Способ моделирования хеликобактериоза

Изобретение относится к экспериментальной медицине, а именно к способу моделирования хеликобактериоза. Для этого перорально вводят белым мышам один раз в сутки 52 мкг препарата Париет, являющегося ингибитором протонного насоса в желудке, с последующим введением животным через 1-1,5 ч перорально однократно в сутки суспензии бактерий Helicobacter pylori КМ-11Rif^R на изотоническом растворе хлорида натрия в объеме 0,2 мл, содержащем 1×10⁵ микробных клеток, причем введение суспензии бактерий Helicobacter pylori КМ-11Rif^R продолжают в течение 10 суток, ежедневно отбирая фекалии для определения количества хеликобактерий, выводимых из организма животных, путем высева фекалий на селективную плотную питательную среду с рифампицином 150 мкг×мл^-1 в чашках Петри, которые инкубируют при температуре 37°С в течение 24-48 ч в микроаэрофильных условиях, затем обрабатывают полученные результаты высева фекалий, основываясь на количестве выросших колоний, и выносят суждение о выживаемости и приживаемости бактерий Helicobacter pylori KM-11RifR в желудке, исходя из величины доли жизнеспособных бактерий Helicobacter pylori KM-11RifR от числа введенных перорально животным, а также о начале бактериовыделения Helicobacter pylori КМ-11RifR с фекалиями животных, интенсивности, длительности и продолжительности бактериовыделения Helicobacter pylori KM-11RifR на основании подсчета колоний, выросших в микроаэрофильных условиях при температуре 37°С при ежедневном отборе и посеве отобранных фекалий белых мышей на селективную плотную питательную среду с рифампицином при следующем количественном соотношении компонентов, г/л: пептон 20,0; дрожжевой экстракт 5,0; натрий хлористый 10,0; глюкоза 5,0; тиамина хлорид 0,008; кальция пантотенат 0,008; натрия сульфит 0,5; гемин 0,01; агар-агар 12,0; твин-80 1,0; рифампицин 150 мкг⋅мл^-1; дистиллированная вода остальное, рН среды 7,3±0,2 ед. рН. Изобретение позволяет изучить приживаемость, колонизирующую способность и персистенции в организме бактерий Helicobacter pylori и вызываемых ими патологических изменений в желудке и в начальных отделах кишечника, а также оценить эффективность новых средств лечения и профилактики хеликобактериоза. 2 з.п. ф-лы, 2 ил., 2 пр.

 

Изобретение относится к экспериментальной медицине, медицинской микробиологии и инфектологии и может быть использовано для изучения приживаемости, колонизирующей способности и персистенции в организме млекопитающих бактерий Helicobacter pylori и вызываемых ими патологических изменений в желудке, а также для оценки эффективности новых средств лечения и профилактики хеликобактериоза.

Хеликобактериоз - инфекционное заболевание с фекально-оральным механизмом передачи, вызываемое бактериями Helicobacter pylori, имеющими выраженную тропность к эпителию слизистой оболочки желудка. Уровень инфицирования хеликобактером детей составляет около 10%, в то время как взрослое население инфицировано практически на 100%. В настоящее время Helicobacter pylori рассматривается как один из факторов, вызывающих хроническое воспаление желудка - хеликобактериоз и способствующих развитию гастрита, язвенной болезни и новообразований желудка (Goodwin C.S., Armstrong J.A., Marshall B.J. Campylobacter pyloris, gastritis, and peptic ulcer // J. Clin. Pathol. - 1986. - Vol. 39. - P. 353-365). Хеликобактер приспособился к длительному пребыванию в желудке, в антральной части которого он скапливается в большом количестве. Именно здесь относительно мало клеток, секретирующих соляную кислоту, что способствует выживанию хеликобаетера на поверхности эпителия желудка.

К роду Helicobacter в настоящее время относится до 10 видов бактерий: Helicobacter pylori, Helicobacter heilmannii, Helicobacter mustalae, Helicobacter felis и др. Основным возбудителем заболевания у людей является Helicobacter pylori. Это грамотрицательные, короткие извитые, S- образные бактерии средних размеров, подвижные, имеющие 4-5 жгутиков, лофотрохи. Не растут на питательных средах, содержащих глицерин, желчные соли и хлорид натрия. Оксидазо- и каталазоположительные, проявляют выраженную уреазную активность, обладают фосфатазой, образуют сероводород, не свертывают молоко. Уреаза Helicobacter pylori (мочевинная амидогидролаза) определяет основные звенья патогенеза хеликобактариоза, начиная от адгезии и колонизации слизистой оболочки желудка вплоть до формирования преканцероза желудка (Mobley Н. The role of Helicobacter pylori urease in the pathogenesis of gastritis and peptic ulceration // Alim. Pharmacol. Ther. -1996. -Vol. 10 (Suppl. 1). - P. 57-64). Фермент обладает абсолютной специфичностью в отношении единственного субстрата - мочевины, которую он расщепляет гидролитическим путем до аммиака и угольной кислоты. Уреаза совместно с другими ферментами Helicobacter pylori (фосфолипазами, протеазами, муциназами) разрушают защитный слизистый барьер желудка и воздействуют на мембраны эпителиоцитов. Данные электронной микроскопии свидетельствуют о том, что при этом клеточные мембраны переходят из гидрофобного состояния в гидрофильное. Такая структурная перестройка снижает резистентность клеток желудочного эпителия к соляной кислоте. Важно при этом отметить, что аммиак, образующийся под влиянием Helicobacter pylori, соединяется с соляной кислотой желудка с образованием цитотоксических продуктов, в том числе гидроксиламина и монохлорамина. Последние усугубляют повреждения клеток желудочного эпителия (Аруин Л.И., Капуллер Л.Л., Исаков В.А. Морфологическая диагностика болезней желудка и кишечника. - М.: Триада - X. -1998.- 496 с; Шкитин В.А., Шкирина А.И., Старовойтов Г.Н. Роль Helicobacter pylori в патологии человека // Клин. микробиол. и антимикроб, химиотерапия. - 2002. - Т. 4, №2. - С. 128-145.). Высокая степень корреляции уреазной активности Helicobacter pylori с гистологическими признаками хронического гастрита продемонстрированы F. Morris (Morris F., Maher К., Thomsen L. et al. Distribution of Campylobacter pylori in the human stomach obtained at postmortem // Scand. J. Gastroenterol. -1988. - Vol. 23. - P. 257-264). Наконец, уреаза, обладающая прямым воздействием на эпителиальные тканевые структуры желудка, рассматривается в качестве потенциального промотора предраковых изменений слизистой оболочки кишечника (Tsujii М, Kawano S., Tsujii S. et al. Ammonia: a possible promotor in Helicobacter pylori - related gastric carcinogenesis // Cancer Lett. - 1992. -Vol. 65.-P. 15-18). Можно констатировать, что свойства уреазы Helicobacter pylori уникальны, позволяющие бактериям колонизировать желудок и выживать в организме хозяина. Длительная персистенция Helicobacter pylori в слизисто -бикарбонатном барьере патологической биопленки создает известные трудности в диагностике и лечении хликобактериоза (Нижевич А.А., Хасанов Р.Ш. Helicobacter pylori: введение в патогенез и патобиохимию гастрита // Материалы VIII тематической сессии Российской группы по изучению Helicobacter pylori, 18 мая 1999 г, Уфа./ www.Helicobacter.ru/index.php?i=59; Helicobacter pylori - инфекция: современные аспекты диагностики и терапии (пособие для врачей) / НИИ физико-химической медицины МЗ РФ, Научно-производственная фирма «Литех», Научный Центр Здоровья Детей, Центральная Клиническая Больница МЦ УД Президента РФ. - М.: - 2004. - 41 с.). Очевидно, что именно этим обстоятельством можно объяснить данные статистики, согласно которым полное выздоровление наблюдается лишь у 15% больных хеликобактериозом, и, как ни странно, далеко не все пациенты, инфицированные Helicobacter pylori, заболевают раком желудка.

Проявления хеликобактериоза весьма индивидуальны, но они затрудняют жизнь больного и заставляют обращаться к врачу. Начиная лечение, врач исходит из стандартной тройной схемы эрадикационной терапии, рекомендованной Российской Гастроэнтерологической Ассоциацией, а именно с первой линии лечения: ингибиторы протонной помпы, антибиотики кларитромицин и амоксициллин или метронидазол (Рекомендация Российской Гастроэнтерологической Ассоциации по диагностике и лечению инфекции Helicobacter pylori у взрослых / В.Т. Ивашкин, И.В. Маев, Т.Л. Лапина, А.А. Шептуллин - Комитет по подготовке проекта рекомендации. Методические рекомендации: РЖГГК - №1. - С. 87-89). Для более адекватного терапевтического воздействия на возбудителя хеликобактериоза целесообразно в эксперименте на лабораторных животных выявить факторы и условия, способствующие длительной персистенции бактерий в желудке и поддержанию хронического воспаления. Экспериментальный хиликобактериоз для изучения характера патологических изменений стенки желудка лабораторных животных, а также для обоснования лечебных режимов, нуждается в определенном обосновании и установлении последовательности действий, направленных на уничтожение (эрадикацию) Helicobacter pylori в слизистой оболочке желудка с целью создания благоприятных условий для заживления язвы и предупреждения ее перерождения в раковую опухоль. То, что эрадикация Helicobacter pylori возможна, свидетельствует успешный опыт одного из авторов открытия бактерий Helicobacter pylori B.J. Marshall по самозаражению возбудителем и излечению приобретенного хеликтобактериозного гастрита в результате двухнедельного курсового приема метронидозола и солей висмута. В последующем именно этот метод лег в основу современной эрадикации Helicobacter pylori. Это тем более важно, что полученные в ходе экспериментов на лабораторных животных результаты можно в последующем экстраполировать на организм человека как в плане профилактики, так и лечения хеликобактериоза.

До настоящего времени вопрос о моделировании хеликобактериоза не решен. В доступной литературе нет описания специальных исследований, выполненных в данном направлении. Имеются лишь сведения о прогрессирующей атрофии слизистой оболочки желудка, у взятых в эксперименты крыс, вследствие продолжительного введения в желудок аммиака. Последующая малигнизация тканей желудка развилась на фоне усиленной клеточной пролиферации с постепенным формированием низкодифференцированных аденокарцином (Tsujii М., Kawano S., Tsujii S. et al. Cell kinetics of mucosal atrophy in rat stomach induced by long-term administration of ammonia // Gastroenterology.- 1933. - Vol. - 104. - P. 769-801.; Tsujii M., Kawano S., Tsujii S. et al. Mechanism for ammonia-induced promotor of gastric carcinogenesis in rats // Carcinogenesis. - 1995. - Vol. 16. - P. 563-566). Возможным объяснением трудностей, возникающих в связи с попытками моделирования хеликобактериоза, является тот факт, о котором 20.06.2015 г.сообщил информационно-аналитический портал «Русская Планета», что животные практически никак не реагируют на хеликобактера и не страдают связанными с ним болезнями. И эта констатация фактически переводит хеликобактериоз в разряд антропонозов, что с очевидностью усложняет проблему моделирования данной инфекции, но при этом делает ее более интересной.

Целью изобретения является разработка способа, позволяющего моделировать хеликобактериоз у лабораторных животных.

Технический результат, который может быть достигнут при использовании данного способа, заключается в том, что у лабораторных животных можно проследить этапность развития инфекции, вызванной бактериями Helicobacter pylori, начиная от адгезии и колонизации бактериями слизистой оболочки кишечника и до хронического воспаления желудка, изъязвления или до новообразования. Другим аспектом решения указанной проблемы является возможность изучения длительности пребывания возбудителя Helicobacter pylori в тканях желудка и выделения из организма с кишечным содержимым, а также оценки терапевтической эффективности эрадикации Helicobacter pylori при использовании существующих и создаваемых средств и методов лечения и профилактики хеликобактериоза.

Технический результат достигается:

- формированием хеликобактериоза путем перорального введения лабораторным животным суспензии бактерий Helicobacter pylori на фоне медикаментозного подавления финальной стадии секреции соляной кислоты под действием ингибиторов протонного насоса в желудке;

- формированием хеликобактериоза путем перорального введения лабораторным животным суспензии бактерий Helicobacter pylori на фоне иммуносупрессивного эффекта от внутримышечного введения Дексаметазона.

Согласно инструкции (Инструкция по медицинскому применению препарата Париет. Производитель «ЭсаиКо», ЛТД, Япония. Регистрационный номер П NO 118890/01), препарат Париет подавляет секрецию желудочного сока путем специфического ингибирования H7R⁺-АТФазы на секреторной поверхности париетальных клеток желудка. В наших экспериментах (Чичерин И.Ю., Лундовских И.А., Погорельский И.П., Гаврилов К.Е., Янов С.Н., Дармов И.В. Влияние подавления секреции желудочного сока препаратом Париет на приживаемость бифидобактерий и лактобактерий в желудочно-кишечном тракте экспериментальных животных // Журн. международной медицины. - 2012. - №1 (1). - С. 98-104) эти данные получили полное подтверждение. Таким же ингибитором протонного насоса в желудке, блокирующим финальную стадию продукции соляной кислоты, является препарат Омепразол (производитель АО «АКРИХИН», Россия). Оба препарата создают условия в организме лабораторных животных, фактически устраняющие кислотный барьер в желудке, конкуренцию кишечной микробиоты, и способствующие приживлению бактерий Helicobacter pylori прежде всего в антральном отделе желудка.

Дексаметазон (производитель KRKA, Словения), согласно инструкции по применению, является мощным синтетическим глюкокортикоидным препаратом, содержащим гормоны коры надпочечников и их синтетические аналоги, который предназначен для регуляции белкового, углеводного и минерального обмена. Иммуносупрессивный эффект дексаметазона обусловлен вызываемой им инволюцией лимфоидной ткани, угнетением пролиферации лимфоцитов (особенно Т-лимфоцитов), подавлением миграции В-клеток и взаимодействия Т- и В-лимфоцитов, торможением миграции цитокинов (интерлейкина 1, интерлейкина 2, интерферона гамма) из лимфоцитов и макрофагов, снижением образования антител.

Суточные дозы вводимых белым мышам препаратов с учетом переводного коэффициента составили: для препарата Париет 52 мкг, а для Дексаметазона - 40 мкг на одно животное.

Важным элементом исследований является установление количества бактерий Helicobacter pylori, адгезированных на эпителиоцитах слизистой оболочки желудка. Исследуют мазки-отпечатки слизистой оболочки желудка, полученные у пациентов при эндоскопии из участков, где обнаружены визуальные отклонения от нормы (отек, гиперемия). Одну часть полученных мазков высушивают, окрашивают и просматривают под микроскопом при увеличении ×360; другую часть мазков используют для окраски «кампи-теста» или для посева на плотную питательную среду, на которой подсчитывают количество выросших при оптимальной температуре колоний Helicobacter pylori. Во всех случаях - либо при микроскопии окрашенных препаратов, либо по времени изменения окраски «кампи-теста», либо при подсчете выросших на плотной питательной среде колоний Helicobacter pylori, определяют обсемененность бактериями слизистой оболочки желудка. Условно выделяют 3 степени обсемененности хеликобактером слизистой оболочки желудка: слабая обсемененность - (+), что соответствует 20 микробам в поле зрения или 10 выросшим на плотной питательной среде колониям, либо изменению окраски «кампи-теста», в течение 24 часов; средняя обсемененность - (++), что соответствует 20-40 микробам в поле зрения или 10-20 выросшим на плотной питательной среде колониям, либо изменению окраски «кампи-теста» в течение 2-3 часов; высокая обсемененность - (+++),что соответствует 40 и более микробам в поле зрения или свыше 50 выросшим на плотной питательной среде колониям, либо изменению окраски «кампи-теста» в течение 1 часа.

Важным показателем, характеризующим размножение хеликобактера в желудке и его дальнейшее проникновение в кишечник, является выделение бактерий Helicobacter pylori из фекалий животных. Данное исследование на людях не проводится ввиду невозможности отличить хеликобактер от представителей кишечной микробиоты. В этой связи необходимо отметить важную особенность заявляемого способа, которая заключается в том, что в работе для перорального введения животным используют маркированный по признаку устойчивости к антибиотику рифампицину штамм Helicobacter pylori КМ-11 (Rif^R). Маркерный признак обеспечивает возможность идентификации хеликобактера Helicobacter pylori в фекалиях животных при их высеве на селективную плотную питательную среду с рифампицином в концентрации 150 мкг×мл^-1, на которой бактерии кишечной микрофлоры и другие бактерии не растут (Дармов И.В., Чичерин И.Ю., Погорельский И.П., Лундовских И.А., Янов С.Н. Способ оценки выживаемости бифидо- и лактобактерий в желудочно-кишечном тракте экспериментальных животных. Патент №2528867. Российская Федерация, опубл. 20.09.2014. Бюл. №26. Номер охранного документа МПК C12Q 1/04, МПК C12Q 1/06).

Для выращивания бактерий Helicobacter pylori КМ-11 (Rif^R), полученных из мазков-отпечатков слизистой оболочки желудков павших животных, а также установления факта возможного выделения с фекалиями животных бактерий Helicobacter pylori КМ-11 (Rif^R) и их количественной оценки, суспензию фекалий белых мышей высевают на селективную питательную среду с рифампицином (150 мкг×мл^-1) и выращивают в микроаэрофильных условиях при температуре 37°С. Пропись селективной питательной среды включает следующие компоненты при их количественном соотношении, г/л:

- пептон	20,0
- дрожжевой экстракт	5,0
- натрий хлористый	10,0
- глюкоза	5,0
- тиамина хлорид	0,008

- кальция пантотенат

0,008

- натрия сульфит	0,5
- гемин	0,01
- агар-агар	12,0
- твин-80	1,0
- рифампицин	150 мкг⋅мл-1
- дистиллированная вода	остальное

рН среды 7,3±0,2 ед. рН

Плотная питательная среда приведенной прописи обеспечивает рост бактерий Helicobacter pylori КМ-11 (Rif^R), маркированных по признаку устойчивости к рифампицину - Rif^R, уже через 24 ч инкубации в микроаэрофильных условиях при температуре 37°С в отличие от традиционно используемого колумбийского агара с кровью, на котором хеликобактер растет 5 суток (Колумбийский агар (основа). Кат. № TN 1247 (для культивирования требовательных микроорганизмов и выявления гемолиза) Производитель: SIFIN Institute fur Immunpraparate und Nahrmedien Gmb H, Берлин, Германия).

Гистологическое исследование желудка у павших лабораторных животных проводят после фиксации ткани в 10% растворе нейтрального формалина, обезвоживают в изопропаноле и заливают в парафин. Приготовленные на микротоме препараты желудка окрашивают гематоксилином Эрлиха и эозином, просматривают на микроскопе «Микмед-2» (ООО «ЛОМО», Россия) при увеличении ×200, ×1000, после чего выносят суждение о выраженности патологического процесса. Пример 1

Выращивают культуру бактерий Helicobacter pylori КМ-11 (Rif^R) в микроаэрофильных условиях при температуре 37°С в течение 24 ч, после чего готовят бактериальную суспензию на изотоническом растворе хлорида натрия исходя из расчета 1×10⁵ микробных клеток в объеме 0,2 мл.

Берут необходимое количество прошедших акклиматизацию белых мышей массой 18 - 20 г, рассаживают их в индивидуальные кюветы с крышками. Ежедневно отбирают от каждого животного фекалии, взвешивают их, после чего суспендируют в 1,0 мл изотонического раствора хлорида натрия и высевают на селективную плотную питательную среду с рифампицином (150 мкг×мл^-1) в чашках Петри, которые инкубируют при температуре 37°С в течение 24-48 ч в микроаэрофильных условиях. С учетом массы фекалий, полученных от каждого животного, делают перерасчет числа бактерий на 1 г фекалий (КОЕ×г^-1).

Готовят суспензию препарата Париет на дистиллированной воде из расчета 52 мкг в 0,2 мл воды (оптимальный объем для перорального введения белым мышам).

Ежедневно белым мышам вводят перорально препарат Париет на дистиллированной воде. Через 1-1,5 ч, в течение которых развивается антисекреторный эффект препарата Париет, животным вводят перорально один раз в сутки 0,2 мл суспензии бактерий Helicobacter pylori КМ-11 (Rif^R) на изотоническом растворе хлорида натрия. Введение суспензии бактерий Helicobacter pylori КМ-11 (Rif^R) продолжают в течение 10 суток, ежедневно отбирая фекалии для определения количества хеликобактерий, выводимых их организма животных.

Обрабатывают полученные результаты высева фекалий на селективную питательную среду с рифампицином, основываясь на количестве выросших колоний, и выносят суждение о приживаемости бактерий Helicobacter pylori КМ-11 (Rif^R) в стенке желудка, о начале бактериовыделения Helicobacter pylori КМ-11 (Rif^R) с фекалиями животных, интенсивности, длительности и продолжительности бактериовыделения Helicobacter pylori КМ-11 (Rif^R).

Заявленный способ позволяет установить приживаемость хеликобактера в желудке, долю выживших маркированных (Rif^R) бактерий Helicobacter pylori КМ-11 (Rif^R), введенных перорально белым мышам и прошедших через желудочно-кишечный тракт. Полученные результаты свидетельствуют, что в фекалиях животных хеликобактер появляется уже на 3 день после начала перорального введения белым мышам; на 4 день количество бактерий Helicobacter pylori КМ-11 (Rif^R) достигает 25000 КОЕ.г^-1 и в последующем снижается к 10 дню эксперимента до 180 КОЕ.г^-1, а после прекращения перорального введения - стабилизируется на уровне 190-195 КОЕ.г^-1 на 16 день эксперимента. Приведенные данные созвучны опубликованным результатам, согласно которым только около 10% клеток Helicobacter pylori, обитающих в желудке, находятся в адгезированном состоянии, остальные эвакуируются из желудка в кишечник. Но даже этого количества адгезированных на слизистой оболочке желудка бактерий достаточно для развития болезни (Пиманов С.И. Эзофагит, гастрит и язвенная болезнь. - М: Мед. книга - 2000. - 378 с.).

В случае летального исхода заболевания у одного или нескольких подопытных животных проводят патологоанатомическое и гистологическое исследование желудка и начальных отделов кишечника, а также бактериологическое исследование биоптатов разных участков слизистой оболочки желудка и двенадцатиперстной кишки. Макропрепарат слизистой оболочки желудка при развившемся хеликобактериозе на фоне перорального введения препарата Париет, где 1 - норма, а 2 - патология, представлен на фигуре 1. Гистологическое исследование срезов желудков белых мышей, павших от инфицирования бактериями хеликобактера на фоне перорального введения препарата Париет показало, что основными мишенями воздействия Helicobacter pylori КМ-11 (Rif^R) в слизистой оболочке желудка являются эпителиоциты, подвегающиеся трансформации с последующими изменениями в виде дистрофии, атрофии, кишечной метаплазии и распространения воспалительного процесса из антрального (пилорического) отдела на тело желудка с преобладанием атрофических процессов в слизистой оболочке и формированием диффузного атрофического пангастрита.

Пример 2

Выращивают культуру бактерий Helicobacter pylori КМ-11 (Rif^R) в микроаэрофильных условиях при температуре 37°С в течение 24 ч, после чего готовят бактериальную суспензию на изотоническом растворе хлорида натрия, исходя из расчета 1×10⁵ микробных клеток в объеме 0,2 мл.

Готовят раствор Дексаметазона из расчета 40 мкг в 0,1 мл дистиллированной воды на одно животное.

Берут необходимое количество прошедших акклиматизацию белых мышей массой 18 - 20 г, рассаживают их в индивидуальные кюветы с крышками. Ежедневно отбирают от каждого животного фекалии, взвешивают их, после чего суспендируют в 1,0 мл изотонического раствора хлорида натрия и высевают на селективную плотную питательную среду с рифампицином (150 мкг×мл^-1) в чашках Петри, которые инкубируют при температуре 37°С в течение 24-48 ч в микроаэрофильных условиях. С учетом массы фекалий от каждого животного делают перерасчет числа бактерий на 1 г фекалий (КОЕ×г^-1).

Вводят 0,1 мл раствора Дексаметазона белым мышам внутримышечно в течение 10 дней.

Через 2 ч после внутримышечного введения раствора Дексаметазона животным вводят перорально один раз в сутки 0,2 мл суспензии бактерий Helicobacter pylori КМ-11 (Rif^R) на изотоническом растворе хлорида натрия. Введение суспензии бактерий Helicobacter pylori КМ-11 (Rif^R) продолжают в течение 10 суток, ежедневно отбирая фекалии для определения количества хеликобактерий, выводимых их организма животных.

Обрабатывают полученные результаты высева фекалий на селективную питательную среду с рифампицином, основываясь на количестве выросших колоний, и выносят суждение о приживаемости бактерий Helicobacter pylori КМ-11 (Rif^R) в стенке желудка, о начале бактериовыделения Helicobacter pylori КМ-11 (Rif^R) с фекалиями животных, интенсивности, длительности и продолжительности бактериовыделения Helicobacter pylori КМ-11 (Rif^R).

Заявленный способ позволяет установить приживаемость хеликобактера в желудке, долю выживших маркированных (Rif^R) бактрий Helicobacter pylori КМ-11 (Rif^R), введенных перорально белым мышам и прошедших через желудочно-кишечный тракт.Полученные результаты свидетельствуют, что в фекалиях животных единичные бактерии хеликобактера появляются на 3 день после начала перорального введения белым мышам; на 4 день количество бактерий Helicobacter pylori КМ-11 (Rif^R) достигает 28000 КОЕ×г^-1 и в последующем снижается к 10 дню эксперимента до 190 КОЕ×г^-1, а после прекращения перорального введения -стабилизируется на уровне 210-215 КОЕ×г^-1 на 16 день эксперимента. Таким образом, после адгезии хеликобактер интенсивно размножается, колонизирует слизистую оболочку антрального отдела желудка, вызывая ее повреждение, воспаление и утяжеление течения болезни (Окороков А.Н. Диагностика болезней внутренних органов. - М.: Мед. лит.- Т. 1. - 1999. - 560 с.).

В случае летального исхода заболевания у одного или нескольких подопытных животных проводят патологоанатомическое и гистологическое исследование желудка и начальных отделов кишечника, а также бактериологическое исследование биоптатов разных участков слизистой оболочки желудка и двенадцатиперстной кишки. При инициации хеликобактериоза внутримышечным введением белым мышам Дексаметазона развивается выраженное прогрессирующее повреждение слизистой оболочки желудка с участками изъязвления. Макропрепарат слизистой оболочки желудка при развившемся хеликобактериозе на фоне внутримышечного введения раствора препарата Дексаметазона, где 1 - норма, а 2 - патология представлен на фигуре 2. В дне и по краям изъязвленных участков отмечается рубцовая ткань, нарушающая трофику новообразованной слизистой оболочки и, по-видимому, способствующая рецидивированию язвы. Одновременно наблюдается желудочная метаплазия эпителия кишки, которая способствует проникновению бактерий хеликобактера в кишечник, где выявляются эпителиоциты с соответствующими рецепторами для Helicobacter pylori КМ-11 (Rif^R). При этом отмечается чередование процессов изъязвления и регенерации с формированием хронической дуоденальной язвы, для которой характерна высокая степень обсемененности Helicobacter pylori КМ-11 (Rif^R) начала двенадцатиперстной кишки.

1. Способ моделирования хеликобактериоза, включающий пероральное введение белым мышам один раз в сутки 52 мкг препарата Париет, являющегося ингибитором протонного насоса в желудке, с последующим введением животным через 1-1,5 ч перорально однократно в сутки суспензии бактерий Helicobacter pylori KM-HRf^R на изотоническом растворе хлорида натрия в объеме 0,2 мл, содержащем 1×10⁵ микробных клеток, причем введение суспензии бактерий Helicobacter pylori KM-11Rif^R продолжают в течение 10 суток, ежедневно отбирая фекалии для определения количества хеликобактерий, выводимых из организма животных, путем высева фекалий на селективную плотную питательную среду с рифампицином 150 мкг × мл^-1 в чашках Петри, которые инкубируют при температуре 37°С в течение 24-48 ч в микроаэрофильных условиях, затем обрабатывают полученные результаты высева фекалий, основываясь на количестве выросших колоний, и выносят суждение о выживаемости и приживаемости бактерий Helicobacter pylori KM-11Rif^R в желудке, исходя из величины доли жизнеспособных бактерий Helicobacter pylori KM-11Rif^R от числа введенных перорально животным, а также о начале бактериовыделения Helicobacter pylori КМ-11Rif^R с фекалиями животных, интенсивности, длительности и продолжительности бактериовыделения Helicobacter pylori KM-11Rif^R на основании подсчета колоний, выросших в микроаэрофильных условиях при температуре 37°С при ежедневном отборе и посеве отобранных фекалий белых мышей на селективную плотную питательную среду с рифампицином при следующем количественном соотношении компонентов, г/л:

пептон	20,0
дрожжевой экстракт	5,0
натрий хлористый	10,0
глюкоза	5,0
тиамина хлорид	0,008
кальция пантотенат	0,008
натрия сульфит	0,5
гемин	0,01
агар-агар	12,0
твин-80	1,0
рифампицин	150 мкг × мл-1
дистиллированная вода	остальное

рН среды 7,3±0,2 ед. рН.

2. Способ моделирования хеликобактериоза по п. 1, отличающийся тем, что бактерии Helicobacter pylori KM-11Rif^R в количестве 1×10⁵ микробных клеток в объеме 0,2 мл изотонического раствора хлорида натрия вводят перорально один раз в сутки белым мышам на фоне иммуносупрессивного эффекта от внутримышечного введения синтетического глюкокортикоидного препарата Дексаметазона в дозе 40 мкг в сутки на одну белую мышь.

3. Способ моделирования хеликобактериоза по п. 1, отличающийся тем, что в работе для перорального введения белым мышам используют маркированный по признаку устойчивости к антибиотику рифампицину штамм Helicobacter pylori KM-11Rif^R, при этом маркированные бактерии штамма Helicobacter pylori KM-11Rif^R получают путем их выращивания на плотной питательной среде с повышающимися концентрациями антибиотика, начиная с 10 мкг × мл^-1 до 150 мкг × мл^-1, причем выросшие колонии спонтанных мутантов, сохраняющих видовые признаки, отбирают и повторно высевают на плотную питательную среду с более высокой концентрацией антибиотика вплоть до 150 мкг × мл^-1.