Способ определения количества коллагена в ткани



Владельцы патента RU 2689337:

федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования "Северный государственный медицинский университет" Министерства здравоохранения Российской Федерации (RU)

Изобретение относится к биотехнологии, гистологии и может быть использовано для количественного определения коллагена в ткани. Способ определения количества коллагена в ткани заключается в многократной гомогенизации материала, полученного путем замораживания, лиофильного высушивания, измельчения предварительно взвешенного кусочка ткани, с последующим ресуспендированием материала с помощью дозатора и центрифугированием, далее подготовленный материал замораживают при -80°С и лиофильно высушивают, полученный безводный материал взвешивают, определяют массу материала m1, разводят материал в 900 мкл буферного раствора с рН 7,0 и добавляют 100 мкл раствора коллализина, который заранее приготовляют путем растворения содержимого одной ампулы коллализина, содержащей коллагеназу в виде лиофилизата в количестве 1000 КЕ, в 2 мл буферного раствора с рН 7,0, пробирку с содержимым перемешивают в течение 2 часов, три раза проводят цикл гомогенизации, центрифугирования при 13400 оборотов в минуту и ресуспендирования материала, материал замораживают при -80°С, лиофильно высушивают и взвешивают, определяют массу материала m2, по разнице масс m1-m2 определяют массу коллагена.

 

Изобретение относится к биотехнологии, гистологии и может быть использовано для количественного определения коллагена в ткани.

Известен способ количественного определения содержания коллагена, заключающийся в проведении реакции антиген-антитело с использованием меченых радиоактивными изотопами реактивов [1]. Недостатками указанного способа являются невозможность исследования образцов тканей (способ применим только для растворов), необходимость применения радиоактивных веществ.

Прототипом заявленного изобретения является способ количественного определения коллагена в ткани [2]. Положительными в данном способе являются его возможность точного определения концентрации коллагена, широкий спектр применения. Недостатками указанного способа являются технологическая сложность процедуры, необходимость применения хроматографа высокого давления, высокая стоимость применяемого оборудования и расходных материалов, реактивов.

Задача предлагаемого изобретения: расширение лабораторных возможностей количественного определения коллагена в тканях. Технический результат предлагаемого изобретения: уменьшение материальных и временных затрат в процессе количественного определения коллагена в тканях.

Указанная задача в предлагаемом способе достигается тем, что предварительно взвешенный замороженный при температуре -80°С в 0,9% физиологическом растворе хлорида натрия кусочек ткани лиофильно высушивают, измельчают микротомным лезвием, заливают 1 мл 15% водного раствора гидроксида натрия на 24 часа при температуре 18-20°С, повторяют процедуру, включающую гомогенизацию путем ресуспендирования дозатором, центрифугирование, аспирацию надосадочной жидкости и добавление воды до объема 1 мл, до достижения уровня рН надосадочной жидкости 7,0, но не менее 5 раз, подготовленный материал замораживают при - 80°С и лиофильно высушивают, полученный безводный материал взвешивают, определяют массу материала m1, разводят материал в 900 мкл буферного раствора с рН 7,0 и добавляют 100 мкл раствора коллализина, который заранее приготавливают путем растворения содержимого одной ампулы коллализина, содержащей коллагеназу в виде лиофилизата в количестве 1000 КЕ, в 2 мл буферного раствора с рН 7,0, пробирку с содержимым перемешивают в течение 2 часов, три раза проводят цикл гомогенизации, центрифугирования при 13400 оборотов в минуту в течение 5 минут и ресуспендирования материала, материал замораживают при -80°С, лиофильно высушивают и взвешивают, определяют массу материала m2, по разнице масс m1-m2 определяют количество коллагена.

Указанный способ осуществляется следующим образом. Предварительно взвешенный и замороженный при -80°С в 1 мл 0,9% физиологического раствора хлорида натрия кусочек ткани лиофильно высушивают в лиофильной сушилке при температуре -46°С и давлении 0,040 мБар, измельчают путем нарезания микротомным лезвием (или микротомным ножом) на максимально мелкие фрагменты толщиной не более 3 мм, можно меньше, помещают полученные фрагменты в градуированную пробирку Eppendorf, вместимостью 1,5 мл. Заливают фрагменты 1 мл 15% водного раствора гидроксида натрия на 24 часа при температуре 18-20°С, после чего удаляют из пробирки раствор щелочи путем аспирации дозатором и наливают дистиллированную воду при температуре 18-20°С в объеме 1 мл. Гомогенизируют материал путем ресуспендирования при помощи дозатора, выполняя многократную последовательную аспирацию содержимого пробирки дозатором и обратного впрыскивания в пробирку из дозатора материала в течение 2-3 минут, центрифугируют гомогенизированный материал в течение 5 минут при 13400 оборотах в минуту. После центрифугирования аспирируют дозатором надосадочную жидкость из пробирки таким образом, чтобы осадок на дне пробирки находился в объеме жидкости, не превышающем 0,5 мл, можно меньше, добавляют дистиллированную воду до объема 1 мл и повторно гомогенизируют материал способом, описанным выше. Процедуру, включающую гомогенизацию путем ресуспендирования дозатором, центрифугирование, аспирацию надосадочной жидкости и добавление воды до объема 1 мл повторяют до достижения уровня рН надосадочной жидкости 7,0, но не менее 5 раз. После достижения целевого уровня рН в надосадочной жидкости 7,0 аспирируют надосадочную жидкость дозатором таким образом, чтобы количество осадка в пробирке не превышало 0,3 мл. Полученный материал замораживают при -80°С, лиофильно высушивают в лиофильной сушилке и взвешивают на аналитических весах, определяют массу материала m1. Затем полученный безводный осадок разводят в 900 мкл буферного раствора с рН 7,0 и добавляют 100 мкл раствора коллализина, который заранее приготавливают путем растворения содержимого одной ампулы коллализина (содержащей коллагеназу в виде лиофилизата для приготовления раствора в количестве 1000 КЕ) в 2 мл буферного раствора с рН 7,0. Затем пробирку с содержимым устанавливают в шейкер при температуре 37°С и перемешивают в течение 2 часов. После этого пробирку снимают, центрифугируют при 13400 оборотов в минуту в течение 5 минут, аспирируют дозатором надосадочную жидкость, добавляют дистиллированную воду до объема 1 мл, гомогенизируют полученный материал путем многократной аспирации содержимого пробирки дозатором и обратного впрыскивания в пробирку. Процедуру, включающую гомогенизацию путем ресуспендирования дозатором, центрифугирование, аспирацию надосадочной жидкости и добавление воды до объема 1 мл повторяют 3 раза. После этого материал замораживают при -80°С, лиофильно высушивают в лиофильной сушилке и взвешивают на аналитических весах, определяя массу материала m2. По разнице масс m1-m2 определяют массу коллагена, содержавшегося в исследуемой ткани. Процентное содержание коллагена в ткани определяют отношением определенной массы коллагена к массе образца ткани.

Способ позволяет определить количество коллагена в ткани, снизить материальные и временные затраты на проведение анализа, избежать использования радиоактивных веществ.

ИСТОЧНИКИ ИНФОРМАЦИИ

1. Земсков В.М., Смирнов М.Д., Алексеев А.Б., Масенко В.П. Способ количественного определения коллагена. Описание изобретения к авторскому свидетельству №935792, заявка 2966207/30-15, 15.06.1982, бюллетень №22.

2. Виллануэва Патриция А., Макналти Эми К., Беникер Герберт Д., Киесветтер Кристин. Способ количественного определения коллагена в ткани. Патент №2452956, заявка 2009109113/15, 21.09.2006.

Способ определения количества коллагена в ткани, заключающийся в многократной гомогенизации материала, полученного путем замораживания, лиофильного высушивания, измельчения предварительно взвешенного кусочка ткани с последующим ресуспендированием материала с помощью дозатора и центрифугированием, отличающийся тем, что подготовленный материал замораживают при -80°С и лиофильно высушивают, полученный безводный материал взвешивают, определяют массу материала m1, разводят материал в 900 мкл буферного раствора с рН 7,0 и добавляют 100 мкл раствора коллализина, который заранее приготовляют путем растворения содержимого одной ампулы коллализина, содержащей коллагеназу в виде лиофилизата в количестве 1000 КЕ, в 2 мл буферного раствора с рН 7,0, пробирку с содержимым перемешивают в течение 2 часов, три раза проводят цикл гомогенизации, центрифугирования при 13400 оборотов в минуту и ресуспендирования материала, материал замораживают при -80°С, лиофильно высушивают и взвешивают, определяют массу материала m2, по разнице масс m1-m2 определяют массу коллагена.



 

Похожие патенты:

Изобретение относится к медицине, а именно к лабораторной диагностике. Способ определения персонифицированного криопротектора по лейкоцитарной кислой фосфатазе (ЛКФ) консервированной крови заключается в том, что у пациента до начала компонентной трансфузионной терапии эксфузируют порцию свежей аутокрови, стабилизируют раствором цитрата натрия, делят в пробирки на равные части, в контрольной пробе (КП) добавки криопротекторов исключают, в опытные пробы (ОП) добавляют по одной равной дозе тестируемых криопротекторов, перемешивают при плюс 37°С в течение 4 ч, капли приготовленных биологических жидкостей из ОП и КП наносят в объеме 4 мкл на предметные стекла, делают 2-3 мазка, высушивают на воздухе, фиксируют в 10% спирт-формалиновой смеси, лейкоциты окрашивают на кислую фосфатазу по методике азосочетания Берстона в модификации Ю.Ф.

Изобретение относится к медицине, а именно к лабораторной диагностике. Способ определения оптимального криопротектора по цитохимическому показателю содержания сукцинатдегидрогеназы в лейкоцитах аутокрови заключается в том, что у больного до начала криогемотрансфузионной терапии получают порцию венозной крови, делят на равные части в пробирки, в одной из которых контрольная проба крови (КП) не содержит криопротектора, в другие добавляют по одной равной дозе тестируемых криопротекторов - опытные пробы (ОП), капли ОП и КП наносят в объеме 4 мкл на предметные стекла, из них делают тонкие мазки, высушивают на воздухе, готовят препараты по методике Нахласа в модификации Р.П.

Изобретение относится к медицине, а именно к морфологии, и может быть использовано для исследования архитектоники структурных элементов глазного яблока у эмбрионов кур.

Изобретение относится к области медицинской диагностики, может быть использовано для прогнозирования неразвивающейся беременности. Способ прогнозирования неразвивающейся беременности включает выделение РНК из эпителиальных клеток цервикального канала на сроке 6-10 недель беременности, проведение обратной транскрипции с получением кДНК, определение экспрессии TLR2, TLR10 и IDO с помощью количественной полимеразной цепной реакции, оценку возраста начала менархе и прогноз вероятности развития неразвивающейся беременности на основании уравнений, полученных по результатам дискриминантного анализа: где x1 – уровень экспрессии мРНК TLR2 (отн.ед.), x2 - уровень экспрессии мРНК TLR10 (отн.ед.), x3 - уровень экспрессии мРНК IDO (отн.ед.), х4 – возраст менархе, при этом, если y1 больше y2, прогнозируют высокий риск развития неразвивающейся беременности, и если y1 меньше y2, то прогнозируют нормальное течение беременности.

Изобретение относится к способу подготовки образцов поствитальной или пострезекционной костной ткани человека для исследования методом растровой электронной микроскопии.

Изобретение относится к медицине, а именно к патоморфологии, и может быть использовано для определения срока физиологически протекавшей беременности у женщин в I триместре.
Изобретение относится к медицине и предназначено для прогнозирования лимфогенного метастазирования при аденокарциноме толстого кишечника. Исследуют ткани опухоли, проводят иммуногистохимическое исследование с антителами: Rb pAb to Beclin 1 (ab62472, Abeam), Rb Anti-mTOR PAb (El8590, Bioscience), p53 Protein (Clone DO-7, monoclonal mouse, RTU, Dako), Ki67 Antigen (Clone MIB-1, monoclonal mouse, RTU, Dako), Bcl2 Oncoprotein (Clone 124, monoclonal mouse, RTU, Dako).

Группа изобретений относится к биосенсорам для определения концентрации аналита в пробе жидкости. Тестовый сенсор для определения концентрации аналита в биологической жидкости содержит: сенсорную пластинку, включающую в себя зону приема жидкости и область вставки в порт; один или более контактов сенсора, расположенных в области вставки в порт; первый ряд оптически прозрачных и непрозрачных позиций, образующих кодовую комбинацию калибровки, расположенную в первой зоне области вставки в порт; и второй ряд оптически прозрачных и непрозрачных позиций, образующих кодовую комбинацию синхронизации, расположенную во второй зоне области вставки в порт, причем вторая зона отличается от первой зоны, так что один или более контактов сенсора расположены между первой зоной и второй зоной.

Изобретение относится к медицине, а именно к эндокринологии, и касается прогнозирования развития сахарного диабета 2 типа у лиц, проживающих в Башкортостане. Для этого выделяют ДНК из лимфоцитов периферической венозной крови, осуществляют генотипирование методом полимеразной цепной реакции синтеза ДНК и проводят амплификацию участка rs2107538 гена хемокина CCL5 и участка rs6749704 гена хемокина CCL20.

Изобретение относится к способу определения производных катехоламинов в биологической жидкости (моче), который может найти применение в клинической диагностике. Способ определения производных катехоламинов в моче методом высокоэффективной жидкостной хроматографии отличается тем, что пробоподготовку образца осуществляют, пропуская образец исследуемой мочи через патрон для твердофазной экстракции ISOLUTE SCX, добавляют раствор 9-флуоренил-метоксикарбонил хлорида и выдерживают 20 минут при комнатной температуре, а затем смывают 5% раствором ацетата аммония в метаноле, далее полученный раствор анализируют УВЭЖХ, в качестве элюента используют двухкомпонентную систему, ацетонитрил: 0,1% муравьиная кислота, при скорости потока 0.45 мл/мин.

Изобретение относится к медицине, а именно к лабораторной диагностике. Способ определения персонифицированного криопротектора по лейкоцитарной кислой фосфатазе (ЛКФ) консервированной крови заключается в том, что у пациента до начала компонентной трансфузионной терапии эксфузируют порцию свежей аутокрови, стабилизируют раствором цитрата натрия, делят в пробирки на равные части, в контрольной пробе (КП) добавки криопротекторов исключают, в опытные пробы (ОП) добавляют по одной равной дозе тестируемых криопротекторов, перемешивают при плюс 37°С в течение 4 ч, капли приготовленных биологических жидкостей из ОП и КП наносят в объеме 4 мкл на предметные стекла, делают 2-3 мазка, высушивают на воздухе, фиксируют в 10% спирт-формалиновой смеси, лейкоциты окрашивают на кислую фосфатазу по методике азосочетания Берстона в модификации Ю.Ф.

Изобретение относится к медицине, а именно к лабораторной диагностике. Способ определения оптимального криопротектора по цитохимическому показателю содержания сукцинатдегидрогеназы в лейкоцитах аутокрови заключается в том, что у больного до начала криогемотрансфузионной терапии получают порцию венозной крови, делят на равные части в пробирки, в одной из которых контрольная проба крови (КП) не содержит криопротектора, в другие добавляют по одной равной дозе тестируемых криопротекторов - опытные пробы (ОП), капли ОП и КП наносят в объеме 4 мкл на предметные стекла, из них делают тонкие мазки, высушивают на воздухе, готовят препараты по методике Нахласа в модификации Р.П.

Изобретение относится к области медицинской диагностики, может быть использовано для прогнозирования неразвивающейся беременности. Способ прогнозирования неразвивающейся беременности включает выделение РНК из эпителиальных клеток цервикального канала на сроке 6-10 недель беременности, проведение обратной транскрипции с получением кДНК, определение экспрессии TLR2, TLR10 и IDO с помощью количественной полимеразной цепной реакции, оценку возраста начала менархе и прогноз вероятности развития неразвивающейся беременности на основании уравнений, полученных по результатам дискриминантного анализа: где x1 – уровень экспрессии мРНК TLR2 (отн.ед.), x2 - уровень экспрессии мРНК TLR10 (отн.ед.), x3 - уровень экспрессии мРНК IDO (отн.ед.), х4 – возраст менархе, при этом, если y1 больше y2, прогнозируют высокий риск развития неразвивающейся беременности, и если y1 меньше y2, то прогнозируют нормальное течение беременности.

Группа изобретений относится к области диагностики в ветеринарии, в частности, к тесту для обнаружения антител против CSFV. Раскрыт способ обнаружения антител против вируса классической чумы свиней (CSFV) дикого типа в тестируемом образце, где указанный образец также может содержать антитела против мутантного эпитопа TAVSPTTLR из CSFV E2, где способ включает стадию совместной инкубации указанного тестового образца с иммобилизованным носителем, который содержит эпитоп TAVSPTTLR из CSFV E2 и с носителем, который содержит мутантный эпитоп TAVSPTTLR из CSFV E2.

Изобретение относится к пищевой промышленности и может быть использовано для определения сроков годности натуральных рыбных консервов. Для этого натуральные рыбные консервы хранят при температуре 30-55°С, периодически определяя по балльной системе органолептические показатели, кислотное число жира и содержание амино-аммиачного азота.

Изобретение относится к исследованию низкотемпературных свойств нефтепродуктов путем пропускания через них ультразвуковых волн и может быть использовано для экспрессного контроля температуры застывания и текучести в аналитических лабораториях нефтехимических предприятий, университетов и научно-исследовательских центров.
Изобретение относится к медицине, а именно к дерматологии, стоматологии и клинической лабораторной диагностике. Способ оценки эффективности лечения у больных с изолированной формой акантолитической пузырчатки полости рта включает исследование ротовой жидкости, в которой на 14 день лечения определяют концентрацию интерлейкина-4 (ИЛ-4), интерлейкина-6 (ИЛ-6) и интерлейкина-1β (ИЛ-1β) и при значениях ИЛ-4 46 пг/мл и выше, ИЛ-6 1,5 пг/мл и ниже, ИЛ-1β 85 пг/мл и ниже эффективность лечения оценивают как низкую, а при значениях ИЛ-4 43 пг/мл и ниже, ИЛ-6 2,0 пг/мл и выше, ИЛ-1β 89,0 пг/мл и выше эффективность лечения оценивают как высокую.
Изобретение относится к медицине, а именно к дерматологии, стоматологии и клинической лабораторной диагностике. Способ прогнозирования характера течения акантолитической пузырчатки у больных с изолированной формой пузырчатки полости рта включает определение в ротовой жидкости содержания интерлейкина-4 (ИЛ-4), интерлейкина-6 (ИЛ-6) и интерлейкина-1β (ИЛ-1β) и при значениях ИЛ-6 1,9 пг/мл и ниже, ИЛ-1β 87 пг/мл и ниже, а ИЛ-4 46 пг/мл и выше прогнозируют вероятность перехода в тяжелую форму заболевания.

Изобретение относится к области медицины, в частности к медицинской генетике и оториноларингологии, и предназначено для выявления мутаций гена GJB2, обуславливающих аутосомно-рецессивную глухоту 1А типа.

Изобретение относится к области медицины, в частности к онкогинекологии, и предназначено для неинвазивной диагностики серозных пограничных цистаденом и высокой степени злокачественности цистаденокарцином яичников.

Изобретение относится к биотехнологии, гистологии и может быть использовано для количественного определения коллагена в ткани. Способ определения количества коллагена в ткани заключается в многократной гомогенизации материала, полученного путем замораживания, лиофильного высушивания, измельчения предварительно взвешенного кусочка ткани, с последующим ресуспендированием материала с помощью дозатора и центрифугированием, далее подготовленный материал замораживают при -80°С и лиофильно высушивают, полученный безводный материал взвешивают, определяют массу материала m1, разводят материал в 900 мкл буферного раствора с рН 7,0 и добавляют 100 мкл раствора коллализина, который заранее приготовляют путем растворения содержимого одной ампулы коллализина, содержащей коллагеназу в виде лиофилизата в количестве 1000 КЕ, в 2 мл буферного раствора с рН 7,0, пробирку с содержимым перемешивают в течение 2 часов, три раза проводят цикл гомогенизации, центрифугирования при 13400 оборотов в минуту и ресуспендирования материала, материал замораживают при -80°С, лиофильно высушивают и взвешивают, определяют массу материала m2, по разнице масс m1-m2 определяют массу коллагена.

Наверх