Способ создания тканеинженерного сосудистого имплантата на основе трубчатой биоразлагаемой полимерной матрицы из микроволокон поли(l-лактида)



Владельцы патента RU 2698133:

федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования "Первый Санкт-Петербургский государственный медицинский университет имени академика И.П. Павлова" Министерства здравоохранения Российской Федерации (RU)

Изобретение относится к биотехнологии, а именно к созданию тканеинженерного сосудистого имплантата на основе трубчатой биоразлагаемой полимерной матрицы из микроволокон поли(L-лактида). Способ включает посев клеточного материала на трубчатую биоразлагаемую полимерную матрицу из микроволокон поли(L-лактида), который осуществляют фильтрованием культуральной среды, содержащей 2×106 мезенхимальных стволовых клеток жировой ткани на 10 мм длины матрицы, вводя ее в просвет матрицы, а отфильтрованную культуральную среду собирают и процедуру ее введения повторяют по меньшей мере дважды. Затем матрицу с нанесенными клетками инкубируют в СО2-инкубаторе в течение 1 часа. Изобретение обеспечивает равномерное распределение клеток в объеме сосудистого имплантата на основе трубчатой биоразлагаемой полимерной матрицы из микроволокон поли(L-лактида). 3 пр.

 

Изобретение относится к медицине, в частности к тканевой инженерии, и может быть использовано при создании тканеинженерного сосудистого имплантата на основе трубчатой биоразлагаемой полимерной матрицы из микроволокон поли(L-лактида).

Распространенность сосудистых заболеваний и необходимость создания новых материалов для проведения операций на сосудах привели к большому количеству исследований, конечной целью которых является создание искусственной артерии или вены. Используемые в настоящее время синтетические протезы не обладают способностью к ремоделированию и росту, что создает, в частности, проблему повторных вмешательств в детской хирургии по поводу врожденных пороков сердца и сосудов.

Наиболее перспективным направлением исследований является создание тканеинженерного сосудистого имплантата (ТИСИ), т.е. искусственного сосуда, полученного методами тканевой инженерии, сосуда, который, постепенно трансформируясь, приобретал бы структуру и функцию естественного сосуда. Оптимальным результатом такого процесса должно стать развитие чувствительности клеточных составляющих имплантата к нейрогуморальному воздействию со стороны организма реципиента, способность к ремоделированию и росту, что решит многие проблемы сосудистой хирургии.

Наиболее перспективным способом разработки ТИСИ является классический метод использования биодеградируемых полимерных матриц [L'Heureux N, Dusserre N, Marini A, Garrido S, de la Fuente L, McAllister T. Technology Insight: the evolution of tissue-engineered vascular grafts-from research to clinical practice. Nat. Clin. Pract. Cardiovasc. Med. 2007; 4(7): 389-395. doi: 10.1038/ncpcardio0930]. Принцип методики вытекает из основной концепции создания любого тканеинженерного органа, которая предполагает использование биоразлагаемой матрицы, клеточного материала и специфических сигналов, моделирующих активность и судьбу клеток после вживления имплантата в организм реципиента [Langer R, Vacanti J. Tissue engineering. Science. 1993; 260(5110):920-926. doi: 10.1126/science.8493529]. Предполагается, что далее на фоне биодеградации волокон полимера произойдет образование сосудистой стенки de novo. Известно, что техника посева клеток является ключевым моментом в разработке ТИСИ.

В настоящее время разработан целый ряд методик посева и культивирования клеток на матрицах, но большинство из них занимает слишком много времени и малоприменимы в клинике [Yow К, Ingram J, Korossis S, Ingham E, Homer-Vanniasinkam S. Tissue engineering of vascular conduits. Br. J. Surg 2006; 93(6):652-661. doi:10.1002/bjs.5343]. Для масштабного производства ТИСИ необходим дешевый, надежный и эффективный способ посева.

Известен статичный способ посева клеток на матрицы. Такой вариант посева заключается в пассивном нанесении пипеткой клеточного материала на внутреннюю и внешнюю поверхности матрицы [Villalona G.A., Udelsman В., Duncan D.R., McGillicuddy Е., Sawh-Martinez R.F., Hibino N.. Painter Ch., Mirensky Т., Erickson В., Shinoka Т., Breuer Ch.K. Cell-seeding techniques in vascular tissue engineering. 2010. Tiss.Eng. B: Reviews. 16: 341-350], в результате чего не удается добиться равномерного распределения клеток как на поверхностях, так и в объеме матрицы.

Данный способ прост в использовании, однако, эффективность посева крайне низкая.

Также известен вакуумный способ посева клеток на матрицы, который заключается в том, что под действием искусственно создаваемого в пробирке вакуума происходит покрытие клетками внутренней или внешней поверхности трубчатой матрицы. [Chen М., Michaud Н., Bhowmick S.J. Controlled vacuum seeding as a means of generating uniform cellular distribution in electrospun polycaprolactone (PCL) scaffolds. Biomech Eng. 2009 Jul; 131(7):074521. Doi: 10.1115/1.3173283].

Таким образом, указанные способы обладают такими недостатками, как низкая эффективность посева и неравномерное распределение клеток в объеме матрицы. Также стоит отметить, что все известные исследования были выполнены строго для определенной модели матрицы и поэтому не могут быть экстраполированы на другие.

Техническим результатом изобретения является создание способа, обеспечивающего равномерное распределение клеток в объеме матрицы из микроволокон поли(L-лактида).

Заявленный технический результат обеспечивается выполнением способа создания тканеинженерного сосудистого имплантата на основе трубчатой биоразлагаемой полимерной матрицы из микроволокон поли(L-лактида), включающего посев клеточного материала на матрицу, согласно которому, культуральную среду, содержащую 2×106 клеток на 10 мм длины матрицы, фильтруют, вводя ее в просвет матрицы, а отфильтрованную культуральную среду собирают и процедуру ее введения повторяют, по меньшей мере, дважды, далее матрицу с нанесенными клетками инкубируют в СО2-инкубаторе в течение 1 часа.

Для разработки способа было проведено исследование, включавшее ряд этапов.

1. Изготовление матрицы.

Трубчатые матрицы на основе микроволокон поли(L-лактида) (ПЛА) Mw=50 кДа получали методом электроформования из раствора ПЛА в хлороформе на лабораторной установке Nanon-01A (Япония). Раствор ПЛА концентрацией 15 wt % с помощью инжекторного насоса подавали через электрод-фильеру в электрическое поле (V=16 kV) при расстоянии между электродами 0,15 м, осаждение волокон происходило на цилиндрическом электроде диаметром 1,1 мм. Скорость вращения последнего составляла 1500 об/мин. Получены трубчатые матрицы с внутренним диаметром 1,1 мм и толщиной стенки 320 мкм. По данным сканирующей электронной микроскопии на аппарате Supra 55VP (Carl Zeiss) в режиме регистрации вторичных электронов при ускоряющем напряжении 5 кВ выявлено, что микроволокна в структуре матрицы имеют хаотичное расположение, размеры пор между ними 75±14 мкм, что сопоставимо с размерами как мезенхимных стволовых клеток жировой ткани (МСК ЖТ), так и других соматических клеток.

2. Получение культуры мезенхимных стволовых клеток жировой ткани

Для получения первичной культуры МСК ЖТ использовали известную методику селекции по адгезии к пластику [Zhu М, Heydarkhan-Hagvall S, Hedrick М, Benhaim Р, Zuk P. Manual Isolation of Adipose-derived Stem Cells from Human Lipoaspirates. J. Vis. Exp. 2013; 79. doi: 10.3791/50585]. Для выделения клеток был использован биологический материал одной взрослой лабораторной крысы линии Вистар (масса - 255 г, самец). Полученную жировую ткань в чашке Петри механически гомогенезировали. Затем проводили энзиматическую диссоциацию клеток 0,2% раствором коллагеназы I (Gibco, США) в растворе Хенкса в термошейкере (Biosan ES-20) в течение 60 мин при 37°С. После нейтрализации действия коллагеназы добавлением 10% фетальной сыворотки крови телят (Gibco, США) суспензию центрифугировали 10 мин при 1,5 тыс.об/мин. Полученный осадок ресуспендировали полной питательной средой α-МЕМ («Панэко», Россия) с добавлением L-глютамина, 10% бычьей эмбриональной сыворотки и антибиотиков 100 ед/мл пенициллина, 100 мкг/мл стрептомицина (все реактивы Gibco, США) и культивировали в условиях СО2-инкубатора (Thermo Fisher Scientific, 3423) при температуре 37°С, концентрации СO2 5% и повышенной влажности. Через 48 ч неприкрепленные клетки, форменные элементы крови и соединительнотканную строму удаляли двукратной отмывкой фосфатно-солевым буфером (ФСБ). На 5 сутки клетки иммобилизовали 0,05% раствором трипсина (Gibco, США) и проводили пересев (1 пассаж). В дальнейшем культивирование МСК ЖТ проводили в культуральных флаконах площадью 175 см2 (Eppendorf) до достижения субконфлюентности монослоя (70% площади поверхности). Для культивирования использовали клетки 3-8 пассажей.

3. Посев МСК ЖТ на ПЛА матрицу

Посев МСК на матрицу выполняли статичным, вакуумным или разработанным фильтрационным методами. Последующее культивирование в СO2-инкубаторе проводили в пробирках-биореакторах в 10 мл питательной среды (здесь и далее α-МЕМ «Панэко», Россия) в течение 1, 3 и 7 сут. Оценку распространения клеток в объеме ПЛА матрицы выполняли с использованием флуоресцентной микроскопии (Zeiss LSM 5 PASCAL) с визуализацией ядер клеток при помощи красителя DAPI в концентрации 1 мкг/мл.

Статичный посев проводили путем нанесения суспензии клеток 2×106 МСК ЖТ в 50 мкл питательной среды на образец матрицы длиной 10 мм, при этом половину суспензии вводили в просвет графта, а вторую половину равномерно распределяли по наружной поверхности. Далее матрицу помещали в СО2-инкубатор на 1 ч, при этом каждые 15 мин выполняли ее поворот на 90 градусов вдоль продольной оси и дополнительное орошение питательной средой.

Через 1 сут. большая часть клеток располагалась отдельными локусами без существенного проникновения вглубь стенки графта. С увеличением времени распространения клеток в объеме матрицы не происходило. Через 7 суток культивирования внутренняя и, в большей степени, наружная поверхности графта были неравномерно покрыты МСК без проникновения вглубь стенки матрицы. Таким образом, статичный метод посева не обеспечивает равномерного распределения клеток в объеме матрицы.

Вакуумный посев МСК ЖТ выполняли по известной методике [Tan L., Ren Y., Kuijer R. 2012. A 1-min method for homogenous cell seeding in porous scaffolds. J. Biomat. Appl. 26: 877-889.] с определенными модификациями. В шприц объемом 3 мл помещали матрицу длиною 10 мм и клеточную суспензию 2×106 МСК ЖТ в 50 мкл питательной среды. Кроме того, в шприц забирали дополнительный объем воздуха (0.1 мл) и закрывали трехходовым краном. После этого производили оттягивание поршня шприца до отметки 3 мл с его удержанием в течение 10 с. Далее поршень возвращали в изначальное положение на 10 с. Процедуру повторяли десять раз. Шприц закрывали антибактериальным фильтром с размерами пор 0.22 мкм (Orange Scientific, Бельгия) и помещали в СО2-инкубатор на 1 ч.

При вакуумном посеве МСК ЖТ распределились в основном на внешней поверхности матрицы отдельными кластерами без значимого проникновения внутрь. Через 3 суток культивирования происходило постепенное распространение клеток по внешней поверхности графта с незначительной инвазией вглубь. Значимого улучшения распределения клеток в сторону равномерности и проникновения в объем матрицы через 7 сут не наблюдалось.

Фильтрационный посев производили путем временного пережатия одного конца матрицы длиной 10 мм пинцетом, а через второй ее конец, используя венозный катетер, подсоединенный к инсулиновому шприцу, вводили клеточную суспензию 2×106 МСК ЖТ в 50 мкл питательной среды. Отфильтрованную среду собирали в пробирку и процедуру ее введения повторяли дважды. Таким образом, стенка матрицы играла роль фильтра. При этом наружный диаметр венозного катетера точно совпадал с внутренним диаметром матрицы. При таком посеве стенка матрицы играет роль своеобразного фильтра для клеток. Через 1 сут. регистрировали формирование градиента плотности клеток от максимальной на внутренней поверхности до минимальной на внешней поверхности графта. Постепенно, через 3 сут., снижалась разница распределения клеток по плотности в толще матрицы, а через 7 сут. сформированный вначале градиент плотности практически нивелируется за счет увеличения количества клеток на периферии стенки матрицы. Исследование показало, что фильтрационный посев обеспечивает равномерное распределение МСК ЖТ в объеме матрицы.

Для разработанного фильтрационного посева МСК ЖТ на ПЛА матрицу было выполнено определение времени адгезии МСК ЖТ к ПЛА матрице и изучение оптимального числа клеток для посева на 10 мм ее длины.

Для определения времени, необходимого МСК ЖТ для прикрепления к исследуемой ПЛА матрице при выполнении фильтрационного посева, поставлена серия экспериментов. В ходе экспериментов производили фильтрационный посев фиксированного числа МСК ЖТ (2×106 МСК ЖТ в 50 мкл питательной среды) на ПЛА матрицы длиной 10 мм. Далее матрицы с МСК ЖТ помещали в СО2-инкубатор на 1, 2 или 3 ч. Затем трехкратно промывали просвет матриц раствором ФСБ, окрашивали МСК ЖТ в промывочной среде 0.4% трипановым синим (Invitrogen, США) и считали их с помощью автоматического счетчика клеток Countess II (Invitrogen, США). Подсчет МСК ЖТ в промывочном растворе показал, что большая часть клеток прикрепляется к матрице в течение первого часа: число МСК ЖТ × 103 в промывочном растворе через 1 час - 314±3; 2 часа - 356±4; 3 часа - 348±3). При увеличении времени культивирования не происходит значимого нарастания числа прикрепившихся клеток

С целью определения оптимального числа МСК ЖТ для фильтрационного посева на ПЛА матрицу длиной 10 мм использовали следующие количества клеток (×106): 0.5, 1.5, 2, 3 и 4 с последующей инкубацией в пробирке-биореакторе с питательной средой объемом 10 мл в течение 1 ч. Затем матрицы трехкратно промывали раствором ФСБ, и считали клетки как в исходной среде, так и в промывочной. Число прикрепившихся МСК ЖТ рассчитывали вычитанием из общего числа посеянных клеток числа нефиксированных МСК в исходной среде и их числа в промывочной среде. Эффективность посева определяли как отношение числа адгезировавших клеток к их исходному числу, выраженное в процентах. Было установлено, что при повышении концентрации МСК ЖТ в питательной среде при посеве происходит линейный рост числа прикрепившихся к матрице клеток, но только до определенного уровня. При исходном числе клеток более 2×106 значимого увеличения числа прикрепившихся клеток не происходит. Таким образом, оптимальным числом МСК ЖТ в клеточной суспензии, используемой для фильтрационного посева клеток, является 2×106 на 10 мм длины матрицы. Эффективность посева при этом составляет 63%.

Таким образом, доказано, что интеграция клеток с ПЛА матрицей путем фильтрационного посева, в ходе которого стенка матрицы выступает в роли своеобразного фильтра, является оптимальным технологическим решением. Показано, что при таком способе посева большая часть МСК ЖТ прикрепляется к ПЛА матрице в течение первого часа. Оптимальное количество клеток, необходимое для засевания матрицы составляет 2×106 на 1 см ее длины.

Использование заявленного способа обеспечивает равномерное распределение клеток в объеме сосудистого имплантата на основе трубчатой биоразлагаемой полимерной матрицы из микроволокон поли(L-лактида).

Способ создания тканеинженерного сосудистого имплантата на основе трубчатой биоразлагаемой полимерной матрицы из микроволокон поли(L-лактида), включающий посев клеточного материала на матрицу и последующее ее культивирование, отличающийся тем, что культуральную среду, содержащую 2×106 мезенхимальных стволовых клеток жировой ткани на 10 мм длины матрицы, фильтруют, вводя ее в просвет матрицы, а отфильтрованную культуральную среду собирают и процедуру ее введения повторяют по меньшей мере дважды, далее матрицу с нанесенными клетками инкубируют в СО2-инкубаторе в течение 1 часа.



 

Похожие патенты:

Изобретение относится к области биотехнологии, а именно к получению высокоочищенного минерального матрикса с остеоиндуктивными свойствами, предназначенного для замещения дефектов костной ткани, из биологического материала, представляющего собой костную ткань млекопитающих, и его применению.

Группа изобретений относится к области медицины и касается медицинских устройств, предназначенных для введения в живой организм. Устройство содержит небиоразлагаемый субстрат, имеющий поверхность контакта с тканями, по меньшей мере частично покрытую микрофибриллами коллагена VI, где указанные микрофибриллы придают антимикробные свойства указанной поверхности контакта с тканью.

Группа изобретений относится к области медицины, а именно к стенту для установки в тело пациента, в котором зоны ячеек снабжены покрытием из функционального материала, где указанный функциональный материал представляет собой полимер, выбранный из группы, состоящей из желатина, полигликолевой кислоты/полимолочной кислоты, поликапролактона, полигидроксибутирата/валерата, полиортоэфира, полиэтиленоксида/полибутилентерефталата, полиуретана, полидиметилсилоксана, силикона, полиэтилентерефталата, политетрафторэтилена и вспененного политетрафторэтилена, в котором объем покрытия в зоне ячейки задан уравнением (1): Vsa=Asa×lscx, где Vsa - усредненный объем стабильного покрытия в расчете на один узел, под которым понимается переплетение или скрещение элементов стента, Asa - усредненная площадь стабильного участка покрытия в расчете на один узел, a lscx - стабильная осевая длина ячейки; и к стенту, в котором объем покрытия зоны ячейки задан уравнением (20): V=2R×(lcx-2R)×h, где R - радиус осевого конца ячейки, lcx - осевая длина ячейки, h - толщина или высота ячейки.

Изобретение относится к области биотехнологии, в частности к композиции для изготовления биодеградируемых скаффолдов, и способу ее получения. Способ включает смешение суспензии микрочастиц межклеточного матрикса размером менее 0,5 мм одной ткани млекопитающего с водным раствором фиброина шелка при соотношении компонентов: водный раствор фиброина шелка 10-95 мас.% и микрочастицы межклеточного матрикса размером менее 0,5 мм 90-5 мас.%.

Изобретение относится к биотехнологии, в частности к получению биодеградируемых скаффолдов. Способ включает смешение водного раствора фиброина шелка с микрочастицами межклеточного матрикса размером менее 0,5 мм при соотношении компонентов водный раствор фиброин шелка 10-95 масс.
Изобретение относится к полимерной промышленности и может быть использовано для медицинских имплантов и культивирования клеток. Осуществляют модификацию поверхности изделий из полилактида путем функционализации гидроксильными группами посредством обработки высокочастотной плазмой разряда инертного газа.

Изобретение относится к способу нанесения покрытия на поверхность. Техническим результатом является улучшение несущей способности имплантов для использования, например, имплантов тазобедренных суставов.
Изобретение относится к области медицины, а именно к полимерным композициям для нанесения на эндопротезы в виде нерассасывающихся хирургических нитей и нерассасывающихся хирургических сеток для реконструктивно-восстановительной хирургии.

Изобретение относится к инновационным смазочным покрытиям на основе силикона для медицинских устройств. Композиция для нанесения смазочного силиконового покрытия содержит поперечносшиваемый силиконовый полимер, имеющий реакционноспособные функциональные группы; несшиваемый силиконовый полимер, причем указанный полимер имеет средневесовую молекулярную массу более приблизительно 200000; силиконовый поперечносшивающий агент; и катализатор, в которой катализатор содержит комплекс платина-дивинилтетраметилдисилоксан-этинилциклогексанол, имеющий формулу Pt[(CH2=CH)(Me)2Si]2O⋅C6H10(OH)(C≡CH).

Группа изобретений относится к медицине. Описано устройство, имеющее поверхность, содержащую слоистое покрытие, в котором внешний слой покрытия содержит множество молекул катионного сверхразветвленного полимера, характеризующихся (i) наличием центрального фрагмента с молекулярной массой 14-1,000 Да, (ii) общей молекулярной массой 1,500-1,000,000 Да, (iii) отношением общей молекулярной массы к молекулярной массе центрального фрагмента по меньшей мере 80:1; и (iv) наличием концевых функциональных групп, где одна или несколько из указанных концевых функциональных групп ковалентно связаны с антикоагулянтным объектом.

Изобретение относится к медицине, а именно к офтальмологии и может быть использовано для получения трансплантат-коллагенового материала требуемой жесткости для выполнения склеропластических хирургических вмешательств.

Изобретение относится к медицине. Устройство для рефиксации сухожилий мышц к костям включает корпус с шероховатой поверхностью, ножками и отверстиями для фиксации сухожилий.

Изобретение относится к медицине. Устройство состоит из винта, шайбы и гильзы.

Изобретение относится к медицинской технике, а именно к устройствам для увеличения размеров и коррекции изгиба полового органа без хирургического вмешательства. Изобретение позволяет наиболее надежно, безболезненно и безвредно для здоровья длительное время удерживать половой орган в вытянутом с усилием положении, обеспечив при этом простоту конструкции, комфортность в использовании и возможность носить устройство незаметно для окружающих.

Изобретение относится к области медицины, в частности к урологии, и может быть использовано в качестве кожного имплантата при иссечения IPP (пластического затвердения пениса) бляшки, возникающей в результате болезни Пейрони.

Группа изобретений относится к медицине. Способ соединения по меньшей мере двух пластинчатых пружин протеза стопы, при котором пластинчатые пружины удерживают ориентированно относительно друг друга в выравнивающем устройстве с образованием промежуточного пространства между пластинчатыми пружинами, при этом выравнивающее устройство и пластинчатые пружины образуют совместно полое пространство, которое соединено по меньшей мере с одним подводящим входом с возможностью прохождения текучей среды, через который в полое пространство вводят клей для склеивания пластинчатых пружин.

Изобретение относится к медицине. Протез голени содержит приемную гильзу, стойку голени, стопу, в которой плоская изогнутая пружина образует переднюю часть стопы, а заднюю часть стопы дополняет неподвижно соединенная с опорной поверхностью упругая пластина.

Изобретение относится к области медицины. Способ хирургического лечения деструктивных заболеваний позвоночника заключается в том, что для замещения, образовавшегося в ходе резекции позвонков дефекта, используется композиционный имплантат представленный: двумя опорными дисками из пористого биоинертного материала, между которыми располагается сетчатая распорка контейнерного типа, заполненная костным цементом с антибиотиком.

Группа изобретений относится к медицине. Устройство для введения интраокулярной линзы может включать часть накопления энергии, исполнительную часть, которая обеспечивает температурную компенсацию, и часть для поддержки линзы.

Изобретение относится к медицине. Абсорбируемое устройство для соединения и восстановления связки содержит центральный восстановительный участок и две соединительные головки, расположенные на концах указанного центрального участка.

Изобретение относится к биотехнологии, а именно к созданию тканеинженерного сосудистого имплантата на основе трубчатой биоразлагаемой полимерной матрицы из микроволокон поли. Способ включает посев клеточного материала на трубчатую биоразлагаемую полимерную матрицу из микроволокон поли, который осуществляют фильтрованием культуральной среды, содержащей 2×106 мезенхимальных стволовых клеток жировой ткани на 10 мм длины матрицы, вводя ее в просвет матрицы, а отфильтрованную культуральную среду собирают и процедуру ее введения повторяют по меньшей мере дважды. Затем матрицу с нанесенными клетками инкубируют в СО2-инкубаторе в течение 1 часа. Изобретение обеспечивает равномерное распределение клеток в объеме сосудистого имплантата на основе трубчатой биоразлагаемой полимерной матрицы из микроволокон поли. 3 пр.

Наверх