Способ прогнозирования риска формирования т-хелперного иммунодефицита у плавсостава
Владельцы патента RU 2691117:
Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Федеральный исследовательский центр комплексного изучения Арктики имени академика Н.П. Лавёрова Российской академии наук ФГБУН ФИЦКИА РАН (RU)
Изобретение относится к медицине, а именно к иммунологии, и может быть использовано для прогнозирования риска формирования Т-хелперного иммунодефицита у плавсостава. Способ выявления риска формирования Т-хелперного дефицита у моряков, включающий подсчет общего количества лейкоцитов, лимфоцитов и моноцитов в крови. При одновременном выявлении концентрации лимфоцитов меньше 1,5×109 кл/л и моноцитов менее 0,35×109 кл/л прогнозируется высокий уровень риска 90% Т-хелперного иммунодефицита. Использование данного способа позволяет выявить лиц, имеющих риск Т-хелперного иммунодефицита при профотборе для работы в море, а также с целью профилактики вторичного экологически зависимого иммунодефицита у плавсостава. 6 пр.
Изобретение относится к медицине, морской медицине и предназначено для выявления риска формирования Т-хелперного иммунодефицита у плавсостава с целью профилактики вторичных иммунодефицитов.
Особенность морского труда заключается в том, что моряки длительно и непрерывно пребывают в специфических условиях судовой среды. Нами установлено, что иммунный статус плавсостава Северного морского пароходства (СМП) характеризуется высокой частотой регистрации Т-хелперного дефицита, снижением содержания Т-хелперов в динамике рейса и с увеличением стажа [Состояние иммунной системы у моряков / А.И. Леванюк // Ж. Экология человека, 2010 г. - №5. - С. 20-23; Лупачев В.В. Иммунный и гормональный статус моряков в динамике рейса // автореф. дисс. … канд. мед. наук / Архангельск, 1993, 22 с.]. Т-хелперный дефицит является самым серьезным иммунодефицитом, отличающимся тем, что организм человека становится совершенно беззащитным не только в отношении патогенных представителей микроорганизмов, но и собственной микрофлоры, а также собственных аутоантигенов. Т-хелперы (Th или CD4+) распознают путем связывания антигена в ассоциации с молекулами главного комплекса гистосовместимости HLADR класса II. Активированные Т-хелперы продуцируют интерферон-γ, фактор некроза опухоли α, интерлейкин-2 (IL-2) и другие цитокины. Полагают, что CD4+ усиливают активацию цитотоксических лимфоцитов, натуральных киллеров (NK), макрофагов и моноцитов. Т-хелперные (CD4+) лимфоциты памяти специфичны к антигену, они первыми встречаются и могут быть привлечены в процессе вторичного иммунного ответа, вызывая более быстрый и более выраженный ответ на антигены.
Раннее выявление риска развития Т-хелперного дефицита имеет важное значение в процессе профотбора для работы в экстремальных условиях, а также для профилактики воспалительных заболеваний и рецидивов хронических процессов.
Известен способ выявления дефицита Т-хелперов путем иммунофенотипирования моноклональными сыворотками с предварительным изучением общего количества лейкоцитов в камере Горяева и % содержания лимфоцитов в мазке крови, окрашенном азуром и эозином унифицированным методом Романовского ["Лабораторные методы исследования в клинике", Справочник, под ред. В.В. Меньшикова, М., Мед., 1987]. Учет количества Т-хелперов производят микроскопией или методом проточной цитометрии на аппарате Epics XL фирмы Beckman Coulter (США). Основные материальные и трудовые затраты идут на определение фенотипа, что связано с длительной предподготовкой на получение лейкоцитарной взвеси [Boyum A. Separation of leukocytes from blood and bone marrow // Scand. J. Clin. Invest, 1968, V. 21. S. 97. - P. 77-89] и постановку непрямой иммунопероксидазной реакции на препарате с дорогостоящими моноклональными сыворотками [Дж. Полак, С. Ван-Норден. Введение в иммуноцитохимию, М., "Медицина", 1986 г.].
Известен способ быстрого выявления риска Т-хелперного дефицита у людей в условиях Арктики, включающий забор крови из вены, определение соотношения отдельных фенотипов иммунокомпетентных клеток периферической крови, определение их активности и суждение о иммунодефиците, отличающийся тем, что определяют общее количество лимфоцитов, малых лимфоцитов в лимфоцитограмме и содержание зрелых функционально активных Т-клеток CD3+, при содержании общего количества лимфоцитов меньше 1,5×109 кл/л и клеток CD3+ меньше 1,5×109 кл/л судят о риске формирования Т-хелперного дефицита [Патент №2614702 MПК: G01N 33/53 Способы быстрого выявления риска Т-хелперного дефицита у людей в условиях Арктики. Щеголева Л.С., Сергеева Т.Б., Филиппова О.Е., Шашкова Е.Ю.]. Данный способ также связан с необходимостью взятия крови из вены, использования дорогостоящих моноклональных сывороток и долговременного способа выделения клеточной взвеси лимфоцитов из цельной крови. Эти способы невозможно внедрить для массового обследования моряков в силу длительности производства анализов (2-3 суток), сложности, высокой стоимости технологического процесса и необходимости наличия оборудования для оценки результатов фенотипирования.
Предлагаемый нами способ простой, достаточно дешевый и не требует никакого оборудования кроме обычного биологического микроскопа, в связи с чем, может быть использован не только в любой лаборатории, но также в экспедиционных и полевых условиях. Данное изобретение особенно эффективно использовать в период прохождения медицинского освидетельствования плавсостава экипажей судов перед выходом в рейс.
Натощак, в утренние часы, с использованием разовых скарификаторов производится забор капиллярной крови с 4-го пальца кисти, определяется общее содержание лейкоцитов в камере Горяева, а в мазке крови, окрашенном по Романовскому-Гимзе подсчитывается лейкограмма в %. Затем высчитывается абсолютное содержание лимфоцитов и моноцитов. Риск дефицита Т-хелперов практически в 100% ассоциирован с одновременным дефицитом лимфоцитов и моноцитов (соответственно менее 1,5 и 0,35×109 кл/л).
Указанным способом был обследован плавсостав Северного морского пароходства (111 человек) в возрасте от 25 до 55 лет в период прохождения медицинского освидетельствования плавсостава экипажей морских судов перед выходом в рейс, все обследованные являлись клинически здоровыми добровольцами, у которых не было выявлено рецидивирующих заболеваний и обострений; 50 больных с Т-хелперным дефицитом, установленным врачем-иммунологом и обследованным в специализированной иммунологической лаборатории Института физиологии природных адаптаций УрО РАН. Исследование проведено с соблюдением основных норм биомедицинской этики (Хельсинкская декларация Всемирной медицинской ассоциации об этических принципах проведения медицинских исследований с участием людей в качестве субъектов, 1964 г., с изменениями и дополнениями в 2008 г.) и с письменного согласия респондентов. В периферической венозной крови изучали лейкограмму с абсолютным содержанием нейтрофилов, моноцитов и лимфоцитов, содержание всех известных фенотипов лимфоцитов, цитокинов Т-хелперов и активность фагоцитов. Количество лимфоцитов, моноцитов подсчитывали в мазках крови, окрашенных по Романовскому-Гимзе при иммерсионном увеличении объектива ×90 и окуляра ×7. Данные анализа выражали в процентах. Абсолютное содержание клеток определяли подсчетом процентного содержания от общего количества лейкоцитов. Содержание фенотипов лимфоцитов определяли с помощью непрямой иммуннопероксидазной реакции с использованием моноклональных антител на препаратах лимфоцитов типа «высушенной капли» и методом проточной цитометрии. Учет результатов производили микроскопией и на проточном цитометре Epics XL фирмы Beckman Coulter (США). Полученные результаты обработаны с помощью пакета программы «Statistica for Windows, версия 6» («StatSoft», США). Данные представлены в виде средних ± ошибка средней. Корреляции между показателями определяли с использованием коэффициента ранговой корреляции Спирмена и коэффициента линейной корреляции Пирсона, достоверными считались различия при уровне значимости p<0,05. Такое многоплановое обследование проведено, чтобы обосновать диагноз Т-хелперного дефицита не только по дефициту содержания CD4+, но и по признакам функциональной недостаточности иммунокомпетентных клеток, определяющих синдром Т-хелперного дефицита. Среди обследуемых 111 человек было выявлено 20 - со всеми лабораторными признаками, соответствующими дефициту Т-хелперов. Нами установлено, что у плавсостава Северного морского пароходства среднее содержание лимфоцитов в периферической крови составило 33,52±0,86%, в абсолютных цифрах - 1,80±0,04×109 кл/л. Колебания в относительном содержании лимфоцитов регистрировали в широких пределах от 17 до 59%, низкое содержание (<1,5×109 кл/л) лимфоцитов установлено у 32 обследуемых (28,83%). Содержание моноцитов в среднем составило 8,28±0,46% и 0,45±0,03×109 кл/л. Колебания относительного и абсолютного их содержания достигали 25% и 0,06-1,63×109 кл/л; в 42,34% случаев (47 человек) наблюдали низкое содержание моноцитов (<0,35×109 кл/л). В абсолютном значении средние концентрации Т-хелперов (CD4+) составили 0,55±0,02×109 кл/л. Дефицит Т-хелперов регистрировали у 20 практически здоровых моряков (18,02%).
Итак, из 20 обследуемых лиц с дефицитом Т-хелперов у всех выявлен дефицит содержания моноцитов и у 18 обследуемых регистрировали лимфопению с содержанием лимфоцитов менее 1,5×109 кл/л. Таким образом, Т-хелперный дефицит у моряков в 90% ассоциируется с одновременно низкими значениями лимфоцитов (меньше 1,5×109 кл/л) и моноцитов (менее 0,35×109 кл/л).
Частные примеры использования заявленного способа.
Пример 1. П., 49 лет, пол мужской. Место проживания г. Архангельск. Место работы СМП. Профессия электромеханик. При лабораторном обследовании выявлен низкий уровень содержания общего количества лимфоцитов (1,28×109 кл/л), моноцитов (0,30×109 кл/л) и CD4+ (0,28×109 кл/л). Совпадение дефицита содержания Т-хелперов с дефицитом циркулирующих лимфоцитов и моноцитов подтверждено.
Пример 2. Ч., 35 лет, пол мужской. Место проживания г. Архангельск. Место работы СМП. Профессия электромеханик. При лабораторном исследовании периферической крови выявлен низкий уровень содержания общего количества лимфоцитов (1,26×109 кл/л), моноцитов (0,12×109 кл/л), CD4+ (0,31×109 кл/л). Выявленная закономерность подтверждена.
Пример 3. Ш., 36 лет, пол мужской. Место проживания г. Архангельск. Место работы СМП. Профессия матрос. При лабораторном исследовании периферической венозной крови выявлен низкий уровень содержания общего количества лимфоцитов (1,05×109 кл/л), моноцитов (0,24×109 кл/л), CD4+ (0,33×109 кл/л). Выявленная закономерность подтверждена.
Пример 4. Д., 33 лет, пол мужской. Место проживания г. Архангельск. Место работы СМП. Профессия матрос. При лабораторном исследовании периферической венозной крови выявлен низкий уровень содержания общего количества лимфоцитов (0,99×109 кл/л), моноцитов (0,29×109 кл/л), CD4+ (0,36×109 кл/л). Выявленная закономерность подтверждена.
Пример 5. К., 41 год, пол мужской. Место проживания г. Архангельск. Место работы СМП. Профессия механик. При лабораторном исследовании периферической венозной крови выявлен нормальный уровень содержания общего количества лимфоцитов (2,05×109 кл/л), моноцитов (0,16×109 кл/л), CD4+ (0,48×109 кл/л). Закономерность не выявлена.
Пример 6. А., 33 лет, пол мужской. Место проживания г. Архангельск. Место работы СМП. Профессия помощник капитана. При лабораторном исследовании периферической венозной крови выявлен нормальный уровень содержания общего количества лимфоцитов (1,80×109 кл/л), моноцитов (0,40×109 кл/л), CD4+ (0,59×109 кл/л). Закономерность не выявлена.
Способ выявления риска формирования Т-хелперного дефицита у моряков, включающий подсчет общего количества лейкоцитов, лимфоцитов и моноцитов в крови, отличающийся тем, что при одновременном выявлении концентрации лимфоцитов меньше 1,5×109 кл/л и моноцитов менее 0,35×109 кл/л прогнозируется высокий уровень риска 90% Т-хелперного иммунодефицита.
