Способ фиксации и хранения биоматериала с использованием высокоэффективного и нетоксичного реагента

Изобретение относится к медицине и касается технологии фиксации и хранения биоматериала с использованием высокоэффективного и нетоксичного реагента. Способ фиксации и хранения биоматериала включает промывание водой биоматериала с последующей фиксацией его путем полного погружения в 10% водный раствор диальдегида по объему, превышающему объем биоматериала не менее чем в 10 раз, с заменой реагента на 7, 14 и 21 сутки каждый раз промывая биоматериал после удаления реагента проточной водой. На 14-е сутки производят замену реагента, имеющего следующий состав исходных компонентов (мас.%): диальдегид – 24,97%, дистиллированная вода – 74,93%, эозин K – 0,0032%, карбоксиметилцеллюлоза – 0,0968%, с выдержкой последнего в растворе диальдегида не менее 12 часов. На 21-е сутки производят замену реагента, имеющего следующий состав исходных компонентов (мас.%): диальдегид – 24,271%, дистиллированная вода – 72,813%, эозин K – 0,0031%, глицерин - 2,9129%, причем каждый раз биоматериал заливают реагентом, превышая объем биоматериала в 10 раз, предварительно промывая его после удаления реагента проточной водой. Предлагаемый способ фиксации и хранения биоматериала обеспечивает увеличение срока хранения органов любых размеров, а также позволяет сохранить цвет и органолептические свойства мягких тканей препаратов. 1 табл., 2 пр.

 

Изобретение относится к медицине и касается технологии фиксации и хранения биоматериала с использованием высокоэффективного и нетоксичного реагента. Изобретение обеспечивает увеличение срока хранения органов любых размеров, а также позволяет сохранить цвет и органолептические свойства мягких тканей препаратов.

Известен способ консервации тела человека или животного (патент РФ №2415572, А01N 1/00, опубл. 2011), в котором применяется по меньшей мере одно соединение формулы (I): , в которой R и R', одинаковые или разные, означают линейный или разветвленный алкильный радикал, включающий от 1 до 5 атомов углерода, и n представляет собой индекс, имеющий значение, включающее от 1 до 8, и/или формулы (II):

где R₂, R₃, R₄ и R₅ означают, независимо, линейный или разветвленный алкильный радикал, включающий от 1 до 8 атомов углерода, или R₂ и R₅ и/или R₃ и R₄ вместе и с двумя атомами кислорода, с которыми они связаны, образуют насыщенный или ненасыщенный 5- или 6-членный гетероцикл, возможно, замещенный одной или несколькими группами, выбираемыми среди ОН, СН₂ОН или линейного или разветвленного алкильного радикала, включающего от 1 до 8 атомов углерода; и R₁ означает группу CH-R₆-CH, где R₆ образует связь или означает линейный или разветвленный алкиленовый радикал, включающий от 1 до 5 атомов углерода, или насыщенный или ненасыщенный карбоцикл, включающий от 3 до 8 атомов углерода; или R₁ означает насыщенный или ненасыщенный карбоцикл, включающий от 3 до 8 атомов углерода; для консервации тела человека или животного и/или для бальзамирования мертвых тел. Консервация осуществляется путем введения в труп композиции, содержащей указанные соединения и глицерин.

Недостатком известного способа является дороговизна данной композиции в сравнении с заявляемым реагентом и невозможность длительного хранения консервированного тела человека и/или животного более 6 дней.

Известен способ, в котором используют жидкость (см. патент US №20030206884 A1, Кл.A01N 1/00, 2003), состоящую из водорастворимого полимера (на основе полисахаридов каррагенана, целлюлозы), нетоксичного дезинфектанта (поливинилпирролидон-йодина, солей хлоргексидина, гексахлоррофена, цетримида, триклозана), красителя кармина, смягчителя (глицерина, этиленгликоля, пропиленгликоля), комплексообразователя (ЭДТА, солей фосфорной кислоты, солей лимонной кислоты, солей угольной кислоты), антикоагулянта цитрата натрия, ароматизирующего вещества (масло розы, сандалового дерева, герани).

Недостатком известного аналога является необходимость хранения тела бальзамированного трупа при температуре 12-14°С, невозможность хранения более 21 суток, невозможность замены жидкости после проявления процессов разложения по истечению 21 суток.

Известен способ консервирования влажных музейных препаратов (см. патент РФ №2180480, Кл.A01N 1/02, 2002) с использованием раствора содержащего 69,99% воды, 15% формалина, 10% 95(спирта, 5% глицерина, 0,01% весового состава хлороформа. Это позволяет увеличить срок сохранения растворов и препаратов без снижения демонстрационных качеств. Предложенный раствор обладает длительным консервирующим свойством, не изменяя демонстрационных качеств препаратов, препараты выдерживают температуру до -5°С, по мере производственной необходимости из музейного препарата можно вырезать нужный участок для проведения гистоморфологических исследований.

Недостатками известного аналога является использование формалина, контакт с формалином оказывает заметное негативное воздействие на глаза, дыхательные пути, кожные покровы, репродуктивные органы, необходимо специальное помещение для работы с формалином. Более того, сам формалин при фиксации имеет ограниченную проникающую способность и очень высокие дубящие свойства, что негативно влияет на зафиксированные препараты.

Известен способ консервации биологических органов (см. патент РФ №2362299, Кл. A01N 1/02, 2009), которые предназначены для трансплантации. Способ консервирования биологических органов включает сохранение в контейнере емкости с биологическим органом, снабженным перфузатом. Контейнер изготавливают из материала с модулем Юнга не менее 216 ГПа, стенки которого имеют толщину с пределом прочности 0,15-0,85 ГПа, при этом контейнер на 80-85% его объема заливают дистиллированной водой, помещают заполненную перфузатом и выполненную из полимерного материала, например полиэтилена, емкость с биологическим объектом в центре верхней трети объема контейнера, доливают дистиллированную воду до полного объема контейнера, герметизируют и охлаждают до температуры -20 - -22°С в течение 1-1,5 часа со скоростью 0,3-0,5 град/мин.

Недостатками известного способа является применение специальной емкости с указанными техническими характеристиками, что требует дополнительных затрат при осуществлении способа.

Известен способ изготовления и хранения музейных анатомических влажных макропрепаратов (см. патент РФ №2566648, Кл. A01N 1/02, 2015), выбранный в качестве прототипа. Способ включает промывание препарата водой с дальнейшей фиксацией препарата путем полного погружения в емкость с раствором химического реагента, с последующей заменой реагента на свежий. При приготовлении макропрепарата фиксацию осуществляют путем его погружения в 10% водный раствор глиоксаля по объему, который превышает объем макропрепарата не менее, чем в 10 раз. Замена реагента производится трижды на 7, 14, 21 сутки, каждый раз промывая макропрепарат после удаления реагента проточной водой, для музейных экспонатов, фиксация которых осуществлялась 10% раствором формалина, формалин сливают, а перезаливку на 14, 28 и 42 сутки проводят 10% водным раствором глиоксаля.

Недостатком указанного прототипа является низкая скорость проникновения реагента на всю глубину ткани биоматериала, низкая эластичность препарата после использования реагента, уменьшение размеров препарата.

Задачей настоящего изобретения является разработка способа для фиксации и хранения биоматериала с использованием высокоэффективного и нетоксичного реагента, применение которого позволяет сохранить целостность биоматериала, в том числе биологические форму и его цвет, сохраняя при этом естественный вид раствора.

Под нетоксичным реагентом понимается последовательное применение 3-ех растворов, содержащих водный раствор диальдегида с функциональными добавками.

Поставленная задача решается тем, что способ включает промывание водой биоматериала с последующей фиксацией его путем полного погружения в 10% водный раствор диальдегида по объему, превышающему объем биоматериала не менее, чем в 10 раз, с заменой реагента на 7 сутки, промывая биоматериал после удаления реагента проточной водой. В отличие от прототипа на 14-е и 21 сутки производят замену реагента, заливая биоматериал раствором, представляющий собой водный раствор диальдегида с функциональными добавками, превышающим объем биоматериала в 10 раз, предварительно промывая биоматериал после удаления реагента проточной водой.

На 14-е сутки производят замену реагента, заливая биоматериал раствором, содержащим Эозин К и карбоксиметилцеллюлозу (КМЦ), с выдержкой КМЦ в растворе диальдегида не менее 12 часов, при следующем соотношении исходных компонентов, масс.%:

Диальдегид - 24,97%

Дистиллированная вода - 74,93%

Эозин К - 0,0032%

КМЦ - 0,0968%

Для приготовления указанного раствора была использована следующая схема приготовления

• растворение диальдегида в воде.

• растворение КМЦ в растворе диальдегида, при перемешивании (до отсутствия взвешенных частиц и неоднородностей в растворе), время набухания - не мене 12 часов.

Для увеличения водоудержания и повышения вязкости (в пределах нормы) был добавлен КМЦ в раствор с диальдегидом.

На 21-е сутки производят замену реагента, заливая биоматериал раствором, содержащим Эозин К и глицерин, превышающим объем биоматериала в 10 раз, предварительно промывая биоматериал после удаления реагента проточной водой при следующем соотношении исходных компонентов, масс.%:

Диальдегид - 24,271%

Дистиллированная вода - 72,813%

Эозин К- 0,0031%

глицерин - 2,9129%

Для приготовления указанного раствора была использована следующая схема приготовления средства:

• Растворение красителя Эозина К в воде

• Смешение раствора красителя с глицерином

• Смешение раствора глицерина и красителя с диальдегидом.

Со временем биоматериал теряет свой цвет, что мешает исследованию. Следовательно, было принято решение добавить краситель в состав раствора для поддержания внешнего вида биоматериала. А также для поддержания эластичности кожных покровов был добавлен глицерин в состав.

Пример конкретного использования способа приведен ниже:

Пример 1

В качестве биоматериала было использовано человеческое сердце, изъятое после вскрытия трупа, промытое проточной водой 1-2 минуты до «чистых вод». После промывания объект помещают в емкость и заливают 10% раствором диальдегида до полного погружения объекта в раствор. При этом объем раствора должен превышать объем биологического объекта не менее, чем в 10 раз. Далее, через 7 дней после помещения объекта в емкость с раствором, раствор сливают для утилизации, промывают емкость и объект проточной водой до чистоты и вновь заливают десятикратным по объему водным раствором диальдегида, далее, перезаливку реагента вышеописанным образом осуществляют на 14 и 21 сутки, после чего емкость герметично закрывают. На 14-е сутки производят замену реагента, заливая сердце раствором содержащим Эозин К и карбоксиметилцеллюлозу (КМЦ), превышающим объем сердцав 10 раз, предварительно промыв его проточной водой при следующем соотношении исходных компонентов, масс.%: диальдегид - 24,97%, дистиллированная вода - 74,93%, Эозин К - 0,0032%, КМЦ - 0,0968%. На 21-е сутки производят замену реагента, заливая сердце раствором, содержащим Эозин К и глицерин, превышающим объем сердца в 10 раз, предварительно промыв его после удаления проточной водой при следующем соотношении исходных компонентов, масс.%: диальдегид - 24,271%, дистиллированная вода - 72,813%, Эозин К- 0,0031%, глицерин - 2,9129%.

Пример 2

По аналогии с примером 1 для реализации заявленного способа в качестве биоматериала были использованы печень, почки, и головной мозг.

В таблице 1 проведена сравнительная характеристика качества фиксации биологического материала (см. в графической части).

В качестве объектов исследования были взяты: паренхиматозные органы человека (печень, почки), сердце и головной мозг. Органы промывали 2 минуты под проточной водой, затем заливали реагентом до полного погружения. Раствор при этом превышал объем органа в 10 раз. Через 7 дней после помещения органов в раствор старый раствор утилизировали, а органы промывали проточной водой и повторяли процедуру. Контроль макроструктуры органов осуществляли визуально и тактильно через 2 недели, 1 месяц, 3 месяца.

Фиксация биологических объектов в реагенте в течение периода наблюдения признана отвечающей требованиям к изготовлению и хранению влажных музейных и учебных препаратов. Следует отметить, что проникающая способность средства оказалась выше по сравнению с раствором диальдегида без функциональных добавок.

Преимуществом заявленного изобретения является разработка малоопасного реагента для фиксации биоматериала, не оказывающего канцерогенное воздействие на человека, обладающего высокой проникающей способностью и обеспечивающего сохранение исходной формы и цвета биоматериала, снижение токсикологической нагрузки на окружающую среду и персонал.

Способ фиксации и хранения биоматериала с использованием высокоэффективного и нетоксичного реагента, включающий промывание водой биоматериала с последующей фиксацией его путем полного погружения в 10% водный раствор диальдегида по объему, превышающему объем биоматериала не менее чем в 10 раз, с заменой реагента на 7 сутки, промывая биоматериал после удаления реагента проточной водой, отличающийся тем, что на 14-е сутки производят замену реагента, при следующем соотношении исходных компонентов, мас.%: диальдегид – 24,97%, дистиллированная вода – 74,93%, эозин K – 0,0032%, карбоксиметилцеллюлоза – 0,0968%, с выдержкой последнего в растворе диальдегида не менее 12 часов, и на 21-е сутки производят замену реагента, при следующем соотношении исходных компонентов, мас.%: диальдегид – 24,271%, дистиллированная вода – 72,813%, эозин K – 0,0031%, глицерин - 2,9129%, причем каждый раз биоматериал заливают реагентом, превышая объем биоматериала в 10 раз, предварительно промывая его после удаления реагента проточной водой.