Ганглиозиды для стандартизации и повышения чувствительности клеток к нейротоксинам ботулизма в тест-системах in vitro

Настоящее изобретение относится к области биотехнологии, а именно к получению происходящих из индуцированных плюрипотентных стволовых клеток нейронов, которые имеют стандартизированную чувствительность по отношению к полипептиду нейротоксина клостридии, и стандартизации чувствительности к полипептиду нейротоксина клостридии нейронов, происходящих из индуцированных плюрипотентных стволовых клеток, а также определению биологической активности полипептида нейротоксина клостридии и применению GT1b. Способ включает культивирование различных групп нейронов, происходящих из индуцированных плюрипотентных стволовых клеток, в культуральной среде, содержащей GT1b, в течение по меньшей мере 3 ч. Затем осуществляют приведение в контакт указанных различных групп нейронов, происходящих из индуцированных плюрипотентных стволовых клеток, с полипептидом нейротоксина клостридии. Затем осуществляют культивирование указанных различных групп нейронов, происходящих из индуцированных плюрипотентных стволовых клеток, в течение по меньшей мере 24 ч в присутствии GT1b в условиях, которые позволяют указанному полипептиду нейротоксина клостридии проявлять свою биологическую активность. Изобретение позволяет расширить арсенал технических средств. 5 н. и 10 з.п. ф-лы, 5 ил., 1 табл., 2 пр.

 

[0001] Настоящее изобретение относится к способу стандартизации чувствительности нейронов, происходящих из индуцированных плюрипотентных стволовых клеток (iPS), к полипептиду нейротоксина, включающему стадии: а) культивирования различных групп нейронов, происходящих из индуцированных плюрипотентных стволовых клеток, в культуральной среде, содержащей GT1b, в течение по меньшей мере 3 часов; b) приведения в контакт различных групп нейронов, происходящих из индуцированных плюрипотентных стволовых клеток, стадии а) с полипептидом нейротоксина; с) культивирования различных групп нейронов, происходящих из индуцированных плюрипотентных стволовых клеток, стадии b) в течение по меньшей мере 24 часов в присутствии GT1b в условиях, которые позволяют полипептиду нейротоксина проявлять свою биологическую активность, в результате чего, происходит стандартизация чувствительности нейронов, происходящих из индуцированных плюрипотентных стволовых клеток, к полипептиду нейротоксина. Настоящее изобретение дополнительно относится к способу получения нейронов, происходящих из индуцированных плюрипотентных стволовых клеток, имеющих стандартизованную чувствительность к полипептиду нейротоксина, включающему стадии: а) обеспечения различных групп (партий) нейронов, происходящих из индуцированных плюрипотентных стволовых клеток; b) культивирования указанных различных групп нейронов, происходящих из индуцированных плюрипотентных стволовых клеток, стадии а) в культуральной среде, содержащей GT1b, в течение по меньшей мере 3 часов, в результате чего, происходит стандартизация чувствительности нейронов, происходящих из индуцированных плюрипотентных стволовых клеток, к полипептиду нейротоксина. Дополнительно, настоящее изобретение включает способ определения биологической активности полипептида нейротоксина, включающий стадии: а) культивирования нейронов, происходящих из индуцированных плюрипотентных стволовых клеток, в культуральной культуре, содержащей GT1b, в течение по меньшей мере 3 часов; b) приведения в контакт нейронов, происходящих из индуцированных плюрипотентных стволовых клеток, стадии а) с полипептидом нейротоксина; с) культивирования нейронов, происходящих из индуцированных плюрипотентных стволовых клеток, стадии b) в течение по меньшей мере 24 часов в присутствии GT1b в условиях, которые позволяют полипептиду нейротоксина проявлять свою биологическую активность; и d) определения биологической активности полипептида нейротоксина в указанных клетках. Наконец, изобретение относится к применению GT1b для а) стандартизации чувствительности различных групп нейронов, происходящих из индуцированных плюрипотентных стволовых клеток, к полипептиду нейротоксина; или b) снижения вариабельности чувствительности различных групп нейронов, происходящих из индуцированных плюрипотентных стволовых клеток, к полипептиду нейротоксина.

[0002] Clostridium botulinum и Clostridium tetani продуцируют сильнодействующие нейротоксины, то есть токсины ботулизма (ботулотоксины) (BoNT) и токсин столбняка (TeNT) соответственно. Данные нейротоксины клостридий (clostridial neurotoxins, CNTs) специфически связываются с нервным клетками и нарушают высвобождение нейромедиаторов. Каждый токсин синтезируется как неактивный непроцессированный одноцепочечный белок с массой приблизительно 150 кДа. Посттрансляционный процессинг включает образование дисульфидных мостиков и ограниченный протеолиз (образование ников) бактериальной протеазой (протеазами). Активный нейротоксин состоит из двух цепей, N-концевой легкой цепи, массой приблизительно 50 кДа, и тяжелой цепи, массой приблизительно 100 кДа, соединенных дисульфидной связью. Нейротоксины клостридий структурно и функционально состоят из трех доменов, то есть каталитической легкой цепи, тяжелой цепи, охватывающей домен транслокации (N-концевая половина) и домен, связывающийся с рецептором (C-концевая половина); см., например, Krieglstein 1990, Eur. J. Biochem. 188, 39; Krieglstein 1991, Eur. J. Biochem. 202, 41; Krieglstein 1994, J. Protein Chem. 13, 49. Нейротоксины ботулизма синтезируются как молекулярные комплексы, содержащие белок нейротоксина массой 150 кДа и ассоциированные нетоксичные белки. Размеры комплекса различаются в зависимости от штамма клостридий и конкретных серотипов нейротоксина, находясь в диапазоне от 300 кДа, свыше 500 кДа и 900 кДа. Нетоксичные белки в данных комплексах стабилизируют нейротоксин и защищают его от деградации; см. Silberstein 2004, Pain Practice 4, S19-S26.

[0003] Бактерия Clostridium botulinum секретирует семь отличающихся по антигенным свойствам серотипов нейротоксина ботулизма (BoNT), обозначаемых буквами от «А» до «G». Все серотипы, также как и родственный нейротоксин столбняка (TeNT), секретируемый Clostridium tetani, являются Zn²⁺-эндопротеазами, которые блокируют синаптический экзоцитоз посредством расщепления белков SNARE; см. Couesnon, 2006, Microbiology, 152, 759. Токсины клостридий вызывают периферический паралич мышц, наблюдаемый при ботулизме и столбняке; см. Fischer 2007, PNAS 104, 10447.

[0004] Несмотря на его токсические эффекты, комплекс токсина ботулизма применяют в качестве терапевтического средства при большом количестве заболеваний. Токсин ботулизма серотипа A был одобрен для медицинского применения в Соединенных Штатах Америки в 1989 году для лечения косоглазия, блефароспазма и других нарушений. Он коммерчески доступен как препарат белка токсина ботулизма типа A (BoNT/A), например, под торговым названием «ВОТОХ» (Allergan, Inc.) или под торговым названием «DYSPORT/RELOXIN» (Ipsen, Ltd). Улучшенный, не содержащий комплекса препарат токсина ботулизма типа A коммерчески доступен под торговым названием «XEOMIN» (Merz Pharmaceuticals, LLC). Для применения в терапии препарат вводят напрямую в мышцу, которая подлежит лечению. При физиологическом рН токсин высвобождается из белкового комплекса и происходит требуемое фармакологическое воздействие. Эффект токсина ботулизма является лишь временным, по этой причине могут потребоваться повторные введения токсина ботулизма для поддержания терапевтического эффекта.

[0005] Нейротоксины клостридий уменьшают силу произвольного сокращения мышц и представляют собой эффективное средство лечения косоглазия, фокальной дистонии, включая цервикальную дистонию, и доброкачественного эссенциального блефароспазма. Дополнительно было показано, что они облегчают гемифациальный спазм и фокальную спастичность и, более того, эффективны при широком ряде других показаний, таких как нарушения в работе желудочно-кишечного тракта, гипергидроз и косметическая коррекция морщин; см. Jost 2007, Drugs 67, 669.

[0006] В ходе производственного процесса нейротоксинов клостридий особенно важно определение качества и количества указанных нейротоксинов, также как контроль качества биологически активных полипептидов нейротоксина. Дополнительно, государственные органы принимают только надежные, правильные, точные, достоверные и валидированные анализы активности токсина ботулизма. В настоящее время биологический анализ 50% летальной дозы (ЛД50) для мышей, тест на смертность, остается «золотым стандартом», применяемым фармацевтическими производителями для анализа активности их лекарственных средств; см. Arnon et al. (2001), JAMA 285, 1059-1070. Однако в последние годы предпринимали значительное усилие для поиска альтернативных подходов с целью снижения необходимости в тестах на животных и всех недостатков, издержек и этических вопросов, связанных с этим типом анализов, основанных на использовании животных. Дополнительно, органы государственного регулирования поощряют фармацевтические компании применять принцип трех «R» для анализа активности нейротоксинов ботулизма: «Reduce, Refine, Replace» (снижать, улучшать, заменять); см. Straughan, Altern. Lab. Anim. (2006), 34, 305-313. В результате чего были разработаны тест-системы на основе клеток, чтобы представить приемлемые альтернативы методикам с использованием живых животных. И все же на сегодняшний день доступны только три клеточные тест-системы для определения биологической активности нейротоксина, которые, как было показано, достаточно чувствительны к полипептидам нейротоксинов. Данные тест-системы на основе клеток включают применение первичных нейронов, выделенных из эмбрионов грызунов, которые дифференцируют in vitro (Pellett et al. (2011), Biochem. Biophys. Res. Commun. 404, 388-392), нейрональных дифференцированных индуцированных плюрипотентных стволовых клеток (Whitemarsh et al. (2012), Toxicol. Sci. 126, 426-35), и клона, полученного из клеточной линии SiMa (WO 2010/105234 A1).

[0007] Однако выделение первичных нейронов требует убийства животных и является трудоемким, затратным по времени, и валидация данных анализов, как представляется, вызывает трудности. Кроме того, тест-системы с использованием различных первичных нейронов демонстрируют большие расхождения в результатах. Схожим образом, получение нейрональных дифференцированных индуцированных плюрипотентных стволовых клеток является трудным и требующим временных затрат. Дополнительно, хранение подобных клеток очень проблематично. Анализы с использованием линий опухолевых клеток часто не являются достаточно чувствительными по отношению к BoNT. Более того, для указанных линий опухолевых клеток требуются сложные протоколы дифференцировки, что приводит к большим расхождениям в результатах и/или высокой частоте ошибок при анализах с использованием указанных клеточных линий.

[0008] Ввиду вышеизложенного крайне востребованными являются дополнительные тест-системы для определения активности полипептида нейротоксина.

[0009] Таким образом, техническую задачу, лежащую в основе настоящего изобретения, можно рассматривать как обеспечение средств и способов, отвечающих вышеупомянутым нуждам. Техническую задачу решают посредством вариантов реализации, описанными в формуле изобретения и далее в данной заявке.

[0010] В первом аспекте настоящее изобретение относится к способу получения нейронов, происходящих из индуцированных плюрипотентных стволовых (iPS) клеток (iPS-derived neurons), имеющих стандартизированную чувствительность к полипептиду нейротоксина, включающему стадии:

a) обеспечения различных групп нейронов, происходящих из индуцированных плюрипотентных стволовых клеток;

b) культивирования указанных различных групп нейронов, происходящих из индуцированных плюрипотентных стволовых клеток, стадии а) в культуральной среде, включающей GT1b, в течение по меньшей мере 3 часов, что приводит к стандартизации чувствительности указанных нейронов, происходящих из индуцированных плюрипотентных стволовых клеток, к полипептиду нейротоксина.

[0011] В данном аспекте различные группы (партии - "batches") нейронов, происходящих из индуцированных плюрипотентных стволовых клеток, обеспечивают на первой стадии. Указанные группы могут отличаться, например, в отношении числа пассажей и/или числа циклов заморозки-разморозки и/или других свойств, упомянутых в других частях настоящей заявки. В результате, указанные различные группы нейронов, происходящих из индуцированных плюрипотентных стволовых клеток, культивируют в подходящей культуральной среде, включающей GT1b, в течение по меньшей мере 3 часов, по меньшей мере 4 часов, по меньшей мере 5 часов, по меньшей мере 6 часов, по меньшей мере 12 часов, по меньшей мере 24 часов (1 день), по меньшей мере 36 часов, по меньшей мере 48 часов (2 дня), по меньшей мере 72 часов (3 дня), по меньшей мере 4 дней, по меньшей мере 5 дней или даже дольше. Предпочтительно, указанное культивирование происходит в течение нескольких часов, например, в течение 3 часов, 4 часов, 5 часов, 6 часов или 12 часов. В качестве подходящей культуральной среды, например, может быть использована среда Neurobasal^®, включающая добавку В27, среда для нейронов iCell^® (Cellular Dynamics International; CDI) или другие культуральные среды, предоставляемые производителем или поставщиками нейронов, происходящих из индуцированных плюрипотентных стволовых клеток. Авторы настоящего изобретения обнаружили, что, таким образом, вариабельность чувствительности различных групп нейронов, происходящих из индуцированных плюрипотентных стволовых клеток, к полипептиду нейротоксина может быть значительно снижена по сравнению с контрольными группами нейронов, происходящих из индуцированных плюрипотентных стволовых клеток, не обработанных GT1b, как указано более подробно ниже.

[0012] В другом аспекте указанный выше способ согласно настоящему изобретению дополнительно включает:

c) приведение в контакт указанных различных групп нейронов, происходящих из индуцированных плюрипотентных стволовых клеток, стадии b) с полипептидом нейротоксина; и

d) культивирование указанных различных групп нейронов, происходящих из индуцированных плюрипотентных стволовых клеток, стадии с) в течение по меньшей мере 24 часов в присутствии GT1b в условиях, которые позволяют полипептиду нейротоксина проявлять свою биологическую активность.

[0013] После культивирования различных групп нейронов, происходящих из индуцированных плюрипотентных стволовых клеток, в культуральной среде, включающей GT1b, в течение по меньшей мере 3 часов, различные группы нейронов, происходящих из индуцированных плюрипотентных стволовых клеток, могут быть сначала приведены в контакт, а затем подвергнуты интоксикации полипептидом нейротоксина на следующей стадии в течение по меньшей мере 24 часов (1 день), по меньшей мере 36 часов, по меньшей мере 48 часов (2 дня), по меньшей мере 60 часов, по меньшей мере 72 часов (3 дня), по меньшей мере 4 дней, по меньшей мере 5 дней, по меньшей мере 6 дней, по меньшей мере 7 часов (1 неделя), по меньшей мере 2 недель, по меньшей мере 3 недель, по меньшей мере 4 недель, по меньшей мере 5 недель, по меньшей мере 6 недель или даже дольше. Предпочтительно, интоксикацию проводят в течение по меньшей мере 72 часов или дольше. Полипептид нейротоксина может быть, например, нейротоксином BoNT/A, BoNT/B, BoNT/C1, BoNT/D, BoNT/E, BoNT/F, BoNT/G, BoNT/H или TeNT или его подтипом, как определено более подробно в других частях настоящей заявки. Различные группы нейронов, происходящих из индуцированных плюрипотентных стволовых клеток, культивируют в течение указанных выше периодов времени в присутствии GT1b в условиях, которые позволяют полипептиду нейротоксина проявлять свою биологическую активность. Подходящие условия культивирования клеток, которые позволяют полипептиду нейротоксина проявлять свою биологическую активность, и биологическая активность полипептида нейротоксина являются такими, как определено в других частях настоящей заявки. Путем такой обработки вариабельность чувствительности различных групп нейронов, происходящих из индуцированных плюрипотентных стволовых клеток, к указанному полипептиду нейротоксина может быть дополнительно снижена по сравнению с контрольными группами подвергшихся интоксикации нейронов, происходящих из индуцированных плюрипотентных стволовых клеток, не обработанных GT1b.

[0014] В дополнительном аспекте настоящее изобретение относится к способу стандартизации чувствительности нейронов, происходящих из индуцированных плюрипотентных стволовых (iPS) клеток, к полипептиду нейротоксина, включающему стадии:

a) культивирования различных групп нейронов, происходящих из индуцированных плюрипотентных стволовых клеток, в культуральной среде, включающей GT1b, в течение по меньшей мере 3 часов;

b) приведения в контакт различных групп нейронов, происходящих из индуцированных плюрипотентных стволовых клеток, стадии а) с полипептидом нейротоксина;

с) культивирования различных групп нейронов, происходящих из индуцированных плюрипотентных стволовых клеток, стадии b) в течение по меньшей мере 24 часов в присутствии GT1b в условиях, которые позволяют полипептиду нейротоксина проявлять свою биологическую активность;

в результате чего, происходит стандартизация чувствительности нейронов, происходящих из индуцированных плюрипотентных стволовых клеток, к полипептиду нейротоксина.

[0015] В дополнительном аспекте вышеупомянутые способы согласно настоящему изобретению могут включать одну или несколько дополнительных стадий. Например, указанные дополнительные стадии могут охватывать стадии для определения биологической активности полипептида нейротоксина, как указано в настоящей заявке. В связи с этим, нейроны, полученные из индуцированных плюрипотентных стволовых (iPS) клеток, которые культивировали в присутствии GT1b, как описано в настоящей заявке, приводят в контакт с полипептидом нейротоксина, как описано в настоящей заявке. Термин «приведение в контакт», используемый в соответствии со способами согласно настоящему изобретению, относится к приведению вышеупомянутых клеток и полипептида нейротоксина, который может быть включен, например, в образец, в близкое расположение, чтобы позволить произойти физическому и/или химическому и/или биологическому взаимодействию. Подходящие условия, которые позволяют произойти специфичному взаимодействию, хорошо известны специалисту. Указанные условия зависят от клеток и нейротоксинов, применяемых в способах согласно настоящему изобретению, и могут быть адаптированы специалистом без труда. Более того, время, достаточное для того, чтобы позволить произойти взаимодействию, также может быть определено специалистом без труда. Например, конкретное количество выделенного или рекомбинантного полипептида нейротоксина или его варианта, как определено в настоящей заявке, или образец, включающий полипептид нейротоксина, можно добавить к обработанным GT1b нейронам, полученным из индуцированных плюрипотентных стволовых (iPS) клеток. Вслед за этим клетки инкубируют с полипептидом нейротоксина в течение по меньшей мере 24 часов в условиях, которые позволяют полипептиду нейротоксина проявлять свою биологическую активность, снова в присутствии GT1b. Фраза «условия, которые позволяют полипептиду нейротоксина проявлять свою биологическую активность», используемая в настоящей заявке, известна в данной области техники. Далее проявление биологической активности останавливают, например, путем добавления лизирующего буфера к клеткам, и определяют биологическую активность полипептида нейротоксина, например, с помощью вестерн-блоттинга, конкретно определяя расщепленный субстрат нейротоксина, или специфической технологии твердофазного иммуноферментного анализа (ELISA). Например, белок SNAP-25 (растворимый белок присоединения N-этилмалеимид-чувствительного фактора (NSF)) является известным субстратом для нейротоксинов BoNT/A, BoNT/C1 и BoNT/E и расщепляется ими. Везикуло-ассоциированный мембранный белок (VAMP)/синаптобревин является субстратом для нейротоксинов BoNT/B, BoNT/D, BoNT/F, BoNT/G и TeNT и расщепляется ими, тогда как синтаксин является субстратом для нейротоксина BoNT/C1 и расщепляется им.

[0016] Для нейротоксинов клостридий характерно, что они специфически ингибируют секрецию нейромедиаторов из пресинаптических нервных окончаний. Селективность для периферических нейронов опосредована распознаванием двух различных рецепторов, SV2 и GT1b. Физиологическое воздействие нейротоксинов основано на расщеплении так называемого комплекса SNARE (рецептор SNAR) вслед за связыванием с рецептором и транслокацией легкой цепи нейротоксина. Определение биологической активности BoNT является важным аспектом при описании характеристик указанных белков нейротоксинов и необходимо, в том числе для органов государственного регулирования, для коммерческого выпуска продуктов, содержащих BoNT. Таким образом, достоверный тест для измерения биологической активности BoNT является основой для исследования, разработки и продвижения на рынке продуктов, содержащих BoNT. Кроме того, тест-системы на основе клеток заменят до сих пор преобладающие тесты на животных по этическим причинам. Для создания подобных тест-систем на основе клеток необходима достаточно высокая чувствительность нейрональных клеток или клеточных линий по отношению к нейротоксинам ботулизма.

[0017] Для определения биологической активности токсинов ботулизма в фармацевтических продуктах нейрональным клеткам или клеточные линиям нужно обладать следующими свойствами: во-первых, клетки должны быть клетками человека, нейронального происхождения, чтобы иметь как можно больше сходства с мишенью, то есть с пациентом-человеком. Во-вторых, системе на основе клеток нужно быть устойчивой в отношении вспомогательных веществ в конечном продукте и предпочтительно также в отношении примесей при промежуточных стадиях производственного процесса (контроли производственного процесса). В-третьих, тест-системе на основе клеток нужно показывать динамический диапазон измерений, который позволяет осуществлять точное определение биологической активности BoNT во флаконе (например, 50 единиц ЛД₅₀ BoNT/A). С учетом технических факторов, таких как растворимость вспомогательных веществ, объемы культуральных сред и т.д., концентрация BoNT менее 1 пМ должна быть определена точно.

[0018] В одной из доступных тест-систем на основе клеток, имеющей достаточно высокую чувствительность к BoNT, применяют нейрональные дифференцированные индуцированные плюрипотентные стволовые клетки. Авторы настоящего изобретения оценили тест-систему с использованием коммерчески доступных нейронов, происходящих из индуцированных плюрипотентных стволовых клеток человека (Cellular Dynamics International, Inc., Мэдисон). Указанные нейроны, полученные из индуцированных плюрипотентных стволовых клеток человека, получали в виде криоконсервированных клеток и размораживали и культивировали в течение 4 дней в соответствии с руководством производителя. Указанные клетки окончательно дифференцированы в нейрональные клетки, для которых характерно, что они больше не пролиферируют и проявляют окончательно дифференцированный, нейрональный фенотип, который не может быть больше изменен. После формирования указанного фенотипа клетки инкубировали с полипептидом нейротоксина в течение 72 часов. После этого определяли количество продукта расщепления субстрата нейротоксина с помощью вестерн-блоттинга (иммуноблоттинга) лизатов клеток или методов ELISA, как показано на примере для полипептида нейротоксина BoNT/A и его субстрата SNAP-25. В результате оценки указанного теста смогли подтвердить высокую чувствительность, воспроизводимость и внутрилабораторную прецизионность указанной тест-системы, при условии, что тест выполняли с использованием одной и той же группы клеток от упомянутого поставщика. Однако при использовании других групп клеток указанного поставщика обнаруживали необъяснимо высокую вариабельность в части чувствительности указанных клеток по отношению к полипептиду нейротоксина, несмотря на то, что описание характеристик указанных групп клеток поставщиком в отношении числа клеток, жизнеспособности, фенотипа и т.д., никаким образом не указывало на упомянутую вариабельность. В частности, чувствительность (ЕС50) различных групп клеток нейронов, происходящих из индуцированных плюрипотентных стволовых клеток человека, от провайдера варьировалась в диапазоне от 1,7 до более 10 единиц/мл.

[0019] Авторы настоящего изобретения с удивлением обнаружили, что введение извне ганглиозидов, таких как GT1b, привело к резкому снижению вариабельности чувствительности между различными группами клеток нейронов, происходящих из индуцированных плюрипотентных стволовых клеток человека. Данное открытие является необычным по следующим причинам: во-первых, клетки, проявляющие нейрональный фенотип, сами продуцируют эндогенно достаточный GT1b. Это было обнаружено, например, для первичных нейронов. Более того, по опыту авторов настоящего изобретения даже различные препараты клеточных культур первичных нейронов не показали подобной вариабельности по чувствительности по отношению к полипептидам нейротоксинов. Дополнительно, подобные эффекты не смогли обнаружить в тестах на основе линий клеток нейробластомы, в которых, например, использовали клетки SiMa, как в случае различного числа пассажей, так и в случае тестирования различных криоконсервированных групп. Во-вторых, руководство поставщика от фирмы «Cellular Dynamics International» не содержало никакой информации в отношении подобной вариабельности чувствительности различных групп клеток нейронов, происходящих из индуцированных плюрипотентных стволовых клеток человека, по отношению к полипептидам нейротоксинов. При применении способов согласно настоящему изобретению указанная вариабельность может быть преимущественно снижена авторами настоящего изобретения от приблизительно 30% до приблизительно 15% (среднеквадратичное отклонение) путем культивирования и инкубации с нейротоксином в присутствии 30 мкМ GT1b, который добавили к культуральной среде. Соответственно, способы согласно настоящему изобретению обеспечивают чувствительную, точную и воспроизводимую тест-систему на основе клеток для определения биологической активности нейротоксинов. Указанные способы могут быть применены в качестве альтернативы традиционным тест-системам на основе животных. Кроме того, сравнительно простые способы согласно настоящему изобретению для стандартизации чувствительности нейронов, происходящих из индуцированных плюрипотентных стволовых клеток человека, к полипептиду нейротоксина приводят к улучшению чувствительности указанных клеток: тогда как для клеток без добавления GT1b была найдена ЕС50, равная приблизительно 5 единиц/мл, соответствующим 167 фМ, для клеток, к которым в культуральную среду добавляли GT1b, была найдена ЕС50, равная приблизительно 0,75 единиц/мл, соответствующим 25 фМ, что соответствует приблизительно 7-кратному повышению чувствительности. Соответственно, авторы настоящего изобретения обнаружили, что чувствительность нейронов, происходящих из индуцированных плюрипотентных стволовых клеток человека, к полипептиду нейротоксина может быть увеличена путем добавления GT1b по сравнению с нейронами, полученными из индуцированных плюрипотентных стволовых клеток человека, которые культивировали в отсутствие GT1b. В частности, чувствительность каждой отдельной группы нейронов, происходящих из индуцированных плюрипотентных стволовых клеток человека, может быть улучшена посредством инкубации с указанным ганглиозидом. Интересно, что чувствительность родительских клеток SiMa к полипептиду нейротоксина также может быть усилена добавлением GT1b. В этом случае было возможно увеличить чувствительность указанных клеток нейробластомы в 10 раз по сравнению с клетками SiMa, не обработанными GT1b . Данные результаты не были простым заданием для получения или самоочевидным открытием, потому что другие клетки нейробластомы, такие как Neuro2a, не проявили сопоставимое увеличение чувствительности к полипептиду нейротоксина при инкубации с GT1b, или проявили лишь небольшое увеличение, как в случае таких клеток как SH-SY5Y (Немецкая коллекция микроорганизмов и клеточных культур (DSMZ) и Европейская коллекция клеточных линий животных (ЕСАСС)), PC12 или NG108-15, как показано в следующих примерах.

[0020] Таким образом, в другом аспекте настоящее изобретение относится к способу получения нейронов, происходящих из индуцированных плюрипотентных стволовых клеток, или клеток SiMa, имеющих повышенную чувствительность к полипептиду нейротоксина, включающему стадии:

a) обеспечения нейронов, происходящих из индуцированных плюрипотентных стволовых клеток, или клеток SiMa;

b) культивирования нейронов, происходящих из индуцированных плюрипотентных стволовых клеток, или клеток SiMa стадии а) в культуральной среде, включающей GT1b, в течение по меньшей мере 3 часов,

таким образом, повышая чувствительность нейронов, происходящих из индуцированных плюрипотентных стволовых клеток, или клеток SiMa к указанному полипептиду нейротоксина. В одном из дополнительных аспектов с помощью данного способа могут быть получены клетки SH-SY5Y, клетки РС12 или клетки NG108-15, имеющие повышенную чувствительность к полипептиду нейротоксина.

[0021] В еще одном другом аспекте указанный выше способ согласно настоящему изобретению дополнительно включает

c) приведение в контакт нейронов, происходящих из индуцированных плюрипотентных стволовых клеток, или клеток SiMa стадии b) с полипептидом нейротоксина; и

d) культивирование нейронов, происходящих из индуцированных плюрипотентных стволовых клеток, или клеток SiMa в течение по меньшей мере 24 часов в присутствии GT1b в условиях, которые позволяют полипептиду нейротоксина проявлять свою биологическую активность.

Альтернативно, в данном аспекте способа согласно настоящему изобретению могут быть применены клетки SH-SY5Y, клетки РС12 или клетки NG108-15, как указано выше.

[0022] В дополнительном аспекте настоящее изобретение относится к способу определения биологической активности полипептида нейротоксина, включающему стадии:

a) культивирования нейронов, происходящих из индуцированных плюрипотентных стволовых клеток, или клеток SiMa в культуральной среде, включающей GT1b, в течение по меньшей мере 3 часов;

b) приведения в контакт нейронов, происходящих из индуцированных плюрипотентных стволовых клеток, или клеток SiMa стадии а) с полипептидом нейротоксина;

c) культивирования нейронов, происходящих из индуцированных плюрипотентных стволовых клеток, или клеток SiMa стадии b) в течение по меньшей мере 24 часов в присутствии GT1b в условиях, которые позволяют полипептиду нейротоксина проявлять свою биологическую активность; и

d) определения биологической активности полипептида нейротоксина в указанных клетках.

Клетки SH-SY5Y, клетки РС12 или клетки NG108-15 могут быть альтернативно применены для определения биологической активности полипептида нейротоксина в других аспектах данного способа согласно настоящему изобретению.

[0023] Предпочтительно, отдельные группы указанных нейронов, происходящих из индуцированных плюрипотентных стволовых клеток, клеток SiMa, клеток SH-SY5Y, клеток PC 12 или клеток NG108-15 применяют в способах согласно настоящему изобретению для получения нейронов, происходящих из индуцированных плюрипотентных стволовых клеток, клеток SiMa, клеток SH-SY5Y, клеток PC 12 или клеток NG108-15, имеющих повышенную чувствительность к полипептиду нейротоксина, или в способах согласно настоящему изобретению для повышения чувствительности упомянутых клеток согласно настоящему изобретению. Предпочтительно, чтобы клетки SiMa являлись родительскими клетками SiMa (номер АСС164 в DSMZ). Предпочтительно, концентрация GT1b находится между 10 и 50 мкМ, более предпочтительно 30 мкМ. Культивирование нейронов, происходящих из индуцированных плюрипотентных стволовых клеток, клеток SiMa, клеток SH-SY5Y, клеток PC 12 или клеток NG108-15 в культуральной среде, включающей GT1b, предпочтительно происходит в течение по меньшей мере 12 часов, по меньшей мере 24 часов, по меньшей мере 36 часов, по меньшей мере 48 часов, по меньшей мере 60 часов, по меньшей мере 72 часов или по меньшей мере 96 часов или даже дольше. Интоксикацию полипептидом нейротоксина предпочтительно проводят в течение по меньшей мере 36 часов, 48 часов, 60 часов, 72 часов, 96 часов или даже дольше. Предпочтительно, полипептид нейротоксина представляет собой нейротоксин BoNT/A. Повышение чувствительности к полипептиду нейротоксина у обработанных GT1b нейронов, происходящих из индуцированных плюрипотентных стволовых клеток, предпочтительно является по меньшей мере 2-кратным, по меньшей мере 3-кратным, по меньшей мере 4-кратным, по меньшей мере 5-кратным, по меньшей мере 6-кратным или по меньшей мере 6,7-кратным по сравнению с нейронами, полученными из индуцированных плюрипотентных стволовых клеток, которые не обрабатывали GT1b. Кроме того, повышение чувствительности к полипептиду нейротоксина у обработанных GT1b клеток SiMa предпочтительно является по меньшей мере 2-кратным, по меньшей мере 3-кратным, по меньшей мере 4-кратным, по меньшей мере 5-кратным, по меньшей мере 6-кратным, по меньшей мере 7-кратным, по меньшей мере 8-кратным, по меньшей мере 9-кратным или по меньшей мере 10-кратным по сравнению с клетками SiMa, которые не обрабатывали GT1b. Повышение чувствительности к полипептиду нейротоксина у обработанных GT1b клеток SH-SY5Y предпочтительно является по меньшей мере 1,2-кратным, по меньшей мере 1,4-кратным, по меньшей мере 1,6-кратным, по меньшей мере 1,8-кратным или по меньшей мере 2-кратным по сравнению с клетками SH-SY5Y, которые не обрабатывали GT1b. Повышение чувствительности к полипептиду нейротоксина у обработанных GT1b клеток PC12 предпочтительно является по меньшей мере 1,1-кратным, по меньшей мере 1,2-кратным, по меньшей мере 1,3-кратным или по меньшей мере 1,4-кратным по сравнению с клетками PC 12, которые не обрабатывали GT1b. Более того, повышение чувствительности к полипептиду нейротоксина у обработанных GT1b клеток NG108-15 предпочтительно является по меньшей мере 1,1-кратным, по меньшей мере 1,2-кратным, по меньшей мере 1,3-кратным, по меньшей мере 1,4-кратным, по меньшей мере 1,5-кратным или по меньшей мере 1,6-кратным по сравнению с клетками NG108-15, которые не обрабатывали GT1b.

[0024] Способы согласно настоящему изобретению позволяют сильно разбавлять подлежащие анализу образцы, содержащие нейротоксин. Кроме того, способы согласно настоящему изобретению устойчивы в отношении вспомогательных веществ и примесей в подлежащих анализу образцах, что позволяет проводить сильное разбавление указанных образцов. Подобные сильные разбавления образцов важны в отношении вспомогательных веществ и примесей, содержащихся в образцах, в целях нанесения указанных потенциально мешающих веществ в как можно меньшей концентрации.

[0025] Термин «нейрон (нейроны), полученный (полученные) из индуцированных плюрипотентных стволовых (iPS) клеток», используемый в настоящей заявке, означает в широком смысле клетку, которая подвержена действию полипептида нейротоксина, проявляющего биологические свойства, характерные для полипептида нейротоксина, а именно (а) связывание с рецептором, (b) интернализация, (с) транслокация через эндосомальную мембрану в цитозоль и/или (d) эндопротеолитическое расщепление белков, участвующих в слиянии синаптических везикул с мембраной. Соответственно, «нейрон, полученный из индуцированных плюрипотентных стволовых (iPS) клеток», как обозначено в настоящей заявке, подвержен интоксикации нейротоксином. В частности, термин «подвержен интоксикации нейротоксином», как обозначено в настоящей заявке, означает клетку, которая может проходить через все клеточные механизмы, при которых полипептид нейротоксина (например, BoNT/A) расщепляет субстрат нейротоксина (например, субстрат BoNT/A белок SNAP-25) и охватывающие связывание нейротоксина с его соответствующим рецептором (например, связывание BoNT/A с рецептором BoNT/A), интернализацию комплекса нейротоксин/рецептор, транслокацию легкой цепи нейротоксина из внутриклеточного везикула в цитоплазму и протеолитическое расщепление субстрата нейротоксина. Анализы для определения биологической активности полипептида нейротоксина хорошо известны в данной области техники и также описаны в других частях настоящей заявки (см., например, Pellett et al., Withemarsh et al., цитированный выше). Как понятно специалистам в данной области техники, чувствительная к нейротоксину клетка предпочтительно способна сначала захватить нейротоксин, а затем пройти через все клеточные механизмы, перечисленные выше. Чувствительная к нейротоксину клетка, используемая в настоящей заявке, может захватывать, например, приблизительно 100 наномоль (нМ), приблизительно 10 нМ, приблизительно 1 нМ, приблизительно 500 пикомоль (пМ), приблизительно 400 пМ, приблизительно 300 пМ, приблизительно 200 пМ, приблизительно 100 пМ, приблизительно 90 пМ, приблизительно 80 пМ, приблизительно 70 пМ, приблизительно 60 пМ, приблизительно 50 пМ, приблизительно 40 пМ, приблизительно 30 пМ, приблизительно 20 пМ, приблизительно 10 пМ, приблизительно 9 пМ, приблизительно 8 пМ, приблизительно 7 пМ, приблизительно 6 пМ, приблизительно 5 пМ, приблизительно 4 пМ, приблизительно 3 пМ, приблизительно 2 пМ, приблизительно 1 пМ, приблизительно 0,5 пМ, приблизительно 0,1 пМ, приблизительно 50 фемтомоль (фМ), приблизительно 40 фМ, приблизительно 30 фМ, приблизительно 20 фМ, приблизительно 10 фМ, приблизительно 5 фМ, приблизительно 4 фМ, приблизительно 3 фМ, приблизительно 2 фМ или приблизительно 1 фМ полипептида нейротоксина или даже меньше, чем одно из указанных значений. Значения ЕС50 свыше 100 пМ приведены в литературе. По определению клетка, подверженная интоксикации нейротоксином, должна экспрессировать или должна быть сконструирована, чтобы экспрессировать, по меньшей мере один рецептор нейротоксина и по меньшей мере один субстрат нейротоксина. Рецепторы и субстраты для нейротоксинов описаны в данной области техники. Соответственно, указанная клетка предпочтительно подвержена действию биологически активного или зрелого полипептида нейротоксина, как описано в настоящей заявке. Предпочтительно, чувствительная к нейротоксину клетка, используемая в настоящей заявке, подвержена интоксикации нейротоксином в количестве, например, приблизительно 1 нМ или менее, 500 пМ или менее, приблизительно 400 пМ или менее, приблизительно 300 пМ или менее, приблизительно 200 пМ или менее, приблизительно 100 пМ или менее, приблизительно 90 пМ или менее, приблизительно 80 пМ или менее, приблизительно 70 пМ или менее, приблизительно 60 пМ или менее, приблизительно 50 пМ или менее, приблизительно 40 пМ или менее, приблизительно 30 пМ или менее, приблизительно 20 пМ или менее, приблизительно 10 пМ или менее, приблизительно 9 пМ или менее, приблизительно 8 пМ или менее, приблизительно 7 пМ или менее, приблизительно 6 пМ или менее, приблизительно 5 пМ или менее, приблизительно 4 пМ или менее, приблизительно 3 пМ или менее, приблизительно 2 пМ или менее, приблизительно 1 пМ или менее, приблизительно 0,9 пМ или менее, приблизительно 0,8 пМ или менее, приблизительно 0,7 пМ или менее, приблизительно 0,6 пМ или менее, приблизительно 0,5 пМ или менее, приблизительно 0,4 пМ или менее, приблизительно 0,3 пМ или менее, приблизительно 0,2 пМ или менее, приблизительно 0,1 пМ, приблизительно 50 фМ или менее, приблизительно 40 фМ или менее, приблизительно 30 фМ или менее, приблизительно 20 фМ или менее, приблизительно 10 фМ или менее, приблизительно 5 фМ или менее, приблизительно 4 фМ или менее, приблизительно 3 фМ или менее, приблизительно 2 фМ или менее или даже приблизительно 1 фМ или менее полипептида нейротоксина. Например, крайне низкое значение ЕС50, равное приблизительно 3 фМ, было найдено авторами настоящего изобретения для нейронов, происходящих из индуцированных плюрипотентных стволовых (iPS) клеток, к которым был добавлен GT1b извне в культуральную среду при осуществлении способов согласно настоящему изобретению. Известный в данной области техники термин «полумаксимальная эффективная концентрация (ЕС50)» относится к концентрации лекарственного средства, антитела или токсиканта, которая вызывает ответ наполовину между исходным уровнем и максимумом после некоторого конкретного времени воздействия. Данный показатель является общепринятым в качестве меры активности лекарственного средства. Таким образом, ЕС50 на градуальной кривой зависимости доза - ответ представляет собой концентрацию соединения, при которой наблюдают 50% эффект от максимального эффекта соединения. ЕС50 на квантовой кривой зависимости доза-ответ представляет собой концентрацию соединения, при которой 50% популяции демонстрирует ответ после воздействия в течение продолжительного времени. Способы идентификации клеток или клеточных линий, подверженных интоксикации нейротоксином и/или обладающих способностью захватывать нейротоксин, то есть чувствительные к нейротоксину клетки, как определено в настоящей заявке, хорошо известны в данной области техники; см., например, US 2012/0122128 A1. Биологическая активность полипептидов нейротоксинов в одном из аспектов является результатом всех вышеупомянутых биологических свойств. Только несколько анализов на основе клеток с достаточно высокой чувствительностью по отношению к нейротоксинам, которые можно применять для определения биологической активности нейротоксина, были на данный момент описаны в известном уровне техники, как указано в других частях настоящей заявки. Анализы in vivo для оценки биологической активности нейротоксинов включают, например, уже упомянутый анализ ЛД₅₀ для мышей и анализ ex vivo гемидиафрагмы мышей, как описано Pearce et al. и Dressier et al.; см. Pearce 1994, Toxicol. Appl. Pharmacol. 128: 69-77 и Dressier 2005, Mov. Disord. 20: 1617-1619. Как известно специалистам в данной области техники биологическая активность нейротоксинов обычно выражают в мышиных единицах ЛД₅₀ (mouse LD₅₀ units, MU). Одна мышиная единица равна количеству нейротоксичного компонента, который убивает 50% конкретной популяции мышей после внутрибрюшинной инъекции.

[0026] Конкретнее, термин «нейроны, полученные из индуцированных плюрипотентных стволовых (iPS) клеток», используемый в настоящей заявке, описан в литературе; см., например, Whitemarsh et al., цитированный выше; WO 2012/135621; US 2010/0279403 и US 2010/0216181. В частности, индуцированные плюрипотентные стволовые клетки человека (hiPSC) имеют большие перспективы в плане обеспечения различными моделями дифференцированных клеток для тестирования токсигенности in vitro. Нейроны, полученные из hiPSC, представляли собой дифференцированные и криоконсервированые клетки, например, фирмы «Cellular Dynamics International» (Мэдисон, Висконсин), и состоят из практически чистой пан-нейрональной популяции преимущественно (гамма-аминомасляная кислота)-ергических и глутаматергических нейронов. Указанные нейроны, полученные из hiPSC, известны как нейроны iCell^®. Данные вестерн-блоттинга и количественной полимеразной цепной реакции (ПЦР) показали, что данные нейроны экспрессируют все необходимые рецепторы и субстраты для осуществления интоксикации BoNT согласно поставщику. Исследования интоксикации нейротоксином BoNT/A показали, что нейроны, полученные из hiPSC, воспроизводимо и количественным образом обнаруживают биологически активный BoNT/A с высокой чувствительностью. Дополнительно, продемонстрировали количественное определение серотипов B, С, Е нейротоксина BoNT и комплекса BoNT/A и подтвердили специфичность BoNT/A посредством исследований гуморального иммунитета. Прямое сравнение способов обнаружения BoNT с применением первичных клеток спинного мозга крысы и с применением нейронов, происходящих из hiPSC, показало эквивалентную или увеличенную чувствительность, более крутую кривую зависимости доза-ответ и более полное направленное расщепление белка SNARE для нейронов, происходящих из hiPSC; см. Whitemarsh et al., цитированный выше. Эти данные предполагают, что нейроны, полученные из hiPSC, обеспечивают идеальную и высокочувствительную платформу для определения активности BoNT, обнаружения с использованием нейтрализующих антител и для исследования механизма действия. В одном из аспектов способов согласно настоящему изобретению нейроны, полученные из индуцированных плюрипотентных стволовых клеток, представляют собой нейроны, полученные из индуцированных плюрипотентных стволовых (iPS) клеток млекопитающего (такого как грызун, яванский макак, макак или шимпанзе), предпочтительно нейроны, полученные из индуцированных плюрипотентных стволовых (iPS) клеток человека. Предпочтительно, указанные нейроны, полученные из индуцированных плюрипотентных стволовых клеток, являются нейронами iCell^® (Cellular Dynamics International, Inc. (CDI)). Согласно поставщику, нейроны iCell^® получены из индуцированных плюрипотентных стволовых (iPS) клеток человека и обеспечивают уникальную систему in vitro для доклинической разработки новых лекарственных средств, тестирования на нейротоксичность и исследования заболеваний. Более того, нейроны iCell^® предоставляют для применения высококачественные и с высокой степенью чистоты нейрональные клетки человека, которые обладают типичными фенотипическими характеристиками и функциональностью зрелых нейронов. Исторически, модели in vitro играли важную роль в процессе поиска новых лекарственных средств, включая применение в ходе моделирования ранних стадий заболевания и выборе кандидата при идентификации, также как при тестировании фармакокинетики и тестировании на безопасность. По причине сложного устройства человеческого мозга ученные в настоящее время применяют упрощенные модели, такие как первичные клетки, выделенные из тканей грызунов, и трансформированные клеточные линии. Могут возникнуть вопросы по биологическому соответствию, воспроизводимости и масштабируемости, и опора на неполноценные модели может привести к тому, что вызванную лекарственным средством нейротоксичность не обнаружат до последней стадии клинических испытаний или после выхода на рынок в области нейротоксинов. Нейроны iCell^® преодолевают эти ограничения, обеспечивая надежную, хорошо описанную с высокой воспроизводимостью модель in vitro для доклинического тестирования нейротоксина на безопасность. Нейроны iCell^® представляют собой окончательно дифференцированные клетки из iPS клеток человека и проявляют нейрональные характеристики и функции. Нейроны iCell^® имеют высокую степень чистоты, обеспечивая биологически значимые и воспроизводимые результаты. Нейроны iCell^® сохраняют жизнеспособность и чистоту в культуре в течение недель, позволяя осуществлять оценку как острых, так и субхронических ответных реакций. Кроме того, нейроны iCell^® поставляют в криоконсервированном виде с культуральной средой, специально составленной для оптимальной работы клеток. Клетки легко размораживать и применять согласно руководству поставщика. Однако авторами настоящего изобретения было обнаружено, что различные группы нейронов iCell^® сильно различаются в отношении чувствительности указанных групп к полипептидам нейротоксинов. В результате, были получены сильные расхождения в измеренных значениях биологической активности нейротоксинов для разных групп. Для снижения вариабельности чувствительности различных групп нейронов, происходящих из iPS клеток, к полипептиду нейротоксина можно успешно применять внешнюю добавку GT1b к культуральной среде в соответствии со способами согласно настоящему изобретению.

[0027] Используемые в настоящей заявке единичные формы единственного числа включают ссылку как на форму единственного числа, так и на форму множественного числа, если по контексту не утверждается явным образом иное. В качестве примера, термин «клетка» относится к одной или более чем к одной клетке.

[0028] Используемый в настоящей заявке термин «приблизительно» («примерно») при обозначении значения указанного предмета, числа, процента или срока относится к диапазону плюс-минус 10 процентов, 9 процентов, 8 процентов, 7 процентов, 6 процентов, 5 процентов, 4 процентов, 3 процентов, 2 процентов или 1 процент от значения указанного предмета, числа, процента или срока. Предпочтительным является диапазон плюс-минус 10 процентов.

[0029] Термины «включающий», «включает» и «состоящий из», используемые в настоящей заявке, являются синонимами с терминами «содержащий», «содержит» и охватывают или не ограничивают и не исключают дополнительные, не изложенные члены, элементы или стадии способа. Очевидно, термин «включающий» охватывает термин «состоящий из». В частности, термин «включает», используемый в настоящей заявке, означает, что формула изобретения охватывает все перечисленные элементы или стадии способа, но может также включать дополнительные, неназванные элементы или стадии способа. Например, способ, включающий стадии а), b) и с), охватывает в своем самом узком смысле способ, который состоит из а), b) и с). Фраза «состоящий из» означает, что композиция (или устройство, или способ) имеет изложенные элементы (или стадии) и больше ничего. Наоборот, термин «включает» может охватывать также способ, включающий дополнительные стадии, например, стадии d) и е) в дополнении к стадиям а), b) и с).

[0030] В случае числовых диапазонов, используемых в настоящей заявке, таких как «GT1b в концентрации от 10 до 50 мкМ», диапазон включает не только 10 и 50 мкМ, но также числовые значения между 10 и 50 мкМ, например, 15 мкМ, 20 мкМ, 25 мкМ, 30 мкМ, 35 мкМ, 40 мкМ и 45 мкМ GT1b .

[0031] Термин «in vitro», используемый в настоящей заявке, обозначает снаружи или внешний по отношению к телу животного или человека. Термин «in vitro», используемый в настоящей заявке, должен пониматься как включающий термин «ех vivo». Термин «ех vivo», как правило, относится к тканям или клеткам, удаленным из тела животного или человека и поддерживаемым или размножаемым вне тела, например, в культуральном сосуде. Термин «in vivo», используемый в настоящей заявке, обозначает внутри или внутренний по отношению к телу животного или человека.

[0032] Термины «дифференцировка», «дифференцирующий» или «дифференцированный», используемые в настоящей заявке, обозначают процесс, посредством которого неспециализированная или относительно менее специализированная клетка становятся относительно более специализированной. В контексте клеточного онтогенеза прилагательное «дифференцированный» является относительным понятием. Следовательно, «дифференцированная клетка» представляет собой клетку, которая продвинулась дальше по определенному пути развития, чем клетка, с которой ее сравнивают. Дифференцированная клетка может быть, например, окончательно дифференцированной клеткой, то есть полностью специализированной клеткой, которая приобретает специализированные функции в различных тканях и органах организма, и которая может быть, но не обязательно, постмитотической клеткой. Например, нейроны iCell^® являются окончательно дифференцированными клетками, полученными из iPS клеток человека, и проявляют нейрональные характеристики и функции. В другом примере дифференцированная клетка также может быть клеткой-предшественником в пределах линии дифференцировки, которая может дополнительно пролиферировать и/или дифференцировать. Схожим образом, клетка является «относительно более специализированной», если она продвинулась дальше по определенному пути развития, чем клетка, с которой ее сравнивают, при этом последняя, таким образом, считается «неспециализированной» или «относительно менее специализированной». Относительно более специализированная клетка может отличаться от неспециализированной или относительно менее специализированной клетки в отношении одной или нескольких наглядных фенотипических характеристик, таких как, например, наличие, отсутствие или уровень экспрессии конкретных клеточных компонентов или продуктов, например, РНК, белков, специфических клеточных маркеров или других веществ, активность определенных биохимических путей, морфологический вид, способность к пролиферации и/или кинетика, потенциал к дифференцировке и/или ответная реакция на сигналы дифференцировки, т.д., при этом подобные характеристики обозначают продвижение относительно более специализированной клетки по указанному пути развития.

[0033] Термин «полипептид нейротоксина», используемый в настоящей заявке, обозначает нейротоксины Clostridium botulinum и Clostridium tetani (или нейротоксины клостридий), то есть токсины ботулизма (BoNT) и токсин столбняка (TeNT). Недавно идентифицировали новый тип токсина ботулизма, то есть BoNT/H; см. Barash and Amon, J. Infect. Dis. (2014), 209 (2): 183-191. В частности, указанный термин охватывает нейротоксины BoNT/A, BoNT/B, BoNT/C1, BoNT/D, BoNT/E, BoNT/F, BoNT/G, BoNT/H и нейротоксин столбняка (TeNT) или их подтипы. Например, подтипы BoNT/A включают BoNT/A1, BoNT/A2, BoNT/A3, BoNT/A4 и BoNT/A5. Подтипы BoNT/B охватывают, например, BoNT/B1, BoNT/B2, BoNT/B3, BoNT/B4, BoNT/B5, BoNT/В6 и BoNT/B7. Подтипы BoNT/C включают, например, BoNT/C1-1 и BoNT/C1-2. Охвачен также подтип BoNT/D-C. Подтипы BoNT/E включают, например, BoNT/E1, BoNT/E2, BoNT/E3, BoNT/E4, BoNT/E5, BoNT/Е6, BoNT/E7 и BoNT/E8. Кроме того, подтипы BoNT/F включают, например, BoNT/F1, BoNT/F2, BoNT/F3, BoNT/F4, BoNT/F5, B0NT/F6 и BoNT/F7. Полипептид нейротоксина и, в частности, его легкую цепь и тяжелую цепь можно получить из одного из отличающихся по антигенным свойствам серотипов нейротоксинов ботулизма, указанных выше. В одном из аспектов указанная легкая и тяжелая цепь полипептида нейротоксина являются легкой и тяжелой цепью нейротоксина, выбранного из группы, состоящей из нейротоксинов BoNT/A, BoNT/B, BoNT/C1, BoNT/D, BoNT/E, BoNT/F, BoNT/G, BoNT/H или TeNT. В другом аспекте полинуклеотид, кодирующий указанные полипептиды нейротоксинов, включает последовательность нуклеиновой кислоты, как показано в последовательности SEQ ID NO: 1 (BoNT/A), SEQ ID NO: 3 (BoNT/B), SEQ ID NO: 5 (BoNT/C1), SEQ ID NO: 7 (BoNT/D), SEQ ID NO: 9 (BoNT/E), SEQ ID NO: 11 (BoNT/F), SEQ ID NO: 13 (BoNT/G) или SEQ ID NO: 15 (TeNT). Более того, в одном из аспектов охвачен полинуклеотид, включающий последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующей аминокислотную последовательность, как показано в любой из последовательностей SEQ ID NO: 2 (BoNT/A), SEQ ID NO: 4 (BoNT/B), SEQ ID NO: 6 (BoNT/C1), SEQ ID NO: 8 (BoNT/D), SEQ ID NO: 10 (BoNT/E), SEQ ID NO: 12 (BoNT/F), SEQ ID NO: 14 (BoNT/G) или SEQ ID NO: 16 (TeNT). В одном из аспектов средств и способ согласно настоящему изобретению дополнительно охвачен полипептид нейротоксина, включающий или состоящий из аминокислотной последовательности, выбранной из группы, состоящей из последовательностей SEQ ID NO: 2 (BoNT/A), SEQ ID NO: 4 (BoNT/B), SEQ ID NO: 6 (BoNT/C1), SEQ ID NO: 8 (BoNT/D), SEQ ID NO: 10 (BoNT/E), SEQ ID NO: 12 (BoNT/F), SEQ ID NO: 14 (BoNT/G) и SEQ ID NO: 16 (TeNT). Соответствующие последовательности BoNT/H показаны в публикации Dover et al., J. Infect. Dis. (2014), 209 (2): 192-202. Указанные последовательности BoNT/H также охвачены в конкретных аспектах средств и способов согласно настоящему изобретении.

[0034] В другом аспекте указанный полипептид является вариантом вышеупомянутых полинуклеотидов, включающим одну или несколько нуклеотидных замен, делеций и/или добавлений, которые в еще одном аспекте могут привести к получению полипептида, имеющего одну или несколько аминокислотных замен, делеций и/или добавлений. Более того, в другом аспекте варианту полинуклеотида нужно включать вариант последовательности нуклеиновой кислоты, который по меньшей мере на 40%, по меньшей мере на 50%, по меньшей мере на 60%, по меньшей мере на 70%, по меньшей мере на 75%, по меньшей мере на 80%, по меньшей мере на 85%, по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 95%, по меньшей мере на 96%, по меньшей мере на 97%, по меньшей мере на 98% или по меньшей мере на 99% идентичен (предпочтительно полной) последовательности нуклеиновой кислоты, как показано в любой из последовательностей SEQ ID NO: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13 или 15, или нуклеиновой кислоте серотипа BoNT/H, или вариант последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующий аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 40%, по меньшей мере на 50%, по меньшей мере на 60%, по меньшей мере на 70%, по меньшей мере на 75%, по меньшей мере на 80%, по меньшей мере на 85%, по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 95%, по меньшей мере на 96%, по меньшей мере на 97%, по меньшей мере на 98% или по меньшей мере на 99% идентична (предпочтительно полной) аминокислотной последовательности, как показано в любой из последовательностей SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14 или 16 или аминокислотной последовательности BoNT/H. Термин «идентичный», используемый в настоящей заявке, относится к идентичности последовательностей, характеризуемой определением числа идентичных аминокислотных остатков между двумя последовательностями нуклеиновой кислоты или двумя аминокислотными последовательностями, при этом последовательности выравнены, так что получают самую высокую степень совпадения. Это может быть рассчитано с применением опубликованных технологий или способов, закодированных в компьютерных программах, таких как, например, BLASTP, BLASTN или FASTA (Altschul 1990, J Mol Biol 215, 403). В одном аспекте значения процента идентичности рассчитывают для всей аминокислотной последовательности. Специалисту доступна серия программ, основанных на разнообразных алгоритмах, для сравнения различных последовательностей. В этом случае алгоритмы Нидлмана и Вунша или Смита и Уотермана дают особенно надежные результаты. Для проведения выравнивания последовательностей могут быть использована программа PileUp (Higgins 1989, CABIOS 5, 151) или программы Gap и BestFit (Needleman 1970, J Mol Biol 48; 443; Smith 1981, Adv Appl Math 2, 482), которые являются частью пакета программного обеспечения GCG (Genetics Computer Group 1991, 575 Science Drive, Madison, Wisconsin, USA 53711). Значения идентичности последовательностей, приведенные выше, в процентах (%), должны быть определены в другом аспекте изобретения с использованием программы GAP для всей области последовательности со следующими параметрами настройки: штраф за появление гэпа (Gap Weight): 50, штраф за продолжение удлинения гэпа (Length Weight): 3, среднее совпадение (Average Match): 10,000 и среднее несовпадение (Average Mismatch): 0,000, которые, если не указано иначе, нужно всегда использовать как стандартные параметры настройки для выравнивания последовательностей. Вариант нейротоксина клостридий, на который ссылаются в настоящей заявке, включает, например, нейротоксин клостридий, полученный с помощью манипуляций человека, включая без ограничений нейротоксин клостридий, полученный с помощью методов генной инженерии или рекомбинантных методов, например, с использованием случайного мутагенеза или рациональной разработки, ферментативно модифицированные варианты нейротоксинов клостридий, которые модифицированы посредством активности ферментов, таких как эндо- или экзопротеолитические ферменты, или нейротоксины клостридий, полученные путем химического синтеза. «Генетические манипуляции» относится к способам, известным в данной области техники, для модификации нативного нейротоксина клостридий любого серотипа/подтипа посредством модификации гена, кодирующего нейротоксин клостридий, или соответствующих нуклеиновых кислот, как ДНК и мРНК. Рекомбинантные методы для генетического конструирования полинуклеотида, кодирующего полипептид нейротоксина, или полипептида нейротоксина хорошо описаны в данной области техники; см., например, Sambrook, J. & Russell, D. (2001). Molecular Cloning: a Laboratory Manual, 3rd edn. Cold Spring Harbor, NY: Cold Spring Harbor Laboratory. Вариант полипептида нейротоксина, используемый в настоящей заявке, дополнительно охватывает химически модифицированные полипептиды нейротоксина. Термин «химическая модификация», используемый в настоящей заявке, относится главным образом к методам, известным в данной области техники, для модификации нативного или рекомбинантного нейротоксина клостридий любого серотипа или подтипа посредством химических реакций или тому подобному; он относится в особенности к заменам, делециям, вставкам, добавлениям или посттрансляционным модификациям аминокислот нейротоксина клостридий. Химически модифицированный полипептид нейротоксина может быть тем полипептидом, который модифицирован посредством присоединения пирувата, фосфорилирования, сульфатирования, липидизации, пегилирования, гликозилирования и/или химического добавления аминокислоты или полипептида, включающего, например, от приблизительно 2 до приблизительно 500 аминокислот. Например, путем включения гуалуроновой кислоты или поливинилпирролидона или полиэтиленгликоля или их смеси в полипептид нейротоксина, нейротоксин клостридий, или в токсин, который получен из токсина клостридий посредством химической модификации или генетических манипуляций, можно его стабилизировать. В одном из аспектов каждый из вышеупомянутых вариантов полинуклеотида кодирует полипептид, сохраняющий одно или несколько и в другом аспекте все биологические свойства соответствующего полипептида нейротоксина, то есть нейротоксина BoNT/A, BoNT/B, BoNT/C1, BoNT/D, BoNT/E, BoNT/F, BoNT/G, BoNT/H или нейротоксина стобняка (TeNT). Специалисты в данной области поймут, что полная биологическая активность поддерживается только после протеолитической активации, хотя вполне возможно, что непроцессированный предшественник может проявлять некоторые биологические функции или быть частично активным. Термин «биологические свойства», используемый в настоящей заявке, относится к (а) связыванию с рецептором, (b) интернализации, (с) транслокации через эндосомальную мембрану в цитозоль и/или (d) эндопротеолитическому расщеплению белков, участвующих в слиянии синаптических везикулов с мембраной. В частности, все клеточные механизмы, при которых нейротоксин (например, BoNT/А) расщепляет субстрат нейротоксина (например, SNAP-25), охватывают связывание нейротоксина с его соответствующим рецептором (например, связывание BoNT/A с рецептором BoNT/A), интернализацию комплекса нейротоксин/рецептор, транслокацию легкой цепи нейротоксина из внутриклеточного везикула в цитоплазму и протеолитическое расщепление субстрата нейротоксина. Анализы in vitro и in vivo для определения биологической активности полипептида нейротоксина хорошо известны в данной области техники. Анализы in vivo для оценки биологической активности включают анализ ЛД50 для мышей и анализ ex vivo гемидиафрагмы мышей, как описано Pearce et al. (Pearce 1994, Toxicol Appl Pharmacol 128: 69-77) и Dressier et al. (Dressier 2005, Mov Disord 20: 1617-1619, Keller 2006, Neuroscience 139: 629-637). Биологическую активность обычно выражают в мышиных единицах. Используемая в настоящей заявке одна мышиная единица равна количеству нейротоксичного компонента, который убивает 50% конкретной популяции мышей после внутрибрюшинной инъекции, то есть мышиная ЛД50 внутрибрюшинно. В одном из дополнительных аспектов варианты полипептида могут кодировать нейротоксины, обладающие улучшенными или измененными биологическими свойствами, например, они могут включать сайты расщепления, которые лучше распознаются ферментами, или они могут быть улучшены в отношении связывания с рецепторами или любого другого свойства, описанного ранее. В некоторых аспектах полипептид нейротоксина может быть включен в образец. Образец может представлять собой, например, клинический образец, биологический образец, образец пищевого продукта, фармацевтический или токсикологический образец, образец антитела или тому подобное.

[0035] Соответственно, термин «определяя биологическую активность полипептида нейротоксина», используемый в настоящей заявке, означает измерение биологической активности белка нейротоксина, а именно (а) связывания с рецептором, (b) интернализации, (с) транслокации через эндосомальную мембрану в цитозоль и/или (d) эндопротеолитического расщепления белков, участвующих в слиянии синаптических везикулов с мембраной.

[0036] Термин «количество», используемый в настоящей заявке, охватывает абсолютное количество, например, полипептида нейротоксина или полипептида субстрата нейротоксина, относительное количество или концентрацию указанного полипептида, также как значение или параметр, который коррелирует с концентрацией или может быть выведен из нее.

[0037] Термин «определяя количество», например, полипептида нейротоксина или полипептида субстрата нейротоксина относится к измерению абсолютного количества, относительного количества или концентрации, например, полипептида нейротоксина или полипептида субстрата нейротоксина количественным или полуколичественным образом. Подходящие средства для обнаружения хорошо известны специалистам в данной области техники. Понятно, что определение количества полипептидов нейротоксинов или полипептидов субстрата нейротоксина в одном из аспектов также требует калибровки способа путем применения стандартных растворов с заданными количествами полипептидов нейротоксина или полипептидов субстрата нейротоксина. Специалистам в данной области техники хорошо известно, как проводить подобную калибровку.

[0038] В одном из аспектов способов согласно настоящему изобретению нейроны, полученные из индуцированных плюрипотентных стволовых (iPS) клеток, культивируют в культуральной среде, включающей GT1b . Ганглиозид GT1b связывается с полипептидом нейротоксина и потенциально опосредует селективность нейротоксинов в отношении нейронов. Соответственно, GT1b можно применять для стандартизации чувствительности нейронов, происходящих из индуцированных плюрипотентных стволовых (iPS) клеток, к полипептиду нейротоксина. Авторы настоящего изобретения показали, что внешняя добавка GT1b к нейронам, полученным из iPS клеток, резко снижает вариабельность чувствительности различных групп указанных нейронов, происходящих из iPS клеток, к полипептиду нейротоксина по сравнению с контрольными группами нейронов, происходящих из iPS клеток, обработанных в отсутствие GT1b . Предпочтительно, указанный GT1b представлен в концентрации от приблизительно 10 до приблизительно 50 мкМ, то есть в концентрации приблизительно 10 мкМ, приблизительно 15 мкМ, приблизительно 20 мкМ, приблизительно 25 мкМ, приблизительно 30 мкМ, приблизительно 35 мкМ, приблизительно 40 мкМ, приблизительно 45 мкМ или приблизительно 50 мкМ, более предпочтительно в концентрации приблизительно 30 мкМ.

[0039] В одном из дополнительных аспектов настоящее изобретение относится к способу определения биологической активности полипептида нейротоксина, включающему стадии:

a) культивирования нейронов, происходящих из индуцированных плюрипотентных стволовых клеток, в культуральной среде, включающей GT1b, в течение по меньшей мере 3 часов;

b) приведения в контакт нейронов, происходящих из индуцированных плюрипотентных стволовых клеток, стадии а) с полипептидом нейротоксина;

c) культивирования нейронов, происходящих из индуцированных плюрипотентных стволовых клеток, стадии b) в течение по меньшей мере 24 часов в присутствии GT1b в условиях, которые позволяют полипептиду нейротоксина проявлять свою биологическую активность;

d) определение биологической активности полипептида нейротоксина в указанных клетках.

[0040] В специфическом аспекте данного способа согласно настоящему изобретению применяют различные группы нейронов, происходящих из индуцированных плюрипотентных стволовых клеток, как определено в других частях настоящей заявки.

[0041] В одном аспекте способов согласно настоящему изобретению «стандартизация чувствительности» (нейронов, происходящих из индуцированных плюрипотентных стволовых клеток, к полипептиду нейротоксина) является снижением вариабельности чувствительности различных групп нейронов, происходящих из индуцированных плюрипотентных стволовых (iPS) клеток, к полипептиду нейротоксина по сравнению с контрольными группами нейронов, происходящих из индуцированных плюрипотентных стволовых (iPS) клеток, обработанных в тех же условиях, однако, в отсутствие GT1b.

[0042] В другом аспекте снижение вариабельности чувствительности различных групп нейронов, происходящих из индуцированных плюрипотентных стволовых (iPS) клеток, к полипептиду нейротоксина составляет по меньшей мере 1,1-кратное, по меньшей мере 1,2-кратное, по меньшей мере 1,3-кратное, по меньшей мере 1,4-кратное, по меньшей мере 1,5-кратное, по меньшей мере 1,6-кратное, по меньшей мере 1,7-кратное, по меньшей мере 1,8-кратное, по меньшей мере 1,9-кратное, по меньшей мере 2-кратное, по меньшей мере 2,1-кратное, по меньшей мере 2,2-кратное, по меньшей мере 2,3-кратное, по меньшей мере 2,4-кратное, по меньшей мере 2,5-кратное или даже по меньшей мере 3-кратное снижение по сравнению с контрольными группами нейронов, происходящих из индуцированных плюрипотентных стволовых (iPS) клеток, обработанных в тех же условиях, однако, в отсутствие GT1b .

[0043] В других аспектах способов согласно настоящему изобретению нейроны, полученные из индуцированных плюрипотентных стволовых (iPS) клеток, представляют собой нейроны, полученные из индуцированных плюрипотентных стволовых (iPS) клеток человека. Предпочтительно, указанные нейроны, полученные из индуцированных плюрипотентных стволовых (iPS) клеток, являются нейронами iCell^® (Cellular Dynamics International; упомянуто выше).

[0044] В одном аспекте способов согласно настоящему изобретению различные группы нейронов, происходящих из индуцированных плюрипотентных стволовых (iPS) клеток, различаются в отношении числа пассажей, числа циклов заморозки-разморозки, условий культивирования, срока хранения, времени роста, условий дифференцировки или комбинацией этих параметров.

[0045] В другом аспекте способов согласно настоящему изобретению культуральная среда включает среду Neurobasal, добавку В27 (2%), глутамин или глутамакс (L-аланин-L-глутамин) (1%). Необязательно культуральная среда может включать антибиотики (1%), добавку N2 (1%) и/или сывороточный альбумин (0,2%).

[0046] В дополнительных аспектах способов согласно настоящему изобретению GT1b добавляют в концентрации от 1 до 300 мкМ, предпочтительно 30 мкМ.

[0047] В другом аспекте способов согласно настоящему изобретению полипептид нейротоксина представляет собой нейротоксин BoNT/A, BoNT/B, BoNT/C1, BoNT/D, BoNT/E, BoNT/G, BoNT/F, BoNT/H или TeNT или его подтип.

[0048] В еще одном дополнительном аспекте способов согласно настоящему изобретению биологическая активность полипептида нейротоксина определяют количественным анализом расщепленного нейротоксином субстрата с помощью вестерн-блоттинга (иммуноблоттинга), иммуноблоттинга с использованием электрофореза в полиакриламидном геле с додецилсульфатом натрия (ДСН-ПААГ-электрофорез) или ELISA (см., например, Pellet et al. (2010), J. Pharmacol. Toxicol. Methods 61, 304-310).

[0049] В дополнительном аспекте изобретение относится к применению GT1b для

a) стандартизации чувствительности различных групп нейронов, происходящих из индуцированных плюрипотентных стволовых (iPS) клеток, к полипептиду нейротоксина; или

b) снижения вариабельности чувствительности различных групп нейронов, происходящих из индуцированных плюрипотентных стволовых (iPS) клеток, к полипептиду нейротоксина.

[0050] Конкретные аспекты способов и применений настоящего изобретения показаны в следующих примерах.

[0051] На фигурах показано:

Фигура 1: Культивировали клетки SiMa и проводили их интоксикацию, как описано в Примере 2, и определяли отношение расщепленного белка к нерасщепленному белку SNAP-25 с помощью вестерн-блоттинга. На оси X представлена концентрация типа нейротоксина ботулизма, а на оси Y относительное количество расщепленного SNAP-25, то есть отложено отношение расщепленной формы к нерасщепленной форме SNAP-25. Кружки символизируют клетки SiMa, культивированные в отсутствие GT1b, квадратики символизируют клетки SiMa, культивированные с 30 мкМ GT1b. Культивирование с GT1b привело к повышению чувствительности приблизительно в 10 раз.

Фигура 2: Культивировали клетки SH-SY5Y и проводили их интоксикацию, как описано в Примере 2, и определяли отношение расщепленного белка к нерасщепленному белку SNAP-25 с помощью вестерн-блоттинга. На оси X представлена концентрация типа нейротоксина ботулизма, а на оси Y относительное количество расщепленного SNAP-25, то есть отложено отношение расщепленной формы к нерасщепленной форме SNAP-25. Кружки символизируют клетки SH-SY5Y, культивированные в отсутствие GT1b, квадратики символизируют клетки SH-SY5Y, культивированные с 30 мкМ GT1b. Культивирование с GT1b привело к повышению чувствительности приблизительно в 2 раз.

Фигура 3: Культивировали клетки PC 12 и проводили их интоксикацию, как описано в Примере 2, и определяли отношение расщепленного белка к нерасщепленному белку SNAP-25 с помощью вестерн-блоттинга. На оси X представлена концентрация типа нейротоксина ботулизма, при этом на оси Y относительное количество расщепленного SNAP-25, то есть отложено отношение расщепленной формы к нерасщепленной форме SNAP-25. Кружки символизируют клетки PC 12, культивированные в отсутствие GT1b, квадратики символизируют клетки PC 12, культивированные с 30 мкМ GT1b. Культивирование с GT1b привело к повышению чувствительности приблизительно в 1,4 раза.

Фигура 4: Культивировали клетки Neuro2A и проводили их интоксикацию, как описано в Примере 2, и определяли отношение расщепленного белка к нерасщепленному белку SNAP-25 с помощью вестерн-блоттинга. На оси X представлена концентрация типа нейротоксина ботулизма, при этом на оси Y относительное количество расщепленного SNAP-25, то есть отложено отношение расщепленной формы к нерасщепленной форме SNAP-25. Кружки символизируют клетки Neuro2A, культивированные в отсутствие GT1b, квадратики символизируют клетки Neuro2A, культивированные с 30 мкМ GT1b. При заданных концентрациях нейротоксина не наблюдали полную кривую зависимости доза-ответ, также как повышение чувствительности в присутствии GT1b .

Фигура 5: Культивировали клетки NG108-15 и проводили их интоксикацию, как описано в Примере 2, и определяли отношение расщепленного белка к нерасщепленному белку SNAP-25 с помощью вестерн-блоттинга. На оси X представлена концентрация типа нейротоксина ботулизма, при этом на оси Y относительное количество расщепленного SNAP-25, то есть отложено отношение расщепленной формы к нерасщепленной форме SNAP-25. Кружки символизируют клетки NG108-15, культивированные в отсутствие GT1b, квадратики символизируют клетки NG108-15, культивированные с 30 мкМ GT1b. Культивирование с GT1b привело к повышению чувствительности приблизительно в 1,6 раз.

[0052] Изобретение теперь будет проиллюстрировано следующими примерами, которые не нужно толковать как ограничивающие объем настоящего изобретения.

[0053] Примеры:

Пример 1:

Нейроны iCell^® 4 разных групп клеток размораживали и высеивали на 96-луночные планшеты согласно инструкции по применению фирмы «Cellular Dynamics International» (CDI). Спустя 24 часа после посева заменяли среду либо на свежую поддерживающую среду, как описано в инструкции по применению, либо на ту же самую среду с добавкой 30 мкМ GT1b.

После дополнительных 72 часов инкубации среду удаляли и заменяли свежей средой, содержащей BoNT/A в различных концентрациях. Если клетки выращивали на среде, содержащей GT1b, свежая среда также содержала 30 мкМ GT1b.

Спустя 72 часа после начала интоксикации аспирировали среду и лизировали клетки, добавляя 25 мкл буфера для образца с ДСН.

Процент расщепленного белка SNAP-25 определяли с помощью иммуноблоттинга с ДСН-ПААГ-электрофорезом, как описано в Pellett et al., 2010 (цитированный выше).

Величина ЕС50 (концентрация BoNT/A, приводящая к полумаксимальному расщеплению SNAP-25) рассчитывали путем нанесения на график процента расщепленного SNAP-25 относительно концентрации BoNT/A.

Получившиеся значения ЕС50 различных групп клеток с добавлением и без добавления GT1b показаны в Таблице 1.

Несмотря на более высокую чувствительность в результате добавления GT1b, снижающего ЕС50 с приблизительно 5,0 до 0,75 ед./мл, относительное среднеквадратичное отклонение значений ЕС50 данных групп снижено от приблизительно 30% до приблизительно 15%.

Пример 2:

Культивирование и дифференцировка клеток SiMa (см. Фигура 1): Флакон, содержащий клетки SiMa, размораживали и ресуспендировали в культуральной среде (90% среда RPMI 1640+10% термоинактивированной эмбриональной бычьей сывороткой (ЭБС) + 2 мМ L-глутамина +/-30 мкМ GT1b) до конечной плотности 30000 клеток/мл. Клетки высеивали на покрытые поли-D-лизином 96-луночные планшеты для микротитрования по 3000 клеток/лунку и инкубировали в течение 72 часов при 37°C, 95% O₂/5% CO₂ в насыщенной водяным паром атмосфере. Спустя 72 часа среду заменяли бессывороточной средой (минимальная среда (MEM) + 2% добавки В27 + 1% добавки N2 + 2% заменимых аминокислот + 2 мМ L-глутамина +/-30 мкМ GT1b), содержавшей нейротоксин ботулизма типа A в концентрациях в диапазоне от 1,0*10^-9 до 5,65*10^-15 М. После 72 часов инкубации, как указано выше, среду удаляли, клетки ресуспендировали в лизирующем буфере (20 мМ Трис/HCl, 20 мМ NaCl, 2 мМ MgCl₂, 0,5% Тритона Х-100, 5 единиц/мл бензоназы при pH 8,0), смешанном с буфером для образца с ДСН фирмы «RotiLoad 1», и подвергали вестерн-блоттингу для определения отношения расщепленный SNAP-25/ нерасщепленный SNAP-25, как описано в Whitemarsh et al. (2012), Toxicol. Sci. 126, 426-35, с использованием мышиных антител (Synaptic Systems SySyl 11111).

Культивирование и дифференцировка клеток SH-SY5Y (см. Фигура 2): Флакон, содержащий клетки SH-SY5Y, размораживали и ресуспендировали в культуральной среде (85% MEM: F12 (смесь минимальной среды и среды Хэма F-12) + 15% термоинактивированной ЭБС +/-30 мкМ GT1b) до конечной плотности 60000 клеток/мл. Клетки высеивали на непокрытые 96-луночные планшеты для микротитрования по 6000 клеток/лунку и инкубировали в течение 24 часов при 37°C, 95% О₂/5% CO₂ в насыщенной водяным паром атмосфере. В среду затем добавляли фактор роста нервов (100 нг/мл) и афидиколин (0,3 мМ) +/-30 мкМ GT1b. Данную среду заменяли каждые 2-3 дня. После 17 дней инкубации среду заменяли свежей средой, содержавшей нейротоксин ботулизма типа A в концентрациях в диапазоне от 1,0*10^-9 до 5,65*10^-15 М. После 72 часов инкубации, как указано выше, среду удаляли, клетки ресуспендировали в лизирующем буфере (20 мМ Трис/HCl, 20 мМ NaCl, 2 мМ MgCl₂, 0,5% Тритона Х-100, 5 единиц/мл бензоназы при pH 8,0), смешанном с буфером для образца с ДСН фирмы «RotiLoad 1», и подвергали вестерн-блоттингу для определения отношения расщепленный SNAP-25/ нерасщепленный SNAP-25, как описано в Whitemarsh et al. (2012), Toxicol. Sci. 126, 426-35, с использованием мышиных антител (Synaptic Systems SySy111111).

Культивирование и дифференцировка клеток PC 12 (см. Фигура 3): Флакон, содержащий клетки PC 12, размораживали и ресуспендировали в культуральной среде (85% среда RPMI 1640 + 10% лошадиной сыворотки + 5% термоинактивированной ЭБС +/-30 мкМ GT1b) до конечной плотности 25000 клеток/мл. Клетки высеивали на покрытые коллагеном 96-луночные планшеты для микротитрования по 2500 клеток/лунку и инкубировали в течение 72 часов при 37°C, 95% O₂/5% CO₂ в насыщенной водяным паром атмосфере. В среду затем добавляли фактор роста нервов (100 нг/мл) +/-30 мкМ GT1b. Данную среду заменяли каждые 2-3 дня. После 11 дней инкубации среду заменяли свежей средой, содержавшей нейротоксин ботулизма типа A в концентрациях в диапазоне от 1,0*10^-9 до 5,65*10^-15 М. После 72 часов инкубации, как указано выше, среду удаляли, клетки ресуспендировали в лизирующем буфере (20 мМ Трис/HCl, 20 мМ NaCl, 2 мМ MgCl₂, 0,55% Тритона Х-100, 5 единиц/мл бензоназы при pH 8,0), смешанном с буфером для образца с ДСН фирмы «RotiLoad 1», и подвергали вестерн-блоттингу для определения отношения расщепленный SNAP-25/ нерасщепленный SNAP-25, как описано в Whitemarsh et al. (2012), Toxicol. Sci. 126, 426-35, с использованием мышиных антител (Synaptic Systems SySy111111).

Культивирование и дифференцировка клеток Neuro2A (см. Фигура 4): Флакон, содержащий клетки Neuro2A, размораживали и ресуспендировали в культуральной среде (90% модифицированная по способу Дульбекко среда Игла (DMEM) + 10% термоинактивированной ЭБС +/-30 мкМ GT1b) до конечной плотности 20000 клеток/мл. Клетки высеивали на 96-луночные планшеты для микротитрования по 2000 клеток/лунку и инкубировали в течение 24 часов при 37°C, 95% О₂/5% CO₂ в насыщенной водяным паром атмосфере. Среду заменяли на бессывороточную среду DMEM +/-30 мкМ GT1b с последующей инкубацией в течение 3 дней при 37°C. Затем среду заменяли свежей бессывороточной средой, содержавшей 0,2% бычьего сывороточного белка (БСА) +/-30 мкМ GT1b и нейротоксин ботулизма типа A в концентрациях в диапазоне от 1,0*10^-9 до 5,65*10^-15 М. После 72 часов инкубации, как указано выше, среду удаляли, клетки ресуспендировали в лизирующем буфере (20 мМ Трис/HCl, 20 мМ NaCl, 2 мМ MgCl₂, 0,5% Тритона Х-100, 5 единиц/мл бензоназы при pH 8,0), смешанном с буфером для образца с ДСН фирмы «RotiLoad 1», и подвергали вестерн-блоттингу для определения отношения расщепленный SNAP-25/ нерасщепленный SNAP-25, как описано в Whitemarsh et al. (2012), Toxicol. Sci. 126, 426-35, с использованием мышиных антител (Synaptic Systems SySy111111).

Культивирование и дифференцировка клеток NG108-15 (см. Фигура 5): Флакон, содержащий клетки NG108-15, размораживали и ресуспендировали в культуральной среде (90% среды DMEM + 10% термоинактивированной ЭБС +/-30 мкМ GT1b) до конечной плотности 60000 клеток/мл. Клетки высеивали на 96-луночные планшеты для микротитрования по 6000 клеток/лунку и инкубировали в течение 72 часов при 37°C, 95% O₂/5% CO₂ в насыщенной водяным паром атмосфере. В среду затем добавляли дибутирил-цАМФ (1 мМ) +/-30 мкМ GT1b. Данную среду заменяли каждые 2-3 дня. После 5 дней инкубации среду заменяли свежей средой, содержавшей нейротоксин ботулизма типа A в концентрациях в диапазоне от 1,0*10^-9 до 5,65*10^-15 М. После 72 часов инкубации, как указано выше, среду удаляли, клетки ресуспендировали в лизирующем буфере (20 мМ Трис/HCl, 20 мМ NaCl, 2 мМ MgCl₂, 0,5% Тритона Х-100, 5 единиц/мл бензоназы при pH 8,0), смешанном с буфером для образца с ДСН фирмы «RotiLoad 1», и подвергали вестерн-блоттингу для определения отношения расщепленный SNAP-25/ нерасщепленный SNAP-25, как описано в Whitemarsh et al. (2012), Toxicol. Sci. 126, 426-35, с использованием мышиных антител (Synaptic Systems SySy111111).

1. Способ стандартизации чувствительности нейронов, происходящих из индуцированных плюрипотентных стволовых клеток (iPS), к полипептиду нейротоксина клостридии,

включающий стадии:

а) культивирования различных групп нейронов, происходящих из индуцированных плюрипотентных стволовых клеток, в культуральной среде, содержащей GT1b, в течение по меньшей мере 3 ч;

b) приведения в контакт указанных различных групп нейронов, происходящих из индуцированных плюрипотентных стволовых клеток, стадии а) с полипептидом нейротоксина клостридии;

с) культивирования указанных различных групп нейронов, происходящих из индуцированных плюрипотентных стволовых клеток, стадии b) в течение по меньшей мере 24 ч в присутствии GT1b в условиях, которые позволяют указанному полипептиду нейротоксина клостридии проявлять свою биологическую активность;

в результате чего происходит стандартизация чувствительности указанных нейронов, происходящих из индуцированных плюрипотентных стволовых клеток, к указанному полипептиду нейротоксина клостридии.

2. Способ получения происходящих из индуцированных плюрипотентных стволовых клеток нейронов, которые имеют стандартизованную чувствительность по отношению к полипептиду нейротоксина клостридии, включающий стадии:

а) обеспечения различных групп нейронов, происходящих из индуцированных плюрипотентных стволовых клеток;

b) культивирования указанных различных групп нейронов, происходящих из индуцированных плюрипотентных стволовых клеток, стадии а) в культуральной среде, содержащей GT1b, в течение по меньшей мере 3 ч;

с) приведения в контакт указанных различных групп нейронов, происходящих из индуцированных плюрипотентных стволовых клеток, стадии b) с полипептидом нейротоксина клостридии; и

d) культивирования указанных различных групп нейронов, происходящих из индуцированных плюрипотентных стволовых клеток, стадии c) в течение по меньшей мере 24 ч в присутствии GT1b в условиях, которые позволяют указанному полипептиду нейротоксина клостридии проявлять свою биологическую активность;

в результате чего происходит стандартизация чувствительности указанных нейронов, происходящих из индуцированных плюрипотентных стволовых клеток, к указанному полипептиду нейротоксина клостридии.

3. Способ определения биологической активности полипептида нейротоксина клостридии, включающий стадии:

а) культивирования нейронов, происходящих из индуцированных плюрипотентных стволовых клеток, в культуральной среде, содержащей GT1b, в течение по меньшей мере 3 ч;

b) приведения в контакт указанных нейронов, происходящих из индуцированных плюрипотентных стволовых клеток, стадии а) с полипептидом нейротоксина клостридии;

с) культивирования указанных нейронов, происходящих из индуцированных плюрипотентных стволовых клеток, стадии b) в течение по меньшей мере 24 ч в присутствии GT1b в условиях, которые позволяют указанному полипептиду нейротоксина клостридии проявлять свою биологическую активность; и

d) определения биологической активности указанного полипептида нейротоксина клостридии в указанных клетках.

4. Способ по п. 3, отличающийся тем, что используют различные группы нейронов, происходящих из индуцированных плюрипотентных стволовых клеток.

5. Способ по п. 1 или 2, дополнительно включающий определение биологической активности указанного полипептида нейротоксина клостридии в различных группах нейронов, происходящих из индуцированных плюрипотентных стволовых клеток.

6. Способ по любому из пп. 1, 2, отличающийся тем, что стандартизация чувствительности представляет собой снижение вариабельности чувствительности указанных различных групп нейронов, происходящих из индуцированных плюрипотентных стволовых клеток, к полипептиду нейротоксина клостридии по сравнению с контрольными группами нейронов, происходящих из индуцированных плюрипотентных стволовых клеток, обработанными в отсутствие GT1b.

7. Способ по п. 6, отличающийся тем, что указанное снижение вариабельности чувствительности указанных различных групп нейронов, происходящих из индуцированных плюрипотентных стволовых клеток, к полипептиду нейротоксина клостридии представляет собой снижение по меньшей мере в 1,5 раза или по меньшей мере в 2 раза.

8. Способ по любому из пп. 1-7, отличающийся тем, что указанные нейроны, полученные из индуцированных плюрипотентных стволовых клеток, представляют собой нейроны, полученные из индуцированных плюрипотентных стволовых клеток человека, предпочтительно нейроны iCell® (Cellular Dynamics International).

9. Способ по любому из пп. 1, 2 и 4-8, отличающийся тем, что указанные различные группы нейронов, происходящих из индуцированных плюрипотентных стволовых клеток, отличаются по числу пассажей, числу циклов заморозки-разморозки, условиям культивирования, сроку хранения, времени роста, условиям дифференцировки или комбинациям этих параметров.

10. Способ по п. 1, 2 или 3, отличающийся тем, что указанная культуральная среда включает среду Neurobasal, добавку B27 (2%), Глутамин или Глутамакс (1%).

11. Способ по любому из пп. 1-10, отличающийся тем, что GT1b добавляют в концентрации от 1 до 300 мкМ, предпочтительно 30 мкМ.

12. Способ по любому из пп. 1-11, отличающийся тем, что указанный полипептид нейротоксина клостридии представляет собой BoNT/A, BoNT/B, BoNT/C1, BoNT/D, BoNT/E, BoNT/F, BoNT/G, BoNT/H или TeNT или его подтип.

13. Способ по п. 3 или 5, отличающийся тем, что биологическую активность указанного полипептида нейротоксина клостридии определяют путем количественного анализа расщепленного нейротоксином субстрата с помощью иммуно-вестерн-блоттинга, иммуноблоттинга с ДСН-ПААГ-электрофорезом или ELISA.

14. Применение GT1b для стандартизации чувствительности различных групп нейронов, происходящих из индуцированных плюрипотентных стволовых клеток, к полипептиду нейротоксина клостридии.

15. Применение GT1b для снижения вариабельности чувствительности различных групп нейронов, происходящих из индуцированных плюрипотентных стволовых клеток, к полипептиду нейротоксина клостридии.