Способ преимплантационной генетической диагностики анемии фанкони

Изобретение относится к области медицины. Предложен способ преимплантационной генетической диагностики анемии Фанкони у эмбриона, предусматривающий определение мутаций с.731Т>А (p.L244X), c.1844dupC и делеции 1-3 экзонов гена FANCA путем проведения прямой и косвенной диагностики. Прямая диагностика подразумевает определение точечной мутации с.731Т>А (p.L244X) и мутации c.1844dupC методом ПЦР-ПДРФ, а косвенная диагностика для делеции 1-3 экзонов гена FANCA предусматривает проведение полугнездовой ПЦР для анализа наследования молекулярно-генетических маркеров, сцепленных с мутацией. При выявлении мутаций с.731Т>А (p.L244X), c.1844dupC или делеции 1-3 экзонов гена FANCA диагностируют анемию Фанкони у эмбриона. Изобретение обеспечивает эффективную преимплантационную генетическую диагностику анемии Фанкони, предусматривающую определение мутаций с.731Т>А (p.L244X), c.1844dupC и делеции 1-3 экзонов гена FANCA путем проведения прямой и косвенной диагностики. 2 пр.

 

В настоящее время в мире насчитывается более 350 миллионов людей, страдающих редким заболеванием (по данным RARE Project). Общее количество таких заболеваний по подсчетам European Organization for Rare Diseases (EURORDIS) варьируется от 5 до 7 тысяч. При этом около 80% редких заболеваний имеют генетическую причину. Генетическая основа заболевания позволяет с высокой точностью предсказать не только здоровье уже родившегося ребенка, но и оценить риск рождения такого ребенка при анализе генотипов родителей, а также провести генетическую диагностику на самых ранних этапах. Преимплантационная генетическая диагностика (ПГД) моногенного заболевания становится мощным инструментом для профилактики таких заболеваний.

- аутосомно-рецессивное заболевание с вариабельной пенетрантностью и генетической гетерогенностью. Гетерозиготное носительство встречается с частотой 1:300. Это заболевание приводит геномной нестабильности: при кариотипировании лимфоцитов и фибробластов больных анемией Фанкони обнаруживают в большом проценте случаев хромосомные аномалии.

У 60-75% больных также встречаются врожденные дефекты, такие как низкорослость, ненормальная пигментация, маленькая голова, аномалии скелета (отсутствие или укорочение большого пальца рук, недоразвитие лучевой кости, врожденный вывих бедра, шейное ребро, косолапость). Кроме этого, определяется ряд неврологических расстройств (косоглазие, недоразвитие одного или обоих глаз, опущение века, глазное дрожание, глухота, умственная отсталость), поражения половых органов (недоразвитие половых органов, отсутствие одного или обоих яичек, гипоспадия), почечные аномалии (недоразвитие почек, удвоение лоханки или мочеточника, подковообразная почка, множественные кисты в тканях почек), врожденные пороки сердца. Средняя продолжительность жизни у больных анемией Фанкони составляет около 30 лет.

В настоящее время известно более 15 генов, связанных с Анемией Фанкони. Один из них - FANCB- находится на Х-хромосоме. Остальные гены расположены на аутосомах. Белки, синтезируемые с этих генов, формируют сложный белковый комплекс, который участвует в процессах репарации повреждений ДНК. Таким образом, нарушение структуры одного белка приводит к поломке всего комплекса и снижает возможности клеток репарировать ДНК, что приводит к высокой степени геномной нестабильности. Клетки от двух больных, выращенные в клеточной культуре в лабораторных условиях, могут дополнять друг друга и функционировать нормально, если они несут нарушения в разных генах. При наличии мутаций в одном и том же гене этого не происходит, и клетки не дополняют друг друга. По этому принципу выделяют группы комплиментации: FANCB (мутация в гене FANCB, который находится на хромосоме Хр22), FANCC (мутация в гене FANCC, который находится на хромосоме 9q22), FANCD1 (мутация в гене BRCA2, который находится на хромосоме 13q12), FANCD2 (мутация в гене FANCD2, который находится на хромосоме 3р25), FANCE (мутация в гене FANCE, который находится на хромосоме 6р21), FANCF (мутация в гене FANCF, который находится на хромосоме 11p15), FANCG (мутация в гене XRCC9 (FANCG), который находится на хромосоме 9р13), FANCI (мутация в гене FANCI, который находится на хромосоме 15q26), FANCJ (мутация в гене BRIP1, который находится на хромосоме 17q22), FANCL (мутация в гене PHF9, который находится на хромосоме 2р16), FANCN (мутация в гене PALB2, который находится на хромосоме 16р12), FANCO (мутация в гене RAD51C, который находится на хромосоме 17q22), FAN CP (мутация в гене SLX4, который находится на хромосоме 16р13), FANCQ (мутация в гене ERCC4, который находится на хромосоме 16р13), FANCR (мутация в гене RAD51, который находится на хромосоме 15ql 5), FANCT (мутация в гене UBE2T, который находится на хромосоме 1q31), FANCU (мутация в гене XRCC2, который находится на хромосоме 7q36), FANCV (мутация в гене MAD2L2, который находится на хромосоме 1р36).

Мутации в гене FANCA самые распространенные и встречаются в 60-70% случаев Анемии Фанкони. Их разнообразие очень высоко относительно небольшого числа пациентов. Известно более 100 мутаций, из которых около трети приходится на точковые, еще треть представляют микроделеции, и около 40% представлены крупными делециями. Описаны также и малые дупликации. По действию мутации в гене FANCA могут быть гипоморфными - т.е. приводить к частичной потере функции белка, они характеризуются более мягкими клиническими проявлениями, однако большая часть мутаций вызывает полную потерю функции. Ряд мутаций в гене FANCA имеет повышенную частоту распространения. Так, микроделеция в 38-м экзоне c.3788_3790delTCT - самая распространенная мутация при Анемии Фанкони в мире (20,7% всех аллелей с мутацией). В случае мутации в гене FANCA у Анемии Фанкони аутосомно-рецессивный тип наследования. Гетерозиготное носительство разных мутаций в одном гене у будущих родителей приводит к возникновению 25% вероятности рождения ребенка с данным заболеванием.

Мутации в гене PALB2 относятся к редким случаям при Анемии Фанкони. Тем не менее в этом гене обнаружено более 14 патогенных вариантов, приводящих к этому заболеванию. Белок гена PALB2 относится к другой группе белков. Он является одним из основных компонентов системы гомологичной рекомбинации, которая используется клеткой как для восстановления серьезных повреждение ДНК (например, двуцепочечных разрывов), так и для стабилизации и перезапуска поврежденных вилок репликации. Гетерозиготное состояние по мутации в этом гене ассоциированно с повышенной вероятность развития рака груди и яичником. В случае мутации в гене PALB2 у Анемии Фанкони аутосомно-рецессивный тип наследования. Гетерозиготное носительство разных мутаций в одном гене у будущих родителей приводит к возникновению 25% вероятности рождения ребенка с данным заболеванием. Именно поэтому важно разрабатывать тест-систему, позволяющую детектировать в условиях ПГД несколько мутаций и маркеры косвенной диагностики.

ПГД Анемии Фанкони проводится для семей, имеющих подтвержденную молекулярно-генетическую природу заболевания. ПГД Анемии Фанкони рекомендуется семьям с высоким риском рождения ребенка с тяжелым (неизлечимым) наследственным заболеванием с установленной мутацией, обуславливающей этот риск. ПГД позволяет выбрать из всех эмбрионов, полученных при ЭКО, такие, которые не несут мутацию, являющуюся причиной заболевания.

Основной проблемой при генетической диагностике эмбрионов является малое исходное количество биоматериала, так как биоптат содержит от одной до трех клеток. В этом случае для повышения эффективности и точности анализа важно как полностью исключить возможность контаминации, так и нивелировать возможный эффект неравномерной и/или неполной амплификации, а также деградации материала. Это требует разработки тест-системы с особыми характеристиками. При этом тест-система разрабатывается с учетом возможности использовать биоматериал разного типа -тотальную ДНК, выделенную из разных тканей, продукт полногеномной амплификации (Whole Genome Amplification, WGA), а также единичные клетки. Сочетание универсальности по отношению к биоматериалу с поэтапной амплификацией целевых фрагментов позволяет проводить анализ нескольких мутаций для одного образца, в том числе на единичных клетках, а также выявить ситуацию неполной амплификации или деградации образца.

Наиболее близким техническим решением является проведение ПГД Анемии Фанкони методом ПЦР-ПДРФ. Для мутации IVS4+4A→Т (аденин-тимин) в гене FANCC была показана тест-система, основанная на амплификации участка с мутацией на биоматериале биопсии эмбрионов на 5-ый день развития в условиях полугнездовой ПЦР. Аллель дикого типа и мутантный различали с помощью рестрикции полученных фрагментов и дальнейшего анализа с помощью гель электрофореза (Verlinsky Y. et al. Preimplantation diagnosis for Fanconi anemia combined with HLA matching). Однако в условиях ПГД прямая детекция без анализа наследования полиморфных маркеров обладает сниженной достоверностью из-за повышенной вероятности контаминации и деградации образца, а также из-за малого количества биоматериала, доступного для анализа.

Задачей являлась разработка более точного способа преимплантационной генетической диагностики моногенного заболевания анемия Фанкони без использования дорогостоящих приборов и реагентов, который можно было бы использовать на биоматериале различного типа: ДНК, выделенную из разных тканей, продукт полногеномной амплификации (WGA), единичные клетки. Сочетание универсальности по отношению к биоматериалу с поэтапной амплификацией целевых фрагментов позволяет достичь высокой достоверности результата и выявить ситуацию неполной амплификации или деградации образца.

Техническим результатом стало создание способа преимплантационной генетической диагностики анемия Фанкони, предусматривающего определение мутаций с.731Т>А (p.L244X), c.1844dupC, делеции 1-3 экзонов гена FANCA путем проведения прямой и косвенной диагностики. Такая система необходима при работе с малым количеством биоматериала, так как нестабильная амплификация может привести к потере информации или сниженной точности анализа. Прямая диагностика подразумевает анализ непосредственно наличия-отсутствия мутации. В данном случае для мутации типа - однонуклеотидный полиморфизм (ОНП, англ. Single nucleotide polymorphism SNP) (c.731T>A) были подобраны эндонуклеазы рестрикции, которые позволяют произвести детекцию мутации, основанную на разнице последовательности в сайте рестрикции у разливающихся аллелей; для мутации типа делеции (c.509_510delGA) и дупликации (c.1844dupC) были подобраны праймеры, которые позволяют произвести детекцию мутации по разнице длин фрагментов. Для протяженной делеции 1-3 экзонов в рамках ПГД оказалась возможна только косвенная диагностика из-за ограничения длины фрагментов, нарабатываемых при полногеномной амплификации. Косвенная диагностика заключается в анализе наследования молекулярно-генетических маркеров, сцепленных с мутацией. Для этого на расстоянии не более 1 Mb (что соответствует 1% кроссинговера в среднем) от гена FANCA были выбраны полиморфные локусы, называемые STR (short tandem repeat - короткий тандемный повтор), с гетерозиготностью не менее 0,75. Для каждого из этих локусов были подобраны праймеры для амплификации по типу полугнездовой ПЦР, позволяющей повысить точность и эффективность анализа. В тест-систему были включены 8 STR локусов для гена FANCA: D16S2621, D16S3023, D16S3026, D16S3048, D16S3121, D16S3123, D16S413, D16S539. Праймеры для амплификации №1 находятся на 16 хромосоме в районе координат 87304670-90149077 (в соответствии с hg19). Важно отметить, что при подборе праймеров соблюдали ряд особенных требований: длина продукта с внешними праймерами не должна превышать 500 п.н. (для наработки с фрагментов, получаемых при полногеномной амплификации), длина продукта с внутренних праймеров от 120 до 300 п.н., высокая специфичность внешних праймеров, температура отжига не отличается более, чем на 0,5°С.

Отработка тест-системы для ПГД

На этапе отработки тест-системы проводится подбор условий амплификации, оптимальных для работы праймеров, анализ эффективности и специфичности ПЦР-амплификации в обоих раундах, универсальность тест-системы для биообразцов различного типа. При отработке тест-системы были приготовлены стоковые разведения праймеров с концентрацией 100 mM, и рабочие разведения комбинаций праймеров (комбинация пар праймеров для 1 и 2 раунда полугнездовой ПЦР) с концентрацией 10 mM каждого праймера в растворе. Так как в рамках диагностики клинического материала могут быть использованы различные типы матриц, при отработке тест-системы были использованы две биопсии единичных клеток, находящихся в специальном лизирующем буфере (1×PCR Buffer, 0,1% Tween-20, 0,1% Triton X-100, 1 мкг Proteinase K), два или три образца продуктов полногеномной амплификации биопсиий эмбриона (WGA), а также тотальной ДНК членов семьи, выделенной из крови, для составления родословной.

В рамках полугнездовой ПЦР (seminested-PCR) амплификация проводится в два этапа. На первом этапе проводится мультиплексная ПЦР со всеми внешними праймерами для всех локусов, входящих в тест-систему, для обогащения образца всеми целевыми фрагментами. Во втором этапе проводится индивидуальная амплификация каждого фрагмента с внутренними праймерами.

Полугнездовая ПЦР

Для первого этапа были подобраны внешние высокоспецифичные праймеры для амплификации фрагментов от 300 до 500 п.н. Для второго этапа были подобраны праймеры для амплификации фрагментов длиной не более 350 пар оснований, а также были введены метки для детекции методом фрагментного анализа на приборе ABI3130XL. ПЦР-смесь для первого раунда амплификации содержала 1xPCR Buffer with Mg2+(Евроген, Россия), 0.1 mM каждого деоксинуклеотида, 0.15 μМ каждого праймера, 2,5 U/μl of HsTaq DNA-polymerase (Евроген, Россия), 6% of DMSO and 1 мкл тотальной ДНК или 2,5 мкл WGA или 5 мкл лизирующего буфера с образцом в качестве матрицы. Первый этап амплификации проводился по следующему протоколу: этап денатурации 94°С в течение 2 минут, 30 циклов с понижением температуры отжига праймеров с 62 до 45°С в каждом, этап достройки всех матриц 72°С 10 минут. Далее продукты 1-ого этапа были разнесены в индивидуальные пробирки с одной парой праймеров на определенный локус.

В состав ПЦР смеси для второго этапа входили 1xPCR буфер с Mg2+ (Евроген, Россия), 0.5xRediLoad™ загрузочный буфер (Thermo Fisher Scientific, USA), 0.2 mM каждого деоксинуклеотида, 0.2 μМ каждого праймера, 1U/μ1 ДНК полимеразы HsTaq (Евроген, Россия), 6% диметилсульфоксида (DMSO) и 1 μl ПЦР-продукта первого этапа амплификации в качестве матрицы. Второй этап амплификации проводился по следующему протоколу: этап денатурации 95°С в течение 2 минут, 35 циклов: денатурация 95°С 30 секунд, отжиг праймеров - 57°С 30 секунд, синтез матрицы - 72°С 1 минута, этап достройки всех матриц 72°С 5 минут. Оценку эффективности и специфичности амплификации проводили с помощью электрофореза в 2% агарозном геле. Результат электрофореза в агарозном геле позволяет определить степень разведения продуктов амплификации для нанесения на фрагментный анализ (продукты амплификации с ДНК членов семьи).

Фрагментный анализ продуктов амплификации проводили с помощью капиллярного электрофореза на приборе 3130xl Genetic Analyzer (Applied Biosystems, USA). По результатам фрагментного анализа составляется родословная и отмечаются информативные маркеры для каждой семьи, которые в дальнейшем будут использованы в клинической диагностике. Детекция мутаций типа делеции (c.509_510delGA) и дупликации (с.1844dupC) также проводилась с помощью фрагментного анализа продуктов амплификации, полученных с праймеров: c.1844dupC - Fout 5'-AATCACTGGTGGTATTTTGTGGT-3', Rout 5'-GCTCACTCGGGTGGTGTAG-3', Fin 5'-AGCCATAGCTGACTTAATTGTATTG-3', Rin 5'-CACAAGTCCCAGAGTGGACA-3'; c.509_510delGA - Fout 5'-GTGACCCTAGTGGTGAGCAAA-3', Rout 5'-ACACCTTTTTCTGGTTGGGCA-3', Fin 5'-GAGAGACTGTGTCTTTGGCACT-3', Rin 5'-semi-3'.

Полимеразная цепная реакция - полиморфизм длин рестрикционных фрагментов (ПЦР-ПДРФ).

Полиморфизм длин рестрикционных фрагментов (Restriction fragment length polymorphism, RFLP) - это способ исследования геномной ДНК, путем специфичного расщипления ДНК с помощью эндонуклеаз рестрикции и дальнейшего анализа размеров образующихся фрагментов (рестриктов) путем гель-электрофореза (ДНК электрофореза).

При использовании данного метода наблюдаются фрагменты различной длины в зависимости от различий в последовательности нуклеотидов в сайте рестрикции, что позволяет идентифицировать некоторые различия в последовательности нуклеотидов ДНК, в случае, когда они располагаются в сайте рестрикции. В виду того, что технологии секвенирования ДНК могут охарактеризовать ДНК очень точно, ПДРФ был разработан как первый и дешевый метод для массового применения.

Для детекции точечной мутации была разработана тест-система на основе ПЦР-ПДРФ. Стадия амплификации подробно описана в предыдущем разделе. Были использованы следующие праймеры: с.731Т>А - Fout 5'-GGCTCCTTCCGCTAAACT-3', Rout 5'-GGGTTTGGTGAACGCTAGT-3', Fin 5'-semi-3', Rin 5'-cagattttgncaaatgtttgtct-3'. Далее продукты амплификации с внутренних праймеров для детекции мутации использовали в реакции рестрикции. Эндонуклеаза BfaI (FspBI) разрезает только аллель дикого типа, эндонуклеаза SmoI (SmlI) разрезает только мутантный аллель. Детекция проводилась с помощью электрофореза в 12% полиакриламидном геле.

Пример 1.

Пациенты А

В ЦГРМ Генетико обратилась семья А, в которой родился ребенок с подозрением на анемию Фанкони с гетерозиготным носительством мутации c.1844dupC в гене FANCA и мутации c.509-510delGA в гене PALB2. Была разработана тест-система для детекции обеих мутаций (для мутации c.509-510delGA - только прямая диагностика), однако в ходе разработки родословной оказалось, что здоровый брат больного ребенка является так же гетерозиготным носителем мутации в гене PALB2, поэтому ПГД было рекомендовано проводить только для мутации c.1844dupC. Паре было рекомендовано проведение ПГД моногенного заболевания Анемия Фанкони в рамках ЭКО для отбора эмбрионов, не унаследовавших заболевание.

Разработка родословной

На первом этапе был получен биоматериал (периферическая кровь) супругов и их больного и здорового ребенка для детекции мутации и выявления групп сцепления полиморфных маркеров. Было проанализировано 18 STR локусов. Из них 6 оказались информативными по матери и/или отцу. Таким образом, образцы эмбрионов тестировались только на информативные маркеры. Полученные результаты по информативным маркерам: партнер пациентки - D16S539 - 165/157, D16S413 - 133/135, D16S2621 - 236/252, D16S3023 - 92/87, D16S3026 - 208/210, D16S3121 - 76/76, c.1844dupC - N/N, пациент - D16S539 - 148/157, D16S413 - 137/129, D16S2621 - 248/236, D16S3023 - 92/98, D16S3026 - 206/210, D16S3121 - 71/74, c.1844dupC - N/c.1844_1845insC, здоровый ребенок - D16S539 - 157/148, D16S413 - 135/137, D16S2621 - 252/248, D16S3023 - 87/92, D16S3026 - 210/206, D16S3121 -, c.1844dupC - N/N, ребенок с заболеванием - D16S539 - 165/157, D16S413 - 133/129, D16S2621 - 236/236, D16S3023 - 92/98, D16S3026 - 208/210, D16S3121 - 76/74, c.1844dupC - N/c.1844_1845insC.

ПГД

В цикле ЭКО было получено 13 эмбрионов, проведена биопсия на 5 день развития (в клинике ЭКО), биоптат в буфере для WGA (1xPBS (Invitrogen, США), 1% поливинилпирролидона (PVP) (Fertipro, Бельгия)) направлен в лабораторию Генетико. Для контроля контаминации на разных этапах работы с образцом в лаборатории разработана система контролей: контроль контаминации буфера для биопсии, контроль контаминации при транспортировке (одна пробирка с буфером не открывается эмбриологом), контроль контаминации каждого образца (проба среды из последней отмывочной капли биопсиийного материала). Все эти контроли вместе с образцами проходят этап полногеномной амплификации, после которого будет заметно малейшее количество ДНК, контаминировавшей контроли. Полногеномную амлификацию проводили с помощью коммерческого набора SurePlex (Illumina, США).

Продукт полногеномной амплификации, а также ДНК всех членов семьи амплифицировали в 1 этапе в мультиплексной ПЦР с праймерами для детекции мутации и праймерами для информативных для семьи А полиморфных маркеров в соответствии с разработанным протоколом для тест-системы. 2 этап проводили для каждого маркера отдельно в соответствии с разработанным протоколом для тест-системы. Таким образом были выявлены группы сцепления, унаследованные эмбрионами, а также проведена прямая детекция мутации. Полученные результаты: T1 - D16S539 - 165/157, D16S413 - FA, D16S2621 - 236, D16S3023 - FA, D16S3026 - 208/210, D16S3121 - 76/ADO, c.1844dupC - N/c.1844_1845insC, Т2 - D16S539 - 157, D16S413 - 135/129, D16S2621 - 252/236, D16S3023 - ADO/92, D16S3026 - 210/206, D16S3121 - 76/ADO, c.1844dupC - N, Т3 - D16S539 - ADO/157+148, D16S413 - 133/137+129, D16S2621 - 236/248, D16S3023 - 92/98, D16S3026 - ADO/210+206, D16S3121 - 76/71+74, c.1844dupC - ADO/c.1844_1845insC, T4 - не прошла амплификация, диагностика по предоставленному образцу невозможна Т5 - D16S539 - 165/148, D16S413 - 133/137, D16S2621 - 236/248, D16S3023 - 87/92, D16S3026 - 200/206, D16S3121 - 76/71, c.1844dupC - N, Т6 - D16S539 - 157/148, D16S413 - FA, D16S2621 - 252/248, D16S3023 - FA, D16S3026 - 210/206, D16S3121 - 76/71, c.1844dupC - N, Т7 - D16S539 - 165/157, D16S413 - 133/129, D16S2621 - 236, D16S3023 - 92/98, D16S3026 - 208/ADO, D16S3121 - 76/ADO, c.1844dupC - N/c.1844_1845insC, Т8 - D16S539 - 157/148, D16S413 - 135/137, D16S2621 - 252/248, D16S3023 - FA, D16S3026 - 210/206, D16S3121 - 76/71, c.1844dupC - N, Т9 - не прошла амплификация, диагностика по предоставленному образцу невозможна Т10 - D16S539 - 165/157, D16S413 - FA, D16S2621 - 236, D16S3023 - FA, D16S3026 - 208/210, D16S3121 - 76/ADO, c.1844dupC - N/c.1844_1845insC, T11 - D16S539 - 157, D16S413 - 135/129, D16S2621 - 252/236, D16S3023 - ADO/92, D16S3026 - 210/206, D16S3121 - 76/ADO, c.1844dupC - N, T12 - D16S539 - ADO/157+148, D16S413 - 133/137+129, D16S2621 - 236/248, D16S3023 - 92/98, D16S3026 - ADO/210+206, D16S3121 - 76/71+74, c.1844dupC - ADO/c.1844_1845insC, T13 - D16S539 - 157+148, D16S413 - 137, D16S2621 - 236+248, D16S3023 - 92+98, D16S3026 - 210+206, D16S3121 - 71+74, c.1844dupC-N.

По результатам прямой и косвенной диагностики у 5 эмбрионов выявлен нормальный генотип, у 6 эмбрионов выявлен гаплотип, соответствующий заболеванию. По результатам всех проведенных анализов 5 эмбрионов были рекомендованы к переносу.

Пример 2.

В ЦГРМ Генетико обратилась семья Б, в которой супруги являются носителями разных мутаций в гене FANCA: у супруга была обнаружена делеция экзонов 1-3, а у супруги - точечная мутация с.731Т>А. В таком случае риск для потомства составляет 25% (вероятность рождения ребенка с данным заболеванием). Им было рекомендовано проведение ПГД моногенного заболевания в рамках ЭКО для отбора эмбрионов, не унаследовавших заболевание. Однако протяженные делеции без точной информации о границах делеции не могут быть детектированы в рамках ПГД из-за малого количества доступного биоматериала с одной стороны, и ограничения по длине нарабатываемых при WGA фрагментов - с другой. Поэтому ПГД проводилась для мутации с.731Т>А прямым и косвенным методом, а для делеции 1-3 экзонов - только косвенным.

Разработка родословной

На первом этапе был получен биоматериал (периферическая кровь) супругов и здорового ребенка носителя мутации с.731Т>А и больного ребенка носителя обеих мутаций для детекции мутации и выявления групп сцепления полиморфных маркеров. Было проанализировано 18 STR локусов. Из них 10 оказались информативными по матери и/или отцу. Таким образом, образцы эмбрионов тестировались только на информативные маркеры. Полученные результаты по информативным маркерам: партнер пациентки - D16S 3048 - 263/253, D16S 3123 - 126/128, D16S 413 - 128/126, D16S 2621 - 236/248, D16S 3023 - 100/96, D16S 88.6 - 240/234, D16S 3026 - 210/210, D16S 89.5 - 256/258, FANCA - ex1-3 DEL /N, rs1800337 - a/g, D16S 90.1 - 300/310, пациентка - D16S 3048 - 253/255, D16S 3123 - 136/132, D16S 413 - 126/130, D16S 2621 - 260/236, D16S 3023 - 89/91, D16S 88.6 - 234/234, D16S 3026 - 212/210, D16S 89.5 - 262/256, FANCA - N/ c.731T>A, rs1800337 - g/g, D16S 90.1 - 281/300, ребенок с заболеванием - D16S 3048 - 263/255, D16S 3123 - 136/128, D16S 413 - 128/130, D16S 2621 - 236/236, D16S 3023 - 100/91, D16S 88.6 - 240/234, D16S 3026 - 210/210, D16S 89.5 - 256/256, FANCA - ex1-3 DEL /c.731T>A, rs1800337 - a/g, D16S 90.1 - 300/300, здоровый ребенок - D16S 3048 - 253/255, D16S 3123 - 132/128, D16S 413 -126/130, D16S 2621 - 248/236, D16S 3023 - 96/91, D16S 88.6 - 234/234, D16S 3026 - 210/210, D16S 89.5 - 258/256, FANCA - W c.731T>A, rs1800337 - g/g, D16S 90.1 - 310/300.

В цикле ЭКО было получено 4 эмбриона, проведена биопсия на 5 день развития (в клинике ЭКО), биоптат в буфере для WGA (1xPBS (Invitrogen, США), 1% поливинилпирролидона (PVP) (Fertipro, Бельгия)) направлен в лабораторию Генетико. Для контроля контаминации на разных этапах работы с образцом в лаборатории разработана система контролей: контроль контаминации буфера для биопсии, контроль контаминации при транспортировке (одна пробирка с буфером не открывается эмбриологом), контроль контаминации каждого образца (проба среды из последней отмывочной капли биопсиийного материала). Все эти контроли вместе с образцами проходят этап полногеномной амплификации, после которого будет заметно малейшее количество ДНК, контаминировавшей контроли. Полногеномную амлификацию проводили с помощью коммерческого набора SurePlex (Illumina, США).

Продукт полногеномной амплификации, а также ДНК всех членов семьи амплифицировали в 1 этапе в мультиплексной ПЦР с праймерами для детекции мутации и праймерами для информативных для семьи Б полиморфных маркеров в соответствии с разработанным протоколом для тест-системы. 2 этап проводили для каждого маркера отдельно в соответствии с разработанным протоколом для тест-системы. Таким образом были выявлены группы сцепления, унаследованные эмбрионами, а также проведена прямая детекция мутации. Полученные результаты: T1 - D16S 3048 - 253, D16S 3123 - FA, D16S 413 - 126, D16S 2621 - 248/260, D16S 3023 - ADO/89, D16S 88.6 - 234, D16S 3026 - 210/212, D16S 89.5 - 258/262, FANCA - N, rs1800337 - g, D16S 90.1 - 310/281, Т2 - D16S 3048 - 253/255, D16S 3123 - 128/132, D16S 413 - 126/ADO, D16S 2621 - 248/236, D16S 3023 - 96/91, D16S 88.6 - 234, D16S 3026 - 210, D16S 89.5 - 258/256, FANCA - N/ c.731T>A, rs1800337 - g, D16S 90.1 - 310/300, T3 - D16S 3048 - 253/ADO, D16S 3123 - FA, D16S 413 - ADO/130, D16S 2621 - 248/236, D16S 3023 - ADO/91, D16S 88.6 - 234, D16S 3026 - 210, D16S 89.5 - 258/256, FANCA - N/ c.731T>A, rs1800337 - g, D16S 90.1 - 310/300, T4 - D16S 3048 - 263/255, D16S 3123 - FA, D16S 413 - 128/130, D16S 2621 - 236, D16S 3023 - ADO/91, D16S 88.6 - 240/234, D16S 3026 - 210, D16S 89.5 - 256, FANCA - ex1-3 DEL /c.731T>A, rs1800337 - a/g, D16S 90.1 - 300.

По результатам прямой и косвенной диагностики у 1 эмбриона выявлен нормальный генотип; у 2 эмбрионов выявлено гетерозиготное состояние по одной из мутаций; у 1 эмбриона выявлен гаплотип, соответствующий заболеванию. С согласия родителей для эмбрионов, не унаследовавших заболевание, провели преимплантационный генетический скрининг хромосомных аномалий. По результатам всех проведенных анализов 3 эмбриона были рекомендованы к переносу (для одного эмбриона-носителя мутации с.731Т>А ПГС не проводился).

Общество с ограниченной ответственностью «Центр Генетики и Репродуктивной Медицины «ГЕНЕТИКО»

Способ преимплантационной генетической диагностики анемии Фанкони

Локусы в районе гена FANCA

Перечень последовательностей праймеров для амплификации № 1.

D16S2621:

SEQ ID NO 1 5'-AGTGGAGGCTTCTGTTCTGT-3' (Fout),

SEQ ID NO 2 5'-CGCTTCCTCTCCTTCCCTTG-3' (Rout),

SEQ ID NO 3 5'-GTCATATGGGCCAATTCCC-3' (Fin),

SEQ ID NO 4 5'-ACCGCAGTAGTGAGACTGTG-3' (Rin);

D16S3023:

SEQ ID NO 5 5'-CCTGTTTTCCGAAAGTCGCC-3' (Fout),

SEQ ID NO 6 5'-ATCGGTTTCCAACCTGCGAT-3' (Rout),

SEQ ID NO 7 5'-CTGCATTTCTCATCACAGTG-3' (Fin),

SEQ ID NO 8 5'-GAGCGCCTATGTTCGG-3' (Rin);

D16S3026:

SEQ ID NO 9 5'-TCCACAAGACCCCAACCAG-3' (Fout),

SEQ ID NO 10 5'-CAGTGTCCATGACGCCGAT-3' (Rout),

SEQ ID NO 11 5'-CTCCCTGAGCAACAAACACC-3' (Fin),

SEQ ID NO 12 5'-GGTCATTTATATGCGCCTGA-3' (Rin);

D16S3048:

SEQ ID NO 13 5'-ATCACTGGAAGTCAAGGCCG-3' (Fout),

SEQ ID NO 14 5'-TGTCTGTCGGCTCAGCTTTT-3' (Rout),

SEQ ID NO 15 5'-AGCAAGCCGTGACTGGGT-3' (Fin),

SEQ ID NO 16 5'-CATGAGTAGTGTCCTGGGGG-3' (Rin);

D16S3121:

SEQ ID NO 17 5'-CAGCCACACACACCATCAAC-3' (Fout),

SEQ ID NO 18 5'-TGGGTCCTGAGGTCACAAAC-3' (Rout),

SEQ ID NO 19 5'-CATGTTGTACATCGTGATGC-3' (Fin),

SEQ ID NO 20 5'-AGCTTTTATTTTCCAGGGGT-3' (Rin);

D16S3123:

SEQ ID NO 21 5'-CCGGGAACGACATTGTCTGA-3' (Fout),

SEQ ID NO 22 5'-GTGGAGCCTGTAGTGAGCTG-3' (Rout),

SEQ ID NO 23 5'-GCCTGGGCAATAGAACAAGACTCTG-3' (Fin),

SEQ ID NO 24 5'-TTTAAGCAGAACAGCAACGCAATC-3' (Rin);

D16S413:

SEQ ID NO 25 5'-TGGTGGTGCATGCCTGTAG-3' (Fout),

SEQ ID NO 26 5'-CCTATTCTGGGCCTTGGAGC-3' (Rout),

SEQ ID NO 27 5'-ACTCCAGCCCGAGTAA-3' (Fin),

SEQ ID NO 28 5'-GGTCACAGGTGGGTTC-3' (Rin);

D16S539:

SEQ ID NO 29 5'-CAAGTGCCAGATGCTCGTTG-3' (Fout),

SEQ ID NO 30 5'-AGCGAAAGTGATGCCATAGAC-3' (Rout),

SEQ ID NO 31 5'-GATCCCAAGCTCTTCCTCTT-3' (Fin),

SEQ ID NO 32 5'-ACGTTTGTGTGTGCATCTGT-3' (Rin).

Способ преимплантационной генетической диагностики анемии Фанкони у эмбриона, предусматривающий определение мутаций с.731Т>А (p.L244X), c.1844dupC, делеции 1-3 экзонов гена FANCA путем проведения прямой и косвенной диагностики, при этом прямая диагностика подразумевает проведение ПЦР-ПДРФ для определения точечной мутации с.731Т>А (p.L244X) праймерами: Fout 5'-GGCTCCTTCCGCTAAACT-3', Rout 5'-GGGTTTGGTGAACGCTAGT-3', Fin 5'-semi-3', Rin 5'-cagattttcaaatgtttgtct-3', мутации c.1844dupC с помощью праймеров Fout 5'-AATCACTGGTGGTATTTTGTGGT-3', Rout 5'-GCTCACTCGGGTGGTGTAG-3', Fin 5'-AGCCATAGCTGACTTAATTGTATTG-3', Rin 5'-CACAAGTCCCAGAGTGGACA-3', а косвенная диагностика для делеции 1-3 экзонов гена FANCA предусматривает применение праймеров SEQ ID NO 1-32 по типу полугнездовой ПЦР для анализа наследования молекулярно-генетических маркеров, сцепленных с мутацией, и при выявлении мутаций с.731Т>А (p.L244X), c.1844dupC или делеции 1-3 экзонов гена FANCA диагностируют анемию Фанкони у эмбриона.