Способ прогнозирования лимфогенного метастазирования при аденокарциноме толстого кишечника

Авторы патента:

Крахмаль Надежда Валерьевна (RU)

Афанасьев Сергей Геннадьевич (RU)

Заявьялова Марина Викторовна (RU)

Рачковский Кирилл Владимирович (RU)

Вторушин Сергей Владимирович (RU)

G01N33/48 - биологических материалов, например крови, мочи (G01N 33/02-G01N 33/14,G01N 33/26,G01N 33/44,G01N 33/46 имеют преимущество; определение всхожести семян A01C 1/02); приборы для подсчета и измерения клеток крови (гемоцитометры) (подсчет клеток крови, распределенных по поверхности, путем сканирования этой поверхности G06M 11/02)

Владельцы патента RU 2688678:

Федеральное государственное бюджетное научное учреждение "Томский национальный исследовательский медицинский центр Российской академии наук" (Томский НИМЦ) (RU)

Изобретение относится к медицине и предназначено для прогнозирования лимфогенного метастазирования при аденокарциноме толстого кишечника. Исследуют ткани опухоли, проводят иммуногистохимическое исследование с антителами: Rb pAb to Beclin 1 (ab62472, Abeam), Rb Anti-mTOR PAb (El8590, Bioscience), p53 Protein (Clone DO-7, monoclonal mouse, RTU, Dako), Ki67 Antigen (Clone MIB-1, monoclonal mouse, RTU, Dako), Bcl2 Oncoprotein (Clone 124, monoclonal mouse, RTU, Dako). Исследуют экспрессию указанных маркеров в опухолевой ткани по следующим параметрам: процент опухолевых клеток с позитивной экспрессией белка beclin 1, процент опухолевых клеток с позитивной экспрессией белка m-TOR, наличие экспрессии белка р53 в ткани опухоли, характер экспрессии белка р53 в ткани опухоли, наличие экспрессии ki67 в клетках воспалительного инфильтрата, наличие экспрессии bcl2 в клетках воспалительного инфильтрата и рассчитывают риск развития лимфогенных метастазов. Способ позволяет повысить эффективность раннего определения риска лимфогенного метастазирования. 2 пр.

Изобретение относится к области медицины, онкологии, и касается способов прогнозирования лимфогенного метастазирования при аденокарциноме толстого кишечника.

Наличие метастатического поражения регионарных лимфоузлов, локализация метастазов и количество пораженных лимфатических узлов при колоректальном раке являются факторами прогноза заболевания, а также показателями, которые имеют крайне важное значение относительно принятия лечащим врачом решения о вариантах дальнейшей терапии в адъювантном режиме. Кроме того, наличие метастазов в лимфатических узлах при злокачественных новообразованиях данной локализации лежит в основе стадирования заболевания во всех современных системах постановки диагноза [2, 3]. Широко обсуждается вопрос о том, что возможность иметь данные относительно состоянии регионарных лимфоузлов до этапа оперативного лечения позволила бы клиническому врачу хирургу определить оптимальную степень хирургической резекции, ведь этот момент на протяжении долгого времени все же продолжает оставаться предметом обсуждений. С высокой степенью достоверности обеспечить наличие информации относительно метастатического поражения лимфатических узлов при колоректальном раке может молекулярно-морфологическое исследование [1, 4, 5]. Идеальным решением этого вопроса может стать определение возможной степени риска лимфогенного метастазирования на этапе биопсии первичной опухоли. В настоящее время крайне актуальным является изучение молекулярных характеристик ткани новообразования с проецированием полученных результатов на параметры прогрессирования процесса.

Наиболее близким к предлагаемому является способ прогнозирования метастазирования, основанный на градации аденокарциномы кишечника на степени дифференцировки опухоли, среди которых выделяют low-grade и high-grade новообразования (World Health Organization Classification of Tumours; 2000). К low-grade опухолям относятся высоко - и умеренно дифференцированная аденокарциномы кишечника. Высоко дифференцированная аденокарцинома (grade 1) преимущественно представлена отчетливо определяемыми железистоподобными структурами, процент которых в опухолевой ткани составляет более 95%. Умеренно дифференцированная аденокарцинома представлена железистоподобными структурами, процент которых в опухолевой ткани составляет от 50 до 95%. К high-grade опухолям относятся низко дифференцированная и недифференцированная аденокарциномы. Низко дифференцированная аденокарцинома (grade 3) представлена опухолевыми структурами, среди которых процент железистоподобных варьирует от 5 до 50%. Опухоли, которые оцениваются как недифференцированные (grade 4), содержат менее 5% структур, формирующих подобие желез, от всего объема опухолевой ткани. Известно, что low-grade аденокарциномы кишечника имеют более хороший прогноз и, соответственно, характеризуются наименьшим риском возникновения метастазов. В свою очередь, high-grade аденокарциномы считаются более агрессивными в плане частоты и сроков метастазирования и, соответственно, имеют худшие показатели в плане прогноза заболевания [7].

Недостатком этого способа является то, что отсутствуют конкретные числовые показатели, позволяющие оценить риск развития метастазов, в частности лимфогенных метастазов, у конкретного пациента с раком толстой кишки. При этом исключительно морфологическое исследование может иметь субъективный характер при оценке патогистологических изменений в ткани опухоли. Соответственно, существует необходимость поиска новых, более достоверных факторов прогноза и необходимость применения более совершенных и современных методов молекулярной диагностики.

Новая техническая задача - создание нового способа прогнозирования лимфогенного метастазирования при аденокарциноме толстого кишечника.

Новый технический результат - повышение точности, достоверности и информативности способа, за счет использования численных показателей молекулярно-морфологических характеристик опухоли.

Для достижения нового технического результата в способе прогнозирования лимфогенного метастазирования при аденокарциноме толстого кишечника путем макроскопического исследования первичной опухоли, линий резекции и всех удаленных во время операции лимфатических узлов, а также морфологического исследования препаратов ткани первичной опухоли на светооптическом уровне, при этом, при исследовании в ткани опухоли в каждом случае детально оценивают наличие участков некроза, при отсутствии в ткани опухоли участков некроза признак оценивают как 1 балл, при наличии в ткани опухоли участков некроза признак оценивают как 2 балла, после гистологического исследования ткани первичной опухоли проводят иммуногистохимическое исследование по стандартной методике согласно протоколам, для которого используют следующие антитела: Rb pAb to Beclin 1 (ab62472, Abcam), Rb Anti-mTOR PAb (E1 8590, Bioscience), p53 Protein (Clone DO-7, monoclonal mouse, RTU, Dako), Ki67 Antigen (Clone MIB-1, monoclonal mouse, RTU, Dako), Bcl2 Oncoprotein (Clone 124, monoclonal mouse, RTU, Dako), далее, исследуют экспрессию указанных маркеров в опухолевой ткани по следующим параметрам: процент опухолевых клеток с позитивной экспрессией белка beclin 1, процент опухолевых клеток с позитивной экспрессией белка m-TOR, наличие экспрессии белка р53 в ткани опухоли, характер экспрессии белка р53 в ткани опухоли, наличие экспрессии ki67 в клетках воспалительного инфильтрата, наличие экспрессии bcl2 в клетках воспалительного инфильтрата, при наличии в опухолевой ткани до 35% клеток с позитивной экспрессией белка beclin 1 признак оценивают как 1 балл, при наличии от 35% до 70% опухолевых клеток с позитивной экспрессией белка beclin 1 признак оценивают как 2 балла, в случаях наличия более 70% опухолевых клеток с позитивной экспрессией белка beclin 1 признак оценивают как 3 балла, при наличии в опухолевой ткани до 35% клеток с позитивной экспрессией белка m-TOR признак оценивают как 1 балл, при наличии от 35% до 70% опухолевых клеток с позитивной экспрессией белка m-TOR признак оценивают как 2 балла, в случаях наличия более 70% опухолевых клеток с позитивной экспрессией белка m-TOR признак оценивают как 3 балла, при отсутствии в ткани опухоли позитивной экспрессии р53 признак оценивают как 1 балл, при наличии в ткани опухоли позитивной экспрессии р53 признак оценивают как 2 балла, далее оценивают характер экспрессии р53 в ткани опухоли -гомогенный или гетерогенный, если в опухоли отмечается тотально негативная экспрессия или равномерная позитивная экспрессия маркера р53 одинаковой интенсивности окрашивания опухолевых клеток, то экспрессию оценивают как гомогенную, а сам признак оценивают как 1 балл, если в опухолевой ткани определяются участки с позитивной и негативной экспрессией маркера р53 одновременно, при этом позитивная экспрессия характеризуется различной интенсивностью иммунного окрашивания от слабо выраженного до резко интенсивного, то экспрессию оценивают как гетерогенную, а признак оценивают как 2 балла, при наличии в клетках воспалительного инфильтрата позитивной экспрессии ki67 признак оценивают как 1 балл, при отсутствии позитивной экспрессии ki67 в клетках воспалительного инфильтрата признак оценивают как 2 балла, при наличии в клетках воспалительного инфильтрата позитивной экспрессии bcl2 признак оценивают как 1 балл, при отсутствии позитивной экспрессии bcl2 в клетках воспалительного инфильтрата признак оценивают как 2 балла, далее рассчитывают значеие значение уравнения регрессии Y по следующей формуле:

Y=6-6⋅Х₁+6⋅Х₂-14,8⋅Х₃+11,9⋅Х₄+9,8⋅Х₅-10,3⋅Х₆+11,9⋅Х₇,

где

6 - значение коэффициента регрессии свободного члена;

X₁ - наличие участков некроза в ткани опухоли, Х₁=1 балл в случае, если участки некроза в ткани опухоли отсутствуют; X₁=2 балла, если участки некроза в ткани опухоли присутствую;

6 - значение коэффициента регрессии признака X₁;

Х₂ - процент опухолевых клеток с позитивной экспрессией белка beclin 1, Х₂=1 балл, если в ткани опухоли определяется до 35% опухолевых клеток с позитивной экспрессией белка beclin 1; Х₂=2 балла, если в ткани опухоли определяется от 35% до 70% опухолевых клеток с позитивной экспрессией белка beclin 1; Х₂=3 балла, если в ткани опухоли определяется более 70% опухолевых клеток с позитивной экспрессией белка beclin 1;

6 - значение коэффициента регрессии признака Х₂;

Х₃ - процент опухолевых клеток с позитивной экспрессией белка m-TOR, Х₃=1 балл, если в ткани опухоли определяется до 35% опухолевых клеток с позитивной экспрессией белка m-TOR; Х₃=2 балла, если в ткани опухоли определяется от 35% до 70% опухолевых клеток с позитивной экспрессией белка m-TOR; Х₃=3 балла, если в ткани опухоли определяется более 70% опухолевых клеток с позитивной экспрессией белка m-TOR;

-14,8 - значение коэффициента регрессии признака Х₃;

Х₄ - наличие в опухолевой ткани позитивной экспрессии р53, Х₄=1 балл, если позитивная экспрессия р53 в ткани опухоли отсутствует; X₄=2 балла, если позитивная экспрессия р53 в ткани опухоли присутствует;

11,9 - значение коэффициента регрессии признака Х₄;

Х₅ - характер экспрессии р53 в ткани опухоли, X₅=l балл в случае наличия гомогенная экспрессия р53, X₅=2 балла в случае наличия гетерогенная экспрессия р53;

9,8 - значение коэффициента регрессии признака Х₅;

Х₆ - наличие в клетках воспалительного инфильтрата позитивной экспрессии ki67, Х₆=1 балл если позитивная экспрессия ki67 в клетках воспалительного инфильтрата присутствует; Х₆=2 балла, если позитивная экспрессия ki67 в клетках воспалительного инфильтрата отсутствует;

-10,3 - значение коэффициента регрессии признака Х₆;

Х₇ - наличие в клетках воспалительного инфильтрата позитивной экспрессии bcl2, Х₇=1 балл, если позитивная экспрессия bcl2 в клетках воспалительного инфильтрата присутствует; Х₇=2 балла, если позитивная экспрессия bcl2 в клетках воспалительного инфильтрата отсутствует;

11,9 - значение коэффициента регрессии признака Х₇,

далее вероятность развития лимфогенных метастазов Р определяют по формуле: Р=e^Y/(1+e^Y), где

е - математическая константа, равная 2,72.

и при вероятности Р≥50% определяют высокий, а при вероятности Р<50% определяют низкий риск развития лимфогенных метастазов

Степень достоверности χ2=188,66; р=0,0000). Чувствительность модели составила 83%, специфичность - 97,4%.

Способ осуществляют следующим образом.

Осуществляют макроскопическое исследование ткани первичной опухоли, линий резекции и всех удаленных во время операции лимфатических узлов. Материал фиксируют в 10-12% растворе нейтрального формалина. Проводку материала и изготовление гистологических препаратов осуществляют по стандартной методике. Гистологический тип опухоли устанавливают на основании международной классификации «Опухоли желудочно-кишечного тракта» (ВОЗ, 2013), способ предназначен только для аденокарциномы толстого кишечника. Далее проводят морфологическое исследование препаратов ткани первичной опухоли на светооптическом уровне. При исследовании в ткани опухоли в каждом случае детально оценивают наличие участков некроза. При отсутствии в ткани опухоли участков некроза признак оценивают как 1 балл, при наличии в ткани опухоли участков некроза признак оценивают как 2 балла. После гистологического исследования ткани первичной опухоли проводят иммуногистохимическое исследование, для которого используют следующие антитела: Rb pAb to Beclin 1 (ab62472, Abcam), Rb Anti-mTOR PAb (E18590, Bioscience), p53 Protein (Clone DO-7, monoclonal mouse, RTU, Dako), Ki67 Antigen (Clone MIB-1, monoclonal mouse, RTU, Dako), Bcl2 Oncoprotein (Clone 124, monoclonal mouse, RTU, Dako). Иммуногистохимическое исследование проводят по стандартной методике согласно протоколам. Далее исследуют экспрессию указанных маркеров в опухолевой ткани по следующим параметрам:

- процент опухолевых клеток с позитивной экспрессией белка beclin 1,

- процент опухолевых клеток с позитивной экспрессией белка m-TOR,

- наличие экспрессии белка р53 в ткани опухоли,

- характер экспрессии белка р53 в ткани опухоли,

- наличие экспрессии ki67 в клетках воспалительного инфильтрата,

- наличие экспрессии bcl2 в клетках воспалительного инфильтрата.

При наличии в опухолевой ткани до 35% клеток с позитивной экспрессией белка beclin 1 признак оценивают как 1 балл, при наличии от 35% до 70% опухолевых клеток с позитивной экспрессией белка beclin 1 признак оценивают как 2 балла, в случаях наличия более 70% опухолевых клеток с позитивной экспрессией белка beclin 1 признак оценивают как 3 балла. При наличии в опухолевой ткани до 35% клеток с позитивной экспрессией белка m-TOR признак оценивают как 1 балл, при наличии от 35% до 70% опухолевых клеток с позитивной экспрессией белка m-TOR признак оценивают как 2 балла, в случаях наличия более 70% опухолевых клеток с позитивной экспрессией белка m-TOR признак оценивают как 3 балла. При отсутствии в ткани опухоли позитивной экспрессии р53 признак оценивают как 1 балл, при наличии в ткани опухоли позитивной экспрессии р53 признак оценивают как 2 балла. Далее оценивают характер экспрессии р53 в ткани опухоли - гомогенный или гетерогенный. Если в опухоли отмечается тотально негативная экспрессия или равномерная позитивная экспрессия маркера р53 одинаковой интенсивности окрашивания опухолевых клеток, то экспрессию оценивают как гомогенную, а сам признак оценивают как 1 балл. Если в опухолевой ткани определяются участки с позитивной и негативной экспрессией маркера р53 одновременно, при этом позитивная экспрессия характеризуется различной интенсивностью иммунного окрашивания (от слабо выраженного до резко интенсивного), то экспрессию оценивают как гетерогенную, а признак оценивают как 2 балла [6]. При наличии в клетках воспалительного инфильтрата позитивной экспрессии ki67 признак оценивают как 1 балл, при отсутствии позитивной экспрессии ki67 в клетках воспалительного инфильтрата признак оценивают как 2 балла. При наличии в клетках воспалительного инфильтрата позитивной экспрессии bcl2 признак оценивают как 1 балл, при отсутствии позитивной экспрессии bcl2 в клетках воспалительного инфильтрата признак оценивают как 2 балла.

Далее расчет вероятности риска лимфогенного метастазирования при колоректальном раке проводят по следующей формуле:

Y=6-6⋅X₁+6⋅Х₂-14,8⋅Х₃+11,9⋅Х₄+9,8⋅Х₅-10,3⋅Х₆+11,9⋅Х₇,

где Y - значение уравнения регрессии;

(6) - значение коэффициента регрессии свободного члена;

X₁ - наличие участков некроза в ткани опухоли (1 балл - участки некроза в ткани опухоли отсутствуют; 2 балла - участки некроза в ткани опухоли присутствуют),

(6) - значение коэффициента регрессии признака X₁;

Х₂ - процент опухолевых клеток с позитивной экспрессией белка beclin 1(1 балл - в ткани опухоли определяется до 35% опухолевых клеток с позитивной экспрессией белка beclin 1; 2 балла - в ткани опухоли определяется от 35% до 70% опухолевых клеток с позитивной экспрессией белка beclin 1; 3 балла - в ткани опухоли определяется более 70% опухолевых клеток с позитивной экспрессией белка beclin 1),

(6) - значение коэффициента регрессии признака Х₂;

Х₃ - процент опухолевых клеток с позитивной экспрессией белка m-TOR (1 балл - в ткани опухоли определяется до 35% опухолевых клеток с позитивной экспрессией белка m-TOR; 2 балла - в ткани опухоли определяется от 35% до 70% опухолевых клеток с позитивной экспрессией белка m-TOR; 3 балла - в ткани опухоли определяется более 70% опухолевых клеток с позитивной экспрессией белка m-TOR),

(-14,8) - значение коэффициента регрессии признака Х₃;

Х₄ - наличие в опухолевой ткани позитивной экспрессии р53 (1 балл - позитивная экспрессия р53 в ткани опухоли отсутствует; 2 балла - позитивная экспрессия р53 в ткани опухоли присутствует),

(11,9) - значение коэффициента регрессии признака X₄;

Х₅ - характер экспрессии р53 в ткани опухоли (1 балл - гомогенная экспрессия р53, 2 балла - гетерогенная экспрессия р53),

(9,8) - значение коэффициента регрессии признака Х₅;

Х₆ - наличие в клетках воспалительного инфильтрата позитивной экспрессии ki67 (1 балл - позитивная экспрессия ki67 в клетках воспалительного инфильтрата присутствует; 2 балла - позитивная экспрессия ki67 в клетках воспалительного инфильтрата отсутствует), (-10,3) - значение коэффициента регрессии признака Х₆;

Х₇ - наличие в клетках воспалительного инфильтрата позитивной экспрессии bcl2 (1 балл - позитивная экспрессия bcl2 в клетках воспалительного инфильтрата присутствует; 2 балла - позитивная экспрессия bcl2 в клетках воспалительного инфильтрата отсутствует), (11,9) - значение коэффициента регрессии признака Х₇.

Вероятность развития лимфогенных метастазов определяют по формуле: Р=e^Y/(1+e^Y), где

е - математическая константа, равная 2,72.

При вероятности Р≥50% определяют высокий риск развития лимфогенного метастазирования, при вероятности Р<50% определяют низкий риск развития лимфогенных метастазов.

Сущность предлагаемого способа иллюстрируется следующими примерами.

Пример 1. Пациентка Т., 88 лет, гистотип опухоли прямой кишки соответствует аденокарциноме. При гистологическом исследовании на светооптическом уровне в ткани опухоли участки некроза отсутствовали (1 балл). При иммуногистохимическом исследовании в ткани новообразования процент опухолевых клеток с позитивной экспрессией белка beclin 1 составил менее 35% (1 балл), процент опухолевых клеток с позитивной экспрессией белка m-TOR составил более 70% (3 балла), также в ткани опухоли присутствовала позитивная экспрессия р53 (2 балла), при этом характер экспрессии р53 в опухоли был расценен как гетерогенный (2 балла). При оценке экспрессии изучаемых маркеров в клетках воспалительного инфильтрата опухоли было установлено отсутствие позитивной экспрессии ki67 (2 балла) и наличие позитивной экспрессии bcl2 (1 балл).

Расчет степени риска лимфогенного проводили по формуле:

Y=6-6⋅X₁+6⋅Х₂-14,8⋅Х₃+11,9⋅Х₄+9,8⋅Х₅-10,3⋅Х₆+11,9-Х₇=

6-6⋅1+6⋅1-14,8⋅3+11,9⋅2+9,8⋅2-10,3⋅2+11,9⋅1=

6-6+6-44,4+23,8+19,6-20,6+11,9=-3,7

Вероятность развития лимфогенных метастазов определяли по формуле:

Р=е^-3,7/(1+е^-3,7)=2,72^-3,7/(1+2,72^-3,7)=0,024665791442429/1,024665791442429=0,02=2%. Таким образом, у пациентки был определен низкий риск развития лимфогенных метастазов. При исследовании лимфатических узлов метастатического поражения обнаружено не было.

Пример 2. Пациентка С., 63 лет, гистотип опухоли прямой кишки соответствует аденокарциноме. При гистологическом исследовании на светооптическом уровне в ткани опухоли участки некроза отсутствовали (1 балл). При иммуногистохимическом исследовании в ткани новообразования процент опухолевых клеток с позитивной экспрессией белка beclin 1 составил менее 35% (1 балл), процент опухолевых клеток с позитивной экспрессией белка m-TOR составил менее 35% (1 балл), также в ткани опухоли присутствовала позитивная экспрессия р53 (2 балла), при этом характер экспрессии р53 в опухоли был расценен как гомогенный (1 балл). При оценке экспрессии изучаемых маркеров в клетках воспалительного инфильтрата опухоли было установлено отсутствие позитивной экспрессии ki67 (2 балла) и отсутствие позитивной экспрессии bcl2 (2 балла).

Расчет степени риска лимфогенного проводили по формуле:

Y=6-6⋅X₁+6⋅Х₂-14,8⋅Х₃+11,9⋅Х₄+9,8⋅Х₅-10,3⋅Х₆+11,9⋅Х₇=

6-6⋅1+6⋅1-14,8⋅1+11,9⋅2+9,8⋅1-10,3⋅2+11,9⋅2=

6-6+6-14,8+23,8+9,8-20,6+23,8=28

Вероятность развития лимфогенных метастазов определяли по формуле:

Р=е²⁸/(1+е²⁸)=2,72²⁸/(1+2,72²⁸)=1472072884036,705/1472072884037,705=0,99=99%. Таким образом, у пациентки был определен высокий риск развития лимфогенных метастазов. При оценке метастатического поражения в 5 лимфоузлах из 12 исследованных было обнаружено наличие метастазов.

Предлагаемый способ основан на анализе данных морфологического и иммуногистохимического исследования операционного материала пациентов.

В исследование были включены 105 больных колоректальным раком T_1-4N_0-2M₀ стадии, проходивших лечение в торакоабдоминальном отделении НИИ онкологии Томского НИМЦ в период с 2012 по 2015 годы. Средний возраст больных составил 59,7±4,3. Среди пациентов было 47% мужчин (n=49) и 53% женщин (n=56). Предоперационного лечения пациенты не получали. Локализация опухоли в толстой кишке была следующей: у 16 (15%) пациентов опухоль располагалась в слепой кишке, у 8 (7%) - в восходящей части ободочной кишки, у 3 (3%) пациентов новообразование было выявлено в области печеночного изгиба. В 2 (2%) случаях опухоль располагалась в поперечной части ободочной кишки, у 23 (22%) пациентов локализация новообразования соответствовала области селезеночного изгиба, в 6 (5%) случаях - нисходящей части ободочной кишки, при этом у 31 (30%) пациента опухоль была обнаружена в сигмовидной кишке и у 16 (16%) пациентов локализация новообразования соответствовала ректо-сигмоидному отделу толстого кишечника. Хирургический этап лечения проводился всем пациентам в объеме гемиколонэктомии или резекции кишки. Сроки наблюдения за больными составили 3 года.

С целью определения прогноза димфогенного метастазирования макроскопическому исследованию подвергали ткань первичной опухоли, линии резекции и все удаленные во время операции лимфатические узлы. Материал фиксировали в 10-12% растворе нейтрального формалина. Проводку материала и изготовление гистологических препаратов осуществляли по стандартной методике. Препараты окрашивали гематоксилином и эозином. Гистологический тип опухоли устанавливали на основании международной классификации «Опухоли желудочно-кишечного тракта» (ВОЗ, 2013), способ предназначается только для аденокарциномы. Проводили морфологическое исследование препаратов ткани первичной опухоли на светооптическом уровне. При исследовании в ткани опухоли в каждом случае детально оценивали наличие участков некроза, при отсутствии в ткани опухоли участков некроза признак оценивали как 1 балл, при наличии в ткани опухоли участков некроза признак оценивали как 2 балла, после гистологического исследования ткани первичной опухоли проводили иммуногистохимическое исследование по стандартной методике согласно протоколам, для которого использовали следующие антитела: Rb pAb to Beclin 1 (ab62472, Abcam), Rb Anti-mTOR PAb (E18590, Bioscience), p53 Protein (Clone DO-7, monoclonal mouse, RTU, Dako), Ki67 Antigen (Clone MIB-1, monoclonal mouse, RTU, Dako), Bcl2 Oncoprotein (Clone 124, monoclonal mouse, RTU, Dako), далее, исследуют экспрессию указанных маркеров в опухолевой ткани по следующим параметрам: процент опухолевых клеток с позитивной экспрессией белка beclin 1, процент опухолевых клеток с позитивной экспрессией белка m-TOR, наличие экспрессии белка р53 в ткани опухоли, характер экспрессии белка р53 в ткани опухоли, наличие экспрессии ki67 в клетках воспалительного инфильтрата, наличие экспрессии bcl2 в клетках воспалительного инфильтрата, при наличии в опухолевой ткани до 35% клеток с позитивной экспрессией белка beclin 1 признак оценивали как 1 балл, при наличии от 35% до 70% опухолевых клеток с позитивной экспрессией белка beclin 1 признак оценивали как 2 балла, в случаях наличия более 70% опухолевых клеток с позитивной экспрессией белка beclin 1 признак оценивали как 3 балла, при наличии в опухолевой ткани до 35% клеток с позитивной экспрессией белка m-TOR признак оценивают как 1 балл, при наличии от 35% до 70% опухолевых клеток с позитивной экспрессией белка m-TOR признак оценивали как 2 балла, в случаях наличия более 70% опухолевых клеток с позитивной экспрессией белка m-TOR признак оценивали как 3 балла, при отсутствии в ткани опухоли позитивной экспрессии р53 признак оценивают как 1 балл, при наличии в ткани опухоли позитивной экспрессии р53 признак оценивали как 2 балла, далее оценивали характер экспрессии р53 в ткани опухоли -гомогенный или гетерогенный, если в опухоли отмечается тотально негативная экспрессия или равномерная позитивная экспрессия маркера р53 одинаковой интенсивности окрашивания опухолевых клеток, то экспрессию оценивали как гомогенную, а сам признак оценивают как 1 балл, если в опухолевой ткани определяются участки с позитивной и негативной экспрессией маркера р53 одновременно, при этом позитивная экспрессия характеризуется различной интенсивностью иммунного окрашивания от слабо выраженного до резко интенсивного, то экспрессию оценивали как гетерогенную, а признак оценивали как 2 балла, при наличии в клетках воспалительного инфильтрата позитивной экспрессии ki67 признак оценивали как 1 балл, при отсутствии позитивной экспрессии ki67 в клетках воспалительного инфильтрата признак оценивали как 2 балла, при наличии в клетках воспалительного инфильтрата позитивной экспрессии bcl2 признак оценивали как 1 балл, при отсутствии позитивной экспрессии bcl2 в клетках воспалительного инфильтрата признак оценивали как 2 балла, далее рассчитывали значение уравнения регрессии Y по следующей формуле:

Y=6-6⋅X₁+6⋅Х₂-14,8⋅Х₃+11,9⋅X₄+9,8⋅Х₅-10,3⋅Х₆+11,9⋅Х₇,

где

6 - значение коэффициента регрессии свободного члена;

X₁ - наличие участков некроза в ткани опухоли, X₁=1 балл в случае, если участки некроза в ткани опухоли отсутствуют; Х₁=2 балла, если участки некроза в ткани опухоли присутствую;

6 - значение коэффициента регрессии признака X₁;

6 - значение коэффициента регрессии признака Х₂;

-14,8 - значение коэффициента регрессии признака Х₃;

Х₄ - наличие в опухолевой ткани позитивной экспрессии р53, X₄=l балл, если позитивная экспрессия р53 в ткани опухоли отсутствует; X₄=2 балла, если позитивная экспрессия р53 в ткани опухоли присутствует;

11,9 - значение коэффициента регрессии признака Х₄;

9,8 - значение коэффициента регрессии признака Х₅;

-10,3 - значение коэффициента регрессии признака Х₆;

11,9 - значение коэффициента регрессии признака X₇,

далее вероятность развития лимфогенных метастазов Р определяют по формуле: Р=e^Y/(1+e^Y), где е - математическая константа, равная 2,72.

и при вероятности Р≥50% определяли высокий, а при вероятности Р<50% низкий риск развития лимфогенных метастазов

Таким образом, предлагаемый способ позволяет с высокой точностью и информативностью с помощью конкретных числовых показателей прогнозировать вероятность лимфогенного метастазирования у пациентов с колоректальным раком, в частности, при аденокарциноме толстой кишки, что может позволить оптимизировать тактику ведения таких больных как в плане коррекции объема лечения, так и в плане последующего послеоперационного динамического наблюдения.

Источники информации, использованные при составлении описания:

1. Bertelsen С., Kirkegaard-Klitbo A., Nielsen М, et al. Pattern of Colon Cancer Lymph Node Metastases in Patients Undergoing Central Mesocolic Lymph Node Excision: A Systematic Review // Dis Colon Rectum. - 2016. - Vol. 59(12). P. 1209-1221

2. Matsuda K., Hotta Т., Takifuji K., et al. Lymph nodes ratio is associated with the survival of colorectal cancer patients with peritoneal carcinomatosis // Am Surg. - 2011. - Vol. 77(5). P. 602-607

3. Ong M., Schofield J. Assessment of lymph node involvement in colorectal cancer // World J Gastrointest Surg. -2016. - Vol. 8(3). P. 179-192

4. Takaaki Fujii, Yuichi Tabe, Reina Yajuma et al. Process of distant lymph node metastasis in colorectal carcinoma: Implication of extracapsular invasion of lymph node metastasis // BMC Cancer. - 2011. - Vol.1 LP. 216

5. Ulintz P.J., Greenson J.K., Wu R., et al. Lymph Node Metastases in Colon Cancer Are Polyclonal // Clin Cancer Res. - 2018. - Vol. 24(9). P. 2214-2224

6. Крахмаль H.B., Вторушин C.B, Перельмутер В.М., Завьялова М.В., Слонимская Е.М., Денисов Е.В. Гетерогенность экспрессии маркеров, ассоциированных с инвазивным клеточным ростом, при раке молочной железы // Сибирский онкологический журнал. - 2016. - Том 15, №4. - С. 56-61

7. Pathology and Genetics of Tumours of the Digestive System / World Health Organization Classification of Tumours. - Lyon, France. - 2000. (P. l10)

Способ прогнозирования лимфогенного метастазирования при аденокарциноме толстого кишечника путем макроскопического исследования первичной опухоли, линий резекции и всех удаленных во время операции лимфатических узлов, а также морфологического исследования препаратов ткани первичной опухоли на светооптическом уровне по стандартной методике, отличающийся тем, что, при исследовании ткани опухоли детально оценивают наличие участков некроза, при отсутствии в ткани опухоли участков некроза признак оценивают, как 1 балл, при наличии в ткани опухоли участков некроза признак оценивают как 2 балла, после гистологического исследования ткани первичной опухоли проводят иммуногистохимическое исследование по стандартной методике согласно протоколам, для которого используют следующие антитела: Rb pAb to Beclin 1 (ab62472, Abcam), Rb Anti-mTOR PAb (E18590, Bioscience), p53 Protein (Clone DO-7, monoclonal mouse, RTU, Dako), Ki67 Antigen (Clone MIB-1, monoclonal mouse, RTU, Dako), Bcl2 Oncoprotein (Clone 124, monoclonal mouse, RTU, Dako), далее, исследуют экспрессию указанных маркеров в опухолевой ткани по следующим параметрам: процент опухолевых клеток с позитивной экспрессией белка beclin 1, процент опухолевых клеток с позитивной экспрессией белка m-TOR, наличие экспрессии белка р53 в ткани опухоли, характер экспрессии белка р53 в ткани опухоли, наличие экспрессии ki67 в клетках воспалительного инфильтрата, наличие экспрессии bcl2 в клетках воспалительного инфильтрата, при наличии в опухолевой ткани до 35% клеток с позитивной экспрессией белка beclin 1 признак оценивают как 1 балл, при наличии от 35% до 70% опухолевых клеток с позитивной экспрессией белка beclin 1 признак оценивают как 2 балла, в случаях наличия более 70% опухолевых клеток с позитивной экспрессией белка beclin 1 признак оценивают как 3 балла, при наличии в опухолевой ткани до 35% клеток с позитивной экспрессией белка m-TOR признак оценивают как 1 балл, при наличии от 35% до 70% опухолевых клеток с позитивной экспрессией белка m-TOR признак оценивают как 2 балла, в случаях наличия более 70% опухолевых клеток с позитивной экспрессией белка m-TOR признак оценивают как 3 балла, при отсутствии в ткани опухоли позитивной экспрессии р53 признак оценивают как 1 балл, при наличии в ткани опухоли позитивной экспрессии р53 признак оценивают как 2 балла, далее оценивают характер экспрессии р53 в ткани опухоли - гомогенный или гетерогенный, если в опухоли отмечается тотально негативная экспрессия или равномерная позитивная экспрессия маркера р53 одинаковой интенсивности окрашивания опухолевых клеток, то экспрессию оценивают как гомогенную, а сам признак оценивают как 1 балл, если в опухолевой ткани определяются участки с позитивной и негативной экспрессией маркера р53 одновременно, при этом позитивная экспрессия характеризуется различной интенсивностью иммунного окрашивания от слабо выраженного до резко интенсивного, то экспрессию оценивают как гетерогенную, а признак оценивают как 2 балла, при наличии в клетках воспалительного инфильтрата позитивной экспрессии ki67 признак оценивают как 1 балл, при отсутствии позитивной экспрессии ki67 в клетках воспалительного инфильтрата признак оценивают как 2 балла, при наличии в клетках воспалительного инфильтрата позитивной экспрессии bcl2 признак оценивают как 1 балл, при отсутствии позитивной экспрессии bcl2 в клетках воспалительного инфильтрата признак оценивают как 2 балла, далее рассчитывают значение уравнения регрессии Y по следующей формуле:

Y=6-6⋅X₁+6⋅Х₂-14,8⋅Х₃+11,9⋅Х₄+9,8⋅Х₅-10,3⋅Х₆+11,9⋅Х₇,

где

6 - значение коэффициента регрессии свободного члена;

6 - значение коэффициента регрессии признака X₁;

6 - значение коэффициента регрессии признака Х₂;

-14,8 - значение коэффициента регрессии признака Х₃;

Х₄ - наличие в опухолевой ткани позитивной экспрессии р53, Х₄=1 балл, если позитивная экспрессия р53 в ткани опухоли отсутствует; Х₄=2 балла, если позитивная экспрессия р53 в ткани опухоли присутствует;

11,9 - значение коэффициента регрессии признака Х₄;

X₅ - характер экспрессии р53 в ткани опухоли, X₅=l балл в случае наличия гомогенная экспрессия р53, X₅=2 балла в случае наличия гетерогенная экспрессия р53;

9,8 - значение коэффициента регрессии признака Х₅;

-10,3 - значение коэффициента регрессии признака Х₆;

11,9 - значение коэффициента регрессии признака Х₇,

далее вероятность развития лимфогенных метастазов Р определяют по формуле: Р=e^Y/(1+e^Y), где

е - математическая константа, равная 2,72.

и при вероятности Р≥50% определяют высокий, а при вероятности Р<50% определяют низкий риск развития лимфогенных метастазов.

Группа изобретений относится к биосенсорам для определения концентрации аналита в пробе жидкости. Тестовый сенсор для определения концентрации аналита в биологической жидкости содержит: сенсорную пластинку, включающую в себя зону приема жидкости и область вставки в порт; один или более контактов сенсора, расположенных в области вставки в порт; первый ряд оптически прозрачных и непрозрачных позиций, образующих кодовую комбинацию калибровки, расположенную в первой зоне области вставки в порт; и второй ряд оптически прозрачных и непрозрачных позиций, образующих кодовую комбинацию синхронизации, расположенную во второй зоне области вставки в порт, причем вторая зона отличается от первой зоны, так что один или более контактов сенсора расположены между первой зоной и второй зоной.

Способ прогнозирования развития сахарного диабета 2 типа у населения башкортостана // 2688208

Изобретение относится к медицине, а именно к эндокринологии, и касается прогнозирования развития сахарного диабета 2 типа у лиц, проживающих в Башкортостане. Для этого выделяют ДНК из лимфоцитов периферической венозной крови, осуществляют генотипирование методом полимеразной цепной реакции синтеза ДНК и проводят амплификацию участка rs2107538 гена хемокина CCL5 и участка rs6749704 гена хемокина CCL20.

Способ определения производных катехоламинов в моче // 2688184

Изобретение относится к способу определения производных катехоламинов в биологической жидкости (моче), который может найти применение в клинической диагностике. Способ определения производных катехоламинов в моче методом высокоэффективной жидкостной хроматографии отличается тем, что пробоподготовку образца осуществляют, пропуская образец исследуемой мочи через патрон для твердофазной экстракции ISOLUTE SCX, добавляют раствор 9-флуоренил-метоксикарбонил хлорида и выдерживают 20 минут при комнатной температуре, а затем смывают 5% раствором ацетата аммония в метаноле, далее полученный раствор анализируют УВЭЖХ, в качестве элюента используют двухкомпонентную систему, ацетонитрил: 0,1% муравьиная кислота, при скорости потока 0.45 мл/мин.

Способ прогнозирования сроков ответа на андроген-депривационную терапию у больных раком предстательной железы // 2688181

Изобретение относится к области медицины, а именно - онкологии, и может быть использовано для прогнозирования сроков ответа на андроген-депривационную терапию (АДТ) у больных раком предстательной железы (РПЖ).

Способ регистрации изменения поверхностного заряда эритроцитов // 2688178

Изобретение относится к медицине, а именно к лабораторной диагностике, и может быть использовано для определения изменения поверхностного заряда эритроцитов у пациентов.

Способ прогнозирования тяжелого течения диабетической полинейропатии и развития синдрома диабетической стопы // 2687978

Изобретение относится к медицине и может быть использовано для прогнозирования тяжелого течения диабетической полинейропатии (ДПН) и развития синдрома диабетической стопы (СДС).

Способ оценки степени тяжести хронического генерализованного пародонтита // 2687746

Способ относится к клинической медицине, а именно - к стоматологии и клинической лабораторной диагностике. Способ оценки степени тяжести хронического генерализованного пародонтита основан на цитологическом исследовании буккального (щечного) эпителия, при котором производится подсчет числа буккальных эпителиоцитов с конденсированным хроматином.

Способ дифференциальной диагностики инфекционного мононуклеоза эпштейна-барр-вирусной этиологии, острого бактериального тонзиллита и острого вирусного гепатита "в" у взрослых // 2687563

Изобретение относится к медицине и предназначено для дифференциальной диагностики инфекционного мононуклеоза Эпштейна-Барр-вирусной этиологии, острого бактериального тонзиллита и острого вирусного гепатита «В» у взрослых.

Способ определения степени риска внутриутробной инфекции плода у женщин, перенесших грипп a(h1n1) в период беременности // 2687486

Изобретение относится к медицине, а именно к инфекционным болезням, акушерству, и может быть использовано в лабораторной диагностике для выбора тактики ведения беременности и снижения риска развития внутриутробной инфекции новорожденного.

Способ дифференциальной диагностики грибовидного микоза от хронических дерматозов // 2687274

Изобретение относится к области медицины и представляет собой способ дифференциальной диагностики грибовидного микоза от хронических дерматозов, включающий проведение у больного конфокальной лазерной сканирующей микроскопии наиболее инфильтрированного участка кожи, выявление патоморфологических признаков и балльную оценку их степени выраженности, характеризующийся тем, что определяют F – суммарный диагностический индикатор указанных патоморфологических признаков по формуле , где p1 – эпидермальная деструкция (от 0 до 3 баллов); р2 – микроабсцессы Потрие (от 0 до 1 балла); р3 – присутствие атипичных лимфоцитов в эпидермисе (от 0 до 3 баллов); р4 – присутствие атипичных лимфоцитов в дермо-эпидермальном соединении (от 0 до 3 баллов); р5 – потеря контура сосочков (от 0 до 3 баллов); р6 – присутствие атипичных лимфоцитов в дерме (от 0 до 3 баллов); и при значении F<5,8 диагностируют хронический дерматоз, при значении 5,9≤F≤6,8 – диагноз не уточнен, а при значении F≥6,9 – грибовидный микоз.

Способ морфологического определения срока беременности // 2688693

Изобретение относится к медицине, а именно к патоморфологии, и может быть использовано для определения срока физиологически протекавшей беременности у женщин в I триместре. Для этого фрагменты соскоба из полости матки фиксируют в нейтральном 10% формалине в течение 24-48 часов при комнатной температуре. Далее обезвоживают в спиртах восходящей концентрации, заливают в парафин с последующим приготовлением срезов толщиной 4-5 мкм, которые помещают на предметное стекло и окрашивают гематоксилином и эозином. Полученные препараты помещают на предметный столик светового микроскопа и отбирают участки, содержащие компактный слой гравидарного эндометрия. С помощью видеокамеры, установленной на световом микроскопе, видимое поле зрения выводят на экран компьютера. Затем морфометрически определяют площади 30 или более децидуальных клеток и площади их ядер в 3-х или более полях зрения одного или нескольких препаратов. Далее определяют средние значения площади клетки и площади ядра и рассчитывают дискриминантную функцию (X) по формуле: X=К+К1 × ср.Sкл - К2 × ср.Sя, где X - срок беременности в акушерских неделях; К - коэффициент равный 3,414; К1 - коэффициент равный 0,019; cp.Sкл - средняя площадь клетки в мкм; К2 - коэффициент равный 0,008; ср.Sя - средняя площадь ядра в мкм. Изобретение обеспечивает достоверность и объективность морфологического заключения о сроке физиологически протекавшей беременности в первом триместре в акушерских неделях. 1 табл., 2 пр.

Способ подготовки образцов костной ткани человека для исследования методом растровой электронной микроскопии // 2688944

Изобретение относится к способу подготовки образцов поствитальной или пострезекционной костной ткани человека для исследования методом растровой электронной микроскопии. Способ характеризуется тем, что образцы вырезают абразивным кругом из костной заготовки, охлажденной жидким азотом, на 5 мин помещают в ультразвуковой диспергатор с ацетоном, далее погружают в заливочную эпоксидную смолу, сушат в вакууматоре в течение 24 ч при 60°C, после высушивания шлифуют шлифовальной бумагой вначале с дисперсностью 800, затем с дисперсностью 1200, далее полируют на сукне с алмазной пастой с зернистостью порошка в пасте 6 мкм и на заключительном этапе подготовки напыляют наночастицами углерода. Достигаемый при этом технический результат заключается в получении высокой контрастности исследуемой поверхности образцов костной ткани человека как материала для исследования в растровом электронном микроскопе, без использования токсичных реагентов при простоте исполнения и снижении материальных, трудовых и временных затрат. 4 ил.

Способ прогнозирования неразвивающейся беременности // 2689165

Изобретение относится к области медицинской диагностики, может быть использовано для прогнозирования неразвивающейся беременности. Способ прогнозирования неразвивающейся беременности включает выделение РНК из эпителиальных клеток цервикального канала на сроке 6-10 недель беременности, проведение обратной транскрипции с получением кДНК, определение экспрессии TLR2, TLR10 и IDO с помощью количественной полимеразной цепной реакции, оценку возраста начала менархе и прогноз вероятности развития неразвивающейся беременности на основании уравнений, полученных по результатам дискриминантного анализа: где x1 – уровень экспрессии мРНК TLR2 (отн.ед.), x2 - уровень экспрессии мРНК TLR10 (отн.ед.), x3 - уровень экспрессии мРНК IDO (отн.ед.), х4 – возраст менархе, при этом, если y1 больше y2, прогнозируют высокий риск развития неразвивающейся беременности, и если y1 меньше y2, то прогнозируют нормальное течение беременности. 3 табл.

Способ исследования архитектоники структурных элементов органов у мелких животных // 2689171

Изобретение относится к медицине, а именно к морфологии, и может быть использовано для исследования архитектоники структурных элементов глазного яблока у эмбрионов кур. Для этого глазное яблоко эмбриона фиксируют в 10% растворе формалина. Затем получают тонкие, не более 10 мкм гистологические срезы, которые окрашивают гематоксилин-эозином. Приклеивают срезы к предметным стеклам и заключают под покровное стекло. После чего полученные препараты подвергают микрофотографированию на 10, 15 и 20 день эмбрионального развития. Для этого зеркальный цифровой фотоаппарат закрепляют на штативе. Производят съемку и снимки обрабатывают через фоторедактирующие программы. Изобретение позволяет определить архитектонические изменения в органах мелких животных и у эмбрионов в различных возрастных периодах. 2 ил.

Способ определения оптимального криопротектора по цитохимическому показателю содержания сукцинатдегидрогеназы в лейкоцитах ауто-крови // 2689328

Изобретение относится к медицине, а именно к лабораторной диагностике. Способ определения оптимального криопротектора по цитохимическому показателю содержания сукцинатдегидрогеназы в лейкоцитах аутокрови заключается в том, что у больного до начала криогемотрансфузионной терапии получают порцию венозной крови, делят на равные части в пробирки, в одной из которых контрольная проба крови (КП) не содержит криопротектора, в другие добавляют по одной равной дозе тестируемых криопротекторов - опытные пробы (ОП), капли ОП и КП наносят в объеме 4 мкл на предметные стекла, из них делают тонкие мазки, высушивают на воздухе, готовят препараты по методике Нахласа в модификации Р.П. Нарциссова, лейкоциты микроскопируют в проходящем свете, проводят сравнительное исследование среднего цитохимического коэффициента (СЦК) сегментоядерных нейтрофилов и лимфоцитов с гранулами синего цвета СДГ ОП и КП; при равности значений СЦК ОП и СЦК КП тестируемый криопротектор оценивают как оптимальный для конкретного больного и пригодный к использованию; при значениях СЦК ОП, отличных от СЦК КП, делают заключение как о непригодном к использованию криопротекторе. 3 пр., 1 табл.

Способ определения персонифицированного криопротектора по лейкоцитарной кислой фосфатазе консервированной крови // 2689334

Изобретение относится к медицине, а именно к лабораторной диагностике. Способ определения персонифицированного криопротектора по лейкоцитарной кислой фосфатазе (ЛКФ) консервированной крови заключается в том, что у пациента до начала компонентной трансфузионной терапии эксфузируют порцию свежей аутокрови, стабилизируют раствором цитрата натрия, делят в пробирки на равные части, в контрольной пробе (КП) добавки криопротекторов исключают, в опытные пробы (ОП) добавляют по одной равной дозе тестируемых криопротекторов, перемешивают при плюс 37°С в течение 4 ч, капли приготовленных биологических жидкостей из ОП и КП наносят в объеме 4 мкл на предметные стекла, делают 2-3 мазка, высушивают на воздухе, фиксируют в 10% спирт-формалиновой смеси, лейкоциты окрашивают на кислую фосфатазу по методике азосочетания Берстона в модификации Ю.Ф. Руденса, И.М. Буйкиса, микроскопируют в проходящем свете, производят подсчет содержания ЛКФ в сегментоядерных (с/я) нейтрофилах и лимфоцитах с подсчетом среднего цитохимического коэффициента (СЦК); при совпадении значений показателей СЦК ОП и СЦК КП тестируемый криопротектор оценивают как оптимальный для конкретного больного и пригодным к использованию; при значениях СЦК ОП, отличных от СЦК КП, делают заключение как о непригодном к использованию криопротекторе. 1 табл., 3 пр.

Способ определения количества коллагена в ткани // 2689337

Изобретение относится к биотехнологии, гистологии и может быть использовано для количественного определения коллагена в ткани. Способ определения количества коллагена в ткани заключается в многократной гомогенизации материала, полученного путем замораживания, лиофильного высушивания, измельчения предварительно взвешенного кусочка ткани, с последующим ресуспендированием материала с помощью дозатора и центрифугированием, далее подготовленный материал замораживают при -80°С и лиофильно высушивают, полученный безводный материал взвешивают, определяют массу материала m1, разводят материал в 900 мкл буферного раствора с рН 7,0 и добавляют 100 мкл раствора коллализина, который заранее приготовляют путем растворения содержимого одной ампулы коллализина, содержащей коллагеназу в виде лиофилизата в количестве 1000 КЕ, в 2 мл буферного раствора с рН 7,0, пробирку с содержимым перемешивают в течение 2 часов, три раза проводят цикл гомогенизации, центрифугирования при 13400 оборотов в минуту и ресуспендирования материала, материал замораживают при -80°С, лиофильно высушивают и взвешивают, определяют массу материала m2, по разнице масс m1-m2 определяют массу коллагена.