля; отрицательный контроль имел почти такую же частоту CFSE-положительных лимфобластов (данные не приведены). После 3 недель размножения была выявлена одна клональная В-лимфобластная культура, секретирующая НРА-1a-специфичные антитела, и был создан клон D18BL26.4 (также называемый в настоящей заявке 26.4 или МАТ 26.4). Антитело 26.4 специфично связывалось с НРА-1a-положительными тромбоцитами (фигура 2a и 2b). Линию гибридомных клеток, D18BL26.4H, секретирующих IgG к HPA-1a, получали путем гибридизации клеток из 26.4 В-лимфобластов с гетеромиеломными клетками (как описано в методическом разделе). С помощью ИФА было обнаружено, что секретированный IgG относится к подклассу IgG3.

Амплификация гена вариабельной области Ig и исследование последовательностей

Для исследования клональности линии клеток D18BL26.4 и амплификации последовательностей генов вариабельной области Ig, сначала выделяли мРНК и синтезировали кДНК с помощью обратной транскрипции, используя праймеры, специфичные к константных областей IgG человека. Полученную кДНК использовали в качестве матрицы для амплификации генов вариабельных областей тяжелой цепи и легкой цепи IgG (VH, Vλ и Vκ) в отдельных ПЦР-реакциях для каждого семейства генов. Два амплифицированных продукта ПЦР размером приблизительно 400 п.н. соответствовали семействам генов VH6 и VK3, подтверждая клональность клеток (данные не приведены). Продукты ПЦР секвенировали, и исследование последовательностей генов вариабельных областей Ig позволило выявить наиболее родственные известные гены зародышевой линии и генные сегменты V, D и J, используемые при соматической рекомбинации (фигура 3). Для получения тяжелой цепи использовали сегменты генов IGHV6-1*01, IGHD6-13*01 и IGHJ6*02, и для получения легкой цепи использовали IGKV3-11*01 и IGKJ4*01.

Рекомбинантное МАТ 26.4 специфично и прочно связывается с антигеном НРА-1a

Чтобы облегчить исследование функции МАТ 26.4 с различными изотипами Ig, ген, кодирующий вариабельную область тяжелой цепи Ig в клетках D18BL26.4, комбинировали с константными доменами IgG1 (26.4G1) и IgG3 (26.4G3) в различных конструкциях для экспрессии. Ген вариабельной области легкой цепи комбинировали с константным доменом каппа-1 цепи в третьей конструкции. Конструкции, содержащие одну тяжелую цепь и легкую цепь, экспрессировали в клетках HEK293E после кратковременной трансфекции. Как правило, трансфецированные культуры вырабатывали 26.4G₁ и 26.4G₃ в супернатанты в концентрации 20-50 мкг/мл и 5-20 мкг/мл, соответственно, согласно результатам измерения методом твердофазного ИФА(ELISA). Моноклональные антитела 26.4G1 и 26.4G3, идентичные исходному антителу 26.4, специфично связывались с HPA-1a-положительными интактными тромбоцитами в исследовании методом проточной цитометрии и MAIPA (фигуры 2a и 2b). Не было обнаружено связывания с HPA-1a-отрицательными тромбоцитами. Все последующие эксперименты выполняли с использованием рекомбинантного 26.4, в частности, его варианта 26.4G1, если не указано иное.

Антитело 26.4 специфично связывалось с HPA-1a-положительными интактными тромбоцитами при исследовании методом проточной цитометрии (FC) и MAIPA. Не было обнаружено специфичного связывания с HPA-1a-отрицательными тромбоцитами.

Для более чувствительной оценки специфичности связывание антитела 26.4 с очищенным тромбоцитарным интегрином αIIbβ3 измеряли методом поверхностного плазмонного резонанса (SPR). В системе для оценки поверхностного плазмонного резонанса (SPR) антитело 26.4 связывалось исключительно с αIIbβ3 от HPA-1aa-положительных индивидуумов; отсутствовало измеримое связывание с НРА-1a-отрицательным αIIbβ3 (фигура 4a). Быстрая ассоциация и медленная диссоциация указывают на то, что 26.4 прочно связывается с антигеном НРА-1a. Связывающие свойства рекомбинантных антител 26.4 были идентичны таковым для препарата, секретированного клетками гибридомы (данные не приведены).

Также было проведено сравнение связывающих свойств 26.4 и МАТ, специфичного в отношении HPA-1a человека, клона B2G1, также полученного с помощью фагового дисплея от женщины, аллоиммунизированной при беременности (Griffin H, Ouwehand W., Blood. 1995; 86(12):4430-6). Аналогичные кривые ассоциации и диссоциации для 26.4 и B2G1 указывают на то, что аффинность двух моноклональных антител находится в аналогичном диапазоне (фигура 5a). Аффинность связывания B2G1 с рекомбинантным αIIbβ3 измеряли ранее, K_D = 6×10^-8 (Santoso S, Kroll H, Andrei-Selmer CL, Socher I, Rankin A, Kretzschmar E, et al. Transfusion. 2006;46(5):790-9).

Далее была проведена оценка связывающих свойств и специфичности ранее описанного мышиного моноклонального антитела, клона SZ21 (Weiss EJ, Goldschmidt-Clermont PJ, Grigoryev D, Jin Y, Kickler TS, Bray PF. Tissue Antigens. 1995;46(5):374-81). Антитело SZ21 связывалось с НРА-1a-положительным и отрицательным интегрином αIIbβ3, тем не менее, оно имело более высокую аффинность в отношении HPA-1a, поскольку указанное антитело медленнее связывалось и быстрее диссоциировало от НРА-1a-отрицательного интегрина (фигура 4b). Описанный характер связывания указывает на то, что SZ21 является псевоспецифичным в отношении HPA-1a.

Моноклональное антитело 26.4 обладает уникальным характером связывания с интегрином αVβ3

Поскольку интегрин β3 также является частью рецептора витронектина (αVβ3), исследовали способность HPA-1a-специфичных моноклональных антител 26.4 и B2G1 связываться с очищенным αVβ3. Источник и способ очистки интегрина αVβ3 описан выше. Оба моноклональных антитела связывались с поверхностью сенсорного чипа, покрытой αIIbβ3 (HPA-1a) и αVβ3 (фигура 5a и 5b). Однако связывание 26.4 с αIIbβ3 на 10% превышало связывание B2G1. Неожиданным фактом явилось то, что различие в связывании было более значительным на поверхности, связанной с αVβ3: величина связывания 26.4 на 42% превышала связывание B2G1 (фигура 5c).

Оба МАТ диссоциировали от αIIbβ3 почти с одинаковой скоростью; приблизительно 81% антител 26.4 и B2G1 оставались связанными в конце периода диссоциации. Однако антитело B2G1 диссоциировало от αVβ3 на 50% быстрее, чем антитело 26.4; 31,4% B2G1, по сравнению с 66,8% для антитела 26.4, оставались связанными в конце периода диссоциации (фигура 5d).

Различие не связано с потерей антигена во время процедуры регенерации, поскольку образцы B2G1 исследовали перед образцами 26.4 на поверхностях, связанных с αIIbβ3 (фигура 5a) и αVβ3 (фигура 5b). Результаты также были получены с использованием различных концентраций антител, 20, 10 и 5 мкг/мл (приведены данные только для 20 мкг/мл), и аналогичные результаты были получены с использованием сенсорного чипа, связанного с более высокими концентрациями интегринов (данные не приведены).

Дополнительные данные по ассоциации/диссоциации приведены в таблице 2

Таблица 2. Исследование связывания МАТ 26.4 и B2G1 с иммобилизованными интегринами αIIbβ3 и αVβ3 с помощью SPR.

	26.4	B2G1
Интегриновый комплекс	Связанное МАТ (RU)	Кол-во связанного МАТ после диссоциации (RU)	Диссоциация (%)	Связанное МАТ (RU)	Кол-во связанного МАТ после диссоциации (RU)	Диссоциация (%)
αIIbβ3	63,1	49,6	21,4	56,1	43,8	22
αVβ3	18,8	12,2	35,1	11,2	3,3	70,5

Вследствие наблюдаемых различий в связывании с αVβ3, исследовали относительную эффективность 26.4 и B2G1 в ингибировании связывания третьего МАТ к HPA-1a, SZ21, с αIIbβ3 и αVβ3 (фигура 5e и 5f). В этой серии экспериментов МАТ 26.4 было более эффективным, чем B2G1 в ингибировании связывания SZ21 с гранулами, связанными с αVβ3 из трофобласта (фигура 5f). Для сравнения, наблюдали незначительное различие в эффективности двух МАТ (26.4 и B2G1) в ингибировании связывания SZ21 с гранулами, связанными с αIIbβ3 из тромбоцитов (фигура 5е). В этой связи, несмотря на то, что МАТ 26.4 и B2G1, очевидно, аналогично связываются с HPA-1a на интегрине αIIbβ3, они различаются по эффективности связывания с интегрином αVβ3.

Моноклональное антитело 26.4 обладает ингибирующим действием на агрегацию тромбоцитов

Поскольку гетеродимер интегрина αIIbβ3 является рецептором фибриногена на тромбоцитах, оценивали влияние 26.4 на агрегацию тромбоцитов (фигура 6). Антитело 26.4 ингибировало агрегацию тромбоцитов НРА-1aa в зависимости от концентрации: 15, 35 и 80% ингибирование наблюдали при концентрации 2, 6 и 12 мкг/мл, соответственно, по сравнению с контролем агрегации. Контроль агрегации представлял собой агрегацию тромбоцитов индивидуума, индуцированную TRAP 6. Агрегацию тромбоцитов индивидуума принимали за 100%. При самой низкой концентрации МАТ ингибирование агрегации тромбоцитов HPA-1ab было сопоставимо с таковым для HPA-1aa. МАТ в концентрации 6 и 12 мкг/мл в равной степени ингибировало агрегацию тромбоцитов HPA-1ab на 20%. Важно отметить, что не было обнаружено значимого влияния 26.4 на агрегацию тромбоцитов HPA-1bb. Антитело 26.4 не влияло на функцию тромбоцитов при измерении агрегации в образцах без активатора тромбоцитов (данные не приведены). Количество тромбоцитов в образцах с МАТ, добавленным в различных концентрациях, не отличалось от контрольных образцов без МАТ для каждого участника (данные не приведены). Уменьшение агрегации тромбоцитов, следовательно, связано исключительно с ингибированием функции тромбоцитов.

Моноклональное антитело 26.4 эффективно индуцирует фагоцитоз тромбоцитов

Чтобы оценить способность 26.4 индуцировать фагоцитоз тромбоцитов, свежевыделенные моноциты инкубировали с 26.4-сенсибилизированными CFSE-мечеными тромбоцитами, и измеряли количество моноцитов с фагоцитированными тромбоцитами методом проточной цитометрии. Моноклональное антитело 26.4 индуцировало фагоцитоз сенсибилизированных HPA-1a-гомозиготных тромбоцитов в зависимости от концентрации (фигура 7a). Действие моноклонального антитела 26.4IgG1 было аналогично таковому 26.4IgG3. В концентрациях 10, 1 и 0,1 мкг/мл антитела индуцировали приблизительно 90, 70 и 30% фагоцитоз, соответственно. Полученные процентные значения фагоцитоза представляют собой процент моноцитов, которые интернализировали тромбоциты. Фагоцитарная активность была близка к 10% при использовании 0,01 мкг/мл антитела, а также в отрицательных контролях. Фагоцитарная активность тромбоцитов HPA-1ab была приблизительно на 20% ниже по сравнению с тромбоцитами HPA-1aa (фигура 7b). Антитела не влияли на фагоцитоз сенсибилизированных HPA-1a-отрицательных тромбоцитов. Не было обнаружено синергического действия при исследовании смеси 26.4IgG1 и 26.4IgG3 в соотношении 1:1 в аналогичных экспериментах (данные не приведены).

Обсуждение

В исследовании, описанном в настоящей заявке, рекомбинантное моноклональное антитело, специфичное в отношении HPA-1a, получали из одной B-клетки памяти. Указанную B-клетку выделяли у женщины, которая, как известно, была иммунизирована НРА-1a в связи с беременностью. Полученное антитело, клон 26.4, успешно рекомбинантно экспрессировали с помощью кратковременной трансфекции клеток человека. Было установлено, что 26.4 прочно связывается с HPA-1a и обладает высокой специфичностью; не было обнаружено реактивности в отношении аллотипа HPA-1b. Антитело также обладает лишь незначительным ингибиторным действием на агрегацию тромбоцитов HPA-1ab и может опсонизировать тромбоциты для усиления фагоцитоза моноцитами. Следовательно, моноклональное антитело 26.4 является перспективным для профилактики FNAIT и фенотипирования HPA-1a.

С помощью чувствительных анализов связывания в настоящей заявке было показано отсутствие измеримой перекрестной реактивности МАТ 26.4 с нативным аллотипом НРА-1b. Не желая быть связанными какой-либо теорией, авторы настоящего изобретения полагают, что этот факт может быть обусловлен отбором антитела иммунной системой человека. Различие между аллотипами HPA-1 заключается в одной аминокислоте, которая представляет собой лейцин в HPA-1a. Моноклональное антитело 26.4, очевидно, не связывается с лейцином по отдельности. Ввиду этого, одно из вероятных объяснений заключается в том, что антитело обладает аффинностью в отношении участка поверхности, который является общим для обоих аллотипов, и что аллогенный лейцин приводит к возникновению различия между стабильным связыванием в случае его присутствия, и отсутствию связывания без него. В другом варианте различие по одной аминокислоте может быть связано с конформационным изменением, которое в действительности создает новый эпитоп, с которым может связываться антитело. В любом из указанных выше случаев отбор в условиях in vivo и созревание аффинности в B-клетке, из которой получено МАТ 26.4, вероятно привели к возникновению самой высокой аффинности связывания с аллоантигеном, при одновременном сохранении низкой перекрестной реактивности с аутологичным аналогом HPA-1b. При разработке антител к HPA-1a путем иммунизации мышей, аналогичное давление, необходимое для того чтобы отобрать антитело с минимальной перекрестной реактивностью с HPA-1b, будет отсутствовать. Этот факт согласуется с наблюдаемой в настоящей заявке значительной перекрестной реактивностью антитела SZ21 с HPA-1b, в то время для МАТ 26.4 такая перекрестная реактивность не была обнаружена. Не желая быть связанными какой-либо теорией, авторы настоящего изобретения полагают, что антитела к HPA-1a, которые способны перекрестно реагировать с антигеном HPA-1b (например, антитело SZ21), могут вызвать нежелательные иммунные реакции у матери, например, ускорить удаление материнских тромбоцитов НРА-1bb из кровотока, вызывая тем самым тромбоцитопению.

Агрегация тромбоцитов является центральным звеном в гемостазе и тромбозе, и интегрин αIIbβ3 играет критическую роль в ней. Предыдущие исследования показали, что антитела к HPA-1a оказывали ингибиторное действие на агрегацию тромбоцитов и адгезию αIIbβ3 и αVβ3-трансфецированных клеток СНО на фибриногене (Joutsi-Korhonen L, Preston S, Smethurst PA, Ijsseldijk M, Schaffner-Reckinger E, Armour KL, et al. Thrombosis and Haemostasis. 2004;91(4):743-54, и Kroll H, Penke G, Santoso S. Thrombosis and Haemostasis. 2005;94(12):1224-9).

Механизм разрушения тромбоцитов плода под действием материнских антител к HPA-1a не до конца понятен. Не желая быть связанными какой-либо теорией, авторы настоящего изобретения полагают, что тромбоциты плода, сенсибилизированные IgG, выводятся из кровотока через FcγR-опосредованный фагоцитоз мононуклеарными фагоцитами в селезенке и печени и, возможно, гранулоцитами. Одним из вариантов применения МАТ к HPA-1a является профилактика аллоиммунизации HPA-1a. Одним из предложенных механизмов предотвращения иммунизации антигеном RhD является удаление эритроцитов плода из кровотока матери посредством фагоцитоза эритроцитов, опсонизированных IgG к RhD. Аналогичным образом, также не желая быть связанными соответствием какой-либо теории, авторы настоящего изобретения предположили, что иммунизация НРА-1a может быть предотвращена с помощью антител к HPA-1a путем сенсибилизации тромбоцитов плода, которые затем будут удалены фагоцитами из материнского кровотока. Используя экспериментальную систему человека в условиях in vitro, авторы настоящего изобретения показали, что МАТ 26.4 (IgG1 и IgG3) может индуцировать фагоцитоз НРА-1a-положительных тромбоцитов.

Как было описано выше, заметное различие между антителом 26.4 и антителом B2G1 заключается в том, что 26.4 более устойчиво связывается с αVβ3, полученным из трофобласта, и является более эффективным в ингибировании связывания антител к HPA-1a (SZ21) с αVβ3. С точки зрения профилактического и терапевтического потенциала, стабильное связывание с HPA-1a на трофобластах может быть выгодным свойством. Как полагают, HPA-1a на αVβ3, который экспрессируется на клетках трофобласта, может инициировать аллоиммунную реакцию у матери (Vanderpuye OA, et al., (1991), Biochem J 280 (Pt 1): 9-17; Kumpel et al. (2008), Transfusion 48: 2077-86). Не желая быть связанными какой-либо теорией, авторы настоящего изобретения полагают, что стабильное связывание 26.4 с αVβ3, полученным из плаценты, может ускорить удаление клеток и материала, экспрессирующего этот антиген, из кровотока матери и предотвратить тем самым аллоиммунизацию. Также не желая быть связанными соответствием какой-либо теории, авторы настоящего изобретения полагают, что дополнительный механизм может заключаться в маскировке эпитопов и фактическом предотвращении связывания НРА-1a-специфичных B-клеток с антигеном, предотвращая тем самым их активацию. Удаление из кровотока также может предотвратить активацию указанных B-клеток.

В заключение следует отметить, что авторы настоящего изобретения разработали новое HPA-1a-специфичное антитело, полученное из отдельной B-клетки женщины, иммунизированной аллоантигеном HPA-1a при беременности. Антитело не имеет детектируемой перекрестной реактивности с аллотипом HPA-1b. Рекомбинантный вариант указанного антитела можно применять в качестве диагностического реагента для выявления индивидуумов, подверженных риску иммунизации НРА-1a, а также в качестве профилактического реагента для предотвращения FNAIT и/или в качестве терапевтического средства для лечения FNAIT.

Пример 2

Новое рекомбинантное моноклональное HPA-1a-специфичное антитело человека является подходящим инструментом для диагностики аллоиммунной тромбоцитопении плода и новорожденного

Введение

В настоящее время не существует безопасного и эффективного способа профилактики или лечения указанного состояния, и в большинстве случаев FNAIT диагностируют после рождения ребенка с сильной тромбоцитопенией. Важно выявить женщин с повышенным риском иммунизации, которые могут получить пользу от профилактического лечения.

В нескольких проспективных исследованиях было установлено, что высокие уровни материнских антител к HPA-1a коррелируют с низким количеством тромбоцитов у новорожденных. Следовательно, определение количества антител к HPA-1a можно использовать в качестве прогностического фактора степени тромбоцитопении у новорожденных. Используемый в настоящее время эталонный материал для количественного определения антител к HPA-1a был получен Национальным институтом биологических стандартов и контроля (NIBSC). Стандарт NIBSC содержит плазму от шести доноров, иммунизированных HPA-1a, и его поставка зависит от присутствия таких доноров.

В настоящем исследовании было получено новое HPA-1a-специфичное рекомбинантное моноклональное антитело человека, клон 26.4. Указанное моноклональное антитело можно применять в качестве реагента для фенотипирования НРА-1, а также в качестве стандарта для количественного определения антител к HPA-1a.

Цель данного исследования состояла в том, чтобы оценить, может ли МАТ, специфичное в отношении HPA-1a человека, клон 26.4, обеспечить различение антигенов HPA-1a и HPA-1b в исследовании методом проточной цитометрии цельной крови. Вторая цель состояла в том, чтобы оценить возможность использования указанного моноклонального антитела в качестве стандарта для анализа MAIPA.

Материалы и методы

Образцы донорской крови

Периферическую кровь получали от случайных здоровых добровольцев-доноров крови, согласившихся предоставить образцы, которые могут быть использованы для исследовательских целей (банк крови университетской больницы Северной Норвегии). Женщины, иммунизированные HPA-1a, сдавали кровь после подписания письменного информированного согласия (исследование было одобрено Региональным комитетом по этике медицинских исследований Северной Норвегии, одобрение №2009/1585).

Антитела

HPA-1a-специфичное МАТ IgG1, клон 26.4, получали путем иммортализации антиген-специфичных B-клеток памяти от женщины, иммунизированной HPA-1a в связи с беременностью, и рекомбинантно экспрессировали. IgG1 очищали из супернатанта культуры клеток осаждением 40% сульфатом аммония и затем выделяли с помощью аффинной хроматографии на белке G (белок G-сефароза 4 FastFlow, GE Healthcare).

Международный эталонный реагент, установленный ВОЗ для количественного определения антител к HPA-1a получали из Национального института биологических стандартов и контроля (NIBSC, код 03/152) (Allen D, et al. Vox Sanguinis. 2005;89(2):100-4).

Генотипирование HPA-1

Образцы донорской крови подвергали генотипированию НРА-1 в исследовании с использованием 5'-нуклеазы TaqMan, как было описано ранее (Bugert P, McBride S, Smith G, Dugrillon A, Klüter H, Ouwehand WH, et al. Transfusion. 2005;45(5):654-9).

Фенотипирование HPA-1 методои проточной цитометрии на цельной крови

Очищенное моноклональное антитело IgG1, 26.4, конъюгировали с флуоресцентным красителем Alexa Fluor 488 в соответствии с инструкциями производителя (Molecular Probes). Степень мечения (DOL) рассчитывали по формуле: моль красителя/моль белка. Сорок микролитров МАТ, разведенного в ФСБ, содержащем 0,3% ЭДТА и 0,2% бычьего сывороточного альбумина, добавляли к 10 мкл цельной крови, содержащей антикоагулянт ЭДТА, и инкубировали в течение 10 минут при комнатной температуре в темноте. После добавления 0,5 мл ФСБ, дополненного 0,3% ЭДТА и 0,2% БСА, образцы исследовали методом проточной цитометрии (FACSCanto, BD Biosciences). Тромбоциты НРА-1aa и HPA-1bb использовали в качестве контролей. Регистрировали медиану интенсивности флуоресценции FITC (MFI) контролей и каждого образца. Данные проточной цитометрии обрабатывали с помощью программного обеспечения FlowJo (TreeStar, Эшланд, Орегон, США). Образцы крови фенотипировали по HPA-1 в течение 10 дней хранения, поскольку более старые образцы были вязкими и трудно поддавались пипетированию.

Испытание МАТ 26.4 в качестве стандарта для количественного определения антител к HPA-1a с помощью MAIPA

Проводили замену буфера очищенного моноклонального антитела IgG1, 26.4, фосфатно-солевым буфером (ФСБ), содержащим 0,02% азида натрия и 0,5% бычьего сывороточного альбумина (БСА). Концентрацию МАТ определяли методом твердофазного ИФА(ELISA), как описано в примере 1. Моноклональное антитело 26.4 количественно определяли с помощью метода иммобилизации моноклональных антител на антигенах тромбоцитов (MAIPA), используя мышиное антитело к CD61 человека, клон Y2/51 (Dako, Дания), в качестве захватывающего антитела (Killie MK, Salma W, Bertelsen E, Skogen B, Husebekk A. 2010;43(2):149-54). Метод MAIPA первоначально был описан Kiefel et al. (выше); модифицированный быстрый протокол с реагентами рекомендован NIBSC (модифицированное быстрый анализ MAIPA. http://www.nibsc.org, and Kjeldsen-Kragh J, Killie MK, Tomter G, Golebiowska E, Randen I, Hauge R, et al. Blood. 2007;110(3):833-9).

Повторные двукратные разведения (1:8 – 1:512) международного стандарта NIBSC, поликлонального антитела к HPA-1a, совместно с препаратом МАТ 26.4 использовали для создания линейной калибровочной кривой. Четыре образца плазмы с различными уровнями антител к HPA-1a исследовали для оценки связывания с тромбоцитами НРА-1aa. Уровни специфичных антител в образцах рассчитывали, используя уравнение линейной регрессии.

Для оценки погрешности метода (точность) образцы исследовали в трех повторах. Среднестатистическая погрешность метода (CV метода) представляет собой среднее значение отдельных CV и рассчитывается по формуле: % CV = среднее значение SD×100/среднее значение.

Для оценки погрешности серии экспериментов (воспроизводимость), исследование повторяли три раза. Погрешность серии экспериментов выражают как среднестатистическую погрешность для серии экспериментов (CV серии экспериментов) и рассчитывают по формуле: % CV = SD среднего значения×100/среднее значение.

Результаты

Моноклональное антитело IgG1, 26.4, можно применять в качестве реагента для фенотипирования HPA-1a

Чтобы проверить, может ли моноклональное антитело IgG1 26.4 обеспечить распознавание тромбоцитов HPA-1a и HPA-1b в образцах цельной крови, МАТ сначала метили флуоресцентным красителем AlexaFuor 488. Рассчитанная степень мечения (DOL) составила приблизительно 3 (оптимальная DOL, рекомендованная производителем, должна быть ~2 флуорофора на антитело). Было определено количество AlexaFuor 488-конъюгированного МАТ, что позволило отличать HPA-1a-положительные от HPA-1a-отрицательных образцов (фигура 8).

Проводили фенотипирование 143 образцов донорской крови (образцы случайных доноров вместе с образцами от индивидуумов с известным генотипом HPA-1, таблица А).

Таблица А. Образцы донорской крови, генотипированные и фенотипированные по HPA-1.

Общее кол-во образцов	HPA-1aa	HPA-1ab	HPA-1bb
143	98	30	15

Зарегистрированные значения медианы интенсивности флуоресценции FITC (MFI) всех НРА-1a-положительных образцов были значительно выше (в 5 раз и более), чем MFI НРА-1a-отрицательных образцов. Все образцы крови имели генотип НРА-1. В группе исследуемых образцов крови не было обнаружено расхождений фенотип-генотип.

Моноклональное антитело IgG1, 26.4, может быть использовано в качестве стандарта для детектирования и количественного определения антител к HPA-1a в анализе MAIPA

Чтобы оценить использование МАТ IgG1, 26.4, в качестве стандарта в количественном исследовании с помощью MAIPA, сопоставляли МАТ IgG1, 26.4, с международным стандартом NIBSC, поликлональными антителами к HPA-1a. В концентрации 5 мкг/мл МАТ обладало анти-HPA-1a активностью, которая соответствовала 100 МЕ/мл.

Сравнивали графики, полученные на основании средних значений поглощения для повторных удвоенных разведений международного стандарта NIBSC, поликлональных антител к HPA-1a, и стандарта МАТ IgG1, 26.4, в исследовании MAIPA. Линейность и диапазон для указанных двух стандартов были сопоставимы (фигура 9). Линейные участки графиков использовали для определения уровней антител к HPA-1a образцов. Средние значения активности антител к HPA-1a в образцах A, B, C и D, измеренные в трех исследованиях, представлены на фигуре 10.

Погрешность метода описывает погрешность результатов в наборе данных, полученных в одном эксперименте (точность). Рассчитанная среднестатистическая погрешность метода (n=12) составила приблизительно 6% для обоих, NIBSC и МАТ 26.4. Погрешность серии экспериментов описывает вариабельность результатов, полученных в повторных экспериментах (воспроизводимость). Рассчитанная погрешность серии экспериментов (n=3) составила приблизительно 9% и 10% для NIBSC и МАТ 26.4 в качестве стандартов, соответственно.

Обсуждение

Существует потребность в реагенте, который может быть использован для создания простой и надежной методики выявления HPA-1a-отрицательных индивидуумов. Методики генотипирования HPA-1a надежны, но отнимают много времени и требуют сложного оборудования. Коммерчески доступные наборы для анализов на основе ИФА являются дорогостоящими и ненадежными из-за ложных положительных результатов. Два способа анализов на основе проточной цитометрии, опубликованных ранее, основаны на использовании антитела SZ21. Моноклональное антитело SZ21 является псевдоспецифичным в отношении HPA-1a; оно связывается с HPA-1a-отрицательными тромбоцитами при увеличении концентраций антитела. Высокоспецифичное в отношении HPA-1a МАТ обеспечит преимущества для анализов с целью фенотипирования, путем снижения вероятности ложных положительных результатов.

Чтобы проверить, может ли новое МАТ 26.4, специфичное в отношении HPA-1a человека, обеспечить различение HPA-1a и HPA-1b аллотипов в образцах цельной крови, 143 образца крови фенотипировали по HPA-1a с использованием флуорофор-конъюгированных антител 26.4, при этом не было обнаружено каких-либо несоответствий фенотип-генотип. Фенотипирование по HPA-1 методом проточной цитометрии цельной крови с помощью указанного МАТ является быстрой и надежной методикой, подходящей для скрининга.

Фенотипирование может быть дополнено генотипированием выявленных НРА-1a-отрицательных образцов.

Количественное определение антител к HPA-1a имеет прогностическое значение в диагностике FNAIT. Доступный от NIBSC эталонный материал, нацеленный к HPA-1a (NIBSC код: 03/152), состоит из объединенной плазмы от нескольких доноров, иммунизированных HPA-1a, и его поставка зависит от присутствия таких доноров. Авторы настоящего изобретения предположили, что рекомбинантное моноклональное антитело обеспечит неограниченный источник стандартизированного и относительно недорогого реагента. Авторы настоящего изобретения обнаружили, что 26.4 проявляет высокую точность и воспроизводимость результатов, аналогичную таковой для эталонного материала NIBSC при использовании в качестве стандарта для исследования образцов с различными уровнями антител к HPA-1a.

Пример 3

Моноклональное антитело 26.4 ингибирует связывание поликлональных IgG к HPA-1a с тромбоцитами

Исследование ингибирования с помощью MAIPA

Фрагмент F(аb')₂ МАТ 26.4 получали с использованием набора для получения F(аb')₂ Pierce (Pierce, Апплетон, Висконсин, США). Концентрацию очищенного фрагмента F(аb')₂ (0,7 мг/мл) определяли спектрофотометрически по поглощению при 280 нм с использованием коэффициента экстинкции 1,4 л×г⁻¹×см⁻¹. Способность 26.4 блокировать связывание поликлональных антител IgG к HPA-1a оценивали с помощью модифицированной доработки методики MAIPA (Griffin H, Ouwehand W. 1995. Blood 86: 4430-6). В общих чертах, НРА-1a-гомозиготные свежие тромбоциты (2×10⁷) инкубировали с 50 мкл F(аb')₂ антитела 26.4 в течение 1 ч при комнатной температуре перед добавлением 100 мкл образцов сыворотки, разбавленных в соотношении 1:10, и инкубировали еще в течение 15 мин. Исследование MAIPA проводили, как описано ранее (Kiefel V et al. 1987. Blood 70: 1722-6; Killie MK et al. 2010. Transfusion and Apheresis Science 43: 149-54). Была исследована группа из 10 образцов донорской сыворотки, при этом активность антител к HPA-1a находилась в диапазоне от 10 до 150 МЕ/мл, согласно результатам измерения с помощью анализа MAIPA (Killie MK et al. 2010. Transfusion and Apheresis Science 43: 149-54).

Одним из возможных вариантов терапевтического применения МАТ 26.4 является блокирование доступа патогенных антител к HPA-1a к тромбоцитам плода. В этой связи исследовали способность 26.4 ингибировать связывание материнских поликлональных антител IgG к HPA-1a с использованием методики MAIPA. Связывание с HPA-1a-гомозиготными тромбоцитами в 10 из 10 образцов значительно ингибировалось после предварительной инкубации тромбоцитов с фрагментом F(аb')₂ антитела 26.4. Величина ингибирования колебалась от 65% до 100% при самой высокой концентрации фрагмента 35 мкг в объеме 50 мкл (фигура 11). Для представления данных исследования ингибирования с помощью MAIPA использовали программное обеспечение GrapHPAd Prism 5 (Сан-Диего, Калифорния, США).

Не желая быть связанными какой-либо теорией, авторы настоящего изобретения полагают, что антитела, которые обладают сниженной или устраненной эффекторной функцией (например, фрагмент F(аb')₂ антитела 26.4), можно применять в лечении FNAIT, поскольку указанные антитела пересекают плаценту и связываются с тромбоцитами плода, препятствуя тем самым связыванию функциональных материнских антител IgG к HPA-1a и защищая ткани и тромбоциты плода от потенциально опасных материнских антител к HPA-1a. Полученные результаты, свидетельствующие о том, что МАТ 26.4 может эффективно блокировать связывание материнских поликлональных IgG, специфичных в отношении HPA-1a, полученных от различных доноров, с тромбоцитами, указывают на то, что моноклональное антитело также может препятствовать связыванию с рецепторами на HPA-1a-специфичных клонах B-клеток у женщин, восприимчивых к иммунизации.

Пример 4

Исследование пептидов с делецией домена β₃ методом твердофазного ИФА(ELISA)

Антитела к HPA-1a являются гетерогенными по их влиянию на интегрин β₃ и классифицированы как антитела типа I и типа II (Liu LX et al., Blood, 1996;88(9):3601-7; Valentin N et al., Blood, 1995;85(11):3028-33; Stafford P et al. Journal of Thrombosis and Haemostasis, 2008;6(2):366-75). Антитела типа I связываются с остатками в домене плексин/семафорин/интегрин (PSI), который представляет собой первые 54 остатка на интегрине β₃, содержащем полиморфизм НРА-1 в положении 33. Эпитоп антитела типа II включает остатки, отдаленные от домена PSI – гибридный домен и домен эпидермального фактора роста (EGF).

Проводили исследование того, ограничен ли эпитоп 26.4 доменом PSI или охватывает несколько доменов интегрина β₃. Для проведения таких исследований использовали способ ИФА на основе пептидов с делецией домена β₃, описанный ранее (Stafford P et al. Journal of Thrombosis and Haemostasis, 2008;6(2):366-75).

Материалы

Антитела

Использовали клоны Y2/51 мышиного моноклонального антитела, специфичного в отношении интегрина β3 (Beckman Coulter, Пасадена, Калифорния, США) и SZ21 (Dako, Глоструп, Дания). Также использовали клон SZ22 МАТ, специфичного в отношении интегрина αIIb (Beckman Coulter, Пасадена, Калифорния, США). Моноклональное антитело человека, специфичное в отношении HPA-1a, клон B2G1, выделяли из B-клеток матери, в случае FNAIT, с использованием фагового дисплея (Griffin H, Ouwehand W, Blood 1995;86(12):4430-6) и нарабатывали с помощью рекомбинантных способов (Garner et al., British Journal of Haematology, 2000;108(2):440-7) (любезно предоставлено Cedric Ghevaert, Департамент гематологии, Школа клинической медицины, Кембриджский университет, Великобритания). МАт 26.4 получали из одной B-клетки, выделенной у женщины, иммунизированной НРА-1a в связи с беременностью (описано в настоящей заявке). В качестве вторичных антител использовали конъюгированные с пероксидазой хрена (ПХ) антитела козы к IgG мыши и конъюгированные с пероксидазой хрена антитела козы к IgG человека (Jackson ImmunoResearch Laboratories, Вест-Гроув, Пенсильвания, США).

Рекомбинантные пептиды с делецией домена β₃

В качестве отрицательного контроля использовали следующие пептиды: ΔβA-Leu33, ΔβA-Pro33, PSI-Leu33 и GPVI (hDID2) (пептиды были любезно предоставлены Рози Машенс, Международная справочная лаборатория групп крови, НСЗ крови и трансплантологии, Филтон, Бристоль, Великобритания, Винни Чонг, Департамент гистосовместимости и иммуногенетики, НСЗ крови и трансплантологии, Колиндейл-авеню, Лондон, Великобритания; Вильемом H. Аувеханд, Кембриджский университет и Велком Траст Сэнджер институт, НСЗ крови и трансплантологии, Великобритания; указанные пептиды описаны Stafford P et al. в Journal of Thrombosis and Haemostasis, 2008;6(2):366-75). CaM-связывающий пептид N9A, соединенный с БСА, был любезно предоставлен Питером Сметаст и Никола Фоад (описан Smethurst PA et al., Blood 2004;103(3):903-11).

Методы

Методы клонирования, экспрессии и очистки рекомбинантных пептидов с делецией домена β₃ с использованием кальмодулиновой (САМ) метки описаны в Stafford et al. (Journal of Thrombosis and Haemostasis, 2008;6(2):366-75). ИФА проводили, как описано ранее (Abou-Chaker K et al., Tissue Antigens 2009;73(3):242-4). В общих чертах, пептиды β₃ иммобилизовали на планшетах для ИФА с помощью CaM-связывающего пептида N9A, соединенного с БСА (Smethurst PA et al., Blood 2004;103(3):903-11). Моноклональные антитела мыши и человека использовали в концентрации 1 и 10 мкг/мл. Связывание МАТ определяли с помощью конъюгированного с пероксидазой хрена антитела козы к IgG мыши или конъюгированного с пероксидазой хрена антитела козы к IgG человека. Поглощение при 492 нм считывали на фотометре для микропланшетов (Multiskan EX, Thermo Scientific, Валтам, Массачусетс, США). Каждый образец исследовали в двух повторах, и средние значения поглощения использовали для построения графика (фигура 12 и фигура 13).

Результаты

Параметры связывания мышиных моноклональных антител, клонов Y2/51 и SZ21, с пептидами с делецией домена β₃ были опубликованы ранее (Stafford P et al., Journal of Thrombosis and Haemostasis, 2008;6(2):366-75) и были использованы в качестве контроля системы. Моноклональное антитело Y2/51 в концентрации 1 и 10 мкг/мл связывалось с вариантами многодоменного пептида ΔβA, Leu33 и Pro33. Моноклональное антитело SZ21 в концентрации 1 мкг/мл связывалось с ΔβA-Leu33, тогда как связывание с ΔβA-Pro33 и PSI-Leu33 обеспечивало относительно низкий отклик. Моноклональное антитело SZ21 в концентрации 10 мкг/мл связывалось с многодоменными пептидами ΔβA, независимо от варианта Leu33 или Pro33, а также с однодоменным пептидом PSI-Leu33. Ни одно из МАТ не связывалось с контрольным пептидом. Полученные результаты согласуются с ранее опубликованными данными (Stafford P et al. Journal of Thrombosis and Haemostasis, 2008;6(2):366-75). Моноклональное антитело SZ22 (специфичное в отношении αIIb, CD41) использовали в качестве отрицательного контроля для мышиного МАТ, при этом антитело SZ22 не связывалось ни с одним из пептидов (данные не приведены).

Моноклональное антитело 26.4 связывалось исключительно с многодоменным пептидом ΔβA-Leu33; не было обнаружено связывания с ΔβA-Pro33, однодоменным пептидом PSI-Leu33 или пептидом для отрицательного контроля. Моноклональное антитело B2G1 имело аналогичный характер связывания, согласующийся с ранее опубликованными результатами (Stafford P et al., Journal of Thrombosis and Haemostasis, 2008;6(2):366-75).

Описанные выше результаты позволяют предположить, что эпитоп 26.4 охватывает несколько доменов интегрина β₃, и антитело 26.4 представляет собой антитело к HPA-1a типа II.

1. Выделенное антитело, которое специфично связывается с НРА-1а и которое содержит по меньшей мере одну вариабельную область тяжелой цепи (VH), которая содержит три гипервариабельных участка (CDR), и по меньшей мере одну вариабельную область легкой цепи (VL), которая содержит три CDR, причем указанная вариабельная область легкой цепи содержит:

(a) CDR1 вариабельной области легкой цепи (VL), который содержит аминокислотную последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 8,

(b) CDR2 VL, который содержит аминокислотную последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 9, и

(c) CDR3 VL, который содержит аминокислотную последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 10; и

причем указанная вариабельная область тяжелой цепи содержит:

(d) CDR1 вариабельной области тяжелой цепи (VH), который содержит аминокислотную последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 5,

(e) CDR2 VH, который содержит аминокислотную последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 6, и

(f) CDR3 VH, который содержит аминокислотную последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 7.

2. Антитело по п. 1, отличающееся тем, что указанная вариабельная область легкой цепи содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 4 или последовательность, которая по меньшей мере на 80% идентична указанной последовательности, и/или указанная вариабельная область тяжелой цепи содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 3 или последовательность, которая по меньшей мере на 80% идентична указанной последовательности.

3. Антитело по п. 1 или 2, отличающееся тем, что указанная вариабельная область легкой цепи содержит аминокислотную последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 4, и указанная вариабельная область тяжелой цепи содержит аминокислотную последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 3.

4. Антитело по любому из пп. 1-3, отличающееся тем, что указанное антитело представляет собой полноразмерное антитело IgG.

5. Антитело по п. 4, отличающееся тем, что указанное антитело содержит:

(i) тяжелую цепь, которая содержит аминокислотную последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 21, или последовательность, которая по меньшей мере на 80% идентична указанной последовательности, и/или легкую цепь, которая содержит аминокислотную последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 22, или последовательность, которая по меньшей мере на 80% идентична указанной последовательности, или

(ii) тяжелую цепь, которая содержит аминокислотную последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 25, или последовательность, которая по меньшей мере на 80% идентична указанной последовательности, и/или легкую цепь, которая содержит аминокислотную последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 26, или последовательность, которая по меньшей мере на 80% идентична указанной последовательности.

6. Антитело по п. 4 или 5, отличающееся тем, что указанное антитело содержит:

(i) тяжелую цепь, которая содержит аминокислотную последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 21, и легкую цепь, которая содержит аминокислотную последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 22, или

(ii) тяжелую цепь, которая содержит аминокислотную последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 25, и легкую цепь, которая содержит аминокислотную последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 26.

7. Антитело по любому из пп. 1-6, отличающееся тем, что указанное антитело способно связываться с интегрином αVβ3, содержащим антиген НРА-1а.

8. Антитело по любому из пп. 1-7, отличающееся тем, что по меньшей мере 35% указанного антитела остаются связанными с очищенным и иммобилизованным интегрином αVβ3 от НРА-1а-положительных индивидуумов в конце периода диссоциации в исследовании методом поверхностного плазмонного резонанса.

9. Антитело по любому из пп. 1-8, отличающееся тем, что указанное антитело связывается с НРА-1а на интактных тромбоцитах.

10. Антитело по любому из пп. 1-9, отличающееся тем, что указанное антитело способно связываться с очищенным интегрином αllbβ3, полученным из тромбоцитов от НРА-1а-положительных индивидуумов.

11. Антитело по любому из пп. 1-10, отличающееся тем, что указанное антитело способно индуцировать фагоцитоз НРА-1а-положительных тромбоцитов.

12. Антитело по любому из пп. 1-11, отличающееся тем, что указанное антитело не ингибирует агрегацию тромбоцитов HPA-1bb.

13. Антитело по любому из пп. 1-12, отличающееся тем, что эффекторная функция указанного антитела снижена или отсутствует.

14. Молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая антитело, содержащая нуклеотидную последовательность, которая кодирует антитело по любому из пп. 1-13.

15. Композиция для связывания НРА-1а, содержащая терапевтически или профилактически эффективное количество одного или более антител по любому из пп. 1-13, в смеси с подходящим разбавителем, носителем или вспомогательным веществом.

16. Способ получения антитела по любому из пп. 1-13, включающий этапы:

(i) культивирования клетки-хозяина, содержащей молекулу нуклеиновой кислоты, определенную в п. 14, или рекомбинантный вектор экспрессии, содержащий указанную молекулу нуклеиновой кислоты, в условиях, подходящих для экспрессии кодируемого антитела; и

(ii) выделение или получение указанного антитела из клетки-хозяина или из ростовой среды/супернатанта.

17. Антитело по любому из пп. 1-13 для применения в лечении или профилактике аллоиммунной тромбоцитопении плода и новорожденных (FNAIT).

18. Антитело по любому из пп. 1-13 для применения в предотвращении аллоиммунизации НРА-1а у субъекта.

19. Способ детектирования НРА-1а, включающий приведение композиции, предположительно содержащей НРА-1а, в контакт с антителом по любому из пп. 1-13 в условиях, допускающих образование комплексов НРА-1а/антитело, и детектирование комплексов, образованных таким образом.

20. Способ анализа для определения присутствия или отсутствия НРА-1а в образце, который был получен от субъекта, причем указанный способ включает следующие этапы:

(a) приведение указанного образца в контакт с антителом по любому из пп. 1-13, которое специфично связывается с НРА-1а; и

(b) анализ присутствия или отсутствия комплексов антитело к НРА-1а/НРА-1а (антиген).

21. Способ по п. 20, отличающийся тем, что указанный образец представляет собой образец, содержащий тромбоциты.

22. Применение антитела по любому из пп. 1-13 в качестве эталонного стандарта для количественной оценки антител к НРА-1а в образце.

23. Применение по п. 22, отличающееся тем, что указанный образец представляет собой образец цельной крови или образец плазмы крови.

24. Способ лечения или профилактики аллоиммунной тромбоцитопении плода и новорожденных (FNAIT), включающий введение пациенту, нуждающемуся в этом, терапевтически или профилактически эффективного количества антитела по любому из пп. 1-13.

25. Применение антитела по любому из пп. 1-13 в производстве лекарственного средства для лечения или профилактики FNAIT.