Способ получения препарата для профилактики и лечения радиационных поражений организма животных и способ профилактики и лечения радиационных поражений организма животных

Группа изобретений относится к радиационной биологии, а именно профилактике и лечению радиационных поражений организма животных с использованием препаратов на основе веществ микробного, зоогенного и минерального происхождения. Для этого на питательных средах выращивают культуры пробиотических микроорганизмов, в качестве которых используют кишечную палочку Е. coli шт. ПЛ-6, бифидобактерии В. bifidum шт. 1 и сенную палочку В. subtilis шт. 3. Затем культуральную жидкость тест-штаммов смешивают в соотношении 0,5:0,3:0,2 и вносят в нее смесь микробных клеток в количестве 1,5⋅10⁹ КОЕ/мг (Е. coli), 0,6⋅10⁹ КОЕ/мг (В. bifidum 1) и 0,4⋅10⁹ КОЕ/мг (В. subtilis 3). В полученную смесь добавляют высокодисперсный бентонит в количестве 20-30 мг на 100 см³ композиции и апизан в количестве 7-10 мг на 100 см³ композиции. Лечение радиационных поражений проводят путем однократного подкожного введения препарата в дозах 7-10 см³ мелким животным и 15-20 см крупным животным. Препарат вводят из расчета 8,5-9,5 мг сухого вещества на 1 кг живой массы: для профилактики - за 1-30 сут до облучения, а для лечения - через 1-10 сут после облучения. Группа изобретений обеспечивает формирование резистентности организма животных при профилактическом и лечебном применении препарата. 2 н. и 2 з.п. ф-лы, 6 пр.

 

Изобретение относится к радиационной биологии, в частности, к получению и применению многокомпонентных смесей радиозащитных препаратов на основе веществ микробного происхождения.

Известен способ получения бактериального полиантигенного комплекса на основе протективного антигена, анатоксина и радиотоксина в соотношении 90:5:5 соответственно, используемого для специфической профилактики радиационных поражений организма (Патент RU 2226106, МПК А61К 39/108, - опубл. 27.01.2003 Бюл. №18). Недостатком способа является отсутствие лечебного эффекта препарата.

Известен способ получения препарата для профилактики или лечения радиационных поражений организма противолучевой сывороткой, получаемой путем двукратного облучения крупных животных с использованием мощной радиационно-опасной гамма-установки (Патент RU 2169572, А61К 61К 35/28, - опубл. 27.06.2001).

Недостатком указанного способа является сложная технология получения препарата - двукратное облучение крупных животных (лошади), использование мощной радиационно-опасной гамма-установки и, самое главное - использование весьма высоких лечебных доз дорогостоящего препарата - противолучевой лечебной сыворотки, расходы которой для крупных животных (коров, ослов, свиней, лошадей) составляют 200-400 мл на 1 голову (100-250 мг/кг белка).

Известен способ получения препарата для профилактики и лечения радиационных поражений организма путем этанолового экстрагирования биологически активных веществ из натуральной кормовой добавки, содержащей следующее соотношение компонентов, мас. %: мед 1,5-2,0; прополис 2,0-2,5; перга - 30,0-35,0; обножка 15,0-17,0; пчелиный яд 0,5-1,0; пчелиный расплод в разных стадиях развития 5,5-6,0; маточное молочко 3,5-4,0; восковая моль и их личинки 2,5-3,0; воск 5,0-7,0; пчелиный подмор 7,0-8,0; травяная мука - остальное (Патент РФ 2338546, МПК A61K 36/00. - опубл. 20.11.2008. Бюл. №32).

Недостатком способа является использование в качестве исходного сырья для получения этанолового экстракта дорогостоящей кормовой добавки весьма сложного химического состава, что сдерживает (ограничивает) использование способа.

Известен способ приготовления и применения бактериального препарата на основе продуктов метаболизма Bacillus subtilis и адсорбента токсинов-цеолита, связывающего и выводящего из организма токсины, тяжелые металлы и радионуклиды (см. статью Е.А. Ткаченко и др. Эрадикационная терапия // Клин. питание. - 2005 - №1. - С. 14-20).

К недостаткам данного способа следует отнести использование в его составе неочищенного цеолита, содержащего значительное количество нерастворимых солей и кварца, не участвующих в процессе адсорбции токсинов, тяжелых металлов и радионуклидов.

Для использования биопрепаратов на основе веществ микробного происхождения с лечебной и профилактической целью наиболее экономичным, эффективным и целесообразным является использование соматических клеток и продуктов метаболизма микроорганизмов, содержащих наиболее богатый набор биологически активных веществ (белков, аминокислот, ферментов, витаминов, минеральных веществ) бифидогенных и пробиотических веществ: лизоцима, бактериоцинов, колицинов, субтилинов и т.д.

Наиболее близким к предлагаемому является способ получения препарата для лечения радиационных поражений организма животных, предусматривающий выращивание споровой культуры Bacillus subtilis 3, получение культуральной жидкости микроба, добавление суспензиеобразующей фракции цеолита и гидролизата лактоальбумина, смешивание их в соотношении 1:1:05 соответственно. Для лечения облученных животных препарат вводят однократно подкожно в дозах 7-10 см³ (мелким) и 15-20 см³ (крупным) из расчета 6,5-7,5 мг/кг сухого вещества впервые 10 суток после облучения (патент RU 2366448, МКП А61К 38/01, опубл. 10.09.2009, Бюл №25).

Несмотря на достаточно высокую эффективность указанной композиции, ее недостатком является ограниченность применения - она используется только для лечения больных острой лучевой болезнью (ОЛБ) животных. Для профилактики ОЛБ данная композиция является неэффективной.

При создании изобретения ставилась задача получить такую композицию для защиты организма от ионизирующей радиации, которая обладала бы высокой эффективностью как для профилактики, так и для лечения радиационных поражений организма.

Поставленная задача решается тем, что в способ, включающий выращивание культур на питательных средах, добавление суспензиеобразующей монтмориллонитовой фракции, смешивание, стерилизацию и розлив во флаконы, в качестве культур используют отдельно выращенные на мясо-пептонном бульоне (МПБ) культуры E.coli шт. ПЛ-6 и споровые культуры В.subtilis шт. 3, и на среде Блаурокка - B.bifidum шт. 1, культуральные жидкости которых смешивают в соотношении 0,5:0,2:0,3 соответственно и в полученную смесь вносят 1,5*10⁹ КОЕ/мл микробы E.coli шт. ПЛ-6; 0,6*10⁹ КОЕ/мл B.bifidum шт. 1 и 0,4*10⁹ КОЕ/мл В.subtilis 3, а в качестве суспензиеобразующей монтмориллонитовой фракции вносят высокодисперсный бентонит в количестве 20-30 мг на 100 см³ композиции. Кроме того, используют бентонит, предварительно подвергнутый обработке соляной кислотой с последующим удалением дистиллированной водой растворимых солей кварца, а из оставшихся частиц бентонита отмучивают частицы монтмориллонита величиной 60-90 мкм с последующим высушиванием полученной фракции. А апизан получают путем измельчения высушенного хитинсодержащего сырья (подмора пчел), депротеинирования в 30%-ном растворе гидроокиси натрия, взятом в соотношении 1:3 в течение 6 ч при температуре 75°C, причем перед фильтрацией смеси проводят активацию хитина путем радиолиза продукта в присутствии хлорной кислоты в соотношении 4:1 на гамма - установке «Пума» в дозе 10,0 Гр при мощности дозы 3,13*10^-5 кл/кг.с, промывают дистиллированной водой, затем продукт подвергают лиофилизации.

При этом полученный радиозащитный препарат вводят животным однократно подкожно в дозах 7-10 см³ (мелким) и 15-20 см³ (крупным) из расчета 8,5-9,5 мг сухого вещества на 1 кг живой массы за 1-30 сут до (с профилактической целью) и через 1-10 сут после облучения (с лечебной целью).

Существенным отличием способа получения и применения пробиотического препарата для профилактики и лечения радиационных поражений организма животных является то, что предлагаемая композиция содержит три соматические антигены E.coli ПЛ-6, B.bifidum шт. 1 и В.subtilis шт. 3, растворимые антигены, экзо- и эндотоксины, ферменты (глюкозо-6-фосфатдегидрогеназа - 8,7 усл. ед; глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназа ГЛАФГД 10,9 усл. ед.; лактатдегидрогеназа ЛДГ - 8,9 усл. ед.; алкогольдегидрогеназа - АДГ - 9,7 усл. ед.; формиатдегидрогеназа - ФДГ - 0,5 усл. ед.; аминокислоты (лизин, 2,01%, гистидин - 1,75%, аргинин - 2,05; аспарагиновая кислота - 3,94; треонин - 1,39; серии - 1,41; глутаминовая кислота - 3,53; пролин - 1,96; цистин - 0,22; валин - 1,72; метионин - 0,46; изолейцин - 1,45; лейцин - 2,25; тирозин - 1,24; фениаланин - 1,91%), макроэлементы (калий - 14,0 г/л; натрий - 5,8; магний 1,38; железо - 1,02; медь - 0,32; цинк - 0,71; марганец - 3,42; хром - 0,11; калий 4,37; фосфор - 4,71 г/л); белки (35,3 г/л), углеводы (18,7 г/л), нуклеиновые кислоты - 8,9 г/л); витамины (мкг/мл): B₁ - 5; В₂ - 0,5; В₃ - 20; В₅ - 0,9; В₆ - 3; В₇ - 0,2; В₉ - 0,3; В₁₀ - 0,1; В₁₂ - 0,7; витамин К - 0,9; витамин Е - 13.

Таким образом, предложенная композиция, состоит из консорциума 3 видов пробиотических микроорганизмов (E.coli ПЛ-6- 1,5*10⁹ КОЕ/мл; B.bifidum1 - 0,6*10⁹ КОЕ/мл и B.subtilis3-0,4*10⁹KOE/W), содержит в своем составе соматические антигены, продукты метаболизма указанных микроорганизмов с целым набором биологически активных веществ, представленных экзо- и эндотоксинами, моно- и полисахаридами, аминокислотами, нуклеиновыми кислотами (ДНК,РНК), окислительно-восстановительными, сульфгидрильными и антиоксидантными (каталаза, пероксидаза) ферментами, антибактериальными (колицины, субтилины) веществами, макро- и микроэлементами и витаминами группы В, К и Е.

Следовательно, благодаря поликомпонентному составу предлагаемой композиции и взаимоусиливающему действию этих компонентов в условиях in vivo, она может обеспечить формирование радиорезистентности при предварительном (профилактическом) и пострадиационном (лечебном) применении препарата.

Выбор 3 таксономических отдаленных микроорганизмов в качестве основных микробных компонентов в предлагаемой композиции обусловлен тем, что кишечная палочка E.coli ПЛ-6 и продукты ее жизнедеятельности (метаболизма) стимулируют рост бифидобактерий, обладают колициногенностью (способностью синтезировать и экспрессировать в культуральную жидкость колицины - высокоактивные антибактериальные агенты, угнетающие патогенную и условно-патогенную микрофлору кишечника-источника аутоинфекции при радиационном поражении организма), оказывая тем самым радиозащитный эффект; бифидумбактерии (B.bifidum шт. 1) и продукты их метаболизма подавляют жизнедеятельность патогенной и условно-патогенной микрофлоры, особенно токсических штаммов кишечной палочки, усиленно размножающихся после облучения организма и вызывающих пострадиационную аутоинфекцию; выбор в качестве третьего компонента предлагаемой радиозащитной композиции (РЗК) - пробиотического микроорганизма - сенной палочки (В.subtilis 3) обусловлен тем, что он оказывает коррегирующее действие в сочетании с адсорбентом (цеолитом, бентонитом), связывающим и выводящим тяжелые металлы, радионуклиды, радиотоксины, способствует улучшению микроэкологических параметров в кишечнике: В.subtilis 3 - синтезирует различные ферменты (каталазу, амилазу, целлюлозу, липазу, лизоцим, протеазу) и коферменты, аминокислоты (L-изолейцин, L-лейцин, L-гистидин, L-цистеин, L-лизин, L- и D-аспарагиновую кислоту, D-глутаминовую кислоту, D-аргинин), полипептиды, пребиотические компоненты, способствующие улучшению микроэкологических условий в кишечнике, влияющие на обменные процессы и оказывающие иммуномодулирующее действие; в процессе роста на жидких питательных средах В.subtilis 3 вырабатывает антибактериальные субстанции (бактериоцины, лизоцим), наиболее высокой биологической активностью из которых обладают антибиотики бацитрацин-10,-20,-30t, субтилин, амилокабактин, протосубтилин, бацитрацины, А, В, С, Д, Е, F-F₃, которые губительно действуют на анаэробные и аэробные грамположительные микроорганизмы (см. кн. Н.П. Блинов, Общие закономерности строения и развития микробов продуцентов биологически активных веществ. - М., Медицина, 1977. - С. 184-185). Выбранные штаммы микроорганизмов в консорциуме, в отдельности обладают радиозащитными свойствами: микробный полиантиген E.coli (патент RU 2226106, A61K 39/108, 2003) при профилактическом (за 1-3 сут до облучения) применения препарата, B.bifidum (см. Хафизов, А.Р. Изыскание радиозащитных средств из класса веществ микробного происхождения: автореф. дис… канд. биол. наук / А.Р. Хафизов. - Казань, 2007. - 19 с.), В.subtilis (патент RU 2366448, - опубл. 20.09.2008) - при лечебном (через 1-10 сут после облучения) применении указанных препаратов соответственно.

В качестве антитоксического сорбента и антиоксиданта, обеспечивающего связывание и выведение низкомолекулярных токсинов (хиноидного и липидного радиотоксинов), тяжелых металлов и радионуклидов, в предлагаемом способе применяют высокоактивную, очищенную от кварца и растворимых солей, легкую (высокодисперсную) фракцию бентонита, которая в консорциуме образует невыпадающую в осадок стабильную суспензию микрочастиц бентонита-адсорбента, обеспечивающего постепенное высвобождение иммобилизованных на нем компонентов композиции: микробных клеток и пробиотических веществ, растворенных в культуральной жидкости биологически активных молекул (наночастиц): растворимых антигенов, белков, углеводов, пептидов, аминокислот, нуклеиновых кислот, ферментов; бентониты обладают сорбционными, ионообменными, молекулярно-ситовыми и каталитическими свойствами. Наличие в составе композиции уникального природного минерала-бентонита, обуславливает нормализацию моторно-эвакуаторную функцию кишечника, сорбцию токсических соединений, не вступая в соединение с витаминами, аминокислотами, белками, оставляя их в организме. Ионы токсинов, радионуклиды, содержащиеся в организме, могут включаться в кристаллическую структуру минерала, и, наоборот, из минерала организм получает те неорганические элементы, в которых испытывает потребность. Происходит так называемый селективный ионообмен. Бентонит способствует у животных, подвергнутых ионизирующей радиации, нормализации жирового, белкового, углеводного обменов, повышению иммунитета, устойчивости к стрессу. Постепенное высвобождение иммобилизованных на бентоните биологически активных компонентов радиозащитной композиции ведет к увеличению срока фармакологического действия препарата.

Включение в состав предлагаемой радиозащитной композиции природного биополимера-хитозана (апизана), обосновано тем, что он обладает уникальными свойствами (биосовместимость, нетоксичность, метоболизм - стимуляция, бактерицидность, содержание в составе белков, углеводов, аминокислот, макро- и микроэлементов); проникая в клетки макроорганизма взаимодействует с рибосомами, усиливает синтез РНК и ДНК, ферментов, регулирует деятельность желудочно-кишечного тракта, стимулирует рост Bifidobacteria - полезной микрофлоры кишечника, нарушенной в следствие пострадиационного дисбактериоза. Хитозан (апизан) обладает рядом биологических эффектов: антиоксидантный, антибактериальный, противовирусный, регенерирующий, имуностиму-лирующий, антитоксический, радиопротекторный, радиодекорпорирующий, иммуномодулирующий и т.д.

Все вышесказанное позволяет получить высокоэффективный препарат, который можно использовать как для профилактики, так и для лечения радиационных поражений организма животных.

Способ получения препарата для профилактики и лечения радиационных поражений осуществляется нижеуказанным образом.

На первом этапе получают биомассу консорциума штаммов кишечной палочки E.coli «ПЛ-6», бифидобактерий B.bifidum шт. 1 и сенной палочки В.subtilis шт. 3. Для этого указанные тест-штаммы подвергают раздельному культивированию, причем культуры штаммов «ПЛ-6» и шт. 3 культивируют на мясо-пептонном бульоне (МПБ), а шт. 1 - на среде Блаурокка. В указанные питательные среды засевают 24-часовую культуру E.coli «ПЛ-6» и 48-часовую B.bifidum шт. 1 и 7-суточную споровую культуру В.subtilis шт. 3 с посевной дозой 1*10⁷, 1*10⁸, 1*10⁹ м.к./мл соответственно для каждой культуры. Штаммы термостатируют в течение 24 ч (E.coli и В.subtilis 3) - 72 ч (B.bifidum 1) (логарифмическая фаза роста соответствующих культур) при температуре 37-38°C. По истечении указанных экспозиций, выросшие культуры фракционируют на биомассу (центрифугат) и культуральную жидкость (супернатант) путем центрифугирования взвеси при 3500 об/мин в течение 10 минут. В полученных центрифугатах каждой культуры определяют количество микробных клеток.

На втором этапе получают высокодисперсную фракцию бентонита путем его кислотной обработки (Пручкина З.В. и др. АС СССР №952260, опубл. 23.08.82). Для разрушения карбонатов, бентонитовую глину обрабатывают 1 н. соляной кислотой, а затем - 0,1 н. Образовавшиеся растворимые соли и кварц удаляют путем отмывания дистиллированной водой. Для этого глину с помощью воды переносят в вегетационные стаканы (20×12 см). На каждый стакан наносят метки: первая - на высоте 3 см от дна, вторая - на 7 см выше, третья - на 7 см выше второй. Дистиллированную воду доливают до третьей метки, взмучивают в ней цеолит и оставляют на 12 ч для отстаивания. Когда твердая часть глины оседает, а над ней остается прозрачная жидкость, то последнюю удаляют сифоном и вновь наливают дистиллированной воды до верхней метки. Когда суспензия остается во взвешенном состоянии, приступают к отмучиванию частиц величиной 60-90 мкм. Для этого в стакан наливают дистиллированную воду до верхней метки, содержимое перемешивают, через 24 ч погружают сифон на глубину 7 см и с его помощью суспензию переливают в стакан приемник. Отмучивание продолжают до просветления суспензии. В стаканы-приемники к каждой новой порции суспензии добавляют 3-4 капли концентрированной соляной кислоты для коагуляции и осаждения суспензии. Фракцию отмывают дистиллированной водой, а затем высушивают в водяной бане и используют в качестве сорбционного компонента в иммунопробиотическом препарате.

Параллельно получают природный биополимер - апизан, используемый в способе в качестве иммуномодулятора - стимулятора роста бифидобактерий, антиоксиданта, антитоксического и радиопротекторного компонента. Получают апизан согласно Патенту РФ 2649360 - опубл. 02.04.2018. Бюл. №10, для чего хитинсодержащее сырье (подмор пчел) подсушивают до влажности 4-6% и измельчают на кофемолке, затем проводят депротеинирование измельченного порошка подмора пчел с использованием 30%-ного раствора гидроокиси натрия, фильтрацию, промывку дистиллированной водой до нейтрального значения pH. Депротеирование измельченного порошка подмора пчел с использованием гидроокиси натрия в соотношении 1:3 проводят в течение 6 ч при температуре 75°C, а перед фильтрацией дополнительно осуществляют активацию хитина путем радиолиза продукта в присутствии хлорной кислоты в соотношении 4:1 на гамма - установке «Пума» в дозе 10,0 Гр при мощности экспозиционной дозы 3,13×10^-5 Кл/кг.с, а после промывки дистиллированной водой продукт подвергают лиофилизации и получают биополимер - апизан - порошок светло-коричневого цвета, растворимый в воде и содержащий 40-43% белка, 20-22% хитина, 2-3% минеральных веществ, 10-20% меланина, 8-10% влаги, 1-2% золы, с вязкостью 5-10 с ПЭ и степенью дэацетиллирования 80-85%.

На следующем этапе готовят радиозащитную композицию на основе культуральной жидкости и биомассы E.coli, B.bifidum и В.subtilis, высокодисперсной фракции бентонита - (ВДФБ) и природного биополимера -апизана.

Для составления радиозащитной композиции берут определенное количество (0,5 частей) культуральной жидкости (КЖ) E.coli ПЛ-6; 0,3 части КЖ B.bifidum 1 и 0,2 части КЖ B.subtilis3, смешивают и в полученную смесь вносят тест микробы консорциума: E.coli - 1,5*10⁹ КОЕ/мл; B.bifidum - 0,6*10⁹ КОЕ/мл и B.subtilis - 0,4*10⁹ КОЕ/мл, в нее вносят порошок высокодисперсной фракции бентонита в количестве 0,02-0,03% (20-30 мг на 100 см³ композиции) и порошок апизана - 0,007-0,010% (7-10 мг на 100 см³ композиции), определяют в ней содержание биологически активных веществ (сухого вещества), которое колеблется в пределах 78,5-79,5 мг на 1 см³ композиции, затем композицию подвергают стерилизации путем фильтрации через фильтр миллипор (размер пор 0,2 мкм) и разливают во флаконы, хранят при температуре 4-6°C.

Полученный по вышеуказанному способу радиозащитный препарат на основе соматических клеток пробиотических микроорганизмов, их продуктов метаболизма (метаболитов), высокодисперсной фракции бентонита и природного биополимера, позволяет использовать его в качестве как профилактическое, так и лечебное средство на облученных в летальных дозах лабораторных и сельскохозяйственных животных.

Радиозащитное действие предложенного многокомпонентного пробиотического препарата осуществляется путем антигенного действия соматических клеток E.coli ПЛ-6, B.bifidum 1 и B.subtilis3, иммуномодифицирующего действия синтезируемых указанными микроорганизмами биологически активных веществ (различных классов ферментов, аминокислот, пептидов, пробиотических компонентов), способствующих антигенному раздражению иммунокомпетентных клеток системы иммуногемопоэза, улучшению микроэкологических условий в кишечнике, нарушенных пострадиационным дисбактериозом, оказывающих бактериостатическое, бактерицидное действие по отношению к условно-патогенной и патогенной микрофлоре, обеспечивая питательные потребности нормальной микрофлоры кишечника и клеток макроорганизма, благодаря входящему в состав культуральных жидкостей, полученных от трех пробиотических микроорганизмов (аминокислот, нуклеиновых кислот, белка, протеинов т.д.), оказывая антитоксическое действие за счет восокоактивной фракции бентонита и апизана, связывающих и выводящих низкомолекулярные токсины (метан, сероводород, аммиак), радиотоксины (супероксидные радикалы, эпоксиды, 0-фенолы, малоновый диальдегид, продукты липопероксидации липидов, продукты распада белков и радионуклиды), нормализуя и пополняя резерв антиоксидантной системы и усиления антиоксидантной активности крови, путем перехвата и дезактивации детерминантов радиационных поражений клеток - радиомодифицированных макромолекул - супероксидных радикалов.

Способ получения и применения композиции препарата для лечения и профилактики радиационных поражений организма иллюстрируется следующими примерами.

Пример 1. Определение концентрации микробов и продуктов метаболизма тест-штаммов в культуральной жидкости. Учитывая, что существующие методы определения концентрации микробов в биомассе (титрация микробных клеток, микроскопирование, измерение сухой или сырой биомассы, определение ДНК, РНК, белка и т.д.) являются сложными, длительными и трудоемкими, мы использовали метод абсорбциометрии (определение концентрации клеток и продуктов их метаболизма в культуральной жидкости по оптической плотности микробной суспензии, измеренной на ФЭКе при длине волны 590 нм). Контролем при определении оптической плотности служил стерильный мясо-пептонный бульон (МПБ) и среда Блаурокка. Для этой цели тест микробы высевали на МПБ (E.coli, В.subtilis) и среду Блаурокка (B.bifidum), выращивали 24,48 и 72 ч и в динамике (через указанные экспозиции) брали пробы культуральной жидкости с выросшими в ней микробами и проводили измерение оптической плотности проб из каждой среды. Полученные значения оптической плотности культуральной жидкости + микробной биомассы соответствовали концентрации микробов и продуктов их метаболизма, поскольку, согласно закону Пауэлла (Powell Е.О. Continuous Cultivation of Micro-organismus / Ed.I. Malek et al. -Prague: Czechoslovae Academy of Sciences, 1964 - P. 45), между микробной биомассой (концентрацией микробов в культуральной жидкости) и количеством образовавшихся продуктов метаболизма существует прямая зависимость:

X=(1/q)(dy/dt), где

Х - количество биомассы, q - метаболический коэффициент, y - количество продукта метаболизма, t - время культивирования микроорганизма

Результаты определения оптической плотности культуральной жидкости с биомассой, полученных в результате культивирования тест-штаммов на соответствующих средах показали, что максимальное накопление биомассы E.coli ПЛ-6 (1,5*10⁹ КОЕ/мл) достигалось через 24 ч культивирования, оптическая плотность = 0,317 ед., вес сухой биомассы микробов и продуктов метаболизма 0,75 мг/мл; максимальное накопление биомассы B.subtilis3 - 0,4*10⁹ КОЕ/мл оптическая плотность - 0,301 ед. достигалась через 24 ч, максимальное накопление биомассы и продуктов метаболизма, B.bifidum1 (0,6*10⁹ КОЕ/мл) оптическая плотность 0,298 ед. достигалась через 72 ч соответственно.

Таким образом, при использовании абсорбциометрического метода определения концентрации микробов и продуктов их метаболизма в культуральной жидкости отпадает необходимость титрации микробов, их микроскопирования и определения концентрации продуктов метаболизма путем измерения сухой или сырой биомассы продуктов метаболизма.

Пример 2. Определение оптимального соотношения компонентов в предлагаемой композиции. Для этой цели получали композиции, содержащие разные объемные соотношения культуральной жидкости 1:1:1; 1:0,9:0,1; 1:0,8:0,2; 1:0,7:0,3; 1:0,6:0,4; 1:0,5:0,5; 0,5:0,5:0,05; 0,5:0,3:0,2; 0,5:0,4:0,1; 0,4:0,5:0,1; содержащие микробные клетки 0,4⋅10⁹, 0,5⋅10⁹, 0,6⋅10⁹, 0,7⋅10⁹, 0,8⋅10⁹, 0,9⋅10⁹, 1,0⋅10⁹, 1,1⋅10⁹, 1,2⋅10⁹, 1,3⋅10⁹, 1,4⋅10⁹, 1,5⋅10⁹, 1,6⋅10⁹, КОЕ/мл Е. coli ПЛ-6, В. Bifidum1, В. Subtilis3, содержащие 10, 15, 20, 24, 30 мг/мл высокодисперсной фракции бентонита и 0,003; 0,005; 0,007; 0,009; 0,010; 0,015; 0,020; 0,025 мг/мл апизана. Полученные варианты композиции испытывали на радиозащитную активность в in vitro тест-системе на летально облученных лимфоцитах путем внесения их в среду культивирования летально облученных лимфоцитов в количестве 1 мг на 10 мл культуральной среды. Установлено, что наиболее высокая выживаемость (70%) летально облученных лимфоцитов достигнута в культуральной среде после внесения в нее композиции, содержащей 0,5 частей культуральной жидкости и 1,5⋅10⁹ КОЕ/мл Е. Coli ПЛ-6; 0,3 части КЖ 0,6⋅10⁹ КОЕ/мл В. Bifidum1; 0,2 части КЖ и 0,4⋅10⁹ КОЕ/мл В. Subtilis3, 25 мг высокодисперсной фракции бентонита и 0,020 мг апизана. Любые изменения соотношений компонентов (объема культуральной жидкости, количества микробных клеток, бентонита и апизана) ведут к снижению выживаемости летально облученных лимфоцитов.

Пример 3. Определение оптимальной лечебно-диагностической дозы препарата при парентеральном (подкожном) введении.

Для определения оптимальной лечебной и профилактической дозы композиции готовили разные концентрации препарата по содержанию биологически активных веществ (БАВ), т.е. по содержанию сухого вещества. Для этого препарат подвергали лиофилизации и полученный сухой порошок разводили в стерильной кипяченой воде в концентрациях 100,0; 90,0; 80,0; 70,0; 60,0; 50,0; 25,0; 12,5; 6,25; 3,12; 1,56; 0,78; 0,39; 0,19 мг/мл. Перечисленные концентрации препарата подкожно вводили белым мышам за 24 ч до облучения (профилактический вариант) и через 24 ч - после облучения (лечебный вариант) в количестве по 0,1 мл на животное.

Установлено, что введение препарата белым мышам как до, так и после облучения в концентрациях 100,0-60,0 мг/мл выживаемость животных составляла 75-80%. Введение менее концентрированных растворов препарата сопровождается снижением радиозащитной активности препарата, которая не превышало 50%. Следовательно, оптимальной лечебной и профилактической дозой препарата является 6,0-10,0 мг/кг живой массы, что в среднем составляет 7,5-8,0 мг/кг животного.

Пример 4. Определение ареактогенности и безвредности композиционного препарата. Для этой цели полученный препарат в различных дозах (1,0; 2,0; 3,0; 4,0; 5,0; 6,0; 7,0; 8,0; 90 и 10,0 мг/кг живой массы) перорально, внутримышечно, внутривенно подкожно одно-, двух- и трехкратно с интервалом 30, 45, 60, 120 мин вводили белым мышам по 5 животных на каждый вариант опыта, учитывая также отсутствие адекватной или неадекватной реакции на препарат. Установлено, что использование препарата при всех вариантах опыта побочных реакций не вызывало: животные были активны, охотно принимали корм и воду, адекватно реагировали на естественные раздражители, что свидетельствует об ареактогенности препарата и переносимости ими использованного диапазона доз, не зависимо от пути и кратности введения.

Пример 5. Определение длительности радиозащитного действия при профилактическом применении препарата. Для этой цели на 60 белых мышах, разделенных на 6 групп по 10 животных в каждой, за 3, 7, 14, 28, 35 и 40 сут до облучения однократно подкожно вводили используемый препарат в оптимальной профилактической дозе (по 0,1 мл, 7,5 мг/кг живой массы). Через указанные сроки после введения препарата животных облучали в дозе ЛД_100/30 (7.7 Гр). В течение 30 сут после облучения за животными вели наблюдение, регистрировали кол-во павших и выживших животных. Установлено, что выживаемость животных по срокам иммунизации составляла: у иммунизированных за 3,7 и 14 сут до облучения - 80%; у иммунизированных за 28,35 и 40 сут - 70%.

Пример 6. Определение длительности радиозащитного действия при лечебном применении препарата. Опыты проводили согласно примеру 4, с той разницей, что испытуемый препарат применяли через 1, 3, 5, 7, 9, 10, 12, 14 и 16 сут после летального облучения животных. Установлено, что применение испытуемого препарата на фоне (после) облучения оказывало радиозащитный эффект, обеспечивая 80%-ную выживаемость в течение 10 сут после облучения. Отсроченное применение препарата на фоне облучения было менее эффективным - выживаемость животных снизилась, и она не превышала 50-15% (срок наблюдения - 11, 12, 13, 14, 15 и 16 сут после облучения и применения препарата).

Таким образом, предлагаемый препарат для профилактики и лечения радиозащитных поражений организма животных, обладает выраженным радиозащитным лечебно-профилактическим и биологическим эффектом и может быть использован в ветеринарной медицине для лечения и профилактики острой лучевой болезни, а так же для регуляции деятельности желудочно-кишечного тракта, стимуляции роста Bifidobacteria в кишечнике после пострадиационного дисбактериоза, в качестве антиоксидантного, антибактериального, противовирусного, иммуностимулирующего, радиодикорпорирующего средства, которое отсутствует у прототипа.

1. Способ получения препарата для профилактики и лечения радиационных поражений организма животных, включающий выращивание культур на питательной среде, добавление суспензиеобразующей монтмориллонитовой фракции, смешивание, стерилизацию и розлив во флаконы, отличающийся тем, что в качестве культур используют отдельно выращенные на мясопептонном бульоне (МПБ) культуры Е. coli шт. ПЛ-6 и споровые культуры В. subtilis шт. 3, и на среде Блаурокка бифидобактерий (В. bifidum шт. 1), культуральные жидкости которых смешивают в соотношении 0,5:0,2:0,3 соответственно, и в полученную смесь вносят 1,5⋅10⁹ КОЕ/мл микробы Е. coli ПЛ-6, 0,6⋅10⁹ КОЕ/мл В. bifidum шт. 1 и 0,4⋅10⁹ КОЕ/мл В. subtilis шт. 3, а в качестве суспензиеобразующей монтмориллонитовой фракции вносят высокодисперсный бентонит в количестве 20-30 мг на 100 см³ композиции и апизан в количестве 7-10 мг на 100 см³ композиции.

2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что используют бентонит, предварительно подвергнутый обработке соляной кислотой с последующим удалением растворимых солей кварца дистиллированной водой, а из оставшихся частиц бентонита отмучивают частицы монтмориллонита величиной 60-90 мкм с последующим высушиванием полученной фракции.

3. Способ по п. 1, отличающийся тем, что апизан получают путем измельчения высушенного хитинсодержащего сырья (подмора пчел), депротеинирования с использованием 30%-ного раствора гидроокиси натрия, взятого в соотношении 1:3, в течение 6 ч при температуре 75°C, причем перед фильтрацией смеси проводят активацию хитина путем радиолиза продукта в присутствии хлорной кислоты в соотношении 4:1 на гамма-установке «Пума» в дозе 10,0 Гр при мощности дозы 3,13⋅10^-5 Кл/кг⋅с, промывают дистиллированной водой, затем продукт подвергают лиофилизации.

4. Способ профилактики и лечения радиационных поражений организма животных осуществляют путем однократного подкожного введения препарата, полученного по пп. 1-3, в дозах 7^⋅-10 см³ (мелким) и 15-20 см³ (крупным) из расчета 8,5-9,5 мг сухого вещества на 1 кг живой массы за 1-30 сут до (с профилактической целью) и через 1-10 сут после облучения (с лечебной целью).