Способ определения пролиферативной активности опухолевых клеток трипл-негативного рака молочной железы

Авторы патента:

A61K48/00 - Лекарственные препараты, содержащие генетический материал, который включен в клетки живого организма для лечения генетических заболеваний; для генной терапии

A61B5/00 - Измерение для диагностических целей (радиодиагностика A61B 6/00; диагностика с помощью ультразвуковых, инфразвуковых и звуковых волн A61B 8/00); опознание личности

Владельцы патента RU 2692561:

Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования "Смоленский государственный медицинский университет" министерства здравоохранения Российской Федерации (RU)

Изобретение относится к медицине и биотехнологии, в частности к определению показателя пролиферативной активности опухолевых клеток трипл-негативного рака молочной железы. Способ включает приготовление парафиновых блоков из опухолевой ткани и гистологических срезов, депарафинирование их в гексане. Затем неокрашенные депарафинированные гистологические срезы опухолевой ткани подвергают флуориметрическому исследованию и измеряют спектры возбуждения флуоресценции с 230 до 360 нм при длине волны регистрации 410 нм и спектры флуоресценции при длине волны возбуждения 300 нм и длин волн регистрации от 330 до 450 нм, определяют соотношение между интенсивностями кривых с максимумами в области 265 и 305 нм (I₂₆₅/I₃₀₅), и если I₂₆₅/I₃₀₅ = 1,0, то пролиферативная активность низкая, увеличение значения соотношения I₂₆₅/I₃₀₅ свидетельствует о высокой пролиферативной активности. Изобретение позволяет повысить эффективность получаемых результатов. 3 ил., 1 табл., 4 пр.

Изобретение относится к медицине, может быть использовано в патологической анатомии, медицинской диагностике и для медицинских исследований, в частности для определения пролиферативной активности опухолевых клеток трипл-негативного рака молочной железы с последующим решением вопроса о назначении терапии и прогнозе пациентки.

В настоящее время трипл-негативный рак молочной железы считается гетерогенным заболеванием и делится на базальноподобный и небазальноподобный подтипы, характеризующиеся различными прогнозами и ответами на химиотерапию. Показатель пролиферативной активности, определенный экспрессией белка Ki-67 является предиктором эффективности неоадьювантной химиотерапии у больных с операбельных трипл-негативным раком. Высокий уровень пролиферативной активности, определенной индексом Ki-67 (более 10%), достоверно ассоциируется с высокой эффективностью неоадьювантной химиотерапии и достижением полной морфологической ремиссии, но низкой выживаемостью, низкий уровень пролиферативной активности (индекс Ki-67 менее 10%) имеет обартное клиническое значение (Fasching P.A., Heusinger К, Haeberle L., et al. Ki-67 can be used for further classification of triple negative breast cancer into two subtypes with different response and prognosis // Breast Cancer Research.- Vol. 11 (486). - P. 2-13. doi: 10.1186/1471-2407-11-486).

Существует способ определения пролиферативной активности клеток рака молочной железы на гистологических срезах, приготовленных путем стандартной парафиновой проводки с использованием иммуногистохимического исследования с моноклональными антителами к белку Ki-67. Фрагмент ткани трипл-негативного рака молочной железы, полученный путем биопсии или во время операции, подвергают стандартной парафиновой проводке с последующим иммуногистохимическим исследованием на парафиновых срезах пероксидазно-антипероксидазным методом с демаскировкой антигенов в РТ-модуле (DAKO) с использованием буфера для демаскировки (Tris/EDTA рН 9) (DAKO). В качестве системы визуализации используют универсальный набор с полимером EnVision Flex (DAKO). Ядра докрашивают гематоксилином Майера. Используют мышиные моноклональные антитела к фактору пролиферации - белку Ki-67 (клон MIB 1, RTU). Пролиферативную активность оценивают на основании расчета индекса пролиферативной активности в процентах на основании подсчета 400 клеток при большом увеличении микроскопа в зонах с максимальной концентрацией позитивно-окрашенных ядер (hot spot) (Петров С.В., Райхлин Н.Т. Руководство по иммуногистохимической диагностике опухолей человека. - Казань, 2004. - 452 с). Недостатки данного способа:

1) Необходимость дорогостоящего оборудования для автоматической стандартизированной окраски и специальных реактивов.

2) Иммунореактивность Ki-67 во многом зависит от целого ряда методических параметров, таких как сроки фиксации образца ткани, условия его обработки и метод демаскировки антигена, условий выполнения метода.

3) Трудоемкость обработки результатов.

4) Результаты способа во многом субъективны и зависят от квалификации специалиста, проводящего оценку экспрессии.

Существуют способы определения пролиферативной активности: радиоавтография с ³Н-тимидином, выявление клеток, меченных BrdU; иммуногисто- и цитохимическое выявление белков, регулирующих клеточный цикл, таких как PNCA, пистоны Н3, циклин D1 (Кирш О.В., Г.В. Безнин, Д.Э. Коржевский Маркеры пролиферации, применяемые в гистологических исследованиях //Морфология. - №6, Т136. - С. 95-100). Недостатками данных методов являются дороговизна, необходимость предварительной подготовки материала, экспрессия маркеров только в определенные фазы клеточного цикла, а также токсичность первого метода.

Техническим результатом предлагаемого способа является упрощение методики и повышение объективности получаемых результатов для определения пролиферативной активности у больных с трипл-негативным раком молочной железы.

Сущность предлагаемого изобретения состоит в том, что неокрашенные депарафинированные гистологические срезы ткани рака молочной железы после определения его трипл-негативного статуса, приготовленные путем стандартной парафиновой проводки, подвергают флуориметрическому исследованию, поместив их на кварцевое стекло, предварительно депарафинировав в растворе гексана. После этого проводят измерение спектра возбуждения флуоресценции опухолевой ткани в диапазоне длин волн от 230 до 360 нм при длине волны регистрации 410 нм. Дополнительно проводят измерения спектра флуоресценции опухолевой ткани при длине волны возбуждения 300 нм и длин волн регистрации от 330 до 450 нм и определяют соотношение между интенсивностями кривых с максимумами в области 265 и 305 нм (I₂₆₅/I₃₀₅) и если I₂₆₅/I₃₀₅ = 1,0, то пролиферативная активность трипл-негативного рака низкая, увеличение значения соотношения I₂₆₅/I₃₀₅ говорит о высокой пролиферативной активности.

Способ осуществляют следующим образом.

Фрагмент ткани рака молочной железы, полученный путем биопсии или во время операции, подвергают стандартной парафиновой проводке. После подтверждения путем иммуногистохимического исследования трипл-негативного статуса рака молочной железы (отсутствие экспрессии рецепторов к эстрогену, прогестерону и рецепторов HER-2/neu) с парафинового блока готовят параллельный срез толщиной 6-7 мкм без окрашивания гематоксилином и эозином, депарафинируют его в гексане в течение 3 мин, помещают на кварцевое стекло, не окрашивая, и измеряют спектры возбуждения флуоресценции с 230 до 360 нм при длине волны регистрации 410 нм и спектры флуоресценции при длине волны возбуждения 300 нм и длин волн регистрации от 330 до 450 нм на спектрофлуориметре SOLAR СМ-2203. На графиках фигуры 1 изображены типичные спектры возбуждения флуоресценции образцов трипл-негативного рака молочной железы. Все спектры возбуждения флуоресценции имеют сложную структуру, состоящую из трех четко выраженных максимумов: первый на 260-265 нм, второй 305-310 нм и третий на 335-340 нм. Кривые 1, 2, 3, 4 представляют собой спектр возбуждения флуоресценции исследуемой ткани при индексе пролиферативной активности, равном 10%, 70%, 80% и 90% соответственно (результаты сравнивали с результатами иммуногистохимического исследования с мышиными с моноклональными антителами к белку Ki-67 (клон MIB 1, RTU) с последующим подсчетом индекса пролиферативной активности по вышеописанной методике). При самом малом индексе пролиферативной активности два пика плохо разрешены и поэтому образуют один общий пик с максимумом на 287 нм, другой пик четко выражен с максимумом на 334 нм. Остальные кривые имеют три четко выраженных хорошо разрешенных между собой максимума в области 265, 305 и 335 нм. При увеличении индекса пролиферативной активности изменяется соотношение между первыми двумя максимумами.

Для анализа спектры раскладывают их на составляющие методом Гауссово-Лоренцевых кривых. На фигуре 2 приведен пример такого разложения типичного спектра. Кривая 1 представляет собой интенсивность света, после поглощения которого произойдет ионизация молекулфлуорофоров исследуемой ткани. Кривые 2 и 3 характеризуют свечение эндогенных флуорофоров исследуемой ткани. Кривая 4 характеризует рассеянный свет. Кривая 5 характеризует измеренный спектр, который разложили на составляющие. После разложения спектра на составляющие необходимо вычисляют отношение максимумов кривых 2 и 3, соответствующее определенному индексу пролиферативной активности.

В таблице 1 приведены соотношения между интенсивностями кривых с максимумами в области 265 и 305 нм (I₂₆₅/I₃₀₅) полученных после разложения кривых фигуры 1. Наибольшее значение отношения I₂₆₅/I₃₀₅, где I₂₆₅ - это интенсивность флуоресценции кривой с максимумом в районе 265 нм, I₃₀₅ - это интенсивность флуоресценции кривой с максимумом в районе 305 нм, наблюдается в образце с индексом пролиферативной активности равным 90%. С увеличением индекса пролиферативной активности вклад I₂₆₅ увеличивается.

На графиках фигуры 3 изображены типичные спектры флуоресценции этих же образцов опухолевой ткани, что и на фигуре 1. Кривая 1 представляет собой спектр флуоресценции ткани трипл-негативного рака молочной железы при индексе пролиферативной активности 10%. Кривые 2, 3, 4 представляют собой спектр возбуждения флуоресценции исследуемой опухолевой ткани трипл-негативного рака молочной железы при индексе пролиферативной активности равном 70%, 80% и 90% соответственно. Кривая 1, как и кривые 2,3 и 4, имеет два пика. Однако второй пик очень маленький с максимумом на 428 нм. На осях координат он изображен отдельно пунктирной линией. При индексе пролиферативной активности от 70 до 90% пик с максимумом на 440 нм хорошо выражен и постепенно уменьшается. Такое различие в спектрах образцов с индексом пролиферативной активности менее и более 10%, являющийся пороговым значением при назначении неоадьювантной химиотерапии, позволяет заменить иммуногистохимию на более доступную флуориметрию.

Способ основан на выявлении биохимического атипизма, который является ранним проявлением злокачественной трансформации клеток на молекулярном уровне. Благодаря селективному свечению флуорофоров (никотинамиддинуклеотида, коллагена, эластина и витамина В6) на длине волны 410 нм и переносу энергии на них с триптофан и тирозин содержащих белов удается выявить радикальные отличия в спектрах возбуждения флуоресценции тканей с различным индексом пролиферативной активности.

Пример 1. Пациентка А., 45 лет. Выполнена правосторонняя мастэктомия по поводу неспецифиированного рака молочной железы, верифицированного предоперационной трепанобиопсией. Гистологическое исследование операционного материала подтвердило предоперационный диагноз. Иммуногистохимическое исследование выявило трипл-негативный рак молочной железы, применение моноклональных антител к белку Ki-67 определило индекс пролиферативной активности равный 10%.

Результаты флуориметрического исследования: значение отношения I₂₆₅/I₃₀₅ составляет 1,0, что соответствует индексу пролиферативной активности равному 10%.

Пример 2. Пациентка К., 54 года. Выполнена правосторонняя мастэктомия по поводу протокового рака молочной железы, верифицированного предоперационной трепанобиоспией. Гистологическое исследование операционного материала подтвердило предоперационный диагноз. Иммуногистохимическое исследование выявило трипл-негативный рак молочной железы, применение моноклональных антител к белку Ki-67 выявило индекс пролиферативной активности равный 80%.

Результаты флуориметрического исследования: значение отношения I₂₆₅/I₃₀₅ составляет 1,22, что соответствует индексу пролиферативной активности равному 80%.

Пример 3. Пациентка С, 76 лет, выполнена левосторонняя мастэктомия по поводу неспецифицированного рака молочной железы, верифицированного предоперационной трепанобиоспией. Гистологическое исследование операционного материала подтвердило предоперационный диагноз. Иммуногистохимическое исследование выявило трипл-негативный рак молочной железы, применение моноклональных антител к белку Ki-67 выявило индекс пролиферативной активности равный 90%.

Результаты флуориметрического исследования: значение отношения I₂₆₅/I₃₀₅ составляет 1,31, что соответствует индексу пролиферативной активности равному 90%.

Пример 4. Пациентка О., 62 лет, выполнена трепанобиоспия опухоли левой молочной железы. Гистологическое заключение: неспецифицированный рак молочной железы. Иммуногистохимическое исследование выявило трипл-негативный рак молочной железы, применение моноклональных антител к белку Ki-67 выявило индекс пролиферативной активности равный 70%.

Результаты флуориметрического исследования: значение отношения I₂₆₅/I₃₀₅ составляет 1,15, что соответствует индексу пролиферативной активности равному 70%.

Данным способом исследовано 28 фрагментов ткани трипл-негативного рака молочной железы, в 100% случаев предложенный метод дифференцировал высокую (больше 10%) и низкую (менее 10%) пролиферативную активность в ткани трипл-негативного рака молочной железы, в 6 случаях с высокой пролиферативной активностью результаты иммуногистохимического исследования разнились на 10% с данными флуориметрического исследования, чем можно пренебречь, учитывая присутствие субъективности в анализе индекса пролиферативной активности путем определения белка Ki-67, а также отсутствия значения для назначения терапии.

Преимуществами предлагаемого способа являются дешевизна, отсутствие необходимости приобретения дорогостоящего оборудования и реактивов, требующих определенных температурных условий хранения, упрощение методики определения пролиферативной активности клеток трипл-негативного рака молочной железы, устранение влияния субъективности на обработку результатов, отсутствие необходимости специальной подготовки материала к исследованию и возможности искажения результатов под влиянием внешних условий, быстрота получения результата, что особенно важно для онкологических больных для скорейшего решения вопроса о назначении химиотерапии.

Способ определения показателя пролиферативной активности опухолевых клеток трипл-негативного рака молочной железы, включающий приготовление парафиновых блоков из опухолевой ткани и гистологических срезов из них, отличающийся тем, что неокрашенные депарафинированные гистологические срезы опухолевой ткани подвергают флуориметрическому исследованию и измеряют спектры возбуждения флуоресценции с 230 до 360 нм при длине волны регистрации 410 нм и спектры флуоресценции при длине волны возбуждения 300 нм и длин волн регистрации от 330 до 450 нм, определяют соотношение между интенсивностями кривых с максимумами в области 265 и 305 нм (I₂₆₅/I₃₀₅), и если I₂₆₅/I₃₀₅=1,0, то пролиферативная активность низкая, увеличение значения соотношения I₂₆₅/I₃₀₅ свидетельствует о высокой пролиферативной активности.

Изобретение относится к области медицины. Предложен способ предотвращения, ингибирования или лечения одного или нескольких симптомов мукополисахаридоза типа I (MPS I) у человека, включающий интратекальное введение нуждающемуся в этом человеку композиции, содержащей эффективное количество вектора на основе рекомбинантного аденоассоциированного вируса (rAAV), содержащего открытую рамку считывания, кодирующую альфа-L-идуронидазу, причем rAAV представляет собой rAAV9 или rAAVrh10.

Способ определения наличия рецепторов к эстрогену и прогестерону в ткани her2-негативного рака молочной железы // 2691606

Изобретение относится к медицине и биотехнологии, в частности к определению экспрессии рецепторов к эстрогену и прогестерону клетками HER-негативного рака молочной железы.

Способы и композиции для лечения болезни хантингтона // 2691102

Изобретение относится к медицине, а именно к неврологии, и может быть использовано для уменьшения экспрессии мутантного гена хантингтина (mHTT) для уменьшения или предотвращения образования агрегатов Htt у субъекта с болезнью Хантингтона (БХ).

Направляемая рнк регуляция транскрипции // 2690935

Изобретение относится к биотехнологии. Представлены способы модулирования экспрессии целевой нуклеиновой кислоты в клетках, включающие введение в клетки первой чужеродной нуклеиновой кислоты, кодирующей одну или несколько РНК, комплементарных к ДНК, причем ДНК включает целевую нуклеиновую кислоту, введение в клетки второй чужеродной нуклеиновой кислоты, кодирующей безнуклеазный белок Cas9, который связывается с ДНК и направляется одной или несколькими РНК, введение в клетки третьей чужеродной нуклеиновой кислоты, кодирующей регулирующий транскрипцию белок или домен, причем одна или несколько РНК, безнуклеазный белок Cas9 и регулирующий транскрипцию белок или домен экспрессируются, при этом одна или несколько РНК, безнуклеазный белок Cas9 и регулирующий транскрипцию белок или домен совместно локализуются на ДНК, а регулирующий транскрипцию белок или домен регулирует экспрессию целевой нуклеиновой кислоты.

Соединения и способы модуляции экспрессии дистрофической миотонин-протеинкиназы (dmpk) // 2690333

Изобретение относится к биотехнологии. Описаны соединения для снижения экспрессии мРНК DMPK, содержащие модифицированный олигонуклеотид, состоящий из 10-30 связанных нуклеозидов и имеющий по меньшей мере один модифицированный сахарный компонент, модифицированную межнуклеозидную связь и/или модифицированное нуклеотидное основание, при этом указанная нуклеотидная последовательность модифицированного олигонуклеотида по меньшей мере на 90% комплементарна SEQ ID NO: 1 и/или SEQ ID NO: 2 на протяжении всей длины модифицированного олигонуклеотида.

Фармацевтическая композиция, обладающая противоопухолевым эффектом, и способ снижения ингибирующего эффекта pd-l1 на т-клетки человека // 2688692

Группа изобретений относится к медицине и касается фармацевтической композиции, обладающей противоопухолевым эффектом, содержащей эффективное количество популяций Т-клеток человека, где Т-клетки человека включают изолированную нуклеотидную последовательность, содержащую нуклеотидную последовательность, кодирующую модифицированный белок запрограммированной смерти клетки 1 (PD-1) и нуклеотидную последовательность, кодирующую химерный антигенный рецептор (CAR), где модифицированный PD-1 и CAR экспрессируются в виде генных продуктов, которые являются отдельными полипептидами, и где модифицированный PD-1 является доминантно-негативным PD-1.

Фармацевтическая композиция для лечения рака, содержащая микрорнк в качестве активного ингредиента // 2686313

Изобретение относится к области медицины. Предложена фармацевтическая композиция для лечения рака, включающая одну или несколько миРНК, выбранных из группы, состоящей из miR-3670 и miR-8078, где miR-3670 включает двухцепочечную РНК, представленную нуклеотидными последовательностями SEQ ID NO: 35 и SEQ ID NO: 36, и miR-8078 включает двухцепочечную РНК, представленную нуклеотидными последовательностями SEQ ID NO: 65 и SEQ ID NO: 66.

Рекомбинантный вектор для создания плазмидных генетических конструкций, обладающих повышенной длительностью экспрессии целевых генов // 2686102

Изобретение относится к области молекулярной генетики, биотехнологии и медицины. Предложен рекомбинантный вектор для создания плазмидных генетических конструкций, обладающих повышенной длительностью экспрессии целевых генов, содержащий гексамер модифицированного S/MAR элемента из человеческого гена IFNβ и сниженное до 13 число CpG динуклеотидов, нуклеотидная последовательность которого представлена в SEQ ID NO 1.

Способы и композиции для направленной модификации генома // 2685914

Настоящее изобретение относится к генной инженерии. Предложен способ in vitro модификации генома в представляющем интерес геномном локусе в нечеловеческой плюрипотентной клетке млекопитающего, включающий внесение в клетку компонентов системы CRISPR/Cas9 в комбинации с крупным направляющим вектором (LTVEC), который составляет по меньшей мере 10 т.п.о.

Химерный антигенный рецептор // 2684713

Изобретение относится к области биотехнологии, конкретно к химерным антигенным рецепторам (CAR), и может быть использовано в медицине для лечения заболевания плазматических клеток, которые характеризуются экспрессией антигена созревания B-клеток (BCMA) и рецептора трансмембранного активатора, модулятора кальция и активатора лиганда циклофилина (TACI).

Способ реабилитации и восстановления двигательной активности под аудиовизуальным самоконтролем // 2692535

Изобретение относится к восстановительной медицине опорно-двигательного аппарата человека, а именно к контролю правильности выполнения движений частей тела при выполнении реабилитационных упражнений для восстановления суставов и к способу реабилитации и восстановления двигательной активности под аудиовизуальным самоконтролем.

Способ прогнозирования риска развития ранних абдоминальных осложнений у пациентов, перенесших коронарное шунтирование в условиях искусственного кровообращения // 2692455

Изобретение относится к медицине. Выявляют 6 наиболее значимых факторов риска.

Способ психофизиологической диагностики отдельных признаков хронического посттравматического стрессового расстройства у военнослужащих-комбатантов // 2692454

Изобретение относится к области медицины, а именно к психиатрии и медицинской психологии. Способ включает стресс-тестирование на аппаратном программном комплексе с использованием видео-, аудио- и электростимулов.

Способ численного определения постуральных нарушений человека и их визуализация // 2692437

Изобретение относится к медицине, а именно к восстановительной медицине и хиропрактике, и может быть использовано для численного определения постуральных нарушений и их визуализации.

Устройство с чувствительным элементом и способ мониторинга показателя жизнедеятельности субъекта // 2692213

Группа изобретений относится к медицине. Способ мониторинга показателей жизнедеятельности субъекта осуществляют с помощью устройства с чувствительным элементом для мониторинга показателей жизнедеятельности субъекта.

Измерение показателя здоровья с использованием времени восстановления ткани // 2691929

Группа изобретений относится к медицинской технике, а именно к средствам ухода за полостью рта. Устройство ухода за полостью рта, выполненное с возможностью оценивать показатель здоровья ткани десны пользователя, содержит модуль генерирования усилия, выполненный с возможностью прикладывать кратковременное усилие к ткани десны посредством подачи на ткань десны импульса сжатого воздуха или импульса жидкости, датчик, выполненный с возможностью принимать множество оптических сигналов от ткани десны с течением времени после приложения кратковременного усилия, контроллер, выполненный с возможностью количественно оценивать, по меньшей мере частично на основе анализа множества оптических сигналов, показатель здоровья ткани десны, причем показатель здоровья по меньшей мере частично основан на промежутке времени, который необходим ткани десны для восстановления после приложения усилия, и модуль обратной связи, выполненный с возможностью обеспечивать для пользователя информацию в отношении количественно оцененного показателя здоровья.

Мониторинг показателей жизненно важных функций во время фототерапевтического лечения на основе камеры // 2691878

Группа изобретений относится к медицине. Способ дистанционного получения информации о показателях жизненно важных функций живого существа, проходящего фототерапевтическое лечение, осуществляют с помощью устройства.

Способ оценки степени тяжести менингоэнцефалитов герпетической этиологии при вич-инфекции // 2691710

Изобретение относится к медицине и может быть использовано для оценки степени тяжести менингоэнцефалитов герпесвирусной этиологии при ВИЧ-инфекции. Определяют признаки общетоксического синдрома (А): температура тела, слабость, снижение аппетита.

Способ диагностики состояния аппендикса при аппендикулярном инфильтрате // 2691709

Изобретение относится к медицине, а именно к хирургии и может быть использовано для диагностики состояния аппендикса при аппендикулярном инфильтрате. Проводят компьютерную томографию.

Способ прогнозирования риска развития ишемической болезни сердца у пациентов с сахарным диабетом 2 типа в сочетании с субклиническим тиреотоксикозом // 2691620

Изобретение относится к медицине, а именно к кардиологии, и может быть использовано при прогнозировании риска развития ишемической болезни сердца (ИБС) у пациентов с сахарным диабетом 2 типа в сочетании с субклиническим тиреотоксикозом.