Способ производства гамма-глобулинового полуфабриката с повышенным содержанием противовирусных антител из боенской крови вакцинированных коров

Изобретение относится к биологической промышленности, в частности к способу получения гамма-глобулинового полуфабриката из боенской крови крупного рогатого скота. Способ получения гамма-глобулинового полуфабриката из боенской крови крупного рогатого скота с помощью химических реагентов, при этом в качестве сырья используется боенская кровь по месту ее заготовки и сепарирования в условиях мясокомбината, а образцы плазмы по мере их изготовления помещаются в насыщенный 100% от насыщения или 4,05 М раствор сульфата аммония с 0,75% дидецилдиметиламмония хлорида, в соотношении раствор : плазма 1:1,5 по объему, до концентрации 40% от насыщения сульфата аммония и 0,3% дидецилдиметиламмония хлорида, образовавшуюся суспензию центрифугируют с получением осадка гамма-глобулиновой фракции, в образовавшийся надосадок добавляют при перемешивании сухой порошок сульфата аммония, получая конечную концентрацию сульфата аммония 75% от насыщения, и доводят рН до 4,6, суспензию перемешивают и центрифугируют, осаждая альбуминовую фракцию, оставшийся после осаждения альбуминовой фракции надосадок используют для ресуспендирования гамма-глобулинового осадка, конечные концентрации сульфата аммония в гамма-глобулиновой суспензии составляют не менее 60% от насыщения и не менее 0,27% дидецилдиметиламмония хлорида. Вышеуказанный способ позволяет получить гамма-глобулиновый полуфабрикат, который хранится в течение 180 дней при комнатной температуре, с сохранением его свойств. 2 з.п. ф-лы, 1 ил., 7 табл., 1 пр.

 

Изобретение относится к биологической промышленности, к заготовке и переработке крови для производства полуфабрикатов в нестандартных условиях без соблюдения стерильности инструментов и надлежащей чистоты производственных помещений. Изготовленные полуфабрикаты не содержат контаминирующей микрофлоры и активных форм естественных протеаз. Для кратковременного хранения полуфабрикатов и их транспортировки не используется холодильное оборудование, в том числе «холодовая цепь». При этом активность антител из класса IgG сохраняется в составе гамма-глобулинового полуфабриката на всех сроках наблюдения в течение 180 дней.

Безопасность препаратов плазмы крови человека подчиняется известному алгоритму формирования реакторной закладки. Во-первых, реакторная закладка формируется из стерильных кроводач донорского контингента, которые в стерильных условиях подвергаются центрифугированию с целью получения стерильных образцов плазмы, предназначенных к фракционированию. Вирусная безопасность контролируется дополнительно и заблаговременно с помощью иммуноферментных подходов и на основе ПЦР-диагностики. Отсутствие реактогенности конечных форм биопрепаратов достигается за счет стандартных условий производства на основе выполнения всех стадий технологического процесса в помещениях с надлежащим уровнем чистоты [1. WHO Recommendation for the production, control and regulation of human plasma for fractionation [Electronic resource]. Fifty-sixth Report. 2007. Available from: http://www.who.int/biologicals/expert_committee/Full%20Text%20TRS941.pdf; 2. Guidance on plasma-derived medicinal products. European Medicines Agency. EMA/CHMP/BWP/706271/2010.; 3. Directive 2002/98/EC of the European Parliament and of the Council of 27.01.2003 setting standards of quality and safety for the collection, testing, processing, storage and distribution of human blood and blood components and amending. [Electronic resource]. Available from: https://ec.europa.eu/health//sites/health/files/files/eudralex/vol-1/dir_2002_98/dir_2002_98_en.pdf; 4. ГОСТ P 53420-2009. Кровь донорская и ее компоненты. Общие требования к обеспечению качества при заготовке, переработке, хранении и использовании донорской крови и ее компонентов].

С учетом изложенного, стандартные схемы технологических процессов производства медицинских биопрепаратов плазмы исключают фракционирование потенциально пирогенного сырья (плазмы крови). В частности, прикладные исследования международного масштаба не ориентированы на разработку методов-приемов-стадий, предназначенных для инактивации микрофлоры в составе коллоидных растворов, сложных по составу индивидуально-своеобразных белков. Известные технологические процессы в принципе не способны инициировать совершенствование производства плазмы при конвейерной заготовке боенской крови в нестандартных (неприемлемых) условиях без соблюдения требований стерильности сырья и надлежащей чистоты соответствующих помещений. В условиях мясокомбината по месту заготовки боенской крови процесс производства плазмы всегда будет технологически неприемлемым, поскольку обеспечивает микробную контаминацию сырьевой заготовки и сопряженную пирогенность готовых биопрепаратов плазмы.

Стандартный технологический процесс производства медицинских биопрепаратов плазмы включает стадии [4. ГОСТ Р 53420-2009. Кровь донорская и ее компоненты. Общие требования к обеспечению качества при заготовке, переработке, хранении и использовании донорской крови и ее компонентов]:

- кратковременного хранения сырья в условиях низких температур. Известно, что низкотемпературный режим хранения плазмы обеспечивает бактерицидно-бактериостатические условия и ингибирование естественных протеаз в составе замороженных образцов плазмы;

- использования «холодовой цепи» для обеспечения транспортировки плазмы в замороженном состоянии от места ее производства до места ее фракционирования с целью обеспечения промышленного выпуска фармацевтических биопрепаратов плазмы.

Физическая химия и биохимия белка, а также прикладная направленность развития достижений в указанной области знаний требуют строжайшего соблюдения низкотемпературного режима, не допускающего неоднократного замораживания и оттаивания образцов, предназначенных для промышленного фракционирования и производства биопрепаратов плазмы. [5. Чард Т. «Радиоиммунологические методы». М.: Мир, 1981, с. 48]. В стационарных условиях соблюдение указанного режима поддается надлежащему контролю. В условиях транспортировки сырьевой заготовки существуют риски сугубо технического характера.

Еще одна проблема, характерная для международной биоиндустрии, касается инфекционной безопасности лекарственных средств, производство которых базируется на фракционировании естественных биоресурсов. [6. Зубкова Н.В. Биотехнологические аспекты эффективной и безопасной переработки донорской плазмы: проблемы и перспективы // Биопрепараты. - 2014. - №1. - С. 4-10.; 7. Burnouf Т. Modern plasma fractionation. Transfus. Med. Rev. 2007; 21(2): 101-17.]. В соответствии с требованиями стандарта GMP и его отечественного аналога [8. ГОСТ Р 52249-2009. Правила производства и контроля качества лекарственных средств] повышение инфекционной безопасности медицинских биопрепаратов достигается на стадии заготовки сырья за счет совершенствования оптимальной комбинации скрининговых тестов. При этом в медицинской промышленности оптимизация комбинации скрининговых тестов осуществляется в основном за счет расширения диагностических процедур в отношении вирусных инфекций человека. Например, индивидуальные донорские кроводачи тестируются на отсутствие ВИЧ1, ВИЧ2, гепатита В и С. Зарубежные варианты диагностических исследований контролируют дополнительно отсутствие Т-клеточных вирусов лейкоза человека, а также герпесвирусов и цитомегаловирусов. В частности, для этих целей промышленным способом выпускаются иммуноферментные наборы для регистрации антител и вирусных белков в сыворотке крови человека. Аналогичная цель достигается за счет выпуска диагностических наборов, сконструированных на основе ПЦР. Немаловажным фактором обеспечения инфекционной безопасности реакторной закладки является также принцип карантинирования донорской плазмы крови человека, обеспечивающий повторное диагностическое исследование одного и того же донора при его последующей кроводаче. [9. Приказ Минздрава РФ от 7 мая 2003 г., №193 «О внедрении в практику работы службы крови в Российской Федерации метода карантинизации свежезамороженной плазмы»; 10. Guide to the preparation, use and quality assurance of blood components. Recommendation №R (95)15/9th edition. - Council of Europe. - 2003.].

Необходимо отметить, что изложенную систему заготовки донорской крови человека, предназначенную для выпуска медицинских биопрепаратов, не представляется возможным воспроизвести в полном объеме для производства биопрепаратов ветеринарного назначения. Во-первых, в биологической промышленности оптимальная комбинация скрининговых тестов разработана в самом общем виде. Инфекционная безопасность индивидуальных кроводач животных-доноров определяется производственным предприятием самостоятельно на основании региональных и российских противоэпизоотических программ. Во-вторых, несмотря на фундаментальные труды в области вирусных инфекций животных [11. Сюрин В.Н., Самуйленко А.Я., Соловьев Б.В., Фомина Н.В. «Вирусные болезни животных». - Москва, ВНИТИБП, 2001.

928 с., ил.] нет прогнозно-плановых исследований научно-практического характера, на основании которых было бы возможно создавать диагностические наборы в отношении первостепенных вирусных угроз, свойственных, например, мясомолочному животноводству. В-третьих, наиболее изучена молекулярная биология вирусов, вызывающих инфекционные заболевания человека. Именно молекулярно-биологическая первооснова вирусных частиц позволяет создавать технологии для промышленного производства комплектующих с целью создания необходимых диагностических наборов. В отношении вирусных агентов, поражающих домашних животных или диких зверей, такого рода технологии развиты крайне недостаточно, прежде всего, из-за отсутствия фундаментальных знаний в области молекулярной вирусологии.

С инженерно-технических позиций оформление участка по заготовке сырья в соответствии с принципиальными технологиями, действующими в медицинской промышленности, также вызывает определенные проблемы при проектировании аналогичных производственных помещений, предназначенных для использования боенской крови животных.

Во-первых, необходимо организовать производство:

- систем и спец. пакетов объемом более 10 литров (типа контейнера «ГЕМАСИН» (ОАО «Кургансинтез») для прижизненного и стерильного обескровливания животных, поступивших на мясокомбинат;

- спец. центрифуг с охлаждением, укомплектованных ротором с крестовиной, для обеспечения стерильности операции центрифугирования спец. пакетов с индивидуальными объемами кроводачи около 10 литров каждый;

- спец. ламинаров для оформления рабочего места для обеспечения возможности заготовки полученной стерильной плазмы в пакетированной форме;

- охлаждающих агрегатов для заморозки около 500 л плазмы, изготовленной за рабочую смену усредненного мясокомбината;

- спец. автомобилей в рамках требований «холодовой цепи» для доставки сырья от места заготовки крови и производства плазмы до предприятия-производителя биопрепаратов плазмы ветеринарного назначения.

Во-вторых, сконцентрировать усилия в области фундаментально-ориентированных и прикладных исследований для:

- внесения определенностей в инфекционную (вирусную) безопасность животноводства в рамках требований оптимизации скрининговых тестов лабораторно-диагностического контроля;

- расшифровки молекулярно-биологической структуры вирусных агентов, потенциально способных к индукции вирусных инфекций, с различным уровнем охвата животноводческих хозяйств;

- внесения конкретики в механизм формирования вирусных реассортантов, в т.ч. детализации взаимосвязей вакцинного иммуногена с трансформацией вирусных частиц, представленных полевыми и вакцинными штаммами.

Отметим главное. Инженерно-техническое оформление производства плазмы по месту заготовки боенской крови в условиях мясокомбината достаточно сложно воспроизвести на основе известных технологических стандартов. Однако создание надлежащих условий в соответствии с требованиями известных технологических стандартов является трудновыполнимой задачей и для предприятий фармацевтической биоиндустрии, использующих иммунную донорскую плазму животных для производства биопрепаратов ветеринарного или медицинского назначения. Кроме того, опубликована избыточная фактология, согласно которой самая современная система формирования инфекционно-безопасной сырьевой заготовки не гарантирует вирусную безопасность биопрепаратов плазмы, изготовленных из вирусбезопасной реакторной закладки. [12. Гармаева Т.Ц., Куликов С.М., Михайлова Е.А., Гемджян Э.Г., Гапонова Т.В., Грумбкова Л.О. и др. Долгосрочные результаты инфицированности вирусами гепатитов В и С больных с заболеваниями системы крови. Терапевтический архив. 2011; 7: 17-26.; 13. Куликов С.М., Гармаева Т.Ц., Зингерман Б.В., Филатов Ф.П., Судариков А.Б., Михайлова Е.А. и др. Вирусная безопасность гемотрансфузий и методы ее оценки. Гематология и трансфузиология. 2008; 4: 3-5.; 14. Farshid М. Viral safety of plasma-derived products. PDA J. Pharm. Sci. Technol. 2011; 65(6): 737-53.] В реалиях и по факту в организационно-методической сфере деятельности возможно достичь одинакового уровня опасности = безопасности, если исходной точкой производства фармацевтических биопрепаратов плазмы является мясокомбинат, позволяющий обеспечивать производство плазмы по месту заготовки боенской крови. Отметим, что только на мясокомбинате возможно исключить боенскую кровь в качестве сырьевого обеспечения по результатам патологоанатомического осмотра. Еще раз подчеркнем, что безопасность сырьевой заготовки плазмы определяется впоследствии по способности биопрепаратов передавать инфекционное начало в составе «безопасных» лекарственных средств. [15. Панов В.П. Принципы обеспечения вирусной безопасности продуктов крови (обзор) // Химико-фармацевтический журнал. - 2004 - Т. 38. - №3. - С. 39-47]

Анализ опубликованных материалов и результатов патентного поиска позволяет заключить, что на современном этапе развития науки и техники объективно гарантировать обобщенную безопасность лекарственных средств не представляется возможным. При этом уровень безопасности медицинских биопрепаратов существенно выше по сравнению с их аналогами ветеринарного назначения. Последнее заключение базируется на стандартах действующих технологий и сопряженных требованиях, предъявляемых к материально-технической базе производства медицинских биопрепаратов плазмы.

Вместе с тем, российский рынок лекарственных средств ветеринарного назначения представлен широким ассортиментом биопрепаратов - производных плазмы крови животных-доноров. Отечественная биоиндустрия выпускает 20 наименований лечебно-профилактических сывороток и 6 наименований направленных иммуноглобулиновых биопрепаратов против инфекционных заболеваний, свойственных крупным сельскохозяйственным и мелким домашним животным. Перечисленные биопрепараты крови изготавливаются на основе донорских кроводач животных-продуцентов, которые содержатся изолированно в условиях, позволяющих контролировать их здоровье с помощью систематических клинических осмотров и поддерживать надлежащие зоогигиенические требования содержания донорского контингента. Иммунологические методы исследования используются в данной технологии только в качестве подхода для определения уровня противовирусных антител, индуцированных вакцинацией животных-продуцентов.

Известные требования, предъявляемые к качеству лечебно-профилактических сывороток направленного действия и их производных гамма-глобулиновых биопрепаратов, оцениваются, прежде всего, по титрам антител к инфекционным агентам (антигенам), использованным для индукции иммунизаторного процесса в организме животных-доноров. Именно титр антител к конкретным инфекционным агентам является основой для обеспечения пассивной иммунопрофилактики или лечебно-профилактических мероприятий. Изложенный технологический подход обеспечивает удаление из состава биопрепарата потенциально возможной контаминирующей микрофлоры. Однако обсуждать объективную безопасность такого качества лекарственных средств на современном этапе развития науки и техники не представляется возможным. Во-первых, иммуносыворотка представляет собой коллоидный раствор множества индивидуально-своеобразных биополимеров, в составе которого присутствуют биологически активные белки, например, групповые вещества крови, обеспечивающие реактогенность конечного товара. Во-вторых, условия заготовки индивидуальных кроводач, изготовление сыворотки из заготовок, ее розлив и укупорка требуют реального воплощения стандарта GMP или его отечественного аналога [8. ГОСТ Р 52249-2009. Правила производства и контроля качества лекарственных средств], который обеспечивает апирогенность лекарственного средства. Однако самая главная проблема сводится к созданию эффективной комбинации скрининговых тестов, позволяющих не использовать потенциально опасное сырье для производства направленных лечебно-профилактических сывороток.

В практике производства медицинских биопрепаратов донорская кровь, иммунная донорская плазма или сыворотка не относятся к лекарственным средствам, но рассматриваются как национальный ресурс, предназначенный для производства фармацевтических биопрепаратов. Изложенное ограничение обусловлено, прежде всего, невозможностью гарантированного обеспечения инфекционной безопасности нативной плазмы за счет использования самых современных клинико-анамнестических и лабораторно-диагностических подходов.

Известны методы обеззараживания плазмы на основе физических методов воздействия. Например, ультрафиолетовое облучение свежезамороженной плазмы, обеспечивающее вироцидный эффект [16. Evaluation of Viral Inactivation Efficacy of a Continuous Flow Ultraviolet-C Reactor (UVivatec) Bae, Jung Eun, Eun Kyo Jeong [et al]. Kor. J. Microbiol. Biotechnol. 2009, Vol. 37, No. 4, p. 377-382]. Отрабатывается инактивация бактериальных и вирусных агентов на основе сверхбыстрой (миллисекунды) низкотемпературной (50-55)°С пастеризации-стерилизации (МСТ-технология) [17. N.N. Nosik, D. Dolgopolov, N.G. Kondrashina. Novel method of virus inactivation in plasma with millisecond technology. International Meeting on Emerging Diseases and Surveillance, 2016].

Недостатком перечисленных методов является использование образцов плазмы крови человека, которая по способу производства должна быть стерильной при относительно низких объемах сырьевой заготовки, несравнимых, например, с 500-1000 л боенской плазмы за рабочую смену мясокомбината.

Используются физико-химические подходы дезактивации инфекционных агентов. Например, обработка метиленовым голубым и облучение видимым светом. Недостатком этого способа является его привязка к стационарным заводским условиям, ориентированным на обеззараживание небольших объемов стерильной донорской плазмы крови, прошедшей контроль на отсутствие инфекционных агентов, вызывающих трудноизлечимые вирусные инфекции человека.

Известны химические методы инактивации инфекционных агентов в образцах донорской плазмы крови человека. Одним из наиболее эффективных методов обеззараживания считается внесение в плазму йодацетальдегида (инактивина) в условия сольвент-детергентного инкубирования обработанной плазмы [18. Guidelines on viral inactivation and removal procedures intended to assure the viral safety of human blood plasma products // WHO Technical Report, Series №924, 2004, p. 151-219; 15. Панов В.П. Принципы обеспечения вирусной безопасности продуктов крови (обзор). // Хим.-фарм. журнал. 2004, т. 38, №3, с. 39-47]. Сама по себе сольвент-детергентная обработка плазмы относится к наиболее популярным методам дезактивации вирусных агентов в составе донорской плазмы человека [19. Peter Hellstern, Bjarte G. Solheim. The Use of Solvent/Detergent Treatment in Pathogen Reduction of Plasma. Transfus Med Hemother, 2011, 38:65-70].

Один из методов противовирусной обработки донорской плазмы крови человека основан на внесении псоралена с последующим облучением ультрафиолетом [20. Wages D., Smith D., Walsh J. et all. Virally inactivated fresh frozen plasma transfusion in normal volunteers // Vox Sang 1998; 74, Suppl 1: p. 1290].

Недостатком известного метода является привязка метода к процессу технологического фракционирования донорской плазмы. Доза-эффект-экспозиция противовирусной обработки является кратковременной стадией, предшествующей этапу промышленного фракционирования реакторной закладки.

Подводя итог перечисленным методам обеззараживания инфекционно безопасной (по результатам клинического и лабораторного контроля) плазмы, отметим главный недостаток известных научно-технических решений. Методы-стадии инактивации инфекционных агентов в составе плазмы предполагают их размещение на территории заводского подразделения, осуществляющего непосредственный процесс фракционирования сырья. Необходимые требования, касающиеся концентрации противовирусного соединения и его экспозиции в составе плазмы, осуществляются за счет кратковременного интервала инкубирования в составе реакторной закладки перед самой первой стадией процесса фракционирования. Именно самая первая стадия фракционирования ориентирована на снижение концентрации собственно дезинфектанта и сопутствующих технологических примесей, обеспечивающих дезинфицирующие условия инкубирования плазмы, загруженной в реактор (реакторной закладки). Необходимо отметить также, что известные методы носят кратковременный характер. Известные научно-технические решения не позволяют обсуждать внесение дезинфектанта в плазму крови с целью обеспечения надлежащего эффекта без негативного влияния бактерицидно-вироцидного соединения на целевые белки, формирующие действующее начало фармацевтических биопрепаратов. Неоднократно отмечается обратный эффект. Известные дезинфектанты обладают белок-денатурирующим действием, которое проявляется в т.ч. впоследствии на стадиях хранения иммуноглобулиновых биопрепаратов [21. Чечеткин А.В., Касьянов А.Д., Солдатенков В.Е., Макеев А.Б. Влияние инактивации патогенов на качество и показатели биологической полноценности компонентов донорской крови // Биомедицинский журнал. Т. 16, СТ. 72. С. 779-790; 22. van Beers М.М., Bardor М. Minimizing immunogenicity of biopharmaceuticals by controlling critical quality attributes of proteins // Biotechnol J. 2012, v. 7(12), p. 1473-1484. doi:10.1002/biot.201200065]. Обобщенным недостатком перечисленных методов дезактивации потенциально возможных инфекционных агентов является отсутствие сведений о бактерицидно-бактериостатических эффектах, сопутствующих целенаправленным противовирусным воздействиям. Существующие методы обеззараживания индивидуальных или пулированных образцов плазмы предполагают их стерильность, которая обеспечивается инженерно-техническим оформлением получения индивидуальных донорских кроводач и изготовлением индивидуальных образцов плазмы крови человека, предназначенных для производства медицинских биопрепаратов.

Немаловажный аспект касается и объемов обеззараживания плазмы (сыворотки) крови. В стандартных схемах действующих технологий на предприятиях медицинской промышленности индивидуальные образцы плазмы представлены небольшими объемами около 100-200 мл, а соответствующие реакторы не превышают объемы 50-200 литров. Таким образом, изложенные ранее методы физической и физико-химической инактивации реакторной закладки технически адаптированы к сравнительно небольшим объемам обеззараживания сырья, например, не более 50 литров, формирующих серию. Подготовленный заявочный материал ориентирован на объемы 500-1000 л производства плазмы в условиях действующего мясокомбината средней мощности. Масштабирования технических средств, предназначенных для обеспечения известных технических решений, основанных на физических или физико-химических методах вироцидно-бактерицидных воздействий, предназначенных для обработки индивидуальных образцов объемом 5 литров боенской плазмы крови или пулированных образцов боенской плазмы крови крупного рогатого скота, в настоящее время нет. Известные технические решения, основанные на использовании физических или физико-химических способов не ориентированы на обеззараживание индивидуальных образцов боенской плазмы объемом 5 литров или их пулированных объемов. Для этого необходимо решить техническую задачу, касающуюся масштабирования необходимого оборудования, ориентированного на облучение, или видимым светом или ультрафиолетом, или гамма-излучением [23. Maclean М., Anderson J.G., MacGregor S.J., White Т., Atreya C.D. A New Proof of Concept in Bacterial Reduction: Antimicrobial Action of Violet-Blue Light (405 nm) in Ex Vivo Stored Plasma // J. Blood Transfus. V. 2016. Article ID 2920514. 11 p.; 6. Зубкова Н.Б. Биотехнологические аспекты эффективной и безопасной переработки донорской плазмы: проблемы и перспективы // Биопрепараты 2014; (1): 4-10]. Однако такого рода подход будет сам по себе неэффективен, поскольку требует организации в условиях мясокомбината заводского подразделения, ориентированного на заготовку боенской плазмы крови с минимальным уровнем микробной контаминации.

Существующие способы хранения и транспортировки плазмы крови человека в условиях низкотемпературной заморозки (-20°С и ниже) позволяют использовать сырье в течение 7 лет. За счет быстрого замораживания плазмы до температуры (-35°С или -40°С) возможно увеличить срок хранения без потери функциональных свойств белков, значимых для фармацевтической биоиндустрии [24. Жибурт Е.Б. «Трансфузиология: учебник». СПб: Питер, 2002, 736 с.]. Показана возможность сравнительно длительного срока хранения иммуносыворток при температуре (-5)°С - (-10)°С без потери активности антител, если ее заморозку осуществлять с использованием жидкого азота (-196)°С [5. Чард Т. «Радиоиммунологические методы». М.: Мир, 1981, с. 48].

Недостатком методов низкотемпературного хранения и транспортировки плазмы (сыворотки) крови является их энергоемкость. При этом низкотемпературный режим хранения и транспортировки плазмы или сыворотки крови должен поддерживаться неукоснительно до этапа промышленного фракционирования сырьевой заготовки [5. Чард Т. «Радиоиммунологические методы». М.: Мир, 1981, с. 48]. Не допускается по техническим причинам оттаивание и замораживание образцов плазмы, поскольку такие нарушения оказывают негативное влияние на конформационную нативность и физиологическую активность целевых белков.

Известны способы инактивации контаминирующей микрофлоры в составе плазмы (сыворотки) крови, заготовленной в ненадлежащих условиях.

Фракционирование этанолом контаминированной микрофлоры плазмы позволяет инактивировать микроорганизмы уже на самых первых стадиях технологического процесса [25. Сборник «Препараты крови. Инструктивно-методические материалы по контролю и производству» под редакцией Буренкова С.П. М.: Изд-во Минздрава СССР, 1976, 384 с.; 26. Русанов В.Н., Скобелев Л.И. «Фракционирование белков плазмы в производстве препаратов крови». - М.: Медицина, 1983, с. 75-111].

Аналогичным бактерицидно-бактериостатическим эффектом обладают риванол, каприловая кислота [27. Zhurina N.A., Shatskaia Т.L., Katushkina N.V. The virological safety and bacterial sterility of a method for fractionating blood plasma proteins with rivanol // Zh. Mikrobiol. Epidemiol. Immunobiol. 1993, 1: p. 45-48,; 28. Bactericidal activity of caprylic acid entrapped in mesoporous silica nanoparticles , Cristina Fuentes, [et al]. Food Control, 2015, Volume 56, p. 77-85], которые используются как реагенты (материалы) в процессе фракционирования плазмы [29. Minipool Caprylic Acid Fractionation of Plasma Using Disposable Equipment: A Practical Method to Enhance Immunoglobulin Supply in Developing Countries. Magdy El-Ekiaby, Mariangela Vargas, Makram Sayed [et al] PLOS Neglected Tropical Diseases, 2015].

Недостатком известных методов является заготовка сырья в неприемлемых условиях, обеспечивающих его контаминирование микрофлорой. Заморозка такого сырья должна осуществляться быстро с целью обеспечения инактивации контаминирующей микрофлоры. Однако бактериально-контаминированная плазма содержит в своем составе пирогены. Удаление пирогенов бактериальной природы требует дополнительных стадий очистки целевых белков [6. Зубкова Н.Б. Биотехнологические аспекты эффективной и безопасной переработки донорской плазмы: проблемы и перспективы // Биопрепараты. - 2014, №1, с. 4-10,; 30. Исрафилов А.Г. и др. Опыт получения апирогенных препаратов // Тезисы докладов IV Российского национального конгресса «Человек и лекарство», Москва 8-12 апреля 1997 г.: сборник «Человек и лекарство». Российский нац. конгр. (4; 1997; Москва). - М.: "ФАРМЕДИНФО", 1997. - с. 54; 31. Патент RU 2192279. Способ получения иммуноглобулинового препарата. Опубл. 10.11.2002 г. Бюл. №31].

Наиболее близким техническим решением, обеспечивающим инактивацию микрофлоры в составе плазмы (сыворотки) крови, является последовательное внесение фенола до его конечной концентрации (0,7±0,2) % и далее сухого порошка сульфата аммония до 50% от насыщения (2,03 М) в фенольно-сульфатной суспензии [32. Патент RU №2338375. Способ хранения плазмы или сыворотки крови для получения иммуноглобулиновых и альбуминовых биопрепаратов. Опубл. 20.11.2008 г. Бюл. №32] (прототип). Изложенный процесс в условиях мясокомбината осуществляется в течение 5 дней. Следовательно, проблема пирогенности сырьевой заготовки не решается с помощью прототипного научно-технического подхода. Кроме того надлежащие бактерицидно-бактериостатические условия реализуются исходно за счет внесения фенола в форме 40% раствора в глицерине. Известно, что такие концентрированные растворы фенола обладают локальным белок-денатурирующим эффектом. Наличие в составе фенолизированной плазмы (сыворотки) крови белков с элементами денатурационных изменений будет сказываться на технологических параметрах выделения и очистки действующего начала. В частности, обсуждаемые изменения касаются гидрофобных белков, к которым, в частности, относится IgG крупного рогатого скота.

Задача изобретения состоит в создании способа инактивации контаминирующей микрофлоры без использования фенола, который в настоящее время относится к экотоксикантам и по классификации вредных веществ [33. ГОСТ 12.1.007-76. Вредные вещества. Классификация и общие требования безопасности] относится к 4 классу опасности (высоко опасное вещество). С этой целью в реакторе объемом 250 литров готовится концентрированный (насыщенный) раствор сульфата аммония (4,05 М), содержащий 0,75% дидецилдиметиламмония хлорида (ЧАС D) (далее - бактерицидно-фракционирующий раствор). В бактерицидно-фракционирующий раствор при постоянном перемешивании загружаются образцы плазмы по мере сепарирования боенской крови. Загрузка образцов плазмы в подготовленный реактор осуществляется для снижения концентрации сульфата аммония до 40% от насыщения (1,62 М). При этом концентрация дезинфектанта уменьшается с 0,75% до 0,3%. После последнего внесения порции плазмы при постоянном перемешивании и концентрациях 40% от насыщения (1,62 М) сульфата аммония и 0,3% дидецилдиметиламмония хлорида сформировавшаяся суспензия дополнительно перемешивается еще (60±10) мин. После чего следует стадия центрифугирования для отделения осадка гамма-глобулинов. В надосадочный раствор вносится порошок сухого сульфата аммония до концентрации 75% от насыщения (3,04 М), а рН инкубационной среды понижают до (4,6±0,1). После отделения центрифугированием осадка альбуминов постальбуминовый центрифугат используют для суспендирования осадка гамма-глобулинов.

Поставленная задача решается за счет использования специально изготовленного раствора, обладающего бактерицидно-бактериостатическим (см. Таблицу 1 Приложения (Иные материалы)) и белок-фракционирующим свойствами. Для инкубирования образцов боенской плазмы (сыворотки) крови исходно используется концентрированный (насыщенный) раствор сульфата аммония (4,05 М) с 0,75% ЧАС D (дидецилдиметиламмония хлорид). Образцы плазмы объемом (5±1) л поступают в исходный (концентрированный) раствор по мере сепарирования крови с интервалом 20-30 минут. Процесс загрузки реактора в условиях мясокомбината продолжается, как правило, (10±5) час. Загрузку реактора прекращают, если концентрация сульфата аммония за счет разбавления индивидуальными образцами плазмы снизилась со 100% (4,05 М) до 40% (1,62 М) от насыщения. Далее следуют стадия отделения центрифугированием осадка гамма-глобулинов, а в альбуминовый центрифугат вносят дополнительно сульфат аммония до конечной концентрации 75% от насыщения (3,04 М) и снижают рН до (4,6±0,1). Сульфатную суспензию альбумин-трансферриновой фракции перемешивают дополнительно (60±10) мин. и затем центрифугированием осаждают агрегированные белки. Надосадочный раствор (постальбуминовый центрифугат) используют для изготовления раствора, предназначенного для суспендирования осадка гамма-глобулинов.

Изложенный способ апробирован в лабораторном варианте для изготовления и хранения гамма-глобулиновых полуфабрикатов плазмы (сыворотки) крови крупного рогатого скота объемом 150 мл и 1000 мл, и в промышленном варианте объемом (150±50) литров плазмы крови крупного рогатого скота.

Из анализа литературных данных следует, что с помощью насыщенных растворов сульфата аммония или его сухого порошка осуществляется фракционирование коллоидных растворов, сложных по составу индивидуальных белков, в лабораторных или промышленных масштабах. Фракционирующий эффект основан на механизмах агрегирования белков под действием сульфата аммония. Сульфат аммония в составе коллоидного раствора обеспечивает разрушение структурированной воды, ориентированной на экранирование гидрофобных и нейтрально заряженных участков на поверхности белковых глобул. В отсутствии гидратной оболочки именно по этим гидрофобно-нейтральным участкам происходит агрегирование индивидуально-своеобразных белков, которые в процессе соосаждения представлены достаточно широким спектром белковых примесей [34. Скоупс Р.К. Методы очистки белков. М.: Мир, 1985, 358 с.]. Из механизма агрегирования белков под действием сульфата аммония следует техника его внесения в коллоидные растворы сложные по составу биомолекул. [35. J.M. Curling. Methods of plasma protein fractionation. Academic press, 1980, 601 p.] В частности, сульфат аммония необходимо вносить по принципу постепенного повышения его концентрации в составе плазмы или сыворотки крови. Для этого используют насыщенный раствор сульфата аммония или его сухой порошок (прототип), которые вводят в инкубационную среду постепенно или струйно-капельным методом или небольшими порциями при постоянном перемешивании (прототип).

В предлагаемом способе реализуется обратный порядок, т.е. к насыщенному раствору (100% от насыщения (4,05 М)) сульфата аммония при рН 7,0 дробно вносится плазма крупного рогатого скота по мере сепарирования боенской крови. В таких условиях обеспечивается максимальное разрушение структурированной воды и, как следствие этого, обеспечивается максимально возможный уровень агрегирования белков по гидрофобно-нейтральным участкам поверхности белковых глобул. Из результатов, приведенных в Таблице 2 Приложения (Иные материалы), следует, что теоретически предполагаемый эффект избыточного осаждения выражен незначительно.

Из анализа техники обеззараживания с помощью известных дезинфектантов следует, что их бактерицидные концентрации невозможно использовать для инактивации микрофлоры, контаминирующей плазму крови [15. Панов В.П. Принципы обеспечения вирусной безопасности продуктов крови (обзор) // Химико-фармацевтический журнал. - 2004 - Т. 38. - №3. - С. 39-47.]. Дезинфектанты обладают выраженным белок-денатурирующим эффектом, который, в частности, выражался в расслоении плазмы и формировании трудно-растворимого или нерастворимого осадка.

В известном способе (прототипе) в качестве дезинфектанта используется фенол (0,7±0,2) % и сульфат аммония 50% от насыщения (2,03 М). Однако фенол представляет собой экотоксикант [36. Food Toxicology - real or imaginary problem? / Eds. G.G. Gibson, R. Walker. - L.: Taylor & Francis, 1985.]. Известна также склонность фенола к интеркаляции, поэтому удаление фенола из состава полупродуктов и готового лекарственного средства представляет определенные трудности научно-методического характера.

В предлагаемом способе вместо фенола используется умеренно токсичное (3 класс опасности) [33. ГОСТ 12.1.007-76. Вредные вещества. Классификация и общие требования безопасности] соединение дидецилдиметиламмония хлорид без указанных выше негативных свойств. В медицинской и гигиенической практике указанный дезинфектант используется для стерилизации медицинских инструментов, других изделий и объектов, требующих периодического обеззараживания.

В известном способе (прототипе) используется концентрация сульфата аммония 50% от насыщения (2,03 М) в составе фенольно-сульфатной суспензии плазмы крови. Однако хранение плазмы крови в форме фенольно-сульфатных суспензий требует поддержания строго определенной температуры, поскольку уровень гидрофобной агрегации белков и их осаждение под действием сульфата аммония зависит от температуры инкубационной среды.

В предлагаемом способе вместо заготовки и хранения плазмы в форме фенольно-сульфатной суспензии используется ее фракционирование под действием сульфата аммония в присутствии дезинфектанта дидецилдиметиламмония хлорида и ресуспендирование гамма-глобулинового осадка постальбуминовым центрифугатом. В Таблице 2 Приложения (Иные материалы) показано, что в зависимости от концентрации сульфата аммония в исходном растворе возможно сформировать фракции гамма-глобулинов с различной полнотой осаждения IgG. Например, при разведении исходного (концентрированного) раствора сульфата аммония (100% от насыщения (4,05 М)) образцами плазмы до концентрации 27% (1,09 М), 33% (1,34 М) и 40% (1,62 М) от насыщения возможно сформировать нехроматографические фракции с наивысшим выходом IgG или альбумина в форме осадков. В предлагаемом способе, ориентированном на максимальное осаждение антител из класса IgG, специфичных к вирусу инфекционного ринотрахеита крупного рогатого, использована конечная концентрация сульфата аммония 40% от насыщения (1,62 М) в плазме крови крупного рогатого скота. Подобранная концентрация обеспечивает практически полное осаждение IgG и антител из класса IgG в составе гамма-глобулиновой фракции и оставляет в надосадке белки для производства альбуминовых биопрепаратов (см. Таблицы 2, 3 и 4 Приложения (Иные материлы)).

В предлагаемом способе изолированные образцы гамма-глобулинов подвергаются суспендированию в постальбуминовом центрифугате - растворе, изготовленном после тотального соосаждения белков из альбуминовой фракцией.

Установлено, что изготовленные таким способом гамма-глобулиновые полуфабрикаты хранятся в течение 180 дней при комнатной (20-25)°С температуре. Остаются без изменений в составе гамма-глобулинового полуфабриката наиболее значимые свойства белков (см. Таблицу 5 Приложения (Иные материалы)). Не изменяется функциональная активность антител из класса IgG к вирусу инфекционного ринотрахеита крупного рогатого скота (см. Таблицу 5 Приложения (Иные материалы)). Полуфабрикаты гамма-глобулина остаются стерильными, естественные протеазы ингибируются под действием сульфата аммония в составе осадка и постальбуминового центрифугата.

На современном этапе развития науки и техники не известно использование сульфатных растворов с добавками четвертичных аммониевых солей и, в частности, дидецилдиметиламмония хлорида для инкубирования индивидуальных и пулированных образцов плазмы или сыворотки по мере сепарирования крови по месту ее заготовки в условиях и помещениях, не отвечающих требованиям стерильности сырья и надлежащей чистоты производственных помещений. За счет высоких концентраций сульфата аммония практически сразу же ингибируется активность протеаз плазмы или сыворотки крови (см. Таблицу 6 Приложения (Иные материалы)). Оптимальная концентрация сульфата аммония в предлагаемом способе составляет 40% от насыщения (1,62 М), что обеспечивает наиболее полное осаждение IgG и противовирусные антитела из класса IgG, а так же ингибирование протеаз. На Фигуре Приложения (Иные материалы) представлен белковый спектр фракций, полученных из плазмы крупного рогатого скота в условиях инкубирования в растворе сульфата аммония с дидецилдиметиламмония хлоридом при исходных концентрациях 100% от насыщения (4,05 М) и 0,75%, соответственно. При этом наличие относительно высокого содержания примесей альбумина в гамма-глобулиновой фракции при конечной концентрации сульфата аммония 40% от насыщения (1,62 М) (4 трек) по сравнению с аналогичными образцами, изготовленными при концентрациях 27% (1,09 М) (6 трек) и 33% (1,34 М) (5 трек) (см. Фигуру Приложения (Иные материалы)). Осаждающая концентрация сульфата аммония 50% от насыщения (2,03 М) также как и 40% от насыщения (1,62 М) вызывает наиболее полное осаждение IgG в составе гамма-глобулиновой фракции (см. Таблицу 2 Приложения (Иные материалы)). Однако примеси альбумина в составе гамма-глобулинов, изготовленных при концентрации 50% от насыщения (2,03 М) сульфата аммония, превышают эффект соосаждения при концентрации осадителя 40% от насыщения (1,62 М) в составе плазмы (сыворотки) крови. В качестве примера приведен белковый спектр фракций альбумина, который позволяет судить о примесях IgG при концентрациях сульфата аммония 27% (1,09 М) (3 трек), 33% (1,34 М) (2 трек) и 40% (1,62 М) (1 трек) от насыщения (см. Фигуру Приложения (Иные материалы)). При этом только при осаждающей концентрации сульфата аммония 40 (1,62 М) и 50% (2,03 М) от насыщения в осадках альбумина не регистрируется наличие антител из класса IgG, специфичных к вирусу инфекционного ринотрахеита крупного рогатого скота (Таблица 7 Приложения (Иные материалы)).

Пример реализации предлагаемого способа Стадия 1. Подготовка бактерицидно-фракционирующего раствора. Раствор представляет собой смесь сульфата аммония (далее - СА) и дидецилдиметиламмония хлорида (далее - ЧАС D) в конечных концентрациях 4,05 М (100% от насыщения) и 0,75%, соответственно.

Для приготовления в лабораторном варианте в мерную колбу объемом 500 мл набирают 300 мл дистиллированной воды с температурой 25-30°С, добавляют при перемешивании 3,75 мл ЧАС D. Если исходно ЧАС D представляет водный или спиртовой раствор, необходимо пересчитать добавляемый объем относительно действующего вещества ЧАС D. Перемешивают 5 минут. Затем взвешивают 266,5 г сухого порошка СА и при перемешивании добавляют в раствор ЧАС D. Далее уровень в мерной колбе доводят дистиллированной водой до 500 мл и продолжают перемешивание до полного растворения сульфата аммония. При уменьшении уровня раствора, его доводят до 500 мл дистиллированной водой. Дополнительно перемешивают 30 минут.

В промышленном варианте в градуированную емкость заливают 50 л дистиллированной воды с температурой 25-30°С. В емкость добавляют при перемешивании якорной мешалкой на скорости 60-70 об/мин 0,75 л дидецилдиметиламмония хлорида. После добавления ЧАС D взвешивают 53,3 кг сульфат аммония и при перемешивании вышеуказанным способом добавляют порционно навеску сульфата аммония. Далее доводят уровень дистиллированной водой до 100 л и продолжают перемешивание до полного растворения сульфата аммония. При уменьшении уровня раствора, его доводят до 100 л дистиллированной водой.

Стадия 2. Доведение рН бактерицидно-фракционирующего раствора до нейтральных значений. В химический стакан объемом 25 мл отбирают 1 мл раствора и разводят 19 мл дистиллированной воды. Измеряют значения рН разведенного раствора на иономере типа Professional Meter РР-20, Sartorius. Затем титруют раствор 1М NaHCO₃ до рН 7,0-7,5. Объем 1М NaHCO₃, пошедший на титрование, умножают на соотношение исходного объема и объема, взятого на титрование. Полученный объем 1М NaHCO₃ при перемешивании вышеуказанным способом добавляют в исходный бактерицидно-фракционирующий раствор. Перемешивают 10 минут и контролируют рН вышеуказанным способом.

Стадия 3. Добавление плазмы в бактерицидно-фракционирующий раствор. Плазму или сыворотку крови крупного рогатого скота добавляют в раствор порциями или одновременно (струйно) при перемешивании на магнитной мешалке, не допуская вспенивания суспензии. Количество порционных добавлений и продолжительность добавления не ограничены. В обоих случаях плазму (сыворотку) добавляют в соотношении раствор-плазма 1:1,5 (по объемам).

В лабораторном варианте апробированы объемы бактерицидно-фракционирующего раствора от 100 до 666 мл и от 150 до 1000 мл плазмы (сыворотки). Пример лабораторного варианта добавления плазмы. В химический стакан объемом не менее 0,5 литра заливают 100 мл бактерицидно-фракционирующего раствора и добавляют вышеуказанными способами 150 мл плазмы (сыворотки) крови. После окончания добавления плазмы (сыворотки) крови перемешивание продолжают 1 час при температуре 18-25°С. Исходные концентрации веществ разводятся плазмой (сывороткой) крови до конечных: 40% от насыщения (1,62 М) по СА и 0,3% по ЧАС D.

В промышленном варианте в реактор емкостью 250 л заливают 100 л бактерицидно-фракционирующего раствора. Затем в раствор при перемешивании якорной мешалкой на скорости 60-70 об/мин вносят вышеописанным способом 150 л плазмы (сыворотки) крови. После окончания добавления перемешивают дополнительно 1 час.

Стадия 4. Осаждение гамма-глобулиновой фракции. Образовавшуюся суспензию центрифугируют на центрифугах типа РС-6 при напряженности гравитационного поля 4200 g в течение 30 минут. В промышленном варианте используют проточные центрифуги типа ОТР-1 при скорости потока 60 л/ч и напряженности гравитационного поля 10000-15000 g. Осадок представляет собой гамма-глобулиновую фракцию. В нее переходят 50-80% от общего белка плазмы.

Стадия 5. Осаждение альбуминовой фракции. В образовавшийся надосадок добавляют при перемешивании сухой порошок сульфата аммония из расчета 241 г на 1 литр надосадка, получая, таким образом, конечную концентрацию сульфата аммония 75% от насыщения (3,04 М). Затем доводят рН до (4,6±1) 1 М раствором соляной кислоты и проверяют значение вышеуказанными способами. После доведения рН суспензию перемешивают 1 час.

Суспензию центрифугируют в лабораторных условиях на центрифугах типа РС-6 при напряженности гравитационного поля 4200 g в течение 30 минут. В промышленном варианте используют проточные центрифуги типа ОТР-1 при скорости потока 60 л/ч и напряженности гравитационного поля 10000-15000 g. В результате оставшиеся белки переходят в осадок.

Стадия 6. Ресуспендирование осадка гамма-глобулинов. Оставшийся после осаждения альбуминовой фракции надосадок (постальбуминовый центрифугат) используют для ресуспендирования гамма-глобулинового осадка. Для этого к осадку гамма-глобулинов приливают постальбуминовый центрифугат в соотношении: 2 литра надосадка к 1 кг сырого осадка. Далее перемешивают 30 минут вышеописанным способом, не допуская вспенивания, для образования гомогенной суспензии. Конечные концентрации сульфата аммония в гамма-глобулиновой суспензии составляют не менее 60% от насыщения (2,43 М), а ЧАС D - не менее 0,27%.

Информация, использованная при подготовке заявки на патент

1. WHO Recommendation for the production, control and regulation of human plasma for fractionation [Electronic resource]. Fifty-sixth Report. 2007. Available from: http://www.who.int/biologicals/expert_committee/Full%20Text%20TRS941.pdf

2. Guidance on plasma-derived medicinal products. European Medicines Agency. EMA/CHMP/BWP/706271/2010. [Electronic resource]. Available from: http://www.ema.europa.eu/docs/en_GB/document_library/Scientific_guideline/2011/07/WC500109627.pdf

3. Directive 2002/98/EC of the European Parliament and of the Council of 27.01.2003 setting standards of quality and safety for the collection, testing, processing, storage and distribution of human blood and blood components and amending. [Electronic resource]. Available from: https://ec.europa.eu/health//sites/health/files/files/eudralex/vol-1/dir_2002_98/dir_2002_98_en.pdf

4. ГОСТ P 53420-2009. Кровь донорская и ее компоненты. Общие требования к обеспечению качества при заготовке, переработке, хранении и использовании донорской крови и ее компонентов

5. Чард Т. «Радиоиммунологические методы». М.: Мир, 1981, с. 48

6. Зубкова Н.В Биотехнологические аспекты эффективной и безопасной переработки донорской плазмы: проблемы и перспективы // Биопрепараты. - 2014. - №1. - С. 4-10.

7. Burnouf Т. Modern plasma fractionation. Transfus. Med. Rev. 2007; 21(2): 101-17.

8. ГОСТ Р 52249-2009. Правила производства и контроля качества лекарственных средств.

9. Приказ Минздрава РФ от 7 мая 2003 г., №193 «О внедрении в практику работы службы крови в Российской Федерации метода карантинизации свежезамороженной плазмы»

10. Guide to the preparation, use and quality assurance of blood components. Recommendation №R (95)15/9th edition. - Council of Europe. - 2003.

11. Сюрин B.H., Самуйленко А.Я., Соловьев Б.В., Фомина Н.В. «Вирусные болезни животных». - Москва, ВНИТИБП, 2001. 928 с., ил.

12. Гармаева Т.Ц., Куликов С.М., Михайлова Е.А., Гемджян Э.Г., Гапонова Т.В., Грумбкова Л.О. и др. Долгосрочные результаты инфицированности вирусами гепатитов В и С больных с заболеваниями системы крови. Терапевтический архив. 2011; 7: 17-26.

13. Куликов С.М., Гармаева Т.Ц., Зингерман Б.В., Филатов Ф.П., Судариков А.Б., Михайлова Е.А. и др. Вирусная безопасность гемотрансфузий и методы ее оценки. Гематология и трансфузиология. 2008; 4: 3-5.

14. Farshid М. Viral safety of plasma-derived products. PDA J. Pharm. Sci. Technol. 2011; 65(6): 737-53.

15. Панов В.П. Принципы обеспечения вирусной безопасности продуктов крови (обзор) // Химико-фармацевтический журнал. - 2004 - Т.38. - №3. - С. 39-47

16. Evaluation of Viral Inactivation Efficacy of a Continuous Flow Ultraviolet-C Reactor (UVivatec) Bae, Jung Eun, Eun Kyo Jeong [et al]. Kor. J. Microbiol. Biotechnol. 2009, Vol. 37, No. 4, p. 377-382.

17. N.N. Nosik, D. Dolgopolov, N.G. Kondrashina. Novel method of virus inactivation in plasma with millisecond technology. International Meeting on Emerging Diseases and Surveillance, 2016.

18. Guidelines on viral inactivation and removal procedures intended to assure the viral safety of human blood plasma products // WHO Technical Report, Series №924, 2004, p. 151-219.

19. Peter Hellstern, Bjarte G. Solheim. The Use of Solvent/Detergent Treatment in Pathogen Reduction of Plasma. Transfus Med Hemother, 2011, 38:65-70.

20. Wages D., Smith D., Walsh J. et all. Virally inactivated fresh frozen plasma transfusion in normal volunteers // Vox Sang 1998; 74, Suppl 1: p. 1290.

21. Нечеткий A.B., Касьянов А.Д., Солдатенков B.E., Макеев А.Б. Влияние инактивации патогенов на качество и показатели биологической полноценности компонентов донорской крови // Биомедицинский журнал. Т. 16, СТ. 72. С. 779-790.

22. van Beers M.M., Bardor M. Minimizing immunogenicity of biopharmaceuticals by controlling critical quality attributes of proteins // Biotechnol J. 2012, v. 7(12), p. 1473-1484.

23. Maclean M., Anderson J.G., MacGregor S.J., White Т., Atreya C.D. A New Proof of Concept in Bacterial Reduction: Antimicrobial Action of Violet-Blue Light (405 nm) in Ex Vivo Stored Plasma // J. Blood Transfus. V. 2016. Article ID 2920514. 11 p.

24. Жибурт E.Б. «Трансфузиология: учебник». СПб: Питер, 2002, 736 с.

25. Сборник «Препараты крови. Инструктивно-методические материалы по контролю и производству» под редакцией Буренкова С.П. М.: Изд-во Минздрава СССР, 1976, 384 с.

26. Русанов В.Н., Скобелев Л.И. «Фракционирование белков плазмы в производстве препаратов крови». - М.: Медицина, 1983, с. 75-111.

27. Zhurina N.A., Shatskaia Т.L., Katushkina N.V. The virological safety and bacterial sterility of a method for fractionating blood plasma proteins with rivanol // Zh. Mikrobiol. Epidemiol. Immunobiol. 1993, 1: p. 45-48.

28. Bactericidal activity of caprylic acid entrapped in mesoporous silica nanoparticles MariaRuiz-Rico, Cristina Fuentes, EdgarPerez-Esteve [et al]. Food Control, 2015, Volume 56, p. 77-85.

29. Minipool Caprylic Acid Fractionation of Plasma Using Disposable Equipment: A Practical Method to Enhance Immunoglobulin Supply in Developing Countries. Magdy El-Ekiaby, Mariangela Vargas, Makram Sayed [et al] PLOS Neglected Tropical Diseases, 2015.

30. Исрафилов А.Г. и др. Опыт получения апирогенных препаратов // Тезисы докладов IV Российского национального конгресса «Человек и лекарство», Москва 8-12 апреля 1997 г.: сборник «Человек и лекарство». Российский нац. конгр. (4; 1997; Москва). - М.: "ФАРМЕДИНФО", 1997. - с. 54.

31. Патент RU 2192279. Способ получения иммуноглобулинового препарата. Опубл. 10.11.2002 г. Бюл. №31

32. Патент RU №2338375. Способ хранения плазмы или сыворотки крови для получения иммуноглобулиновьгх и альбуминовых биопрепаратов. Опубл. 20.11.2008 г. Бюл. №32.

33. ГОСТ 12.1.007-76. Вредные вещества. Классификация и общие требования безопасности.

34. Скоупс Р.K. Методы очистки белков. М.: Мир, 1985, 358 с.

35. J.M. Curling. Methods of plasma protein fractionation. Academic press, 1980, 601 p.

36. Food Toxicology - real or imaginary problem? / Eds. G.G. Gibson, R. Walker. - L.: Taylor & Francis, 1984,404 p.

ПРИЛОЖЕНИЕ

Таблица 1. Влияние растворов фенола, дидецилдиметиламмония хлорида и сульфата аммония на уровень инактивации контаминирующей микрофлоры, свойственной образцам плазме крови крупного рогатого скота, произведенной в условиях мясокомбинатов

Примечание: ЧАС D - дидецилдиметиламмония хлорид; СА - сульфат аммония; КОЕ - колониеобразующие единицы. К (контроль) - количество колониеобразующих единиц, зафиксированное на поверхности мясопептонного агара при культивировании микроорганизмов без внесения исследуемых дезинфектантов и сульфата аммония; О (опыт) - количество колониеобразующих единиц, зафиксированное на поверхности мясопептонного агара при культивировании микроорганизмов в присутсвии исследуемых дезинфектантов и сульфата аммония; - среднеарифметическое значение КОЕ; σ - стандартное отклонение; Р - уровень значимости различий; n=5. Уровень бактериальной контаминации определяли по методу, рекомендованному Государственной фармакопеей, изд. XII, ч. 1 ОФС 42-0067-07.

Для стандартизации приготовления культуры бактерий использовали плазму, заготовленную в условиях мясокомбината, которую термостатировали 3 суток при 37°С. Инкубированную плазму сеяли на поверхность мясопептонного агара и теромостатировали 2 суток. Колонии смывали с поверхности стерильной водой, измеряли оптическую плотность бактериальной взвеси на спектрофотометре СФ-46 при длине волны 540 нм и кварцевой кювете толщиной 1 см. Параллельно взвесь сеяли с разведением 10⁷ на поверхность мясопептонного агара для определения КОЕ в объеме взвеси согласно методу, описанному выше. Сопоставляя величины оптической плотности бактериальной взвеси и КОЕ в ней, получали величину КОЕ на 1 единицу оптической плотности. Полученную величину использовали для стандартизованного приготовления контрольной культуры бактерий с известным количеством КОЕ.

Таблица 2. Распределение белка по фракциям в зависимости от конечной концентрации сульфата аммония.

Примечание: - среднеарифметическое значение; σ - стандартное отклонение; Р - уровень значимости различий; n=5; К (контроль) - добавление насыщенного раствора сульфата аммония в плазму до достижения требуемой конечной концентрации; О (опыт) -разбавление насыщенного раствора сульфата аммония плазмой до требуемых конечных концентраций согласно предлагаемому способу.

Таблица 3. Определение полноты осаждения IgG и уровня инактивации контаминирующей микрофлоры гамма-глобулиновой фракции при разведении образцами плазмы насыщенного раствора сульфата аммонии с 0,75% дидецилдиметиламмония хлорида до 40% от насыщения и дидецилдиметиламмония хлорида до 0,3%

Примечание: - среднеарифметическое значение; σ - стандартное отклонение.

Уровень микробной контаминации определялся методом посева 0,1 мл образцов на поверхность мясо-пептонного агара с последующим инкубированием в течение 2 суток.

¹ - Распределение белка определено на основании общего количества белка по фракциям, определенного биуретовым методом в соответствии с Методическими указаниями МУК 4.1/4.2.588-96 "Методы контроля медицинских иммунобиологических препаратов, вводимых людям", с. 46.

² - Уровень бактериальной обсемененности определен по методу, рекомендованному Государственной фармакопеей, изд. XII, ч. 1 ОФС 42-0067-07.

³ - Содержание целевых белков определялось с помощью денситометрии электрофореграммы образцов полуфабрикатов (концентрация ПААГ 3-25%, количество наносимого белка - 40 мкг/трек, электрофорез по Дэвису-Лэмли, нативные образцы в диссоциирующих условиях) в соответствии с Методическими указаниями МУК 4.1/4.2.588-96 "Методы контроля медицинских иммунобиологических препаратов, вводимых людям", с. 2.

Таблица 4. Апробация оптимальной концентрации сульфата аммония 40% от насыщения и дидецилдиметиламмония хлорида 0,3% в отношении полноты осаждения антител из класса IgG, специфичных к вирусу инфекционного ринотрахеита крупного рогатого скота

Примечание: - среднеарифметическое значение; σ - стандартное отклонение; Р - уровень значимости различий; (n=5); ОП 450 нм - оптическая плотность субстратной смеси; К (контроль) - фракции, полученные предлагаемым способом без использования дидецилдиметиламмония хлорида; О (опыт) - фракции, полученные предлагаемым способом с использованием использования дидецилдиметиламмония хлорида.

Фракции представлены соответствующими сульфатными суспензиями. Суспензии центрифугировали 4200 g 20 минут. Сульфатные осадки растворяли до концентрации белка 40 мг/мл. Активность антител определяли тест-системой «ИРТ-СЕРОТЕСТ» (ООО «Ветбиохим») согласно прилагающейся инструкции. ОП образцов альбуминовых фракций соответствует по величине ОП образцом отрицательного контроля тест-системы.

Таблица 5. Сравнительная характеристика полуфабриката гамма-глобулинов, прошедшего хранение в течение 180 дней при температуре (20±5)°С

Примечание: - среднеарифметическое значение; σ - стандартное отклонение; Р - уровень значимости различий; (n=5); Контроль - полуфабрикат гамма-глобулинов без внесения дидецилдиметиламмония хлорида в условиях хранения при температуре (20±5)°С; Опыт - полуфабрикат гамма-глобулинов, полученный предложенным способом в условиях хранения при температуре (20±5)°С; КОЕ - количество колониеобразующих единиц, посчитанных на поверхности мясо-пептонного агара после термостатирования в течение 48 часов.

Фракции представлены соответствующими сульфатными суспензиями. Суспензии центрифугировали 4200 g 20 минут. Сульфатные осадки растворяли до концентрации белка 40 мг/мл. Активность антител определяли тест-системой «ИРТ-СЕРОТЕСТ» (ООО «Ветбиохим») согласно прилагающейся инструкции.

Таблица 6. Влияние использованных концентраций сульфата аммония и дидецилдиметиламмония хлорида на протеолитическую

активность трипсина в процессе изготовления полуфабрикатов.

Примечание: СА - сульфат аммония; - среднеарифметическое значение; σ - стандартное отклонение; Р - уровень значимости различий; n=5; ОП₄₀₅ - оптическая плотность при длине волны 405 нм; ОП₄₀₅(Ф+СА+Б4) - оптическая плотность реакционной среды в присутствии фермента, сульфата аммония и дидецилдиметиламмония хлорида; ОП₄₀₅(Ф) - оптическая плотность реакционной среды в оптимальных условиях. Эксперимент проводился согласно методике, изложенной в «Практическая энзимология» / X. Биссвангер; пер. с англ. - М.: Бином. Лаборатория знаний, 2010. - c. 163.

Таблица 7. Определение активности специфических антител против вируса инфекционного ринотрахеита крупного рогатого скота во фракциях, полученных из плазмы крови крупного рогатого скота

Примечание: активность специфических антител определяли с помощью тест-системы «ИРТ-СЕРОТЕСТ» (ООО «Ветбиохим») согласно прилагающейся инструкции.

1. Способ получения гамма-глобулинового полуфабриката из боенской крови крупного рогатого скота с помощью химических реагентов, отличающийся тем, что в качестве сырья используется боенская кровь по месту ее заготовки и сепарирования в условиях мясокомбината, а образцы плазмы по мере их изготовления помещаются в насыщенный 100% от насыщения или 4,05 М раствор сульфата аммония с 0,75% дидецилдиметиламмония хлорида, в соотношении раствор : плазма 1:1,5 по объему, до концентрации 40% от насыщения сульфата аммония и 0,3% дидецилдиметиламмония хлорида, образовавшуюся суспензию центрифугируют с получением осадка гамма-глобулиновой фракции, в образовавшийся надосадок добавляют при перемешивании сухой порошок сульфата аммония, получая конечную концентрацию сульфата аммония 75% от насыщения, и доводят рН до 4,6, суспензию перемешивают и центрифугируют, осаждая альбуминовую фракцию, оставшийся после осаждения альбуминовой фракции надосадок используют для ресуспендирования гамма-глобулинового осадка, конечные концентрации сульфата аммония в гамма-глобулиновой суспензии составляют не менее 60% от насыщения и не менее 0,27% дидецилдиметиламмония хлорида.

2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что в качестве дезинфектанта используется дидецилдиметиламмония хлорид, не обладающий свойствами экотоксиканта и разрешенный к применению для дезинфекции медицинских инструментов, рабочих поверхностей и производственных помещений.

3. Способ по п. 1, отличающийся тем, что осаждение IgG из состава пулированных образцов плазмы осуществляется в процессе их инкубирования за счет разведения индивидуальными образцами плазмы насыщенного раствора 100% от насыщения или 4,05 М сульфата аммония до концентрации 40% от насыщения или 1,62 М.