Способ борьбы с гусеницами непарного шелкопряда (lymantria dispar)
Владельцы патента RU 2691614:
ОБЩЕСТВО С ОГРАНИЧЕННОЙ ОТВЕТСТВЕННОСТЬЮ "ДНК-ИНСЕКТИЦИДЫ" (RU)
Изобретение относится к области биотехнологии. Изобретение представляет собой способ борьбы с гусеницами непарного шелкопряда (Lymantria dispar), включающий использование инсектицида на основе антисмыслового фрагмента ДНК, избирательно действующего на личинок насекомых определенного вида, где проводят контактную обработку пульверизатором гусениц насекомого водным раствором короткого 11 нуклеотидов длиной антисмыслового фрагмента ДНК гена 5,8S рибосомальной РНК непарного шелкопряда с последовательностью 5'-TGCGTTGAAA-3' в концентрации 200 пмоль/мкл таким образом, чтобы на гусеницу I-II возраста попало не менее 0,3 мкл раствора. Изобретение позволяет повысить смертность гусениц непарного шелкопряда (Lymantria dispar). 4 табл.
Изобретение относится к области борьбы с листогрызущими насекомыми на личиночной стадии развития.
Непарный шелкопряд (Lymantria dispar (Lepidoptera: Lymantriinae)), являясь полифагом, относится к числу серьезных вредителей древесных и кустарниковых пород растений Северного полушария. Периодические вспышки массового размножения непарного шелкопряда наблюдаются ежегодно в тех или иных частях его ареала. Довольно часто они носят местный характер и образуются на небольших площадях, иногда же распространяются на огромных пространствах, захватывая несколько ландшафтно-географических зон, нанося существенный экономический ущерб. На сегодняшний день остро требуются эффективные препараты для контроля численности непарного шелкопряда в Хабаровском крае, Алтайском крае, Тюменской области, Курганской области и других регионах Российской Федерации. Общий объем средств, необходимый для регуляции численности непарного шелкопряда по оценкам, сделанным через доступные ресурсы в открытой печати и Интернете, позволяют говорить о сумме, превышающей 1 миллиард рублей в год. Сумма ущерба от неконтролируемого роста численности непарного шелкопряда оценивается в сотни раз больше, чем предупредительные меры борьбы, в частности для лесозаготовительных предприятий.
Чаще всего в борьбе с непарным шелкопрядом применяют доступные, но неизбирательные в действии химические препараты - пиретроиды, фосфорорганические соединения, карбаматы, ингибиторы синтеза хитина, неоникотиноиды. Биологическая регуляция численности непарного шелкопряда происходит реже и основана на использовании избирательных в действии, но дорогих препаратов на основе вируса ядерного полиэдроза непарного шелкопряда и бактерии Bacillus thuringiensis.
На сегодняшний день на стадии разработки для борьбы с листогрызущими насекомыми находятся препараты на основе коротких немодифицированных антисмысловых ДНК-олигонуклеотидов, которые способны объединить наилучшие характеристики современных препаратов - доступность и избирательность. Это связано с тем, что синтез ДНК становится все более недорогим, а комбинация азотистых оснований в каждом отдельном ДНК-олигонуклеотиде (ДНК-инсектициде) уникальна и обеспечивает безопасность для нецелевых организмов. Кроме этого, ДНК является полимером природного происхождения и не будет накапливаться в окружающей среде.
Известен способ борьбы с непарным шелкопрядом при помощи химического инсектицида - димилина [Berry, R.E., Moldenke A.F., Miller J.C., Wernz J.G. (1993). Toxicity of diflubenzuron in larvae of gypsy moth (Lepidoptera: Lymantriidae): effects of host plant. Journal of Economic Entomology. V. 86, P. 809-814], в котором используются действующее вещество дифторбензурон, нарушающее процессы хитинообразования, что приводит к появлению нежизнеспособных особей, имеющих истонченные покровы и погибающих в результате разрыва кутикулы и излияния гемолимфы в период линьки или вскоре после нее.
Недостатками этого метода является то, что дифторбензурон не обладает избирательностью в действии и способен уничтожить нецелевых насекомых, включая полезных и хищных насекомых, а также навредить позвоночным животным (стимулировать возникновение рака, снижать уровень тестостерона, вызывать раздражение глаз) и иметь продолжительный негативный эффект на членистоногих, живущих в водоемах. В лесных экосистемах дифторбензурон способен сохраняться в течение нескольких месяцев.
Известен способ борьбы с личинками металловидки серой [Патент РФ №2645258, МПК: C12N 15/113, автор - Оберемок В.В., опубл. 10.02.2018, Бюл. №5], в котором используется инсектицид на основе нуклеиновой кислоты, избирательно действующий на личинок насекомых определенного вида, с использованием короткого (18 нуклеотидов) одноцепочечного антисмыслового фрагмента генома бакуловируса из консервативного домена RING гена IAP вируса ядерного полиэдроза металловидки серой 5'-CGACATGACCGCAAGGTA-3' при наружной обработке личинок насекомого раствором данного фрагмента, в котором личинок насекомого обрабатывают раствором данного фрагмента в концентрации 50 пмоль/мкл, таким образом, чтобы на личинку I-II возрастов попало не менее 0,1-0,3 мкл раствора, при этом используют один фрагмент данного генома бакуловируса.
Недостатками этого метода является то, что он не предназначен для борьбы с гусеницами непарного шелкопряда. Кроме того, используемый антисмысловой фрагмент ДНК является более длинным по сравнению с заявляемым фрагментом, а потому синтез его будет менее доступным.
В качестве прототипа выбран способ повышения эффективности бакуловирусных препаратов [Патент РФ №2581794, МПК: A01N 63/00, C12N 7/00, автор - Оберемок В.В., опубл. 20.04.2016, Бюл. №11], включающий использование полиэдров вируса ядерного полиэдроза, избирательно действующих на гусениц непарного шелкопряда, в котором предварительно проводят заражение насекомых вирусом ядерного полиэдроза, для чего в течение 2-х дней гусениц I-III возрастов кормят питательной средой, содержащей 103-104 полиэдров на 1 мг среды, через 2-5 дней после этого пульверизатором осуществляют наружную обработку насекомого водным раствором консервативного короткого 18 нуклеотидов длиной антисмыслового фрагмента антиапоптозного гена IAP-3 вируса ядерного полиэдроза непарного шелкопряда с последовательностью 5'-CGACGTGGTGGCACGGCG-3' в концентрации 10 пмоль/мкл.
Способ направлен на борьбу с гусеницами непарного шелкопряда, однако имеет следующие недостатки: 1) используется более длинный, а потому менее доступный фрагмент дезоксирибонуклеиновой кислоты; 2) в качестве подготовительного этапа, до применения антисмыслового олигонуклеотида, применяются полиэдры вируса ядерного полиэдроза непарного шелкопряда, что также приводит к дополнительному удорожанию способа; 3) наблюдается низкая смертность насекомого в результате применения антисмыслового фрагмента ДНК.
Техническим результатом изобретения является увеличение доступности предлагаемого подхода, а также повышение смертности насекомых в результате применения антисмыслового фрагмента ДНК.
Разработанный способ борьбы с гусеницами непарного шелкопряда (Lymantria dispar) включает использование инсектицида на основе водного раствора короткого консервативного антисмыслового фрагмента ДНК гена 5,8S рибосомальной РНК непарного шелкопряда с последовательностью 5'-TGCGTTGAAA-3' в концентрации 200 пмоль/мкл таким образом, чтобы на гусеницу I-II возраста попало не менее 0,3 мкл раствора.
В классической защите леса применение инсектицидных препаратов не всегда эффективно, т.к. у насекомого вырабатывается генетическая устойчивость к химическим агентам. Поэтому мы предлагаем использовать для борьбы с гусеницами непарного шелкопряда препарат на основе короткого консервативного антисмыслового ДНК-олигонуклеотида, который способен заменить неизбирательные химические инсектициды, в частности димилин. Предлагаемый нами ДНК-инсектицид на основе природного полимера является экологически чистым, имеет целевой характер и к нему медленней вырабатывается генетическая устойчивость насекомого.
Авторами заявленного технического решения впервые выявлен тот факт, что обработка гусениц непарного шелкопряда антисмысловым фрагментом гена 5,8S рибосомальной РНК достоверно увеличивает смертность насекомого по сравнению с контролем. И поскольку влияние этого фрагмента на гусениц непарного шелкопряда выявлено впервые, это доказывает существенность отличий.
Причинно-следственная связь между отличительными признаками изобретения и достигаемым техническим результатом заключается в том, что антисмысловой фрагмент гена 5,8S рибосомальной РНК непарного шелкопряда блокирует сайт 5'-GAAC-3' на 5,8S рибосомальной РНК непарного шелкопряда, который отвечает за присоединение молекул транспортной РНК во время трансляции, тем самым вызывая ингибирование биосинтеза белка, что в конечном итоге приводит к гибели насекомого. Тонкие детали механизма действия данного ДНК-инсектицида на сегодняшний день изучаются, но предполагается, что фрагмент гена 5,8S рибосомальной РНК работает по механизму действия антисмысловых олигонуклеотидов.
Пример конкретного осуществления способа.
Для эксперимента были собраны гусеницы непарного шелкопряда (Lymantria dispar) из дубравы. Для одной повторности каждого варианта эксперимента были использованы 16-20 гусениц 1-II возрастов. Все насекомые находились в пластиковых контейнерах объемом 100 мл, при среднесуточной температуре 25-27°С. В качестве питания использовали листья дуба пушистого Quercus pubescens. Последовательность примененного антисмыслового фрагмента гена 5,8S рибосомальной РНК (Oligo5.8S) была следующей: 5'-TGCGTTGAAA-3'. Гусеницы контрольной группы, находящиеся в пластиковых контейнерах, были обработаны водой. В качестве контрольного антисмыслового олигонуклеотида использовался ДНК-фрагмент OligoCG (случайный фрагмент) с последовательностью 5'-CGCGCGCGCGC-3'. В ходе эксперимента на каждую гусеницу попало не менее 60 пмоль ДНК-олигонуклеотида. Фрагменты были синтезированы компанией Евроген (Россия). Был использован х2-критерий Пирсона с поправкой Йетса для оценивания инсектицидного действия фрагментов ДНК. Эксперимент провели в пятикратной повторности.
Антисмысловой фрагмент гена 5,8S рибосомальной РНК непарного шелкопряда проявил достоверное инсектицидное действие на гусениц непарного шелкопряда. Достоверные различия в смертности насекомых были обнаружены между группами контроль и 01igo5.8S на третий (Р<0,01) и шестой (Р<0,01) дни.
Результаты эксперимента представлены в таблицах 1, 2, 3 и 4. Полученные результаты показывают перспективность применения антисмыслового фрагмента гена 5,8S рибосомальной РНК в практике лесного хозяйства с целью борьбы с непарным шелкопрядом. По сравнению с прототипом заявленный способ является более доступным и эффективным.
В таблице представлены средние значения и стандартные ошибки средних значений
В таблице представлены средние значения и стандартные ошибки средних значений
Способ борьбы с гусеницами непарного шелкопряда (Lymantria dispar), включающий использование инсектицида на основе антисмыслового фрагмента ДНК, избирательно действующего на личинок насекомых определенного вида, отличающийся тем, что проводят контактную обработку пульверизатором гусениц насекомого водным раствором короткого 11 нуклеотидов длиной антисмыслового фрагмента ДНК гена 5,8S рибосомальной РНК непарного шелкопряда с последовательностью 5'-TGCGTTGAAA-3' в концентрации 200 пмоль/мкл таким образом, чтобы на гусеницу I-II возраста попало не менее 0,3 мкл раствора.
