Фармацевтическая композиция на основе n-бензил-n-метил-1-фенилпирроло [1,2-a] пиразин-3-карбоксамида

Изобретение относится к фармацевтической композиции, обладающей анксиолитической активностью. Фармацевтическая композиция для получения твердой лекарственной формы содержит N-бензил-N-метил-1-фенилпирроло[1,2-а]пиразин-3-карбоксамид и фармацевтически приемлемые вспомогательные вещества в указанном соотношении, мас.%: N-бензил-N-метил-1-фенилпирроло[1,2-а]пиразин-3-карбоксамид - 1,0; микрокристаллическая целлюлоза - 88,0; поперечносшитый поливинилпирролидон - 4,0; поливинилпирролидон - 6,0; магния стеарат - 1,0. Изобретение обеспечивает расширение арсенала лекарственных средств, обладающих анксиолитическим действием, повышает биодоступность действующего вещества за счет используемых вспомогательных веществ. 2 з.п. ф-лы, 7 табл., 7 пр.

 

Изобретение относится к медицине, в частности к фармации, и касается фармацевтической композиции, содержащей в качестве действующего вещества фармацевтическую субстанцию N-бензил-N-метил-1-фенилпирроло[1,2-а]пиразин-3-карбоксамида (ГМЛ-1), а также фармацевтически приемлемые вспомогательные вещества при определенном количественном соотношении компонентов, выполненной в виде твердой лекарственной формы (таблетки, капсулы). Фармацевтическая композиция по изобретению обладает выраженной анксиолитической активностью, улучшенной биодоступностью и улучшенными технологическими характеристиками по сравнению с субстанцией, нетоксично и не вызывает побочных эффектов, характерных для большинства транквилизаторов.

Невротические расстройства сегодня называют самым частым видом психических заболеваний во всем мире. По данным ВОЗ распространенность выраженных невротических расстройств в развитых странах - примерно 15%, а их скрытые формы встречаются более чем у половины населения [World Health Statistics 2017. Monitoring Health for the SDGs, WHO: 2017. 103 p.; World Health Statistics 2016. Monitoring Health for the SDGs, WHO: 2016. 121 p]. Немаловажным является и социально-экономическое значение невротических расстройств (оплата нетрудоспособности, расходы на лечение, снижение работоспособности), а также их психологическая роль (влияние на личностные и социальные контакты) в жизни человека, что делает разрешение этой проблемы особенно актуальным. Одним из характерных клинических проявлений невротических расстройств являются тревожные расстройства.

Начиная с 50-х годов XX века проводятся активные поиски новых молекул, обладающих анксиолитическим (транквилизирующим, противотревожным) действием, и ведутся разработки лекарственных форм на их основе. Сегодня группа транквилизаторов (анксиолитиков) насчитывает более 100 препаратов. Только в наиболее популярном ряду производных 1,4-бензодиазепина синтезировано свыше 3 тыс. соединений, из которых более 40 используется в клинической практике [Воронина Т.А., Середенин С.Б. Перспективы поиска анксиолитиков // Эксперим. и клин. фармакология. 2002. Т. 65, №5. С. 4-17].

Однако для транквилизаторов и, в особенности, для бензодиазепинов, характерны проявления таких побочных эффектов как гиперседация (дозозависимая дневная сонливость, снижение уровня бодрствования, нарушение координации внимания, забывчивость и др.), миорелаксация (расслабление скелетной мускулатуры, проявляющееся общей слабостью, слабостью в отдельных группах мышц), «поведенческая токсичность» (легкое нарушение когнитивных функций и психомоторных навыков, проявляющееся даже в малых дозах и выявляемое при нейропсихологическом тестировании), «парадоксальные» реакции (усиление агрессивности и ажитации (возбужденное состояние), нарушения сна, обычно проходящие самопроизвольно или после снижения дозы), психическая и физическая зависимость, возникающая при длительном применении (6-12 месяцев непрерывно), проявления которой напоминают невротическую тревогу [Бородин В.И. Побочные эффекты транквилизаторов и их роль в пограничной психиатрии // Психиатр. и психофармакол. 2000. №3. С. 72-74]. Бензодиазепины могут вызывать артериальную гипотензию (особенно при парентеральном введении), сухость во рту, диспепсию (тошнота, рвота, диарея или запор), повышение аппетита и потребления пищи, дизурию (расстройства мочеиспускания), нарушение полового влечения и потенции, а также могут повышать внутриглазное давление, поэтому противопоказаны при закрытоугольной глаукоме. При длительном применении возможно развитие толерантности [Лоуренс Д.Р., Бенитт П.Н. Побочные эффекты лекарственных веществ // Клиническая фармакология: В 2 т. / Пер. с англ. М.: Медицина, 1993. Т. 1. С. 254-294, Т. 2. С. 54-80].

Периферический бензодиазепиновый рецептор, более известный как транслокаторный протеин (18 kDa) (TSPO) представляет собой обогащенный триптофаном белок, локализующийся преимущественно на наружной мембране митохондрий в тканях, продуцирующих стероидные гормоны, таких как ткани здорового головного мозга, яичников, тестикул, надпочечников и др. [A. Beurdeley-Thomas et al., J. Neuro-Oncol. 2000; 46: 45-56]. TSPO участвует в транспорте холестерина от внешней к внутренней митохондриальной мембране, что является лимитирующей стадией в синтезе стероидов и нейростероидов [V. Papadopoulos et al., Mol. Cell Endocrinol. 2007; 266: 59-64]. Хорошо известно, что нейростероиды, усиливающие нейромедиаторную функцию ГАМК, играют ключевую роль в функционировании центральной нервной системы, формировании психического статуса, эмоций, поведения, обучения и памяти [N.J. Alkayed et al., J. of the Amer. Heart Assoc. 2000; 31: 161-168]. Поэтому считается перспективным использование TSPO в качестве мишени для создания лекарственных средств для лечения нейрональных заболеваний.

Известно, что снижение экспрессии TSPO наблюдается при генерализованных тревожных расстройствах, социальных тревожных расстройствах, посттравматических стрессовых расстройствах, и панических расстройствах у пожилых людей, а также при коморбидных тревожных расстройствах или суицидальном поведении пациентов с депрессией или биполярным расстройством. Кроме того, генетические исследования показали, что у пациентов с депрессией и тревожными расстройствами, наблюдается высокая частота Ala147Thr полиморфизма в TSPO, который может оказывать влияние на синтез нейростероида прегненолона. При шизофрении, снижение уровня экспрессии TSPO также связывают с тревогой, стрессовым состоянием, агрессией. Кроме того, предполагается, что генетический полиморфизм в экзоне 4, кодирующем TSPO, увеличивает восприимчивость к паническим расстройствам. Так как эндогенные нейростероиды имеют очень короткое время жизни в биологических средах [Mellon SH, Gong W, Schonemann MD. Brain Res. Rev. 2008; 57(2): 410-440], их непосредственное применение в клинике затруднено. В то же время, использование физиологического потенциала нейростероидных гормонов может быть достигнуто путем модуляции рецептора TSPO при помощи его лигандов.

В настоящее время ведется поиск лигандов TSPO в качестве перспективных кандидатов для фармакотерапии ряда неврологических и психиатрических расстройств, включая тревожные и депрессивные состояния [Rupprecht R, Papadopoulos V, Rammes G, et al. Translocator protein (18 kDa) (TSPO) as a therapeutic target for neurological and psychiatric disorders. Nat Rev Drug Discov. 2010; 9(12): 971-988; Nothdurfter C, Rammes G, Baghai TC, et al., Translocator protein (18 kDa) as a target for novel anxiolytics with a favourable side-effect profile. J Neuroendocrinol. 2012; 24(1): 82-92].

Среди лигандов TSPO известны производные изохинолинов (РК11195) [М. Gavish, et al, J. Neurochem., 1992, 58, 1589-1601]; производные хинолинов; производные бензоксазепинов (OXA-17f) [G. Campiani, et. al, J. Med. Chem., 1996; 39: 3435-3450]; производные бензотиазепинов (THIA-4i) [I. Fiorini, et al., J. Med. Chem., 1994; 37: 1427-1438]; производные индолацетамидов (FGIN-1-27) [E. Romeo, et al, J. Pharmacol. Exp. Ther., 1992; 262: 971-978]; производные имидазопиридинов (алпидем, CB-34) [G. Trapani, et al, J. Med. Chem., 1999; 42: 3934-41]; производные пиразолопиримидинов (PYRA-3q) [S. Selleri, et al, Bioorg. Med. Chem., 2001; 9: 2661-2671]; трициклические лиганды [A. Capelli, et al., Bioorg. Med. Chem., 2008; 16: 3428-3437]; тетрациклические лиганды и производные бензимидазолов [Т. Okubo, et al., Bioorg. Med. Chem., 2004; 12: 3569-3580]; производные хиназолинов [S. Castellano, et al., J. Med. Chem., 2012; 55: 4506-4510]; производные пиразолохинолинов [A. Capelli, et al., J. Med. Chem., 2011; 54: 7165-7175]; производные пурина (XBD-173 (эмапунил) [A. Kita, et al., Br. J. Pharmacol., 2004, 142, 1059-1072] производные имидазопиридазинов [US Patent 8492379 (2013)].

Недостатком полученных на сегодняшний день лигандов TSPO, является наличие у них нежелательных побочных эффектов, низкая биодоступность и токсичность, вследствие чего не создано практически ни одного эффективного нейропсихотропного препарата.

В НИИ фармакологии имени В.В. Закусова создана новая группа лигандов TSPO относящихся к классу пирролопиразинов, а именно к 1-арилпирроло[1,2-а]пиразин-3-карбоксамидам [Патент РФ №2572076]. Исследование анксиолитической активности веществ этой группы с использованием тестов «Открытое поле со световой вспышкой» и «приподнятый крестообразный лабиринт» (ПКЛ) подтвердило ее наличие у ряда соединений. Наиболее эффективным оказалось соединение N-бензил-N-метил-1-фенилпирроло[1,2-а]пиразин-3-карбоксамид (ГМЛ-1), которое в обоих тестах в интервале доз от 0,1 до 5,0 мг/кг обладало выраженной анксиолитической активностью, сопоставимой с активностью диазепама в дозе 1,0 мг/кг и при этом не обладало характерными для диазепама седативным, миорелаксантным и амнестическим побочными эффектами Дурнев А.Д. Незнамов Г.Г., Ярков С.А., Мокров Г.В., Гудашева Т.А., Яркова М.А., Середенин С.Б. Эксп. и клин. фармакология. 2016; Т. 79 (1): 7-11].

Изучение фармакокинетики на крысах при пероральном и внутрибрюшинном введении с использованием метода ВЭЖХ/МС показало, что вещество проникает через ГЭБ. Радиолигандным методом установлено, что ГМЛ-1 обладает высокой аффинностью по отношению к TSPO (Ki=5,2*10^-8 М) [G.V. Mokrov, О.А. Deeva, Т.А. Gudasheva, S.A. Yarkov, М.А. Yarkova, S.B. Seredenin. Bioorg. & Med. Chem., 2015, V. 23, P. 3368-3378]. Доказано, что механизм фармакологического действия N-бензил-N-метил-1-фенилпирроло[1,2-а]пиразин-3-карбоксамида обусловлен его взаимодействием с TSPO-рецептором, селективная блокада которого соединением РК11195 приводит к полному исчезновению анксиолитического эффекта. Кроме того, был доказан нейростероидогенезный механизм анксиолитического действия ГМЛ-1 путем исследования влияния двух ингибиторов биосинтеза нейростероидов - трилостана и финастерида. Установлено, что трилостан и финостерид полностью блокировали анксиолитическое действие ГМЛ-1 [М.А. Яркова, Г.В. Мокров, Т.А. Гудашева, С.Б. Середенин. Хим.-фарм. журнал. 2016, т. 50, №8, стр. 3-6]. Вещество обладает низкой острой токсичностью: LD₅₀>1000 мг/кг, где LD₅₀ - средняя доза вещества, вызывающая гибель половины группы животных.

Предпочтительно получение твердой лекарственной формы (ЛФ), в частности таблетки или капсулы, которые обладают большими преимуществами по сравнению с другими ЛФ, среди которых наиболее важными являются удобство в применении, что обеспечивает комплаенс пациентов, а также длительный срок годности.

Задачей настоящего изобретения является разработка фармацевтической композиции на основе N-бензил-N-метил-1-фенилпирроло[1,2-а]пиразин-3-карбоксамида, характеризующейся высокой анксиолитической активностью, обладающей соответствующими свойствами для получения твердой ЛФ, в частности таблетки или капсулы, критерии качества которых удовлетворяют требованиям ГФ XIII издания.

Техническим результатом изобретения является расширение арсенала лекарственных средств, обладающих анксиолитическим действием, малой токсичностью и отсутствием побочных эффектов, характерных для многих анксиолитиков. Также техническим результатом является повышение биодоступности действующего вещества и улучшение технологических характеристик по сравнению с субстанцией. Также техническим результатом изобретения является повышение удобства в применении, хранении и транспортировки твердой лекарственной форм.

Решение поставленной задачи достигалось путем создания фармацевтической композиции, выполненной в твердой лекарственной форме, содержащей терапевтически эффективное количество N-бензил-N-метил-1-фенилпирроло[1,2-а]пиразин-3-карбоксамида в комбинации со вспомогательными веществами в количествах, находящихся преимущественно в следующих интервалах:

В качестве наполнителя указанной фармацевтической композиции могут быть использованы соединения, обеспечивающие необходимую массу таблетке. Желательно вводить наполнитель в количестве, близком к нижнему пределу интервала массы наполнителя. Предпочтительными наполнителями являются сахара, такие как лактоза, и производные целлюлозы, такие как, микрокристаллическая целлюлоза, наиболее предпочтительно - микрокристаллическая целлюлоза с размером частиц 101.

В качестве связующего в данной фармацевтической композиции могут быть использованы производные полимера поливинилпирролидона, предпочтительно поливинилпирролидона с молекулярной массой 28000-34000 (Kollidon 25, BASF, Германия). В качестве растворителя для приготовления связующего раствора предпочтительно использовать воду очищенную или спирт этиловый.

В качестве дезинтегрирующего вещества, облегчающего диспергирование таблетки в среде организма, используют поперечносшитый поливинилпирролидон, натрия крахмала гликолят или кроскармелозу натрия. Предпочтительно использовать поперечносшитый поливинилпирролидон (Кросповидон (Polyplasdone XL, BASF, Германия).

В качестве скользящего вещества, способного устранить проблемы, связанные с формованием таблетки, например, налипание таблеточной массы на пуансоны при таблетировании, преимущественно использование производные высших жирных кислот и их соли, в частности магния стеарат.

Фармацевтическая композиция выполнена в твердой форме, любым подходящим для этого способом, преимущественно в виде таблетки или капсулы, содержащей 0,00005-0,005 г (0,06-6,25%) N-бензил-N-метил-1-фенилпирроло[1,2-а]пиразин-3-карбоксамида.

На основе данной фармацевтической композиции получают таблетки любым подходящим для этого способом. Для изготовления таблеток преимущественно применение технологии влажного гранулирования.

Осуществление настоящего изобретения демонстрируется следующими примерами, не ограничивающими его объем. Количество ингредиентов фармацевтической композиции, использованных в примерах, представлено в граммах (г).

Пример 1.

1. Отвешивание и просеивание сырья. Отвешивают и просеивают 880,0 г микрокристаллической целлюлозы 101, 40,0 г кросповидона, 10,0 г магния стеарата и 10,0 г N-бензил-N-метил-1-фенилпирроло[1,2-а]пиразин-3-карбоксамида.

2. Приготовление 12% раствора Kollidon 25: отмеривают 440,0 г воды очищенной, добавляют 60,0 г Kollidon 25 перемешивают до полного растворения Kollidon 25.

3. Увлажнение. Полученным раствором увлажняют предварительно приготовленную смесь, состоящую из 880,0 г микрокристаллической целлюлозы 101, 20,0 г кросповидона и 10,0 г N-бензил-N-метил-1-фенилпирроло[1,2-а]пиразин-3-карбоксамида.

4. Влажное гранулирование. Пробивают увлажненную смесь через сито (d=2 мм).

5. Сушка. Полученный гранулят сушат в сушильном шкафу при t=40-45°C до полного высушивания необходимое количество времени.

6. Сухое гранулирование и опудривание. Высушенную смесь пробивают повторно через сито (d=2 мм) и опудривают 20,0 г кросповидона в течение 2-5 минут; затем - 10,0 г магния стеарата в течение 1-3 минут.

7. Таблетирование. Из полученного гранулята получают таблетки массой 0,100 г в количестве 10000 таблеток.

Пример 2.

1. Отвешивание и просеивание сырья. Отвешивают и просеивают 1325,0 г микрокристаллической целлюлозы 101, 80,0 г кросповидона, 15,0 г натрия стеарил фумарата и 50,0 г N-бензил-N-метил-1-фенилпирроло[1,2-а] пиразин-3-карбоксамида.

2. Приготовление 8% раствора Kollidon 25: отмеривают 345,0 г воды очищенной, добавляют 30,0 г Kollidon 25 перемешивают до полного растворения Kollidon 25.

3. Увлажнение. Полученным раствором увлажняют предварительно приготовленную смесь, состоящую из 1325,00 г микрокристаллической целлюлозы 101, 60,0 г кросповидона и 50,0 г N-бензил-N-метил-1-фенилпирроло[1,2-а]пиразин-3-карбоксамида.

4. Влажное гранулирование. Пробивают увлажненную смесь через сито (d=2 мм).

5. Сушка. Полученный гранулят сушат в сушильном шкафу при t=40-45°C до полного высушивания необходимое количество времени.

6. Сухое гранулирование и опудривание. Высушенную смесь пробивают повторно через сито (d=2 мм) и опудривают 20,0 г кросповидона в течение 2-5 минут; затем - 15,0 г натрия стеарил фумарата в течение 1-3 минут.

7. Таблетирование. Из полученного гранулята получают таблетки массой 0,150 г в количестве 10000 таблеток.

Пример №3.

1. Отвешивание и просеивание сырья. Отвешивают и просеивают 721,0 г микрокристаллической целлюлозы 101, 50,0 г натрия крахмала гликолята, 8,0 г натрия стеарил фумарата и 1,0 г N-бензил-N-метил-1-фенилпирроло[1,2-а] пиразин-3-карбоксамида.

2. Приготовление 10% раствора Kollidon 25: отмеривают 180,0 г воды очищенной, добавляют 20,0 г Kollidon 25 перемешивают до полного растворения Kollidon 25.

3. Увлажнение. Полученным раствором увлажняют предварительно приготовленную смесь, состоящую из 721,0 г микрокристаллической целлюлозы 101, 50,0 г натрия крахмала гликолята и 1,0 N-бензил-N-метил-1-фенилпирроло[1,2-а]пиразин-3-карбоксамида.

4. Влажное гранулирование. Пробивают увлажненную смесь через сито (d_o=2 мм).

5. Сушка. Полученный гранулят сушат в сушильном шкафу при t=40-45°C до полного высушивания необходимое количество времени.

6. Сухое гранулирование и опудривание. Высушенную смесь пробивают повторно через сито (d=2 мм) и опудривают 8,00 г натрия стеарил фумарата в течение 1-3 минут.

7. Капсулирование. Полученным гранулятом заполняют твердые желатиновые капсулы количеством по 80 мг в количестве 10000 капсул.

Пример №4.

1. Отвешивание и просеивание сырья. Отвешивают и просеивают 737,0 г микрокристаллической целлюлозы 101, 30,0 г натрия крахмала гликолята, 8,0 г натрия стеарил фумарата и 5,0 г N-бензил-N-метил-1-фенилпирроло[1,2-а]пиразин-3-карбоксамида.

2. Приготовление 12% раствора Kollidon 25: отмеривают 146,0 г воды очищенной, добавляют 20,0 г Kollidon 25 перемешивают до полного растворения Kollidon 25.

3. Увлажнение. Полученным раствором увлажняют предварительно приготовленную смесь, состоящую из 737,0 г микрокристаллической целлюлозы 101, 30,0 г натрия крахмала гликолята и 5,0 N-бензил-N-метил-1-фенилпирроло[1,2-а]пиразин-3-карбоксамида.

4. Влажное гранулирование. Пробивают увлажненную смесь через сито (d_o=2 мм).

5. Сушка. Полученный гранулят сушат в сушильном шкафу при t=40-45°C до полного высушивания необходимое количество времени.

6. Сухое гранулирование и опудривание. Высушенную смесь пробивают повторно через сито (d=2 мм) и опудривают 8,00 г натрия стеарил фумарата в течение 1-3 минут.

7. Таблетирование. Из полученного гранулята получают таблетки массой 80 мг в количестве 10000 таблеток.

Таблетки или капсулы, полученные из всевозможных композиций изобретения, содержат от приблизительно 0,00005 до 0,005 г (0,06-6,25 мас. %) N-бензил-N-метил-1-фенилпирроло[1,2-а]пиразин-3-карбоксамида на одну таблетку или капсулу. Масса полученной таблетки/содержимого капсулы предпочтительно составляет от 80 мг до 150 мг.

В таблицах 1 и 2 приведены средние значения технологических характеристик субстанции ГМЛ-1, таблеточной смеси и таблеток, выполненных на ее основе по примеру 1. Технологические характеристики измерялись согласно методикам, указанным в ГФ XIII издания, выпуск 2.

Об улучшении технологических свойств субстанции ГМЛ-1 в составе фармацевтической композиции свидетельствует увеличение степени сыпучести и уменьшение угла естественного откоса, а также оптимизация показателя насыпной плотности, имеющей большое значение в процессе таблетирования (однородность массы дозирования). На основе данных насыпной плотности рассчитаны безразмерные показатели Карра и Хауснера, значения которых позволяют наглядно судить об улучшении технологических характеристик новой фармацевтической композиции, содержащей N-бензил-N-метил-1-фенилпирроло[1,2-a]пиразин-3-карбоксамид, а именно, сыпучести таблеточной массы и ее прессуемости.

*¹ - характеризуется как "неудовлетворительная" (ГФ XIII, вып. 2, ОФС.1.4.2.0016.15);

*² - характеризуется как "хорошая" (ГФ XIII, вып. 2, ОФС.1.4.2.0016.15);

*³ - характеризует степень сыпучести таблеточной смеси; считается удовлетворительным при значении менее 20% [Carr R. Evaluating flow properties of solids. Chem. Eng, 1965. №72. P. 163-168];

*⁴ - характеризует степень сыпучести таблеточной смеси; значение индекса менее 1,25 характеризует удовлетворительную сыпучесть и прессуемость смеси [Abdullah Е.С., Geldart D. The use of bulk density measurements as flowability indicators, Powder Technol, 1999. №102. P. 151-165].

* - минимально допустимое значение прочность (Н) для таблеток d=6,00 мм.

Таким образом фармацевтическая композиция ГМЛ-1 обладает улучшенными технологическими характеристиками относительно субстанции ГМЛ-1 и твердая лекарственная форма, на ее основе, удовлетворяет нормы ГФ XIII издания (вып. 2).

Пример 5.

Оценка наличия анксиолитического действия готовой лекарственной формы ГМЛ-1, полученной по примеру №1, при ее интрагастральном введении проводилась на аутбредных крысах-самцах Wistar и мышах-самцах ICR в тесте «Приподнятый крестообразный лабиринт» (ПКЛ) [Lister RG, Psychopharmacology, 1987; 92 (1): 180-85; Pellow S, Chopin P, Pile S, Briley M. Validation of open: closed arm entries in elevated plus-maze as a measure of anxiety in the rat // Neurosci. Meth J., 1985; 14: 149-67].

Животные содержались в контролируемых условиях окружающей среды (температура: 20-22°C и относительная влажность: 30-60%) при постоянном доступе к корму и воде при использовании полного рациона экструдированного брикетированного корма (СП №2.2.1.3218-14 от 29 августа 2014 г.), в пластмассовых клетках с верхней крышкой из нержавеющей стали с подстилкой, обеспыленной из деревянной стружки, по 16 мышей в клетке типа 3Н и по 8 крыс в клетке типа 4G.

Животных распределяли по группам рандомизированно, используя в качестве критерия отбора массу тела (среднее значение в выборке ±10%). В каждой группе было по 8 животных.

Фармацевтическая композиция на основе N-бензил-N-метил-1-фенилпирроло[1,2-а]пиразин-3-карбоксамид (ФК ГМЛ-1) и плацебо использовались в виде таблеток, из которых непосредственно перед экспериментом готовилась суспензия с добавлением Твин-80 и дистиллированной воды. Субстанция ГМЛ-1 готовилась непосредственно перед экспериментом с добавлением Твин-80 и дистиллированной воды.

Растворы тестируемых веществ и препарат сравнения диазепам вводили однократно зондом в желудок за 60 мин до эксперимента в соответствии с весом животного. Объем введения составлял 0,1 мл на 10 г веса для мышей и 0,1 мл на 100 г веса для крыс.

Методика ПКЛ основана на врожденном страхе открытого пространства и высоты у грызунов. Сущность метода заключается в анализе соотношения реакции страха животных в незнакомом пространстве и высоты с одной стороны и поисковой активности в новой обстановке с другой. В соответствии с характеристиками форм поведения для грызунов реакция страха определяется стремлением животных находиться в закрытых рукавах лабиринта, снижением двигательной активности. Поисковая активность определяет пребывание животных в открытых рукавах, увеличением двигательной активности.

Для численных данных применена описательная статистика: подсчитаны среднее значение (М) и стандартное отклонение (SD), которые представлены в итоговых таблицах. Статистический анализ проводился с помощью пакета статистических программ Statistica 6.0. Межгрупповые различия были проанализированы с помощью U-критерия Манна-Уитни.

Установлено, что в тесте ПКЛ таблетированная лекарственная форма ГМЛ-1 в интервале доз 0,1-5,0 мг/кг при интрагастральном введении статистически значимо увеличивала время пребывания мышей ICR в открытых рукавах лабиринта, уменьшала время пребывания в закрытых рукавах лабиринта (на 30-70 сек по сравнению с плацебо), увеличивала число заходов в открытые рукава по сравнению с плацебо (Табл. 3). В интервале доз от 0,1 до 5,0 мг/кг ЛФ ГМЛ-1 статистически значимо в 5-15 раз увеличивала время (%) пребывания в открытых рукавах по отношению к суммарному времени в открытых и закрытых рукавах, что считается основным критерием анксиолитического действия в тесте ПКЛ. Кроме того, соединение ГМЛ-1 в интервалах доз 0.5-5.0 мг/кг значимо увеличивала число (%) заходов в открытые рукава по отношению к суммарному числу заходов в открытые и закрытые рукава лабиринта (Табл. 3). Препарат сравнения Диазепам в дозе 1,0 мг/кг проявлял выраженный противотревожный эффект по сравнению с группой «Плацебо», который не отличался от соответствующих показателей животных, получавших ГМЛ-1 в дозах 0,1-5,0 мг/кг (Табл. 3). Таким образом, таблетированная лекарственная форма ГМЛ-1 в интервале доз 0,1-5,0 мг/кг при интрагастральном введении проявляла высокую анксиолитическую активность.

Анализ поведения крыс Wistar в приподнятом крестообразном лабиринте через 60 минут, после введения таблетированной лекарственной формы ГМЛ-1 в диапазоне доз 0,05-5,0 мг/кг показал наличие выраженного анксиолитического эффекта. Значимо увеличилось время пребывания и число заходов в открытые рукава, сократилось время пребывания в закрытых рукавах лабиринта по сравнению с группой «Плацебо» (Табл. 4). Значительно выросли интегральные показали поведения животных в приподнятом крестообразном лабиринте, такие как процент нахождения в открытых рукавах по отношению к суммарному времени в открытых и закрытых рукавах и процент заходов в открытые рукава по отношению к числу заходов в открытые и закрытые рукава, что считается наиболее адекватным критерием наличия у препарата анксиолитического действия (Табл. 4).

Примечания:

* (#) - статистически значимые различия (р<0,05) по сравнению с группой «Плацебо» (Контроль), согласно U-критерию Манна-Уитни.

Тоткр / Тотк + Тзакр, % - 100 × (время в открытых рукавах) / (время в открытых рукавах + время в закрытых рукавах); Nотк / Nотк + Nзакр, % - 100 × (число заходов в открытые рукава) / (число заходов в открытые рукава + число заходов в закрытые рукава лабиринта).

Примечания:

* - статистически значимые различия (p<0,05) по сравнению с группой «Плацебо» согласно критерию Манна-Уитни;

# - статистически значимые различия (p<0,05) по сравнению с группой «Субстанция ГМЛ-1 1,0 мг/кг» согласно критерию Манна-Уитни.

Тоткр / Тотк + Тзакр, % - 100 × (время в открытых рукавах) / (время в открытых рукавах + время в закрытых рукавах);

Nотк / Nотк + Nзакр, % - 100 × (число заходов в открытые рукава) / (число заходов в открытые рукава + число заходов в закрытые рукава лабиринта).

При сравнительном анализе активности таблетированной лекарственной формы ГМЛ-1 в дозах от 0,05 до 5 мг/кг с субстанцией ГМЛ-1 в дозе 1,0 мг/кг выявлено значимое повышение эффективности готовой лекарственной формы в тесте ПКЛ (Табл. 4). Препарат сравнения Диазепам в дозе 5,0 мг/кг проявлял выраженный противотревожный эффект через 1 час после введения по сравнению с группой «Плацебо».

Таким образом, анксиолитическая активность ФС ГМЛ-1 - N-бензил-N-метил-1-фенилпирроло[1,2-а]пиразин-3-карбоксамида, выявленная при ее внутрибрюшинном введении в интервале доз 0,1-5,0 мг/кг, не только сохраняется у фармацевтической композиции ГМЛ-1 в твердой лекарственной форме в сходном диапазоне доз при интрагастральном введении, но и более выражена по эффективности (действие вещества в ЛФ ГМЛ-1 проявляется при ее применении в более низких дозах - от 0,05 мг/кг), что свидетельствует о повышении биодоступности действующего вещества в составе фармацевтической композиции.

Пример 6.

Оценка анксиолитического действия и побочных эффектов готовой лекарственной формы ГМЛ-1, полученной по способу, указанному в примере №1, при ее интрагастральном введении проводилась на половозрелых мышах-самцах линии C57BL/6 и Balb/c в тесте «открытое поле со световой вспышкой» (ОП) в модификации Бородина [Бородин П.М., Шулер Л., Беляев Д.К. Проблемы генетики стресса. Сообщение 1. Генетический анализ поведения мышей в стрессовой ситуации // Генетика. 1976; 12(12): 62-71; Середенин С.Б., Ведерников А.А. Влияние психотропных препаратов на поведение инбредных мышей в условиях открытого поля // Бюлл. Эксп. Биол. Мед. 1979; 88(7): 38-40].

Животные содержались в контролируемых условиях окружающей среды (температура: 20-22°C и относительная влажность: 30-60%) при постоянном доступе к корму и воде при использовании полного рациона экструдированного брикетированного корма (СП №2.2.1.3218-14 от 29 августа 2014 г.), в пластмассовых клетках с верхней крышкой из нержавеющей стали с подстилкой, обеспыленной из деревянной стружки, по 16 мышей в клетке типа 3Н.

Животных распределяли по группам рандомизированно, используя в качестве критерия отбора массу тела (среднее значение в выборке ±10%). В каждой группе было по 8 животных.

Фармацевтическая композиция на основе N-бензил-N-метил-1-фенилпирроло[1,2-а]пиразин-3-карбоксамид (ФК ГМЛ-1) и плацебо использовались в виде таблеток, из которых непосредственно перед экспериментом готовилась суспензия с добавлением Твин-80 и дистиллированной воды.

Исследование готовой лекарственной формы ГМЛ-1 проводилось в дозах 0,1; 0,5; 1,0 мг/кг, препарата сравнения Диазепама в дозе 1,0 мг/кг и плацебо из расчета 0,1 мл на 10 г веса тела животного. Исследуемые соединения вводились однократно внутрижелудочно за 60 минут до начала эксперимента соответственно.

Тест «открытое поле со световой вспышкой» представляет собой распространенную модель для исследования анксиолитического (противотревожного) действия фармакологических средств в условиях неизбегаемого эмоционального стресса у мелких лабораторных животных. Поведение в ОП формируется с одной стороны, как реакция на новую обстановку, а с другой как на угрожающую ситуацию. Индивидуальное поведение животных в ОП неодинаково. Мыши линии C57BL/6 - животные с низкой тревожностью и с «активным» типом эмоционально-стрессовой реакции, демонстрируют высокий уровень двигательной активности в тесте ОП: осуществляют больше перемещений по периферической зоне установки и выходов в ее центральные зоны (2/3 поля), большее число вертикальных стоек и меньшее число дефекаций. Напротив, мыши линии Balb/c имеют «пассивный» тип эмоционально-стрессовой реакции, что сопровождается «freezing» реакцией (замирание): незначительным числом перемещений, высоким уровнем дефекаций. Эти линии являются надежной, хорошо зарекомендовавшей себя моделью для изучения фармокогенетики поведения в условиях эмоционально-стрессового воздействия.

Изучение влияния готовой лекарственной формы ГМЛ-1 на поведение мышей линии Balb/c с «пассивным» типом эмоционально-стрессовой реакции показало наличие у соединения анксиолитической активности в дозах 0,5 и 1,0 мг/кг. Установлено статистически значимое увеличение горизонтальной и вертикальной двигательной активности мышей линии Balb/c в сравнении с группой Плацебо. При этом на фоне введения ГМЛ-1 в дозе 1,0 мг/кг отмечено повышение в 6 раз двигательной активности в прецентральной части поля (2/3 поля) и увеличение почти в 2 раза числа вертикальных стоек по сравнению с группой мышей, получавших диазепам в дозе 1 мг/кг (Табл. 5). По другим показателям, фиксируемым в условиях методики «Открытое поле», различий в эффектах ФК ГМЛ-1 во всех изученных дозах с Диазепамом в дозе 1,0 мг/кг не обнаружено (Табл. 5).

ГМЛ-1 в готовой лекарственной форме в дозах 0,1-1,0 мг/кг не оказывал влияния на поведение мышей линии C57Bl/6 в тесте «Открытое поле». Отмечено лишь увеличение числа перемещений животных, получавших ГМЛ-1 в дозе 1 мг/кг, в прецентральной части поля по сравнению с группой «Плацебо» (Табл. 6).

На фоне введения Диазепама мышам линии C57Bl/6, обладающих «активным» типом эмоционально-стрессовой реакции, отмечалось снижение почти в 2 раза всех видов двигательной активности мышей по сравнению с группой «Плацебо» (Табл. 6). При этом между группами животных, получавших ЛФ ГМЛ-1 в диапазоне доз 0,1-1 мг/кг и Диазепам в дозе 1 мг/кг отмечались статистические значимые различия по ряду показателей двигательной активности (Табл. 6).

Таким образом, анксиолитическое действие ФК ГМЛ-1 в изученном диапазоне доз не сопровождается характерным для бензодиазепинового транквилизатора Диазепама седативным действием, угнетающим двигательную активность мышей с «активным» фенотипом эмоционально-стрессовой реакции.

Примечания:

* - достоверность различий (p<0,05) с группой «Плацебо» по U-критерию Манна-Уитни; # - достоверность различий (p<0,05) с группой «Диазепам» по U-критерию Манна-Уитни;

Примечания:

* - достоверность различий (p<0,05) с группой «Плацебо» по U-критерию Манна-Уитни; # - достоверность различий (p<0,05) с группой «Диазепам» по U-критерию Манна-Уитни.

Пример 7.

Изучение общетоксического действия (острая токсичность) готовой лекарственной формы ГМЛ-1 проводилась на беспородных белых мышах (12 самок и 12 самцов) и беспородных белых крысах (12 самках и 12 самцах) при однократном пероральном или внутрибрюшинном введении.

Животные содержались в контролируемых условиях окружающей среды (температура: 20-22°C и относительная влажность: 30-60%) при постоянном доступе к корму и воде при использовании полного рациона экструдированного брикетированного корма (СП №2.2.1.3218-14 от 29 августа 2014 г.), в пластмассовых клетках с верхней крышкой из нержавеющей стали с подстилкой, обеспыленной из деревянной стружки, по 12 мышей в клетке типа 3Н и по 12 крыс в клетке типа 4G.

Фармацевтическая композиция на основе N-бензил-N-метил-1-фенилпирроло[1,2-а]пиразин-3-карбоксамид (ФК ГМЛ-1) использовалась в виде таблеток, полученных по примеру 1, из которых непосредственно перед экспериментом готовилась суспензия с добавлением Твин-80 и дистиллированной воды. Контрольные животные получали дистиллированную воды с добавлением Твин-80 в эквивалентных объемах.

При изучении острой токсичности препарата ГМЛ-1 на беспородных мышах и крысах обоего пола при внутрибрюшинном (1 г/кг) или пероральном (4 г/кг) способах введения определение средней смертельной дозы (LD₅₀) не представлялось возможным из-за отсутствия гибели животных в условиях достижения максимально допустимых объемов введения.

Таким образом, в результате изучения острой токсичности установлено, что ГМЛ-1 в готовой лекарственной форме при пероральном и внутрибрюшинном введении в максимально возможных дозах 4 г/кг и 1 г/кг, соответственно, не вызывает гибели экспериментальных животных.

Патологоанатомическое исследование мышей и крыс, проводимое через 14 дней после однократного перорального (4 г/кг) или внутрибрюшинного (1 г/кг) введения ФК ГМЛ-1, выявило отсутствие различий в морфологической картине внутренних органов опытных и контрольных групп животных.

Исходя из полученных данных (и невозможности дальнейшей оценки токсичности соединения при введении в большой дозе) готовая лекарственная форма ГМЛ-1 может быть отнесена к 4 классу токсичности - малотоксичное вещество (по классификации Сидорова К.К. - 1973 г.). В соответствии с ГОСТом 12.1.007-76 фармацевтическая композиция ГМЛ-1 относится к 3 классу опасности для перорального способа введения - вещества умеренно опасные.

1. Фармацевтическая композиция для получения твердой лекарственной формы, обладающая анксиолитической активностью, содержащая N-бензил-N-метил-1-фенилпирроло[1,2-а]пиразин-3-карбоксамид и фармацевтически приемлемые вспомогательные вещества в указанном соотношении, мас. %:

N-бензил-N-метил-1-фенилпирроло[1,2-а]пиразин-3-карбоксамид - 1,0;

Микрокристаллическая целлюлоза - 88,0;

Поперечносшитый поливинилпирролидон - 4,0;

Поливинилпирролидон - 6,0;

Магния стеарат - 1,0.

2. Фармацевтическая композиция по п. 1, в которой в качестве растворителя для приготовления раствора связующего предпочтительно использование воды очищенной или спирта этилового.

3. Фармацевтическая композиция по п. 1, предназначенная для формования таблеток или заполнения капсул.