Средство, обладающее иммуномодулирующей активностью

Изобретение относится к медицине, а именно к фармакологии, и касается применения растительных водорастворимых полисахаридов с молекулярной массой 1070±50 и 17±2 кДа, выделенных посредством заявленного способа из надземной части люцерны посевной (Medicago sativa L.), в качестве иммуномодулирующего средства для активации антигенпрезентирующих клеток и избирательной стимуляции продукции интерлейкина-12, фактора некроза опухоли-альфа макрофагами и интерферона-гамма лимфоцитами. Изобретение позволяет расширить арсенал малотоксичных иммуномодулирующих средств для профилактики и лечения нарушений патологических состояний иммунной системы при терапии хронических воспалительных заболеваний, в том числе, в педиатрии и геронтологии, а также у людей со сниженной реактивностью иммунной системы, характеризующихся высокой биологической совместимостью и биоразлагаемостью. 8 табл., 3 пр.

 

Изобретение относится к медицине, конкретно к фармакологии, и может быть использовано для профилактики и лечения нарушений патологических состояний иммунной системы, связанных с недостаточностью Th1-зависимого типа иммунного ответа (хронические, вялотекущие и рецидивирующие инфекционные, а также онкологические заболевания).

Известно, что баланс специфических про- или противоспалительных цитокинов играет ключевую роль в регуляции иммунных реакций при воспалении и влияет на созревание и дифференцировку лимфоцитов, формирование иммунной толерантности и памяти, регуляцию гомеостаза. Интерлейкин-12 (ИЛ), секретируемый антигенпрезентирующими клетками, является важнейшим координатором врожденного и адаптивного иммунитета, а совместно с цитокинами родственного семейства - ИЛ-23 и ИЛ-27, способствует экспансии и пролиферации Т-клеток и развитию Th1 типа иммунного ответа [1]. С другой стороны, противовоспалительный цитокин ИЛ-10, также продуцируемый макрофагами при вирусных, бактериальных и протозойных инфекциях, подавляет активность натуральных киллеров и клеток моноцитарно-макрофагальной природы, необходимых для развития реакции подавления патогена и может рассматриваться как антагонист цитокинов Th1 типа (ИФН-γ, ИЛ-1β, ФНО-α и ИЛ-6, ИЛ-12) [2]. В литературе показано, что подавление или нейтрализация продукции ИЛ-10 приводит к повышению уровня ФНО-α и ИЛ-6, а его повышение снижает уровень провоспалительных цитокинов [3].

Таким образом, создание иммуномодулирующих препаратов для выработки эффективной, сбалансированной иммунной реакции на основе веществ, способных контролировать и регулировать секрецию провоспалительных цитокинов ИЛ-12, ФНО-α и иммунодепрессивного ИЛ-10 макрофагами, является крайне актуальным для терапии хронических, вялотекущих и рецидивирующих инфекционных, а также онкологических заболеваний [4]. Иммуномодуляторы же растительного происхождения проявляют минимальное количество побочных эффектов и противопоказаний, что позволяет применять их в педиатрии и гериатрии, а также длительными курсами при хронических воспалительных заболеваниях [5]. Кроме того, доказано, что растительные полисахариды могут оказывать влияние на поляризацию лимфоцитов через соответствующую активацию антигенпрезентирующих клеток, а также связываться с их рецепторами, способствуя развитию как Th1, так и Th2-зависимого иммунного ответа [6, 7, 8, 9].

В качестве иммуномодулирующего средства для коррекции патологических состояний, связанных с недостаточностью Th1-зависимого типа иммунного ответа, мы предлагаем использовать водорастворимые полисахариды (ПС) с молекулярной массой 1070±50, 17±2 кДа, полученные из надземной части люцерны посевной (Medicago sativa L.), обладающие способностью избирательной стимуляции продукции ИЛ-12, TNF-α и IFN-γ.

Люцерна посевная ( sativa L.) - травянистое растение семейства Бобовые (Fabaceae), широко распространена в природе и культивируется, как ценное кормовое растение и фитосанитар для оздоровления почвы [10, 11]. Растение не входит в Государственную Фармакопею РФ и не используется в официальной медицине. Однако фитотерапевты считают его источником витаминов, минеральных элементов и в народной медицине трава люцерны применяется для лечения язвы желудка, ревматизма, цистита, различных повреждений кожи - травм и ожогов, диабета, профилактики атеросклероза, в качестве успокаивающего средства, при воспалении суставов [12, 13].

На основе травы и сока люцерны посевной разработан ряд биологически активных добавок, содержащих флавоноиды и изофлавоны - Кардиин, Эрамин, Эраконд, Артриосин, Alfalfa-Santegra [14]. Известно, что экстракт травы люцерны посевной повышает эффективность терапии при сочетанном использовании в традиционной терапии экссудативного и вульгарного псориаза, а также проявляет гипогликемические свойства в комплексной терапии сахарного диабета 2-го типа [15, 16, 17]. Трава люцерны входит в состав растительного сбора для нормализации уровня холестерина, профилактики и лечения атеросклероза [18], а также лекарственного средства "Фитобальзам - фабацерон" для иммунокоррекции с седативным действием [19]. Препарат Эраконд, представляющий собой экстракт люцерны и содержащий аминосахара, аминокислоты, уроновые кислоты, углеводы, органические кислоты, флавоноиды и микроэлементы, обладающий иммуномодулирующей, противовоспалительной, анаболизирующей и антиоксидантной активностью, относится к малотоксичным веществам [20].

Известны способы получения экстрактов люцерны, обладающих иммуномодулирующими свойствами, экстракцией сырья водным раствором микроэлементов и содержащие макро- и микроэлементы, аминокислоты, белок, липиды, аминосахара, органические кислоты, углеводы и витамины в определенных соотношениях [21, 22].

Задачей данного изобретения является расширение арсенала иммуномодулирующих средств растительного происхождения, повышение их эффективности путем избирательной стимуляции продукции макрофагами интерлейкина-12, фактора некроза опухоли-альфа и лимфоцитами интерферона-гамма.

Принципиально новым в предлагаемом изобретении является применение в качестве иммуномодулирующего средства комплекса водорастворимых ПС с молекулярными массами 1070±50, 17±2 кДа и их относительным содержанием в образце 91,8±4,3% и 7,9±0,4%, соответственно, выделенных из надземной части люцерны посевной. Новое свойство водорастворимых ПС, полученных из надземной части люцерны посевной, было обнаружено в результате экспериментальных исследований и для специалиста явным образом не вытекает из уровня техники, а описание этих свойств не обнаружено авторами в патентной и научно-медицинской литературе. Таким образом, предлагаемое техническое решение соответствует критериям изобретения, а именно -«новизна», «изобретательский уровень» и «промышленная применимость».

Изобретение будет понятно из следующего описания.

Пример 1.

Надземную часть люцерны посевной заготавливали в местах естественного произрастания в фазу цветения. Стандартизацию сырья проводили по общетехническим характеристикам: зольность и содержание экстрактивных веществ.

Водорастворимые полисахариды (ПС) выделяли из надземной части люцерны посевной по следующей методике: 20,0 г надземной части люцерны посевной, высушенной до воздушно-сухого состояния, обрабатывали последовательно кипящими хлороформом и спиртом этиловым в аппарате Сокслета в течение 3 часов для удаления пигментов и ингибирования ферментов. Перед экстракцией обработанное сырье высушивали в течение 2 часов в сушильном шкафу при температуре 45-50°С. Исчерпывающую экстракцию проводили очищенной водой, подщелоченной раствором натрия гидроксида (рН 9), при соотношении сырье : экстрагент - 1:20 при нагревании на кипящей водяной бане в течение 2 ч при периодическом перемешивании. Далее экстрагент сменялся новым объемом, процесс экстракции повторяли. Полученные фильтраты объединяли и упаривали на роторном испарителе при температуре не более 40°С до 1/5 от исходного объема. Для осаждения полисахаридов добавляли 96% этанол в соотношении 1:4 (по объему) и отстаивали 12 часов при температуре 2-4°С, затем осадок центрифугировали (10 мин, 4400 об/мин) и растворяли в 100 мл очищенной воды при перемешивании на магнитной мешалке в течение 2 ч при комнатной температуре. Не растворившийся остаток, отделяли центрифугированием (30 мин, 4000 об/мин). Для удаления низкомолекулярных веществ и примесей белка раствор ПС подвергали ультрафильтрации на кассетах VivaFlow 200, MWCO 10 000, давление на выходе 3 атм., после чего раствор замораживали и лиофильно высушивали. Полученные образцы были стандартизованы по содержанию углеводов, белка и нуклеиновых кислот (Таблица 1).

Изучение компонентного состава ПС надземной части люцерны посевной проводили на газовом хроматографе Agilent 7890А (США): колонка 1 MS 30 м, внутренний диаметр капилляра 0,25 мм, скорость потока газа-носителя (Не) 1 мл/мин, в градиенте температур: 70°С - 2 минуты, далее со скоростью 10°С в минуту (до 300°С), температура инжектора 280°С, детектирование вели на масс-спектрометре Agilent 5975S (США) ионизация электронным ударом, сканирование m/z 33-600, температура ионного источника 120°С. Хроматограмма силилированного образца гидролизата полисахаридов, полученных из надземной части травы люцерны посевной, показала, что полисахаридный комплекс относится к арабинанам и состоит из арабинозы - 45,02,9%, галактуроновой кислоты -30,8±1,5%, глюкозы - 12,7±0,8%, галактозы - 6,5±0,2%, фруктозы - 3,2±0,2%, ксилозы - 1,8±0,1%.

Молекулярно-массовое распределение образцов оценивали на жидкостном хроматографе Ultimate 3000 (Германия, «Dionex»): колонке TSK GMPWXL, 300×78 мм, 13 мкм, подвижная фаза - вода, скорость потока 1 мл/мин, детектирование рефрактометрическое, температура ячейки детектора 40°С, используя калибровочную прямую, построенную по растворам декстранов молекулярной массой 1000, 17000, 40000, 250000, 500000, 1200000 Да. На хроматограмме исследуемого образца, полученного из надземной части люцерны посевной, выявлено 2 пика, соответствующих молекулярным массам 1070±50 и 17±2 (Таблица 2).

Пример 2.

Биологическую активность оценивали в экспериментах на линейных мышах C57BL/6 8-10 недельного возраста. Животные были получены из отдела экспериментальных биологических моделей НИИФиРМ им. Е.Д. Гольдберга Томский НИМЦ. Все манипуляции с животными были проведены в соответствии с ГОСТ 33215-2014 «Правила оборудования помещений и организация процедур при работе с лабораторными животными» и ГОСТ 33216-2014 «Правила работы с лабораторными грызунами и кроликами».

Макрофаги (МФ) выделяли из суспензии клеток перитонеальной полости мышей. Для чего после забоя животных дислокацией шейного отдела позвоночника брюшную полость промывали ледяным изотоническим раствором хлорида натрия (ФР), суспензию клеток центрифугировали, удаляли надосадок, осадок ресуспендировали в культуральной среде и оценивали их жизнеспособность в тесте с 0,1% трипановым синим. Затем клетки помещали в пластиковые чашки Петри 1,5-2,0×10⁶/мл, культивировали 2 ч при 37°С (в атмосфере 5% СО₂ и абсолютной влажности) в среде следующего состава: RPMI 1640 («Sigma»), 10% ЭТС («Hyclone»), 20 мМ HEPES («Sigma»), 0,05 мМ 2-меркаптоэтанола («Sigma»), 50 мкг/мл гентамицина («Sigma»), 2 мМ L-глютамина («Sigma»). После чего удаляли неприлипшую фракцию клеток, для работы использовали адгезивную фракцию - МФ (не менее 95% жизнеспособных клеток), которые переносили в плоскодонные 96-луночные планшеты и культивировали (3×10⁶ клеток/мл) в указанных выше условиях в присутствии полисахарида (20 мкг/мл); 1 мкг/мл липополисахарида ЛПС (серотип O111:В4, «Sigma»); 10 мкг/мл мурамилдипептида (МДП) (N-ацетилмурамил-L-аланил-D-изоглютамин, «Calbiochem»). Через 24 ч от начала культивирования собирали из лунок надосадок и замеряли в нем концентрацию цитокинов.

Количество цитокинов, вырабатываемых мононуклеарами периферической крови человека при активации ПС люцерны посевной, определяли в супернатантах клеток, полученных из цельной крови здоровых доноров с добавлением гепарина (50 ЕД/мл), которую осторожно наслаивали на жидкость для сепарации клеток «Histopaque-1077» («Sigma-Aldrich») с плотностью 1,077 помещали и 15 минут центрифугировали при 400 g и температуре 4°С. Затем сформировавшееся кольцо клеток собирали, трижды отмывали холодным ФР, ресуспендировали в культуральной среде и проводили фракционирование клеточной взвеси адгезией (см. получение макрофагов) для получения моноцитов -прилипающая - и лимфоцитов – не прилипающая фракция. Далее, моноциты (1×10⁶ клеток/мл) или лимфоциты (2,5-3,0×10⁶ клеток/мл) инкубировали 24 ч в 96-луночных планшетах вместе с изучаемыми растительными полисахаридами (20 мкг/мл), ЛПС (1 мкг/мл), после чего собирали бесклеточный супернатант. Количество цитокинов определяли твердофазным иммуноферментным методом при помощи тест-систем согласно прилагаемым протоколам: ИФН-γ, ИЛ-10 и ИЛ-12 («R@D Systems», США); ФНО-α - («Вектор-Бэст»),

Полученные в ходе исследования данные обрабатывали с помощью пакета статистических программ Statistica 8,0. Для каждой выборки вычислялось среднее арифметическое (X), ошибка среднего арифметического (m), среднее арифметическое отклонение (σ). Проверка на нормальность распределения проводилась с помощью критерия Шапиро-Уилка. Сравнение выборочных средних осуществлялось по критерию Даннета для сравнения нескольких экспериментальных выборок с одной контрольной в случае нормального распределения или по критерию Крускалла-Уоллиса для к-несвязанных выборок (к>2) и критерия Данна в случае распределения, отличающегося от нормального.

Водорастворимые ПС с молекулярной массой 1070±60, 17±2 кДа, полученные из надземной части люцерны посевной, при прямом действии на макрофаги вызывали резкое усиление продукции ключевого цитокина, ответственного за эффективность Т-клеточного иммунного ответа - ИЛ-12 (Таблица 3). МФ ни спонтанно, ни при активации ЛПС не вырабатывали цитокин. МДП (фармакологическая субстанция препарата «Ликопид») существенно в 7,5 раз увеличивал уровень ИЛ-12, а ПС повышали продукцию цитокина в 15 и 2 раза относительно контроля и МДП, соответственно.

Примечания:* - достоверные различия с контролем (уровень цитокинов, вырабатываемый макрофагами в отсутствии каких-либо веществ), р<0,05. n=6

Интактные макрофаги секретировали 17,56±2,23 пг/мл другого цитокина - ИЛ-10, продукция которого увеличивалась в 7,6 раз при стимуляции ЛПС (Таблица 4). Инкубация с ПС не изменяла ЛПС-активированную секрецию. Таким образом, ПС люцерны посевной не влияли на уровень ИЛ-10 на модели воспаления in vitro.

Продукция ИЛ-12 также возрастала в 4,9 раза при инкубации моноцитов ПС в 4,9 раза до 19,65±2,27 пг/мл и в 5,3 раза под воздействием МДП до 21,07±2,52 пг/мл, относительно контроля 3,99±1,25 пг/мл (Таблица 5). ПС люцерны посевной усиливали выработку ФНО-α в 188,4 раза с 1,49±0,92 пг/мл в контроле до 279,96±4,46 в опыте, что значительно в 1,8 раз превышало значения активирующего действия МДП. Продукция ИФН-γ лимфоцитами под влиянием ПС люцерны посевной многократно усиливалась, повышаясь с нулевого уровня до 26,02±8,13 пг/мл.

Примечания:* - достоверные различия с контролем (уровень цитокинов, вырабатываемый макрофагами в отсутствии каких-либо веществ), р<0,05; • - различия показателя со сравнению с МДП, р<0,05. n=6

Влияния исследуемых веществ на спонтанную продукцию ИЛ-10 выявлено не было (Таблица 6). На модели воспаления (ЛПС-стимуляция моноцитов) показано, что инкубация с митогеном приводила к увеличению показателя в 1,2 раза до 4,04±0,11 пг/мл относительно интактного контроля - 3,43±0,09 пг/мл. ПС люцерны посевной и МДП снижали в митоген-активированную выработку цитокина в 1,2 раза до 3,25±0,21 и 3,41±0,08 пг/мл, соответственно.

Примечание: * - различия с показателем спонтанной продукции (среда) достоверны, р<0,05; • - различия с показателем ЛПС-стимулированной продукции достоверны, р<0,05. n=6

Пример 3.

Для индукции Th1-зависимого типа иммунного ответа животных иммунизировали эритроцитами барана, водорастворимые ПС вводили мышам ежедневно внутрибрюшинно в течение 10 дней. Дозы ПС (10 мг/кг) и ликопида (2 мг/кг), обладающие выраженным иммуномодулирующим эффектом, были выявлены в предварительных экспериментах.

Оценку влияния исследуемого вещества на клеточное звено иммунитета изучали, используя реакцию гиперчувствительности замедленного типа (ГЗТ), на гуморальное звено - количество антителообразующих клеток (АОК) и выработку гемагглютининов (РГА). На 5-е сутки от начала введения ПС проводили иммунизацию/сенсибилизацию животных внутрибрюшинной инъекцией (5×10⁷ эритроцитов барана в 0,1 мл ФР), через 5 суток введения ПС для проведения ГЗТ осуществляли вторую (разрешающую) инъекцию эритроцитов барана в подушечку задней лапы - «опытная лапа» (10⁸ эритроцитов барана в 0,05 мл ФР). В «контрольную (контрлатеральную) лапу» также вводили 0,05 мл ФР. Реакцию ГЗТ оценивали через 24 часа по разнице массы опытной и контрольной лап для чего животных забивали, обе лапы отрезали по выступу кости выше пяточного сустава и ниже сочленения мало- и большеберцовой кости. Для определения количества АОК и оценки реакции гемагглютинации у животных, также на 5-е сутки после иммунизации эритроцитами барана извлекали селезенки и проводили отбор сыворотки крови. Определение (АОК) в селезенке определяли методом подсчета зон локального гемолиза, титра антител в сыворотке крови оценивали в реакции гемагглютинации и выражали величиной log₂ [23].

Курсовое введение суммы водорастворимых ПС с молекулярной массой 1070±50, 17±2 кДа, выделенных из надземной части люцерны посевной, животным на фоне развития у них Th1-зависимого иммунного ответа, индуцированного введением эритроцитов барана, привело к усилению маркерной реакции клеточного звена иммунного ответа (Таблица 7). Ликопид и ПС люцерны посевной в 2,6 и 2.8 раза усиливали величину реакции до 16,4±3,5 и 18,0±5,3 мг, соответственно.

Примечание: * - различия показателя с физ. раствором достоверны, р<0,05. n=7.

Курсовое введение водорастворимых ПС с молекулярной массой 1070±50, 17±2кДа, выделенных из надземной части люцерны посевной, животным на фоне развития у них Th1-зависимого иммунного ответа, приводило к усилению показателей гуморального звена иммунитета (Таблица 8). Число АОК достоверно увеличивалось в 2,3 раза как у мышей, получавших ПС, так и ликопид в 2,8 раза с 36,4±3,0 тыс/селезенку в контроле до 91,6±8,6 и 102,3±14,8 тыс/селезенку в опыте, соответственно. При этом титр гемагглютинина не изменялся.

Примечание: * - различия показателя с физ. раствором достоверны, р<0,05. n=5.

Таким образом, экспериментально установлено, что водорастворимые полисахариды с молекулярной массой 1070±50, 17±2 кДа, полученные из надземной части люцерны посевной, обладают способностью усиливать протекание иммунного ответа, стимулировать продукцию провоспалительных цитокинов ИЛ-12, ФНО-α и ИНФ-γ и, следовательно, являются активаторами Th1-зависимого типа иммунного ответа, а также воспалительных свойств макрофагов. Классическая активация антигенпрезентирующих клеток, опосредованная ПС люцерны посевной, характеризуется многократным усилением продукции главного провоспалительного цитокина - ИЛ-12 на фоне снижения или отсутствия влияния на продукцию ИЛ-10 (основного противовоспалительного цитокина). Выявленные свойства ПС люцерны посевной позволяют рассматривать их в качестве основы для разработки малотоксичного таргетного препарата для лечения патологических состояний иммунной системы, хронических, вялотекущих и рецидивирующих инфекционных заболеваний, а также коррекции необластомных процессов, связанных с недостаточностью Th1-зависимого иммунного ответа. Более того, растительные полисахариды характеризуются прекрасной биологической совместимостью, высокой биоразлагаемостью, что, несомненно, вызывает интерес использования их в качестве основы для разработки широкого спектра не только иммуномодуляторов, но и активных, малоинвазивных, терморезистентных вакцин.

Литература

1. The biology of IL-12: coordinating innate and adaptive immune responses / Watford W.T., Moriguchi M., Morinobu A., O'Shea J.J. // Cytokine & Growth Factor Reviews. - 2003. - Vol. 14. - Is. 5. - P. 361-368. DOI:10.1016/S1359-6101 (03)00043-1.

2. IL-10: The Master Regulator of Immunity to Infection / Couper K.N., Blount D.G., Riley E.M. // The Journal of Immunology. - 2008. - Vol. 180. - №9. - P. 5771-5777. DOI:10.4049/jimmunol. 180.9.5771.

3. Cytokines in common variable immunodeficiency as signs of immune dysregulation and potential therapeutic targets - a review of the current knowledge / F.N. Varzaneh, B. Keller, S. Unger, A. Aghamohammadi, K. Warnatz, N. Rezaei // J. Clin. Immunol. - 2014. - Vol. 34(5). - P. 524-543. DOI:10.1007/s10875-014-0053-0.

4. Differential Production of Type I IFN Determines the Reciprocal Levels of IL-10 and Proinflammatory Cytokines Produced by C57BL/6 and BALB/c Macrophages / Howes A., Taubert C., Blankley S., Spink N., Wu X., Graham С.М., Zhao J., Saraiva M., Ricciardi-Castagnoli P., Bancroft G.J., o'Garra A. // J. of Immunol. (Baltimore, Md.: 1950). - 2016. - Vol. 197(7). - P. 2838-2853. DOI: 10.4049/jimmunol. 1501923.

5. Горностаева Ю.А. Профилактика ОРВИ у пациентов с неспецифическими заболеваниями легких / Горностаева Ю.А. // Медицинский совет. - 2014. - №7. - С. 8-11.

6. Effect of the native polysaccharide of cashew-nut tree gum exudate on murine peritoneal macrophage modulatory activities / Yamassaki F.T., Lenzi R.M., Campestrini L.H., Bovo F., Seyfried M., Soldera-Silva A., Stevan-Hancke F.R., Zawadzki-Baggio S.F., Pettolino F.A., Bacic A., Maurer J.B. // Carbohydrate Polymers. - 2015. - Vol. 125. - P. 241-248.

7. Characterization and immunomodulatory activity of rice hull polysaccharides / Yang L.C., Hsieh C.C., Lin W.C. // Carbohydrate Polymers. - 2015. - Vol. 124. - P. 150-156.

8. Characterization of polysaccharides with antioxidant and immunological activities from Rhizoma Acori Tatarinowii / Zhang W., Song D., Xu D., Wang Т., Chen L., Duan J. // Carbohydrate Polymers. - 2015. - Vol. 133. - P. 154-162.

9. Botanical polysaccharides: macrophage immunomodulation and therapeutic potential / Schepetkin I.A., Quinn M.T. // Int. Immunopharmacol. - 2006. - Vol. 6. - №3. - P. 317-733.

10. Бордаков, Л.П. Люцерна синяя посевная / Всесоюз. акад. с.-х. наук им. В.И. Ленина, Всесоюз. ин-т растениеводства, Л.П. Бордаков. - Л., М. -: Изд-во Всесоюз. акад. с.-х. наук им В.И. Ленина, 1936. - 54 с.

11. Культурные растения СССР / В.Н. Вехов, И.А. Губанов, Г.Ф. Лебедева; ред. Т.А. Работнов; - Москва: Мысль, 1978. - 336 с.

12. Мир лекарственных растений NSP: Иллюстрированный справочник / под ред. П.В. Дружинина, А.Ф. Новикова; сост. И. Турова. - М., 2010.

13. Ильина, Т.А. Большая иллюстрированная энциклопедия лекарственных растений / Т.А. Ильина // Москва: Эксмо, 2016. - 305 с.

14. Патент RU 2053783 МПК A61K 35/78 Опубликовано: 1996.02.10.

15. Бурханова, Н.Р. Клинико-лабораторный контроль результатов лечения больных псориазом экстрактом люцерны посевной / Н.Р. Бурханова // Практическая медицина. - 2013 - №4. Т-1 (70). - С. 102-105.

16. Оксид азота при терапии больных псориазом с использованием препаратов из экстракта травы люцерны посевной / Ф.Х. Камилов, Н.Р. Бурханова, О.М. Капулер, Х.С. Фахретдинова // Пермский медицинский журнал. - 2011. - Т. XXVIII. - №6. - С. 38-43.

17. Ерёменко, P.M. Экспериментальное исследование гипогликемической активности экстракта из травы люцерны посевной / P.M. Ерёменко, Л.Н. Малоштан, Е.Ю. Яценко // Казанский медицинский журнал. - 2014. - Т. 95. - №4. - С. 557-561.

18. Патент RU 2242986 С1 МПК A61K 35/78, А61Р 9/10 Опубликовано: 27.12.2004.

19. Патент RU 2197257 МПК A61K 35/78 опубликован 27.01.2003.

20. Киреева P.M. Токсико-фармакологические свойства экстракта люцерны посевной: Автореф… дис. канд. мед. наук. - УФА, 1996- 20 с.

21. Патент RU 2311191 МПК A61K 36/48 опубликовано 27.11.2007.

22. Патент RU 2335925 МПК A61K 36 A23L 1/305 A23L 1/304 A23L 1/302 A23L 1/30 опубликовано 2006-04-12.

23. Руководство по проведению доклинических исследований лекарственных средств // Ч.1. М.: Гриф и К. 2013. С. 64-79.

Применение растительных водорастворимых полисахаридов с молекулярной массой 1070±50 и 17±2 кДа, выделенных из надземной части люцерны посевной (Medicago sativa L.), в качестве иммуномодулирующего средства для активации антигенпрезентирующих клеток и избирательной стимуляции продукции интерлейкина-12, фактора некроза опухоли-альфа макрофагами и интерферона-гамма лимфоцитами, характеризующееся тем, что указанные полисахариды получены путем удаления пигментов и ингибирования ферментов в высушенном до воздушно-сухого состояния сырье последовательно кипящими хлороформом и спиртом этиловым в аппарате Сокслета в течение 3 часов, дальнейшего высушивания и исчерпывающей двухкратной экстракции очищенной водой, подщелоченной раствором натрия гидроксида (рН 9), в соотношении сырье : экстрагент - 1:20 при нагревании на кипящей водяной бане в течение 2 ч при периодическом перемешивании, фильтрации через многослойный тканевый фильтр, упаривания фильтрата на роторном испарителе при температуре не более 40°С до 1/5 от исходного объема, осаждения полисахаридов добавлением 96% этанола в соотношении 1:4 (по объему), отстаивания 12 часов при температуре 2-4°С, центрифугирования осадка 10 мин при 4400 об/мин, растворения его в 100 мл очищенной воды при перемешивании на магнитной мешалке в течение 2 ч при комнатной температуре, отделения центрифугированием 30 мин при 4000 об/мин не растворившейся части остатка из мельчайших частицы сырья и денатурированного белка, удаления низкомолекулярных примесей ультрафильтрацией на кассетах VivaFlow 200, MWCO 10000, давление на выходе 3 атм, замораживания раствора и его лиофильной сушки.