Способ получения бактериальных антигенов

Изобретение относится к области медицины и биотехнологии и может быть использовано для получения антигенов из клеточных стенок бактерий, которые могут являться компонентами препаратов для профилактики и лечения хронических воспалительных заболеваний, вызываемых условно-патогенными микроорганизмами. Способ осуществляется следующим образом: к клеткам Staphylococcus aureus в количестве 109 клеток в изотоническом растворе добавляют смесь веществ - лизостафина в количестве 0.25U и высокомолекулярного хитозана, со средневесовой молекулярной массой 200 кДа, в количестве 100 мкг, инкубируют смесь в течение 5 мин при 37°С, отделяют бактериальные протопласты центрифугированием при 2500 g в течение 5 мин, полученный раствор, содержащий антигены, диализуют, концентрируют и высушивают лиофильно. Использование изобретения позволяет разработать простой и более дешевый способ получения антигенов из клеточных стенок бактерий, характеризующийся хорошей воспроизводимостью результатов, быстротой проведения реакции, малым расходом дорогостоящего фермента - лизостафина. 2 пр.

 

Изобретение относится к области биотехнологии, а именно к способам получения антигенов из клеточных стенок бактерий, которые могут являться кандидатами в качестве компонентов препаратов для профилактики и лечения хронических воспалительных заболеваний, вызываемых условно-патогенными микроорганизмами.

Борьба с инфекционными заболеваниями, вызываемыми резистентными штаммами бактерий рода Staphylococcus, и, в частности, золотистым стафилококком - Staphylococcus aureus, является одной из наиболее актуальных проблем медицины уже на протяжении длительного времени. Противовоспалительная, антибактериальная и симптоматическая терапия не обеспечивает положительный эффект, что ведет к хронизации процесса. Возникает необходимость в использовании препаратов, воздействующих на иммунологический статус организма, то есть в вакцинах. Однако, большинство стратегий вакцинации против S. aureus, концентрировались на однокомпонентных вакцинах на основе капсулярных полисахаридов или известных вирулентных факторов, обладающих мотивом LPXTG, таким как фибронектин-связывающий белок (FnBP), коллагено-подобный белок (CnBP), или хлопьеобразующий (клампинг) фактор A (ClfA), в качестве целей вакцинации [1, 2]. Однако, несмотря на перспективные результаты вакцинации, полученные на животных моделях, до сих пор большинство потенциальных вакцин, проверенных в клинических испытаниях, не обеспечили значительной зашиты от инфекции S. aureus [3]. Вместе с тем, в клеточных стенках бактерий присутствуют нековалентно связанные с ней белки - ACW-белки (anchorless cell wall proteins). Белки, принадлежащие к этому классу, не обладают ни консервативным сигнальным пептидом, ни мотивом LPXTG и признаны в качестве отдельных факторов вирулентности грамположительных бактерий [4]. Большинство из этих ACW-белков являются многофункциональными, например, они участвуют в различных метаболических путях, а также в адгезии к внеклеточному матриксу и инвазии в клетки макроорганизма. Такие белки не могут быть выявлены скринингом последовательности генома из-за отсутствия консервативных эпитопов, таких как LPXTG, а значит требуют непосредственного выделения из клеточных стенок для идентификации.

Существуют различные способы получения антигенов из клеточных стенок бактерий. Одним из них является способ основанный на дезинтеграции бактериальных клеток с добавлением солянокислого гидроксиламина, при этом процесс занимает длительное время - около 48 часов и нуждается в дополнительной очистке от цитоплазматических примесей [5]. Другой способ основан на полном или частичном лизисе пептидогликана клеточной стенки бактерии без нарушения целостности протопласта с использованием лизостафина (ЕС 3.4.24.75) [6] или трипсина [7]. Использование трипсина имеет преимущества в виде невысокой стоимости этого фермента, однако он практически не расщепляет муреиновый остов клеточной стенки золотистого стафилококка, к тому же трипсин частично разрушает получаемые белковые антигены. Поскольку трипсин не разрушает клеточную стенку стафилококка, то его можно использовать для получения антигенов, которые располагаются только на самой поверхности клетки, но не в самой клеточной стенке. Лизостафин в отличие от трипсина эффективно расщепляет муреиновую структуру клеточных стенок золотистого стафилококка, высвобождая максимально большое количество антигенов, которые ассоциированы с клеточной стенкой. Однако, лизостафин обладает высокой стоимостью, поэтому использование 5U лизостафина для получения антигенов из 3×109 клеток, как описано в работе [6] будет приводить к высокой стоимости полученных антигенов, а значит и вакцин полученных из этих антигенов таким способом.

В связи с этим задачей заявленного изобретения является разработка более доступного способа, позволяющего получать антигены из клеточных стенок бактерий с использованием лизостафина.

Поставленная задача достигается путем разработки способа получения антигенов из клеточных стенок бактерий, который предусматривает получение очищенной от культуральной жидкости суспензии S. aureus в количестве 109 клеток в 10 мл изотонического раствора, содержащем 30% маннитола, 10 мМ Трис-HCl, рН 7.5, 1 мМ ЭДТА, 1 мМ PMSF, добавление к суспензии смеси веществ - лизостафина в количестве 0.25U и высокомолекулярного хитозана, со средневесовой молекулярной массой 200 кДа, в количестве 100 мкг, инкубации смеси в течение 5 мин при 37°С, отделением бактериальных протопластов центрифугированием при 2500 g в течение 5 мин, диализом полученного раствора против против буфера 10 мМ Трис-HCl, рН 7.5, концентрированием антигенов в пробирках с мембранами с порами 5 кДа и лиофильным высушиванием. Использование лизостафина в сочетании с высокомолекулярным хитозаном позволялет снизить количество используемого фермента за счет эффекта, который был ранее нами описан в работе [8]: высокомолекулярный хитозаном - поликатион, взаимодействует с клеточной стенкой, экранирует полианионные компоненты клеточной стенки - тейхоевый кислоты, тем самым предотвращая связывание ими лизостафина, который заряжен положительно. Это позволяет снизить количество используемого дорогостоящего лизостафина с 5U до 0.25, то есть в 20 раз, с итоговым получением того же количества бактериальных антигенов. Стоимость высокомолекулярного хитозана составляет менее 1% от стоимости лизостафина (около 2000 руб. за 1 кг вещества в ценах 2018 года), поэтому практически не влияет на удорожание потенциального продукта.

Техническим результатом заявленного изобретения является разработка простого и более дешового способа получения антигенов из клеточных стенок бактерий, характеризующегося хорошей воспроизводимостью результатов, быстротой проведения реакции, малым расходом дорогостоящего фермента - лизостафина.

Пример 1. Получения антигенов из клеточных стенок S. aureus. Клетки S. aureus в количестве 109 клеток ресуспендируют в 10 мл изотонического раствора, содержащем 30% маннитола, 10 мМ Трис-HCl, рН 7.5, 1 мМ ЭДТА, 1 мМ PMSF. Затем к полученной суспензии добавляют смесь веществ - лизостафин в количестве 0.25U и высокомолекулярного хитозана, со средневесовой молекулярной массой 200 кДа, в количестве 100 мкг. При постоянном интенсивном но плавном перемешивании суспензию инкубируют в течение 5 мин при 37°С. Затем суспензию подвергают центрифугированию при 2500 g в течение 5 мин для отделения бактериальных протопластов. После отделения протопластов надосадочную жидкость, содержащую антигены, диализуют против буфера 10 мМ Трис-HCl, рН 7.5, (1:200 по объему) в течение 12 ч. После диализа раствор антигенов концентрируют и дополнительно промывают от маннитола буфером 10 мМ Трис-HCl, рН 7.5 антигенов в пробирках с мембранами с порами 5 кДа. После концентрирования антигенов раствор подвергают лиофильному высушиванию.

Пример 2. Получения антигенов из клеточных стенок проводим аналогично примеру 1, но вместо Staphylococcus aureus используем другой вид бактерий - Staphylococcus epidermidis.

ЛИТЕРАТУРА

1. Fattom, A.I., G. Horwith, S. Fuller, M. Propst, Naso R. / Development of StaphVAX, a polysaccharide conjugate vaccine against S. aureus infection: from the lab bench to phase III clinical trials. // Vaccine 2004. 22:880-887.

2. Rivas J.M., Speziale P., Patti J.M., M Hook. / MSCRAMM-targeted vaccines and immunotherapy for staphylococcal infection. // Curr. Opin. Drug Discov. Dev. 2004. 7:223-227.

3. Schaffer A.C., Lee J.C.. Vaccination and passive immunisation against Staphylococcus aureus. Int. J. Antimicrob. Agents 2008. 32(Suppl. 1):S71-S78.

4. Chhatwal G.S. 2002. Anchorless adhesins and invasins of Gram-positive bacteria: a new class of virulence factors. Trends Microbiol. 10:205-208.

5. Егорова Н.Б., Семенов Б.Ф., Курбатова E.A., Ефремова В.Н., Каверина К.Г., Михайлова Н.А. / Поликомпонентная вакцина для иммунопрофилактики и иммунотерапии заболеваний, вызываемых условно-патогенными микроорганизмами // Патент RU №2209081

6. Vytvytska О., Nagy Е., М., Meyer Н.Е., Kurzbauer R., Huber L.A., Klade C.S. / Identification of vaccine candidate antigens of Staphylococcus aureus by serological proteome analysis // Proteomics. 2002 (5):580-90.

7. Ventura C.L., Malachowa N., Hammer C.H., Nardone G.A., Robinson M.A., Kobayashi S.D., DeLeo F.R. / Identification of a novel Staphylococcus aureus two-component leukotoxin using cell surface proteomics // PLoS One. 2010 5(7):e11634. doi: 10.1371/journal.pone.0011634.

8. Куликов C.H., Хайруллин P.З., Варламов В.П. / Влияние поликатионов на антибактериальную активность лизостафина // Прикладная биохимия и микробиология 2015. Т. 51. №6. с. 610-615. DOI: 10.7868/S0555109915060082

Способ получения антигенов из клеточных стенок бактерий, отличающийся тем, что при его проведении к клеткам Staphylococcus aureus в количестве 109 клеток в изотоническом растворе добавляют смесь веществ - лизостафина в количестве 0.25U и высокомолекулярного хитозана, со средневесовой молекулярной массой 200 кДа, в количестве 100 мкг, инкубации смесь в течение 5 мин при 37°С, отделяют бактериальные протопласты центрифугированием при 2500 g в течение 5 мин, полученный раствор антигенов диализуют, концентрируют и высушивают лиофильно.



 

Похожие патенты:

Изобретение относится к области органической химии, а именно к гетероциклическому соединению формулы (I) и к его фармацевтически приемлемой соли, где R1 представляет собой Н; R2 представляет собой -(С1алкил)nN(R9)2; R3 и R5 представляют собой H; R4 представляет собой -фенил(R13)q; каждый R9 независимо выбран из группы, состоящей из H, -C1-3алкила, -(С1-3алкил)nциклопентила и -(С1-2алкил)N(R16)2; альтернативно, два смежных R9 могут вместе с атомами, к которым они присоединены, образовывать гетероциклил(R17)q, где гетероциклил выбирают из пиперазина, пирролидина и пиперидина; каждый R13 представляет собой заместитель, присоединенный к арильному кольцу, и независимо выбран из группы, состоящей из галогенида, -морфолинила, -N(R9)2 и -(С1алкил)nNHSO2R18; каждый R16, R17 и R18 представляют собой метил; A представляет собой C; каждый q является целым числом от 1 до 2; и каждый n является целым числом 0 или 1.

Изобретение относится к области органической химии, а именно к 3'-ароил-1-бензил-4'-гидрокси-1'-(2-гидроксиэтил)-6,6-диметил-6,7-дигидроспиро[индоло-3,2'-пиррол]-2,4,5'(1Н,1'Н,5Н)-трионам, обладающим анальгетической активностью, и способу их получения.

Изобретение относится к соединению, имеющему структуру: или к его фармацевтически приемлемой соли. Изобретение также относится к способу лечения состояния у животного при помощи указанного соединения, которое связывает LANCL2.

Изобретение относится к пиразолотиазоловому соединению, представленному формулой [I], где R1 представляет собой водород, С1-6алкил или С1-6алкокси; Z представляет собой -OR3 или -NR4R5; где R3 представляет собой С1-6алкил, С1-6алкил, замещенный С3-6циклоалкилом, С3-6циклоалкил, фенил или пиридил; R4 представляет собой водород или С1-6алкил; R5 представляет собой С1-6алкил, С3-6циклоалкил или насыщенную гетероциклическую группу, выбранную из оксана, пиперидина, пирролидина, оксетана, указанный С1-6алкил в R5 необязательно замещен одной или двумя группами, выбранными из группы, состоящей из следующих (1)-(5): (1) гидрокси,(2) С1-6алкокси и дифторС1-6алкокси, (3) С3-6циклоалкил, С3-6циклоалкил, замещенный (дифторС1-6алкокси)С1-6алкилом, и С3-6циклоалкил, замещенный С1-6алкоксиС1-6алкилом, (4) насыщенная гетероциклическая группа, выбранная из тетрагидропирана, необязательно замещенная (дифторС1-6алкокси)С1-6алкилом, и (5) фенил, замещенный фтором, и фенил, замещенный С1-6алкокси, указанный С3-6циклоалкил в R5 необязательно замещен одной или двумя группами, выбранными из группы, состоящей из следующих (1)-(3): гидрокси, (2) С1-6алкокси и дифторС1-6алкокси, и (3) нитрил, и указанные оксан, пиперидин, пирролидин, оксетан в R5 необязательно замещены одной группой, выбранной из группы, состоящей из следующих (1)-(3): (1) С1-6алкил, (2) С1-6алкилкарбонил, и (3) С1-6алкоксикарбонил; R2 представляет собой гидрокси или -NHR8, где R8 представляет собой гетероарил (пиримидин, тиазол), гетероарил (пиридин), необязательно замещенный фтором или С1-6алкилом, 1,2-оксазол, необязательно замещенный С1-6алкилом, или -COL1, -COOL2 или -SO2L3, указанный L1 представляет собой группу, выбранную из группы, состоящей из следующих (1)-(5): (1) С1-6алкил, дифторС1-6алкил и С1-6алкил, замещенный С1-6алкокси, (2) С3-6циклоалкил, (3) фенил, (4) пиридин и тиенил, и (5) С1-6диалкиламино и С3-6циклоалкиламино, указанный L2 представляет собой группу, выбранную из группы, состоящей из следующих (1)-(3): (1) С1-6алкил, моногалогенС1-6алкил, дигалогенС1-6алкил, тригалогенС1-6алкил, и С1-6алкил, замещенный С1-6алкокси, (2) С3-6циклоалкил, и (3) С1-6диалкиламиноС1-6алкил, и указанный L3 представляет собой С1-6алкил или С3-6циклоалкил, или его фармацевтически приемлемой соли или его гидрату.

Изобретение относится к новым соединениям (3Z,3'Z)-3,3'-[(2,6-диметилпиридин-3,5-диил)бис(2-оксоэтан-2-ил-1-илиден)]бис(3,4-дигидрохиноксалин-2(1H)-ону (Iа) и (3Z,3'Z)-3,3'-[(2,6-диметилпиридин-3,5-диил)бис(2-оксоэтан-2-ил-1-илиден)]бис(3,4-дигидро-2H-бензо[b][1,4]оксазин-2-ону (Ib) с общей формулой Iа, b.

Изобретение относится к области органической химии, а именно к производному пирролохинолина формулы (XIV) или к его стереоизомеру или фармакологически приемлемой соли или гидрату, где R1, R2 независимо представляют собой водород, алкокси(C1-C3) группу или независимо группу, выбранную из: циано, нитро, амино; T представляет собой CO, CH2, SO2; Ar представляет собой арил (6-членный), необязательно замещенный одним или двумя заместителями, выбранными из алкил(C1-C3) группы, алкил(C1-C3) группы, замещенной тремя атомами галогена, алкокси(C1-C3) группы, галогена, циано и амино; незамещенный биарил (10-членный); гетероарил (5-членный), содержащий 1 атом S и необязательно замещенный одним атомом галогена; гетероарил (9-10-членный), содержащий 1 гетероатом, выбранный из группы, состоящей из N и S, и необязательно замещенный одним или двумя заместителями, выбранными из алкил(C1-C3) группы и галогена; R3 представляет собой заместитель, выбранный из группы циклических или линейных, замещенных или незамещенных аминов, состоящей из структур (XV)-(XVIII), где A представляет собой NH, O, CH2, NR5; BR4 представляет собой NH, O; R5 представляет собой алкил(C1-C3) группу или бензил; R6 представляет собой алкил(C1-C3) группу; n выбирают из 0, 1, 2; m выбирают из 1, 2; l равно 1.

Группа изобретений относится к медицине и может быть использована для облегчения симптома аутоиммунного заболевания и хронического воспалительного заболевания. Способ включает идентификацию субъекта, у которого имеется аутоиммунное или воспалительное заболевание.

Изобретение относится к применению [(S)-1-карбамоил-2-(фенилпиримидин-2-иламино)этил]амид 2-(2-метиламинопиримидин-4-ил)-1H-индол-5-карбоновой кислоты для лечения боли, связанной с остеоартритом в коленном суставе, в том числе у пациентов с выпотом и синовитом.

Изобретение относится к области биохимии. Описана группа изобретений, включающая в себя аптамер, связывающийся с FGF2; комплекс для связывания аптамера с FGF2; лекарственные средства для лечения или профилактики заболевания, сопровождаемого ангиогенезом; заболевания костей и суставов; боли; способ лечения или профилактики вышеперечисленных заболеваний, применение вышеуказанного аптамера или комплекса в получении лекарственного средства для лечения или профилактики вышеперечисленных заболеваний.

Группа изобретений относится к химико-фармацевтической промышленности и представляет собой противоопухолевое и антиметастатическое средство, обладающее противовоспалительным и противоаллергенным действием, представляющее собой хлоргидрат 2-изобутил-4,6-диметил-5-оксипиримидина формулы 1 .

Изобретение относится к области ветеринарии и медицины и может быть использовано для лечения радиационных поражений организма. Для этого используют бактериальный радиозащитный препарат - стерильный фильтрат фаголизата патогенного штамма стафилококка, который вводят однократно подкожно в дозе 0,35-0,40 мг/кг живой массы через 24 ч после облучения.

Изобретение относится к биотехнологии, в частности к иммунологии, и представляет собой иммуногенный модифицированный белок, содержащий (i) белок, имеющий суперспиральный домен, и (ii), по меньшей мере, один положительно заряженный пептид, связанный с С-концом или N-концом суперспирального домена, где указанный модифицированный белок имеет последовательность, как показано в SEQ ID NO: 42 (IMX313P), или имеет последовательность, как показано в SEQ ID NO: 7.

Изобретение относится к области ветеринарии и представляет собой способ лечения острых лактационных маститов у свиноматок, заключающийся в том, что на кожу опорожненной молочной железы свиноматки тонким слоем наносят композицию, состоящую из димексида в количестве 1%, жидкого мыла в количестве 85-95% и стафилококкового анатоксина – остальное.

Группа изобретений относится к медицине, в частности к способу предупреждения и/или уменьшения тяжести сепсиса, ассоциированного с S. aureus, и к способу предупреждения и/или уменьшения тяжести пневмонии, ассоциированной с S.

Группа изобретений относится к медицине и раскрывает композицию и способы для лизиса, ингибирования, снижения развития резистентности грам-положительных бактерий, конкретно стафилококка и стрептококка, а также потенцирования антибиотической активности с использованием комбинаций лизина PlySs2 и одного или нескольких антибиотиков, включающих даптомицин, ванкомицин и оксациллин.

Настоящее изобретение относится к области фаговой терапии и касается композиции и способа ее использования. Представленная композиция содержит: первый и второй очищенные штаммы бактериофага, причем каждый из указанных штаммов имеет геном, характеризующийся по меньшей мере 99%-ной идентичностью последовательности по отношению к нуклеотидной последовательности, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO:1 и SEQ ID NO:2, демонстрирующие антибактериальную активность против Staphylococcus aureus; третий и четвертый очищенные штаммы бактериофага, имеющие геном, характеризующийся по меньшей мере 99%-ной идентичностью последовательности по отношению к нуклеотидным последовательностям SEQ ID NO:3 и SEQ ID NO:4 соответственно, демонстрирующие антибактериальную активность против Pseudomonas aeruginosa; и пятый очищенный штамм бактериофага, имеющий геном, характеризующийся по меньшей мере 99%-ной идентичностью последовательности по отношению к нуклеотидной последовательности SEQ ID NO:5, демонстрирующий антибактериальную активность против Acinetobacter baumannii.

Группа изобретений относится к способам и композициям для предотвращения, контроля и разрушения бактериальных биопленок с использованием лизина, имеющего способность к лизису стафилококковых и стрептококковых бактерий, включая резистентные к лекарственным средствам.

Группа изобретений относится к области медицины, а именно к способам и композициям для профилактики и лечения стафилококка у пациента. Лечебные композиции изобретения составляют лейкоцидин белка и его полипептида E и/или D и фармацевтически приемлемый носитель.

Изобретение относится к области биотехнологии, конкретно к получению модифицированных биотин-связывающих белков, и может быть использовано в медицине для индуцирования иммунного ответа против антигенного белка или пептида.

Изобретение относится к биохимии. Описано выделенное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент.

Изобретение относится к области медицины и биотехнологии и может быть использовано для получения антигенов из клеточных стенок бактерий, которые могут являться компонентами препаратов для профилактики и лечения хронических воспалительных заболеваний, вызываемых условно-патогенными микроорганизмами. Способ осуществляется следующим образом: к клеткам Staphylococcus aureus в количестве 109 клеток в изотоническом растворе добавляют смесь веществ - лизостафина в количестве 0.25U и высокомолекулярного хитозана, со средневесовой молекулярной массой 200 кДа, в количестве 100 мкг, инкубируют смесь в течение 5 мин при 37°С, отделяют бактериальные протопласты центрифугированием при 2500 g в течение 5 мин, полученный раствор, содержащий антигены, диализуют, концентрируют и высушивают лиофильно. Использование изобретения позволяет разработать простой и более дешевый способ получения антигенов из клеточных стенок бактерий, характеризующийся хорошей воспроизводимостью результатов, быстротой проведения реакции, малым расходом дорогостоящего фермента - лизостафина. 2 пр.

Наверх