Способ оценки неврологического дефицита конечностей у экспериментальных крыс

Изобретение относится к медицине, а именно к экспериментальной биологии, и может быть использовано для оценки неврологического дефицита конечностей у экспериментальных крыс путем выявления работоспособности конечностей в ответ на стимуляцию. Способ состоит из 5 основных тестов. В каждом из тестов оценивается работоспособность отдельно взятой конечности животного. Суммируют полученные данные пяти тестов для левой и правой стороны животного отдельно. Значение по 12 баллов для левой и правой стороны соответствует отсутствию неврологического дефицита конечностей. Менее 12 баллов для левой и менее 12 для правой стороны - наличие неврологического дефицита конечностей у экспериментальных крыс. Способ позволяет выявить снижение работоспособности конечностей, незначительные нарушения и разделить с большей достоверностью пограничные состояния неврологического дефицита между собой за счет разработанной тест-системы, которая является чувствительной к степени полученного повреждения и способна улавливать любые сдвиги в неврологическом статусе животного, происходящие в результате лекарственных коррекций, влияющих на пластичность мозга. 3 табл., 2 ил.

 

Изобретение относится к области экспериментальной биологии и медицины и может быть использовано для оценки неврологического дефицита конечностей у экспериментальных крыс путем выявления работоспособности конечностей в ответ на стимуляцию.

Крыса является важным объектом экспериментальных исследований, в частности при изучении неврологического дефицита конечностей при различных патологиях. Соответственно, такое изучение требует наличия адекватных методов оценки данного патологического состояния.

На сегодняшний день известен способ определения неврологического дефицита у мелких лабораторных животных при поражении головного мозга путем тестирования 10 непроизвольных врожденных поведенческих реакций, каждую из которых оценивают от нуля до двух баллов с оценкой два балла -отсутствие реакции. Полученные баллы суммируют и при значении от 0 до 5 баллов диагностируют легкую степень, от 6 до 9 баллов - среднюю, от 10 до 20 баллов - тяжелую степень повреждения головного мозга. Способ расширяет арсенал средств для определения неврологического дефицита у мелких лабораторных животных при поражении головного мозга (RU 2327227, 20.06.2008).

Известен также способ оценки неврологического дефицита у крыс после 30-минутной фокальной ишемии мозга на ранних и поздних сроках постишемического периода. В исследовании проводилось сравнение нескольких методов изучения неврологического дефицита у крыс, направленное на выявление наиболее чувствительных критериев оценки постишемического повреждения на различных сроках после ишемии. На модели транзиторной окклюзии средней мозговой артерии у крыс по методике J. Koidzumi проводилась оценка неврологических расстройств с помощью следующих тестов - хождение по балке (Ledged Tapered Beam); установка позы (Bracing test); угловой тест (Corner test); вытягивание лапы (Placing test); шкала mNSS (Modified Neurological Severity Scores); Бедерсон-тест (Bederson test) и шкала Гарсия - на 2-й, 7-й, 14-й, 21-й и 28-й дни постишемического периода. Все предложенные тесты позволяют выявить и количественно оценить неврологический дефицит у крыс до 21-го дня постишемического периода, к 28-му дню после ишемии очаговый неврологический дефицит регрессирует.Наиболее чувствительными и репрезентативными оказались шкала Гарсия, тест с вытягиванием лапы (Placing test) и Бедерсон-тест (Bederson test). При этом следует отметить, что данные методы сложны и трудоемки для процесса исследования неврологического дефицита.

Наиболее близким техническим решением является способ оценки неврологического дефицита с помощью поведенческих тестов при действии антагониста α2-адренорецептора атипамезола после фокальной церебральной ишемии у крыс. Тест состоит из семи задач, которые оценивают сенсомоторную функцию передних и задних конечностей на тактильную и проприоцептивную стимуляцию путем отслеживания возвращения и размещения стимулированной конечности в исходную позицию. Задачи оцениваются следующим образом: крыса выполняет задачу нормально, 2 балла; крыса выполняет задачу с задержкой 2 с и/или не полностью, 1 балл; и крыса не выполняет задачу, 0 баллов. Тестируются обе стороны тела животного. В первом задании крысу медленно опускают с высоты 10 см к поверхности стола. Во втором задании крысу держат на весу по направлению к столу, а передние конечности ставят на стол. Третья задача такая же, как и вторая, за исключением того, что, держат голову животного вверх под углом 45° и крысе не позволяют видеть стол или контактировать с ним своими вибриссами. Крысу помещают вдоль края стола стороной туловища, чтобы проверить наличие боковых рефлексов по размещению передней (четвертая задача) и задней конечности (пятая задача), поочередно отводя конечность в сторону. В шестой задаче, крыса располагается задом к краю стола. Седьмое задание: передние конечности крысы располагаются у края стола. Крысу осторожно толкают сзади по направлению к краю стола. В норме максимально возможное суммарное количество баллов равно 14 для каждой стороны тела. Максимально возможное количество баллов, получаемых в результате тестирования для левой передней и правой передней конечности крысы по 10 баллов, для левой задней и правой задней по 4 балла (Jolkkonen J, Puurunen К, Rantakomi S, Harkonen A, Haapalinna A, Sivenius J. Behavioral effects of the alpha(2)-adrenoceptor antagonist, atipamezole, after focal cerebral ischemia in rats. Eur J Pharmacol. 2000 Jul 21;400(2-3):211-9). Однако, несмотря на использование семи тестов, что значительно увеличивает время исследования, используемая авторами градация оценочной шкалы не обеспечивает достоверную оценку неврологического дефицита. Известно, что при невнимательном или поспешном тестировании неврологический дефицит может не выявляться вследствие выработки животным компенсаторной поведенческой стратегии (Barth, Т.М., Jones, Т.А., and Schallert, Т. (1990). Functional subdivisions of the rat somatic sensorimotor cortex. Behav Brain Res 39, 73-95; Jones, T.A., Chu, C.J., Grande, L.A., and Gregory, A.D. (1999). Motor skills training enhances lesion-induced structural plasticity in the motor cortex of adult rats. JNeurosci, 19, 10, 153-63).

Таким образом, введение в наш метод модификаций в тесты для стимуляции конечностей позволяет однозначно выявлять замаскированное снижение работоспособности конечности крысы.

Технический результат заключается в снижении трудоемкости и временных затрат на проведение эксперимента по оценке неврологического дефицита конечностей у экспериментальных крыс с высокой достоверностью и точностью.

Технический результат достигается тем, что оценку неврологического дефицита конечностей у экспериментальных крыс проводят путем определения двигательной активности конечностей крыс, причем двигательную активность и функцию определяют посредством проведения пяти тестов и балльной оценки, при этом на первом тестировании экспериментальную крысу держат за корень хвоста и медленно опускают вниз головой по направлению к поверхности стола, удерживая в этом положении крысу в течение 10 секунд так, чтобы крыса не изгибалась в бок и висела прямо, при этом активность и функцию оценивают для каждой конечности отдельно по следующей шкале: для передних конечностей - конечность в течение всего времени тянется к поверхности стола, не повисает и активно двигается в воздухе, совершая от 10 движений и более, оценивают как 2 балла, конечность вытягивается к поверхности стола, не повисает, но совершает менее 10 активных движений, оценивают как 1,5 балла, конечность в течение как минимум 5 секунд не тянется к поверхности стола, повисает и не работает, оценивают как 1 балл, конечность не тянется по направлению к столу, висит, производит 1-2 движения, оценивают как 0,5 баллов, конечность не работает, повисает, не совершает никаких движений, оценивают как 0 баллов; для задних конечностей - конечность активно двигается в воздухе, совершая от 10 движений и более, не висит, оценивают как 2 балла, конечность двигается в воздухе, но совершает менее 10 активных движений, при этом никогда не повисает, оценивают в 1,5 балла, конечность в течение как минимум 5 секунд повисает и не работает, оценивают в 1 балл, конечность висит, не работает, производит 1-2 движения, оценивают в 0,5 баллов, конечность не работает, повисает, не совершает никаких движений, оценивают как 0 баллов, при этом выставляют 4 оценки в баллах, на втором тестировании крысу размещают передними конечностями у края стола и подталкивают за туловище по направлению к пропасти, в случае, если крыса сопротивляется толканию, активно перебирая и упираясь в стол передней конечностью, не давая конечности соскользнуть в пропасть, и активно пятиться назад, это оценивают как 2 балла, если крыса сопротивляется толканию, конечностью упирается в стол, но не пятиться назад, это оценивают в 1,5 балла, крыса толканию в пропасть не сопротивляется, передней конечностью не перебирает и не упирается в стол, конечность проваливается в пропасть и свисает с края стола, но через временной интервал в 3-5 секунд крыса возвращает конечность на поверхность стола, упираясь в край, это оценивают в 1 балл, крыса не сопротивляется, передней конечностью не перебирает и не упирается в стол, конечность проваливается в пропасть и свисает с края стола, но через временной интервал в 6 и более секунд она возвращает конечность на поверхность стола, это оценивают в 0,5 баллов, крыса не сопротивляется толканию, передней конечностью не перебирает и не упирается в стол, конечность проваливается за край стола, висит, и крыса не может вернуть ее на поверхность стола, это оценивают в 0 баллов при этом обе передние конечности оценивают отдельно, выставляя 2 оценки в баллах, далее в процессе третьего тестирования крысу размещают параллельно краю стола левой стороной туловища, все лапы исходно располагают на поверхности стола при этом экспериментатор последовательно отводит каждую конечность вниз и в сторону за край стола в трех заданных направлениях: вперед, перпендикулярно продольной оси туловища по центру и по направлению назад, оценивая работоспособность передней и задней конечности отдельно и в случае, если крыса активно одергивает и возвращает конечность в исходное положение из любого из трех направлений, это оценивают в 2 балла, снижение работоспособности конечности крысы в виде задержки до 2-3 секунд при одергивании конечности, но при этом возврат в исходное положение осуществляется всегда из всех трех позиций, это оценивают в 1,5 балла, конечность крысы в одном из трех положений повисает и не работает, фиксируется возврат конечности в исходное положение только из двух любых позиций, это оценивают в 1 балл, конечность крысы висит в двух из трех направлений, возврат в исходное положение осуществляется только из одного из трех направлений, это оценивают в 0,5 баллов, конечность крысы не работает, повисает, не совершает никаких движений, крыса не может вернуть конечность в исходное положение ни из одного направления, это оценивают в 0 баллов, при этом обе левые конечности оценивают отдельно, выставляя 2 оценки в баллах, при четвертом тестировании крысу располагают на столе всеми лапами, хвостом к краю стола, придерживая животное аккуратно за туловище, каждую заднюю конечность трижды отводят назад и вниз, за край стола, и в случае активного одергивания конечности и возвращения в исходное положение при каждом отведении конечности экспериментатором, это оценивают в 2 балла, снижение функции в виде временной задержки до 2 секунд при одергивании конечности и возвращение в исходное положение при всех трех стимулированиях конечности экспериментатором, это оценивают в 1,5 балла, конечность крысы повисает, не работает и не может вернуться в исходное положение только при одной из трех стимуляций конечности экспериментатором, это оценивают в 1 балл, конечность крысы висит, не работает, не может вернуться в исходное положение при двух из трех стимуляций конечности, возврат в исходное положение осуществляется только при одной из трех стимуляций с большой временной задержкой в 6 и более секунд, это оценивают в 0,5 баллов, конечность крысы не работает, повисает, не совершает никаких движений, крыса не может вернуть конечность в исходное положение, это оценивают в 0 баллов при этом обе задние лапы оценивают отдельно, выставляя 2 оценки в баллах, при пятом тестировании крысу размещают параллельно краю стола правой стороной туловища, все лапы исходно располагают на поверхности стола при этом экспериментатор последовательно отводит каждую конечность вниз и в сторону за край стола в трех заданных направлениях: вперед, перпендикулярно продольной оси туловища по центру и по направлению назад, оценивая работоспособность передней и задней конечности и в случае, если крыса активно одергивает и возвращает конечность в исходное положение из любого направления, это оценивают в 2 балла, снижение работоспособности конечности крысы в виде задержки до 2-3 секунд при одергивании конечности, но при этом возвращение в исходное положение осуществляется из всех трех позиций, это оценивают в 1,5 балла, конечность крысы повисает и не работает в одном из трех направлений, фиксируется возврат конечности в исходное положение только из двух любых позиций, это оценивают в 1 балл, конечность крысы висит в любых двух из трех направлениях, возврат в исходное положение осуществляется только из одного из трех направлений, это оценивают в 0,5 баллов, конечность крысы не работает, повисает, не совершает никаких движений, крыса не может вернуть конечность в исходное положение ни из одного направления, это оценивают в 0 баллов, при этом обе правые конечности оценивают отдельно, выставляя 2 оценки в баллах, затем суммируют полученные данные пяти тестов для левой и правой стороны животного отдельно, и при значении по 12 баллов для левой и правой стороны оценивают как отсутствие неврологического дефицита конечностей, а менее 12 баллов для левой и менее 12 для правой стороны - наличие неврологического дефицита конечностей у экспериментальных крыс.

Способ осуществляется следующим образом.

Разработанная тест-система для оценки неврологического дефицита является чувствительной к степени полученного повреждения, а также она способна улавливать любые сдвиги в неврологическом статусе животного, происходящие в результате лекарственных коррекций, влияющих на пластичность мозга.

Тест состоит из 5 основных задач, в каждой из которых оценивается работоспособность отдельно взятой конечности животного:

1. Первое тестирование - крысу осторожно держат за корень хвоста и медленно опускают вниз головой по направлению к поверхности стола, удерживая в этом положении крысу в течение 10 секунд так, чтобы крыса не изгибалась в бок и висела прямо. В норме крыса вытягивает вперед обе передние конечности к поверхности стола в попытке дотянуться до него и активно симметрично перебирает в воздухе задними лапами. При этом активность и функцию оценивают для каждой конечности отдельно по следующей шкале:

Для передних конечностей- конечность в течение всего времени тянется к поверхности стола, не повисает и активно двигается в воздухе, совершая от 10 движений и более, оценивают как 2 балла;

- конечность вытягивается к поверхности стола, не повисает, но совершает менее 10 активных движений конечностью в воздухе, оценивают как 1,5 балла;

- конечность в течение как минимум 5 секунд не тянется к поверхности стола, повисает и не работает, оценивают как 1 балл;

- конечность не тянется по направлению к столу, висит, производит 1-2 движения, оценивают как 0,5 баллов;

- конечность не работает, повисает, не совершает никаких движений, оценивают как 0 баллов.

Для задних конечностей - конечность активно двигается в воздухе, совершая от 10 движений и более, не висит, оценивают как 2 балла;

- конечность двигается в воздухе, но совершает менее 10 активных движений, при этом никогда не повисает, оценивают в 1,5 балла;

- конечность в течение как минимум 5 секунд повисает и не работает оценивают в 1 балл;

- конечность висит, не работает, производит 1-2 движения, оценивают в 0,5 баллов;

- конечность не работает, повисает, не совершает никаких движений, оценивают как 0 баллов. При этом выставляют 4 оценки в баллах.

2. Второе тестирование - крысу размещают передними лапами у края стола и аккуратно подталкивают за туловище по направлению к пропасти. В норме крыса сопротивляется толканию, активно перебирая и упираясь в стол обеими передними лапами. При этом активность и функцию оценивают для каждой конечности отдельно по следующей шкале:

- крыса сопротивляется толканию, активно перебирая и упираясь в стол передней конечностью, не давая конечности соскользнуть в пропасть, и активно пятиться назад, это оценивают как 2 балла;

- крыса сопротивляется толканию, конечностью упирается в стол, не давая конечности соскользнуть в пропасть, но не пятиться назад, это оценивают в 1,5 балла;

- крыса толканию в пропасть не сопротивляется, передней конечностью не перебирает и не упирается в стол, конечность проваливается в пропасть и свисает с края стола, но через временной интервал в 3-5 секунд крыса возвращает конечность на поверхность стола, упираясь в край, это оценивают в 1 балл;

- крыса толканию не сопротивляется, передней конечностью не перебирает и не упирается в стол, конечность проваливается в пропасть и свисает с края стола, но через временной интервал в 6 и более секунд она возвращает конечность на поверхность стола, это оценивают в 0,5 баллов;

- крыса не сопротивляется толканию, передней конечностью не перебирает и не упирается в стол, конечность проваливается за край стола, висит, и крыса не может вернуть ее на поверхность стола, это оценивают в 0 баллов. При этом обе передние конечности оценивают отдельно, выставляя 2 оценки в баллах.

3. Третье тестирование - крысу размещают параллельно краю стола левой стороной туловища, все лапы исходно располагают на поверхности стола. При этом экспериментатор последовательно отводит каждую конечность вниз и в сторону за край стола в трех заданных направлениях: вперед, перпендикулярно продольной оси туловища по центру и по направлению назад, (см. фиг. 1), оценивая работоспособность передней и задней лап. На фиг. 1 показано боковое тестирование передней (панель А) и задней (панель Б) конечностей животного в трех заданных направлениях. Стрелкой указан перпендикуляр относительно продольной оси тела животного. В норме крыса быстро и энергично одергивает лапу в исходное положение из любого направления. При этом активность и функцию оценивают для каждой конечности отдельно по следующей шкале:

- крыса активно одергивает и возвращает конечность в исходное положение из любого из трех направлений, это оценивают в 2 балла;

- снижение работоспособности конечности крысы в виде задержки до 2-3 секунд при одергивании конечности, но при этом возврат в исходное положение осуществляется из всех трех позиций, это оценивают в 1,5 балла;

- конечность крысы в одном из трех положений повисает и не работает, фиксируется возврат конечности в исходное положение только из двух любых позиций, это оценивают в 1 балл;

- конечность крысы висит в двух из трех направлений, возврат в исходное положение осуществляется только из одного из трех направлений, что оценивают в 0,5 баллов;

- конечность крысы не работает, повисает, не совершает никаких движений, крыса не может вернуть конечность в исходное положение ни из одного направления, это оценивают в 0 баллов. Причем обе левые конечности оценивают отдельно, выставляя 2 оценки в баллах.

4. Четвертое тестирование - крысу располагают на столе всеми лапами, хвостом к краю стола, придерживая крысу аккуратно за туловище, и каждую заднюю конечность трижды отводят назад и вниз, за край стола. В норме -быстрое одергивание лапы в исходное положение. При этом активность и функцию оценивают для каждой конечности отдельно по следующей шкале:

- крыса активно одергивает конечность и возвращает в исходное положение при каждом отведении конечности экспериментатором, это оценивают в 2 балла;

- снижение функции в виде временной задержки до 2 секунд при одергивании конечности и возвращение в исходное положение при всех трех стимулированиях конечности экспериментатором, это оценивают в 1,5 балла;

- конечность крысы повисает, не работает и не может вернуться в исходное положение при одной из трех стимуляций конечности экспериментатором, это оценивают в 1 балл;

- конечность крысы висит, не работает, возврат в исходное положение осуществляется только при одной из трех стимуляций с большой временной задержкой в 6 и более секунд, это оценивают в 0,5 баллов;

- конечность крысы не работает, повисает, не совершает никаких движений, крыса не может вернуть конечность в исходное положение, это оценивают в 0 баллов. Причем обе задние лапы оценивают отдельно, выставляя 2 оценки в баллах.

5. Пятое тестирование - эта задача аналогична задаче номер 3, только крысу размещают параллельно краю стола правой стороной туловища, все лапы исходно располагают на поверхности стола. При этом экспериментатор последовательно отводит каждую конечность вниз и в сторону за край стола в трех заданных направлениях: вперед, по центру перпендикулярно туловищу и по направлению назад, оценивая работоспособность передней и задней лап. В норме крыса быстро и энергично одергивает лапу в исходное положение из любого направления. Активность и функцию оценивают для каждой конечности отдельно по следующей шкале:

- крыса активно одергивает и возвращает конечность в исходное положение из любого направления, это оценивают в 2 балла;

- снижение работоспособности конечности крысы в виде задержки до 2-3 секунд при одергивании конечности, но при этом возвращение в исходное положение осуществляется из всех трех позиций, это оценивают в 1,5 балла;

- конечность крысы повисает и не работает в одном из трех направлений, фиксируется возврат конечности в исходное положение только из двух любых позиций, это оценивают в 1 балл;

- конечность крысы висит в любых двух из трех направлениях, возврат в исходное положение осуществляется только из одного из трех направлений, что оценивают в 0,5 баллов;

- конечность крысы не работает, повисает, не совершает никаких движений, крыса не может вернуть конечность в исходное положение ни из одного направления, что оценивают в 0 баллов. Причем обе правые конечности оценивают отдельно, выставляя 2 оценки в баллах. Затем суммируют полученные данные пяти тестов для левой и правой стороны животного отдельно, и при значении 12 баллов для левой и 12 баллов для правой стороны оценивают как отсутствие неврологического дефицита конечностей, а менее 12 баллов для левой и менее 12 для правой стороны - наличие неврологического дефицита конечностей у экспериментальных крыс.

Таким образом, максимально возможное количество баллов, получаемых в результате тестирования для каждой конечности крысы в норме по 6 баллов, для оценки неврологического состояния левой стороны -12 баллов, для оценки неврологического состояния правой стороны - баллов, суммарно по всем конечностям - 24. Максимальное количество баллов, полученных в результате тестирования, отражает отсутствие неврологического дефицита конечностей, минимальное - максимальную выраженность неврологического дефицита.

При моделировании неврологических нарушений или заболеваний, клинически проявляющихся в нарушении моторной функции, тестирование по данной разработанной методике позволяет оценить выраженность неврологического дефицита животного, фиксируя даже незначительное снижение работоспособности какой либо конечности, а также выявить возможную нарастающую или убывающую во времени асимметрию в работе ипси- и контралатеральных очагу повреждения конечностей. В эксперименте обязательно должно производиться предварительное тестирование моторных функций, что позволяет избежать ложноположительных и отрицательных результатов.

Задачей, решаемой данной модификацией метода стимулирования конечностей, является разработка способа выявления опорно-двигательных нарушений конечностей у крыс, позволяющего снизить трудоемкость и временные затраты на проведение эксперимента. Данный модифицированный нами метод обладает большей чувствительностью к обнаружению снижения работоспособности конечностей по сравнению с классической методикой, выявляя даже незначительные, легкие нарушения, позволяет выявить замаскированное снижение работоспособности конечности крысы. Каждая задача выполняется крысой на рефлекторном уровне, не требуется дополнительное обучение, однако крыса должна быть приучена к рукам.

Заявленный метод тестирования был успешно применен для оценки неврологического дефицита конечностей у экспериментальных крыс, возникающего при моделировании фокальной открытой черепно-мозговой травмы, которое было подробно описано в статье Genrikhs et al, 2015 (Genrikhs E.E., Stelmashook E.V., Popova O.V. Kapay N.A., Korshunova G.A., Sumbatyan N.V., Skrebitsky V.G., Skulachev V.P., Isaev N.K.. Mitochondria-targeted antioxidant SKQT1 decreases trauma-induced neurological deficit in rat and prevents amyloid-pMnduced impairment of long-term potentiation in rat hippocampal slices. // Journal of Drug Targeting.- 2015.- V. 23.- №4.- P. 347-352). Проведена оценка работоспособности конечностей у ложнооперированных крыс: n=34 и группы экспериментальных животных, получивших травму легкой (n=27) и средней степени тяжести (n=30).

Исследование выполнено на крысах-самцах линии Вистар весом от 160 до 220 г. Для моделирования травматического повреждения левого полушария головного мозга в трепанационное отверстие, высверленное в черепе над зоной сенсомоторной коры, помещали подвижный тефлоновый поршень диаметром 4 мм и ходом 2,5 мм, по которому с высоты 5 см (легкая степень повреждения) или 10 см (средняя степень повреждения) ударял с ускорением свободного падения груз весом 50 г. Локализацию зоны сенсомоторной коры определяли по данным, представленным в атласе (Paxinos G., Watson С.Atlas of anatomy of rat brain. The Rat Brain in Stereotaxic Coordinates: San Diego. 1997) и работе Hicks, D'Amato (Hicks S.P., D'Amato C.J. Locating corticospinal neurons by retrograde axonal transport of horseradish peroxidase. // Exp.Neurol.- 1977.- V. 56.- P. 410-420). С ложнооперированными животными проводили все те же манипуляции, исключая удар грузом. Тестирование с помощью предложенной шкалы проводили до моделирования черепно-мозговой травмы и через неделю после нанесения ЧМТ, когда формирование очага повреждения уже закончилось и значимо не изменяется, что сопровождается выраженным неврологическим моторным дефицитом конечностей, контралатеральных очагу повреждения, данные представлены ниже в таблицах 1-3. В исследование включали только тех животных, которые по предварительному тестированию набирали в сумме по обеим сторонам не менее 23,5 баллов. Контрольное исследование наличия в нужной области головного мозга очага повреждения производили после выполнения всех тестов. Для этого мозг животных извлекали и фиксировали с помощью смеси формалин-этиловый спирт-уксусная кислота в пропорции 2:7:1.

До операции средний балл, набранный посредством заявленного теста, для контрольной ложнооперированной группы экспериментальных животных и в группах, впоследствии получивших ЧМТ, был сходным и составил 12±0 баллов для контралатеральной очагу повреждения стороны. У групп животных после моделирования черепно-мозговой травмы легкой и средней степени тяжести спустя неделю балл, полученный посредством заявленного теста, особенно снизился по контралатеральной стороне и составил 9,2±0,23 и 6,97±0,23, соответственно, при этом у группы ложнооперированных животных через неделю после операции он остался на том же уровне, что и до манипуляций - 12±0 (см. фиг. 2Б). Заявленный тест показал высокую чувствительность (даже к незначительному снижению функции, как в нашем примере для ипсилатеральной стороны животных из исследуемых нами групп (см. фиг. 2А), и достоверность при выявлении снижения работоспособности конечностей у животных, получивших травматическое повреждение зоны сенсомоторной коры головного мозга различной степени тяжести (р<0,001).

На фиг. 2 А, Б показано развитие повреждения головного мозга животного после фокальной односторонней черепно-мозговой травмы сенсомоторной области коры левого полушария легкой (5 см) и средней (10 см) степени тяжести. (А) - Баллы, полученные при тестировании ипсилатеральной стороны ложнооперированных животных и групп, получивших черепно-мозговую травму, до операции (0) и после, на 7 день. (Б) - Баллы, полученные при тестировании контралатеральной стороны ложнооперированных животных и групп, получивших ЧМТ, до операции (0) и после, на 7 день. Данные тестирования представлены из как минимум 5-ти независимых экспериментов, в каждом из которых было исследовано 3-7 животных.

* - р<0,001 по сравнению с данными, полученными путем тестирования до операции (0) для той же группы,

** - р<0,001 по сравнению с группой животных, получивших легкую (5 см) степень ЧМТ на 7 день.

Таким образом, заявленный способ оценки неврологического дефицита конечностей у экспериментальных крыс в отличие от известного имеет ряд особенностей обеспечивающих высокую эффективность в достижении технического результата, в частности:

- классическая известная задача тестирования на хвосте (первое тестирование) определяет работоспособность только передних конечностей, в заявленной методике используется оценка работоспособности и передних, и задних конечностей, что позволило с помощью этого теста расширить получаемые данные по работоспособности задних конечностей животного;

- в заявленной методике также упразднены две задачи (2 и 3 классической методики), оценивающие только работоспособность передних конечностей, что позволяет сэкономить время на тестировании без потери качества получаемого результата;

- модифицирована задача по стимуляции конечностей сбоку классической методики (4 и 5 задачи), которые, как правило, могут привести к ошибочному выставлению балла при изучении работоспособности конечности, так как в эксперименте часто встречается замаскированное снижение ее работоспособности. Чтобы избежать подобных ошибок, при тестировании сбоку была введена стимуляция каждой конечности в трех заданных направлениях: вперед, по центру (строго перпендикулярно продольной оси туловища) и по направлению назад, и разработана соответствующая система оценок при таком тестировании;

- введена более дробная пятибалльная шкала оценки функции каждой конечности по сравнению с более грубой трехбалльной классической шкалой, что позволяет нам фиксировать даже незначительное снижение работоспособности какой-либо конечности, а также выявить возможную даже незначительно нарастающую или убывающую во времени асимметрию в работе ипси- и контралатеральных очагу повреждения конечностей. Благодаря введению пятибалльной системы оценок, было выделено пять уровней работоспособности конечности.

Все эти особенности обеспечили высокую чувствительность к обнаружению снижения работоспособности конечностей по сравнению с классической методикой, выявляя даже незначительные, легкие нарушения и разделяя с большей достоверностью пограничные состояния неврологического дефицита между собой.

Способ оценки неврологического дефицита конечностей у экспериментальных крыс, включающий определение двигательной активности конечностей крыс, отличающийся тем, что двигательную активность и функцию определяют посредством проведения пяти тестов и балльной оценки, при этом на первом тестировании экспериментальную крысу держат за корень хвоста и медленно опускают вниз головой по направлению к поверхности стола, удерживая в этом положении крысу в течение 10 секунд так, чтобы крыса не изгибалась в бок и висела прямо, при этом активность и функцию оценивают для каждой конечности отдельно по следующей шкале: для передних конечностей - конечность в течение всего времени тянется к поверхности стола, не повисает и активно двигается в воздухе, совершая от 10 движений и более, оценивают как 2 балла, конечность вытягивается к поверхности стола, не повисает, но совершает менее 10 активных движений конечностью в воздухе, оценивают как 1,5 балла, конечность в течение как минимум 5 секунд не тянется к поверхности стола, повисает и не работает, оценивают как 1 балл, конечность не тянется по направлению к столу, висит, производит 1-2 движения, оценивают как 0,5 баллов, конечность не работает, повисает, не совершает никаких движений, оценивают как 0 баллов; для задних конечностей - конечность активно двигается в воздухе, совершая от 10 движений и более, не висит, оценивают как 2 балла, конечность двигается в воздухе, но совершает менее 10 активных движений, при этом никогда не повисает, оценивают в 1,5 балла, конечность в течение как минимум 5 секунд повисает и не работает, оценивают в 1 балл, конечность висит, не работает, производит 1-2 движения, оценивают в 0,5 баллов, конечность не работает, повисает, не совершает никаких движений, оценивают как 0 баллов, при этом выставляют 4 оценки в баллах, на втором тестировании крысу размещают передними конечностями у края стола и подталкивают за туловище по направлению к пропасти, в случае если крыса сопротивляется толканию, активно перебирая и упираясь в стол передней конечностью, не давая конечности соскользнуть в пропасть, и активно пятится назад, это оценивают как 2 балла, если крыса сопротивляется толканию, конечностью упирается в стол, но не пятится назад, это оценивают в 1,5 балла, крыса толканию в пропасть не сопротивляется, передней конечностью не перебирает и не упирается в стол, конечность проваливается в пропасть и свисает с края стола, но через временной интервал в 3-5 секунд крыса возвращает конечность на поверхность стола, упираясь в край, это оценивают в 1 балл, крыса не сопротивляется, передней конечностью не перебирает и не упирается в стол, конечность проваливается в пропасть и свисает с края стола, но через временной интервал в 6 и более секунд она возвращает конечность на поверхность стола, это оценивают в 0,5 баллов, крыса не сопротивляется толканию, передней конечностью не перебирает и не упирается в стол, конечность проваливается за край стола, висит и крыса не может вернуть ее на поверхность стола, это оценивают в 0 баллов, при этом обе передние конечности оценивают отдельно, выставляя 2 оценки в баллах, далее в процессе третьего тестирования крысу размещают параллельно краю стола левой стороной туловища, все лапы исходно располагают на поверхности стола, при этом экспериментатор последовательно отводит каждую конечность вниз и в сторону за край стола в трех заданных направлениях: вперед, перпендикулярно продольной оси туловища по центру и по направлению назад, оценивая работоспособность передней и задней конечности отдельно, и в случае, если крыса активно одергивает и возвращает конечность в исходное положение из любого из трех направлений, это оценивают в 2 балла, снижение работоспособности конечности крысы в виде задержки до 2-3 секунд при одергивании конечности, но при этом возврат в исходное положение осуществляется всегда из всех трех позиций, это оценивают в 1,5 балла, конечность крысы в одном из трех положений повисает и не работает, фиксируется возврат конечности в исходное положение только из двух любых позиций, это оценивают в 1 балл, конечность крысы висит в двух из трех направлений, возврат в исходное положение осуществляется только из одного из трех направлений, это оценивают в 0,5 баллов, конечность крысы не работает, повисает, не совершает никаких движений, крыса не может вернуть конечность в исходное положение ни из одного направления, это оценивают в 0 баллов, при этом обе левые конечности оценивают отдельно, выставляя 2 оценки в баллах, при четвертом тестировании крысу располагают на столе всеми лапами, хвостом к краю стола, придерживая животное аккуратно за туловище каждую заднюю конечность трижды отводят назад и вниз, за край стола, и в случае активного одергивания конечности и возвращения в исходное положение при каждом отведении конечности экспериментатором, это оценивают в 2 балла, снижение функции в виде временной задержки до 2 секунд при одергивании конечности и возвращение в исходное положение при всех трех стимулированиях конечности экспериментатором, это оценивают в 1,5 балла, конечность крысы повисает, не работает и не может вернуться в исходное положение при одной из трех стимуляций конечности экспериментатором, это оценивают в 1 балл, конечность крысы висит, не работает, возврат в исходное положение осуществляется только при одной из трех стимуляций с большой временной задержкой в 6 и более секунд, это оценивают в 0,5 баллов, конечность крысы не работает, повисает, не совершает никаких движений, крыса не может вернуть конечность в исходное положение, это оценивают в 0 баллов, при этом обе задние лапы оценивают отдельно, выставляя 2 оценки в баллах, при пятом тестировании крысу размещают параллельно краю стола правой стороной туловища, все лапы исходно располагают на поверхности стола при этом экспериментатор последовательно отводит каждую конечность вниз и в сторону за край стола в трех заданных направлениях: вперед, перпендикулярно продольной оси туловища по центру и по направлению назад, оценивая работоспособность передней и задней конечности, и в случае, если крыса активно одергивает и возвращает конечность в исходное положение из любого направления, это оценивают в 2 балла, снижение работоспособности конечности крысы в виде задержки до 2-3 секунд при одергивании конечности, но при этом возвращение в исходное положение осуществляется из всех трех позиций, это оценивают в 1,5 балла, конечность крысы повисает и не работает в одном из трех направлений, фиксируется возврат конечности в исходное положение только из двух любых позиций, это оценивают в 1 балл, конечность крысы висит в любых двух из трех направлений, возврат в исходное положение осуществляется только из одного из трех направлений, это оценивают в 0,5 баллов, конечность крысы не работает, повисает, не совершает никаких движений, крыса не может вернуть конечность в исходное положение ни из одного направления, это оценивают в 0 баллов, при этом обе правые конечности оценивают отдельно, выставляя 2 оценки в баллах, затем суммируют полученные данные пяти тестов для левой и правой стороны животного отдельно и при значении по 12 баллов для левой и правой стороны оценивают как отсутствие неврологического дефицита конечностей, а менее 12 баллов для левой и менее 12 для правой стороны - наличие неврологического дефицита конечностей у экспериментальных крыс.