Противоящурная вакцина

Группа изобретений относится к медицине и касается иммуногенной композиции, содержащей антигенный компонент и адъювантный компонент. При этом а) адъювантный компонент содержит эмульсию, содержащую масло, иммуностимулирующий олигонуклеотид, содержащий CpG, и диэтиламиноэтил(ДЭАЭ)-декстран и б) антигенный компонент содержит 0,5-10 мкг композиции вируса FMD (ящур) на дозу. Также предложны способ лечения или предупреждения поражений, индуцированных FMD у животного, способ содержания стада и способ снижения частоты персистенции FMD у жвачного животного. Группа изобретений обеспечивает 100% эффективную защиту жвачного животного от ящура при использовании указанной композиции, содержащей низкое количество антигенного компонента композиции вируса FMD на дозу. 4 н. и 25 з.п. ф-лы, 1 ил., 8 табл., 2 пр.

 

ПРЕДШЕСТВУЮЩИЙ УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

Ящур (FMD) представляет собой высококонтагиозное вирусное заболевание парнокопытных, включая домашних животных (крупный рогатый скот, свиней, овец, коз и других) и ряд диких животных. Наиболее выраженные симптомы заболевания у крупного рогатого скота, инфицированного FMD, включают везикулярные поражения эпителия ротовой полости, языка, вымени и конечностей. Хотя считается, что в некоторых странах, к которым относятся Соединенные Штаты, Канада, Мексика, Австралия и большая часть Европы, FMD не встречается, заболевание широко распространено в мире и оказывает значительное экономическое влияние на экспортную индустрию. Действительно, за последнее десятилетие было отмечено несколько экономически разорительных вспышек заболевания практически на каждом континенте.

В настоящее время в процессе производства противоящурной вакцины, содержащей убитый антиген, выращивают большие объемы (тысячи литров) вирулентных штаммов вируса FMD, адаптированных для роста в клетках, что требует обязательного обеспечения биологической безопасности и иногда может оказаться затруднительным. Произошедшая в ходе такого процесса утечка вирулентного вируса со скотоводческой фермы вызвала вспышки заболевания среди сельскохозяйственных животных, которые дорого обошлись (см. Cottam et al. 2008. PLoS Pathogen 4:1-8). После культивирования вирус подвергают химической инактивации и готовят концентраты антигена, а затем удаляют контаминирующие белки на последующих стадиях очистки. Дифференциация инфицированных и вакцинированных животных с помощью серологических диагностических тестов затруднительна. Перекрестный иммунитет между серотипами и подтипами незначителен или отсутствует, поэтому для обеспечения защиты вакцина должна соответствовать полевым штаммам. Несмотря на эти недостатки вакцин, ежегодно в мире выпускают миллионы доз. Их применение в ходе массовых кампаний вакцинации легло в основу эрадикации вируса FMD в Европе и борьбы с заболеванием во многих частях земного шара. Создание генетически модифицированных вирусов, содержащих остов и необходимые сайты рестрикции, позволяет отчасти устранить недостатки инактивированных вакцин, поскольку сайты рестрикции служат локусами встраивания белков капсида различных штаммов вируса FMD. Однако на стоимость антигена приходится наибольшая доля в стоимости противоящурных вакцин и большинства других вакцин.

Борьбу с FMD еще больше осложняет феномен персистенции вируса. Если говорить коротко, как показывает опыт, инактивированные противоящурные вакцины не были способны предотвратить персистенцию или состояние носительства (выделение вируса через 28 дней после инфицирования и/или контакта с вирусом). Животные, выделяющие вирус, могут не иметь симптомов FMD, однако оставаться источником инфицирования FMD других животных. В этой связи, общепринятые мероприятия по борьбе с заболеванием требуют убоя всех животных в вакцинированном стаде, даже если у них не наблюдается клинических признаков заболевания.

Таким образом, по-прежнему существует потребность в способах и композициях, позволяющих получить вакцины с уменьшенной антигенной нагрузкой без ущерба для эффективности и/или сокращения персистенции или элиминации FMD.

СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

В одном аспекте изобретения предложена иммуногенная композиция, содержащая антигенный компонент и адъювантный компонент, где адъювантный компонент содержит эмульсию, содержащую маслянистую фазу, указанная маслянистая фаза составляет по меньшей мере 50% об./об. указанной иммуногенной композиции, иммуностимулирующий олигонуклеотид и по меньшей мере один поликатионный полимер; источник алюминия; и антигенный компонент содержит антигенную композицию вируса FMD в количестве, эквивалентном 0,5-8 мкг вируса FMD на дозу.

В некоторых воплощениях иммуностимулирующий олигонуклеотид представляет собой CpG-содержащий олигонуклеотид. В некоторых воплощениях поликатионный полимер представляет собой ДЭАЭ-декстран.

В различных воплощениях антиген представляет собой композицию вируса FMD и присутствует в количестве 0,5-4 мкг на дозу или 0,5-2 мкг на дозу или 0,5-1 мкг на дозу, или в количестве приблизительно 0,5 мкг на дозу.

Вирус FMD может быть инактивированным или аттенуированным. В некоторых воплощениях вирус FMD представляет собой инактивированный штамм вируса FMD А24 Cruzeiro. В отдельных воплощениях инактивированный штамм представляет собой генетически модифицированный штамм, имеющий делецию области, кодирующей лидерный белок (LL) и, необязательно, содержит отрицательные антигенные маркеры.

В некоторых воплощениях генетически модифицированный вирус содержит белки капсида гетерологичного штамма.

В другом аспекте изобретения предложен способ предупреждения FMD у животного, которому это необходимо, способ включает введение указанному животному иммуногенной композиции по воплощениям предыдущего аспекта. В различных воплощениях животное выбрано из крупного рогатого скота, овец, свиней и коз.

В другом аспекте изобретения предложен способ снижения частоты персистенции вируса FMD у жвачного животного, инфицированного вирусом FMD, включающий введение перед инфицированием указанному жвачному животному иммуногенной композиции, содержащей антигенный компонент и адъювантный компонент, где адъювантный компонент содержит эмульсию, содержащую маслянистую фазу, указанная маслянистая фаза составляет по меньшей мере 50% об./об. указанной иммуногенной композиции, иммуностимулирующий олигонуклеотид в количестве 75-200 мкг на дозу и поликатионный полимер в количестве 75-200 мг на дозу; а антигенный компонент содержит антиген вируса FMD в количестве, эквивалентном 6-10 мкг вируса FMD на дозу.

В следующем аспекте изобретения предложен способ содержания стада, включающий введение животным в указанном стаде иммуногенной композиции, содержащей антигенный компонент и адъювантный компонент, где адъювантный компонент содержит эмульсию, содержащую маслянистую фазу, указанная маслянистая фаза составляет по меньшей мере 50% об./об. указанной иммуногенной композиции, иммуностимулирующий олигонуклеотид в количестве 75-200 мкг на дозу и поликатионный полимер в количестве 75-200 мг на дозу; а антигенный компонент содержит антиген вируса FMD в количестве, эквивалентном 6-10 мкг вируса FMD на дозу, где при подозрении на контакт с инфекцией FMD не забивают вакцинированных членов стада.

В изобретении также предложен способ содержания стада, включающий введение животным в указанном стаде иммуногенной композиции, содержащей антигенный компонент и адъювантный компонент, где адъювантный компонент содержит эмульсию, содержащую маслянистую фазу, указанная маслянистая фаза составляет по меньшей мере 50% об./об. указанной иммуногенной композиции, иммуностимулирующий олигонуклеотид в количестве 75-200 мкг на дозу и поликатионный полимер в количестве 75-200 мг на дозу; а антигенный компонент содержит антиген вируса FMD в количестве, эквивалентном 6-10 мкг вируса FMD на дозу, где при подозрении на контакт с инфекцией FMD вакцинированных членов стада помещают на карантин в течение 0-62 суток.

В изобретении также предложен способ содержания стада, включающий введение животным в указанном стаде иммуногенной композиции, содержащей антигенный компонент и адъювантный компонент, где адъювантный компонент содержит эмульсию, содержащую маслянистую фазу, указанная маслянистая фаза составляет по меньшей мере 50% об./об. указанной иммуногенной композиции, иммуностимулирующий олигонуклеотид в количестве 75-200 мкг на дозу и поликатионный полимер в количестве 75-200 мг на дозу; а антигенный компонент содержит антиген вируса FMD в количестве, эквивалентном 6-10 мкг вируса FMD на дозу, где при подозрении на контакт с инфекцией FMD вакцинированных членов стада выводят за пределы инфицированной зоны.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ГРАФИЧЕСКИХ МАТЕРИАЛОВ

Фиг. 1 демонстрирует различие в качестве антигенов, преципитированных ПЭГ и концентрированных с использованием полых волокон.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Определения

Термины «примерно» или «приблизительно», используемые применительно к измеряемому численному значению, относятся к указанному значению переменной и ко всем значениям переменной, которые находятся в пределах экспериментальной ошибки указанного значения (например, в пределах 95% доверительного интервала для среднего значения) или в пределах 10 процентов от указанного значения, в зависимости от того, которое из них больше, кроме случаев, когда «примерно» используют применительно к временным интервалам в неделях, где «примерно 3 недели» означает от 17 до 25 дней, а примерно от 2 до 4 недель означает от 10 до 40 дней.

«Адъювант» означает любое вещество, которое усиливает гуморальный или клеточный иммунный ответ на антиген. Адъюванты обычно используют в двух целях: контролируемое высвобождение антигенов из участка инъекции и стимуляция иммунной системы.

«Антитело» относится к молекуле иммуноглобулина, которая способна связываться со специфическим антигеном в результате иммунного ответа на этот антиген. Иммуноглобулины представляют собой сывороточные белки, состоящие из «легкой» и «тяжелой» полипептидных цепей, имеющих «константные» и «вариабельные» области, которые подразделяют на классы (например, IgA, IgD, IgE, IgG, и IgM) в зависимости от состава константных областей.

«Антиген» или «иммуноген» относится к любому веществу, которое распознается иммунной системой животного и вызывает иммунный ответ. Термин охватывает убитые, инактивированные, аттенуированные или модифицированные живые бактерии, вирусы или паразиты. Термин «антиген» также охватывает полинуклеотиды, полипептиды, рекомбинантные белки, синтетические пептиды, экстракты белков, клетки (включая опухолевые клетки), ткани, полисахариды или липиды, или их фрагменты, как по-отдельности, так и в любой комбинации. Термин антиген также охватывает антитела, такие как анти-идиотипические антитела или их фрагменты и синтетические пептидные мимотопы, которые имитируют антиген или антигенную детерминанту (эпитоп).

«Буфер» означает химическую систему, предупреждающую изменение концентрации другого химического вещества, например, системы донора и акцептора протонов служат в качестве буферов, предупреждающих значимые изменения в концентрации ионов водорода (pH). Другим примером буфера является раствор, содержащий смесь слабой кислоты и ее соли (сопряженного основания) или слабого основания и его соли (сопряженной кислоты).

«По существу состоящий из» применительно к композициям адъюванта относится к композициям, которые не содержат дополнительных адъювантных или иммуномодулирующих агентов, помимо указанных, в количестве, в котором указанный агент проявляет измеримые адъювантные или иммуномодулирующие эффекты.

«Доза» относится к вакцине или иммуногенной композиции, вводимой субъекту. «Первая доза» или «примирующая вакцина» относится к дозе, в которой указанную композицию вводят на 0 сутки. «Вторая доза» или «третья доза» или «годовая доза» относится к количеству такой композиции, которую вводят после первой дозы, которая может представлять собой ту же самую вакцину или иммуногенную композицию, как и первая доза, или иную.

В данном описании часто используют термин «эмульгатор». Он охватывает вещества, которые обычно считают эмульгаторами, например, различные продукты из линейки продукции TWEEN® или SPAN® (эфиры жирных кислот и полиэтоксилированного сорбита и замещенные жирными кислотами сорбитановые поверхностно-активные вещества, соответственно) и различные усилители растворимости, такие как ПЭГ-40 касторовое масло или другие пегилированные гидрогенизированные масла.

«Гуморальный иммунный ответ» относится к иммунному ответу, опосредованному антителами.

«Иммунный ответ» субъекта относится к развитию гуморального иммунного ответа, клеточного иммунного ответа или гуморального и клеточного иммунного ответа на антиген. Иммунные ответы обычно определяют с использованием стандартных иммунологических анализов и анализов на нейтрализацию, известных в области техники.

«Иммунологически эффективное количество антигена» или «эффективное количество антигена, вызывающее иммунный ответ» представляет собой количество, эффективное для индукции иммунологического ответа реципиента. Иммунологический ответ может быть достаточным для диагностических целей или других исследований, или может быть адекватным для предупреждения признаков или симптомов заболевания, включая неблагоприятные воздействия на здоровье или их осложнения, вызванные инфицированием болезнетворным агентом. Может происходить индукция гуморального иммунитета или клеточно-опосредованного иммунитета, или и того, и другого. Иммуногенный ответ животного на иммуногенную композицию можно оценивать, например, косвенным образом, через измерение титров антител, лимфопролиферативных анализов, или напрямую, отслеживая признаки и симптомы после воздействия штамма дикого типа, тогда как защитный иммунитет, обеспечиваемый вакциной, можно оценивать путем измерения, например, уменьшения клинических признаков, таких как смертность, заболеваемость, температура, общее физическое состояние и общее состояние здоровья и активности субъекта. Иммунный ответ может включать, без ограничения, индукцию клеточного и/или гуморального иммунитета.

«Иммуногенный» означает индукцию иммунного или антигенного ответа. Таким образом, иммуногенная композиция может быть любой композицией, индуцирующей иммунный ответ.

«Инфицированная территория» обозначает территорию, где на основании лабораторных тестов, соответствующих клинических признаков, определения термина «случай FMD» и международных стандартов обнаружены подозрительные или подтвержденные случаи заболевания.

«Инфицированная зона» относится к области в пределах 3 км за периметром инфицированных или подозреваемых в инфицировании территорий.

«Липиды» относятся к любой группе органических соединений, включая жиры, масла, воски, стерины и триглицериды, нерастворимые в воде, но растворимые в неполярных органических растворителях, маслянистых на ощупь и вместе с углеводами и белками составляющих основной структурный материал живых клеток.

«Фармацевтически приемлемый» относится к веществам, которые с медицинской точки зрения подходят для применения в контакте с тканями субъекта, без чрезмерной токсичности, раздражения, аллергического ответа и т.п., с адекватным соотношением пользы к риску и эффективные при их предполагаемом применении.

«TCID50» относится к «инфицирующей дозе культуры ткани», которую определяют, как разведение вируса, инфицирующее 50% данной партии инокулированных клеточных культур. Для расчета TCID50 можно использовать различные способы, включая метод Спирмена-Кербера, который используют в данном документе. Описание метода Спирмена-Кербера можно найти, например, у В.W. Many & Н.О. Kangro, Virology Methods Manual, p. 25-46 (1996).

У животных с персистирующей инфекцией или животных-носителей вирус FMD выделяется через 28 суток после инфицирования или клинического проявления заболевания.

Композиции адъювантов и способы получения

В данном описании изложено несколько композиций адъювантов, подходящих для данного изобретения. Общей характеристикой данных адъювантов является наличие масла и одного или более эмульгаторов, где маслянистая фаза составляет по меньшей мере 50% композиции вакцины, включающей композиции адъювантов, изложенные в данном описании.

Для применения в данном изобретении подходят различные масла и их комбинации. Данные масла включают, без ограничения, масла животного происхождения, масла растительного происхождения, а также неметаболизируемые масла. Неисчерпывающими примерами растительных масел, подходящих для применения в данном изобретении, являются кукурузное масло, арахисовое масло, соевое масло, кокосовое масло и оливковое масло. Неисчерпывающим примером масла животного происхождения является сквалан. Подходящие неисчерпывающие примеры неметаболизируемых масел включают легкое минеральное масло, насыщенные масла с линейной или разветвленной цепью и т.п.

В ряде воплощений масло, которое применяют в композициях адъювантов по данному изобретению, представляет собой легкое минеральное масло. В данном описании термин «минеральное масло» относится к смеси жидких углеводородов, полученных из остаточных нефтяных масел методом перегонки. Термин является синонимом «сжиженного парафина», «жидкого вазелина» и «белого минерального масла». Термин также охватывает «легкое минеральное масло», т.е. масло, которое получают аналогичным образом путем перегонки остаточных нефтяных масел, но которое имеет несколько меньшую относительную плотность по сравнению с белым минеральным маслом. См., например, Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th Edition (Easton, Pa.: Mack Publishing Company, 1990, на с. 788 и 1323). Минеральное масло можно получать из различных коммерческих источников, например, J.Т. Baker (Phillipsburg, Pa.) or USB Corporation (Cleveland, Ohio). Предпочтительное минеральное масло представляет собой минеральное масло, которое можно приобрести под коммерческим наименованием DRAKEOL®.

В некоторых воплощениях, наиболее подходящих для предупреждения или элиминации персистенции вируса FMD, маслянистая фаза присутствует в количестве от 50% до 95% от объема; предпочтительно в количестве, превышающем от 50% до 85%; более предпочтительно, в количестве, превышающем от 50% до 60%, и более предпочтительно, в количестве, превышающем 50-52% об./об. композиции вакцины. Маслянистая фаза включает масло и эмульгаторы (например, SPAN® 80, TWEEN® 80 и др.), если присутствуют какие-либо эмульгаторы. Объем маслянистой фазы рассчитывают, как сумму объемов масла и эмульгатора(ов). Так, например, если объем масла составляет 40%, а объем эмульгатора(ов) составляет 12% композиции, маслянистая фаза будет составлять 52% об./об. композиции. Аналогично, если масло присутствует в количестве 45%, а объем эмульгатор(ы) присутствует(ют) в количестве приблизительно 6% композиции, маслянистая фаза будет составлять 51% об./об. композиции.

Также следует принимать во внимание, что поскольку адъюванты по данному изобретению составляют только часть вакцин по данному изобретению, маслянистая фаза присутствует в количестве от 50% до 95% от объема; предпочтительно в количестве, превышающем от 50% до 85%; более предпочтительно, в количестве от 50% до 60%, и более предпочтительно, в количестве 50-52% об./об. каждого из адъювантов по данному изобретению.

В некоторых воплощениях маслянистая фаза присутствует в количестве, от 50% до 95% от объема; предпочтительно в количестве, превышающем от 50% до 85%; более предпочтительно, в количестве, превышающем от 50% до 60%, и более предпочтительно, в количестве, превышающем 50-52% об./об. композиции вакцины. Так, например, без ограничений, масло может присутствовать в количестве 45%, а растворимый в липидах эмульгатор будет присутствовать в количестве, превышающем 5% об./об. Следовательно, суммарное объемное процентное содержание масла и растворимого в масле эмульгатора будет по меньшей мере 50%.

В другой подгруппе, применимой ко всем вакцинам по изобретению, объемное процентное содержание масла составляет более 40%, например, от 40% до 90% от объема; от 40% до 85%; от 43% до 60%, 44-50% об./об. композиции вакцины.

Эмульгаторы, подходящие для применения в данных эмульсиях, включают естественные биологически совместимые эмульгаторы и искусственные синтетические поверхностно-активные вещества. Биологически совместимые эмульгаторы включают фосфолипидные соединения или смесь фосфолипидов. Предпочтительными фосфолипидами являются фосфатидилхолины (лецитин), такие как соевый и яичный лецитин. Лецитин можно получать в виде смеси фосфатидов и триглицеридов путем водной отмывки неочищенных растительных масел и разделения, и высушивания полученных гидратированных смол. Очищенный продукт можно получать путем фракционирования смеси нерастворимых в ацетоне фосфолипидов и гликолипидов, остающихся после удаления триглицеридов и растительных масел путем отмывки ацетоном. В альтернативном варианте лецитин можно получать из различных коммерческих источников. Другие подходящие фосфолипиды включают фосфатидилглицерин, фосфатидилинозитол, фосфатидилсерин, фосфатидную кислоту, кардиолипин и фосфатидилэтаноламин. Фосфолипиды можно выделять из естественных источников или синтезировать стандартным способом.

В дополнительных воплощениях эмульгаторы, применяемые в данном изобретении, не включают лецитин или применяют лецитин в количестве, которое не является иммунологически эффективным.

Неприродные синтетические эмульгаторы, подходящие для применения в композициях адъювантов по данному изобретению, включают неионные поверхностно-активные вещества на основе сорбитана, например, замещенные жирными кислотами сорбитановые поверхностно-активные вещества (доступные для приобретения под наименованиями SPAN® или ARLACEL®), сложные эфиры жирных кислот и полиэтоксилированного сорбита (TWEEN®), сложные эфиры полиэтиленгликоля и жирных кислот из таких источников, как касторовое масло (EMULFOR®); полиэтоксилированные жирные кислоты (например, стеариновую кислоту, доступную под наименованием SIMULSOL® М-53), сополимер полиэтоксилированного изооктилфенола и формальдегида (TYLOXAPOL®), полиоксиэтиленовые эфиры жирного спирта (BRIJ®); нонилфениловые эфиры полиоксиэтилена (TRITON® N), изооктилфениловые эфиры полиоксиэтилена (TRITON® X). Предпочтительные синтетические поверхностно-активные вещества представляют собой поверхностно-активные вещества, доступные под названиями SPAN® и TWEEN®, такие как TWEEN®-80 (полиоксиэтилен (20) сорбитан моноолеат) и SPAN®-80 (сорбитан моноолеат).

В сущности, эмульгатор(ы) могут присутствовать в композиции вакцины в количестве от 0,01% до 40% от объема, предпочтительно, от 0,1 до 15%, более предпочтительно, от 2% до 10%.

Дополнительные ингредиенты, присутствующие в предложенных композициях адъювантов, включают катионные носители, иммуностимулирующие олигонуклеотиды, монофосфолипид А и его аналоги (MPL-A), полиинозиновую:полицитидиловую кислоту (poly I:C), сапонины, четвертичные аммонии, стерины, гликолипиды, источник алюминия (например, REHYDRAGEL® или влажный гель VAC 20®) и их комбинации.

Подходящие поверхностно-активные катионные носители включают, без ограничения, декстран, ДЭАЭ-декстран (и его производные), ПЭГи, гуаровые камеди, производные хитозана, производные полицеллюлозы, такие как гидроксиэтилцеллюлоза (НЕС), полиэтиленимин, полиаминокислоты, такие как полилизин и т.п.

Подходящие иммуностимулирующие олигонуклеотиды включают олигонуклеотиды ODN (на основе ДНК), ORN (на основе РНК) или химерные структуры ODN-ORN, которые могут иметь модифицированный остов, включая, без ограничений, фосфоротиоатные модификации, галогенирование, алкилирование (например, модификации этил- или метил-) и фосфодиэфирные модификации. В некоторых воплощениях можно применять полиинозиновую-полицитидиловую кислоту или ее производное (poly I:C).

CpG-олигонуклеотиды представляют собой недавно описанный класс фармакотерапевтических агентов, которые характеризуются наличием неметилированного динуклеотида CG в определенном нуклеотидном окружении (CpG-мотив). (Hansel ТТ, Barnes PJ (eds): New Drugs for Asthma, Allergy and COPD. Prog Respir Res. Basel, Karger, 2001, vol 31, pp 229-232, содержание документа включено путем ссылки). Данные мотивы CpG не обнаруживаются в ДНК эукариот, где динуклеотиды CG снижены, а когда они присутствуют, обычно они метилированы, но присутствуют в бактериальной ДНК, которой они придают иммуностимулирующие свойства.

В отдельных воплощениях адъюванты по данному изобретению используют так называемые иммуностимулирующие олигонуклеотиды Р-класса, более предпочтительно, модифицированные иммуностимулирующие олигонуклеотиды Р-класса, еще более предпочтительно, Е-модифицированные иммуностимулирующие олигонуклеотиды Р-класса. Иммуностимулирующие олигонуклеотиды Р-класса представляют собой CpG-олигонуклеотиды, характеризующиеся наличием палиндромов, обычно, длиной 6-20 нуклеотидов. Олигонуклеотиды Р-класса обладают способностью спонтанно самоассоциироваться в конкатамеры in vitro и/или in vivo. Эти олигонуклеотиды, в строгом понимании, являются одноцепочечными, но наличие палиндромов позволяет образоваться конкатамерам или, возможно, структурам стебель-петля. Общая длина иммуностимулирующих олигонуклеотидов Р-класса составляет от 19 до 100 нуклеотидов, например, 19-30 нуклеотидов, 30-40 нуклеотидов, 40-50 нуклеотидов, 50-60 нуклеотидов, 60-70 нуклеотидов, 70-80 нуклеотидов, 80-90 нуклеотидов, 90-100 нуклеотидов.

В одном аспекте изобретения иммуностимулирующий олигонуклеотид содержит 5' домен активации TLR и по меньшей мере два палиндромных повтора, одна палиндромная область представляет собой 5' палиндромную область по меньшей мере 6 нуклеотидов длиной, соединенную напрямую или через спейсер с 3' палиндромной областью по меньшей мере 8 нуклеотидов длиной.

Иммуностимулирующие олигонуклеотиды Р-класса могут быть модифицированы согласно известным в области техники способам. Например, J-модификация означает нуклеотиды, модифицированные йодом. Е-модификация обозначает этил-модифицированный(е) нуклеотид(ы). Так, Е-модифицированные иммуностимулирующие олигонуклеотиды Р-класса представляют собой иммуностимулирующие олигонуклеотиды Р-класса, где по меньшей мере один нуклеотид (предпочтительно, 5' нуклеотид) этилирован. Дополнительные модификации включают присоединение 6-нитро-бензимидазола, О-метилирование, модификацию проинил-dU, модификацию инозином, присоединение 2-бромвинила (предпочтительно, к уридину).

Иммуностимулирующие олигонуклеотиды Р-класса также могут содержать модифицированную межнуклеотидную связь, включая, без ограничения, фосфодиэфирные связи и фосфоротиоатные связи. Олигонуклеотиды по данному изобретению могут быть синтезированы или получены из коммерческих источников.

Олигонуклеотиды Р-класса и модифицированные олигонуклеотиды Р-класса более подробно описаны в опубликованной международной заявке согласно РСТ WO2008/068638, опубликованной 12 июня 2008. Подходящие не являющиеся исчерпывающими примеры модифицированных иммуностимулирующих олигонуклеотидов Р-класса представлены ниже («*» обозначает фосфоротиоатную связь, а «-» обозначает фосфодиэфирную связь).

Количество иммуностимулирующего олигонуклеотида Р-класса для применения в композициях адъювантов зависит от природы используемого иммуностимулирующего олигонуклеотида Р-класса и от целевого биологического вида.

Помимо масла и эмульгатора(ов) композиции адъювантов также содержат (или по существу состоят из, или состоят из) комбинацию иммуностимулирующего олигонуклеотида и поликатионного носителя. Эти адъюванты обозначены «ТХО».

В ряде воплощений адъюванты ТХО могут также включать в себя источник алюминия, такой как гель Al(OH)3. Адъюванты ТХО с алюминием обозначаются «ТХО-А».

В ряде воплощений адъюванты ТХО и ТХО-А могут необязательно содержать стерин, например, такой как холестерин, ланостерин, сигмастерин и т.д. Адъюванты ТХО и ТХО-А, содержащие стерин, обозначаются ТСХО и ТСХО-А, соответственно. Необязательно присутствующий стерин может присутствовать в количестве до приблизительно 1000 мкг (например, 100-1000 мкг, 200-1000 мкг, 250-700 мкг или приблизительно 400-500 мкг) на дозу.

В ряде воплощений иммуностимулирующий олигонуклеотид в адъювантах ТХО, предпочтительно, ODN, предпочтительно содержащий палиндромную последовательность и, необязательно имеющий модифицированный остов, может присутствовать в количестве 5-400 мкг на дозу, а поликатионный носитель может присутствовать в количестве 5-400 мг на дозу.

Например, в некоторых воплощениях одна доза ТХО будет составлять от 5 до 400 мкг на дозу (например, 6,25-200 мкг или 6,25-100 мкг или 6,25-50 мкг или 6,25-25 мкг или 6,25-10 мкг или 10-200 мкг или 25-200 мкг или 25-100 мкг или 25-50 мкг или 25-100 мкг или 50-100 мкг на дозу) иммуностимулирующего олигонуклеотида, а поликатионный носитель может присутствовать в количестве от 5 до 500 мг на дозу (например, 6,25-200 мг или 6,25-100 мг или 6,25-50 мг или 6,25-25 мг или 6,25-10 мг или 10-200 мг или 25-200 мг или 25-100 мг или 25-50 мг или 25-100 мг или 50-100 мг на дозу).

В некоторых воплощениях адъюванты ТХО получают следующим образом:

а) сорбитан моноолеат растворяют в легком минеральном масле. Полученный масляный раствор стерилизуют фильтрованием;

б) иммуностимулирующий олигонуклеотид, ДЭАЭ-декстран и полиоксиэтилен (20) сорбитан моноолеат растворяют в водной фазе, таким образом, получая водный раствор; и

в) водный раствор добавляют к масляному раствору при непрерывной гомогенизации, таким образом получая композицию адъюванта ТХО.

В ряде воплощений в адъювантах ТХО-А иммуностимулирующий олигонуклеотид присутствует, как в адъюванте ТХО, источник алюминия присутствует в количестве до 40% об./об. (например, 35%, 30%, 25%, 20%, 15%, 10%, 5%, 1%). В ряде воплощений источник алюминия присутствует в количестве 2%-20% об./об. композиции вакцины, более предпочтительно от приблизительно 5% и до приблизительно 17% об./об.

В некоторых воплощениях адъюванты ТХО-А получают аналогично адъювантам ТХО, а источник алюминия добавляют к водному раствору.

При получении адъювантов ТСХО и ТСХО-А холестерин растворяют в масляном растворе, а другие стадии получения ТСХО и ТСХО-А аналогичны стадиям, используемым при получении ТХО и ТХО-А, соответственно.

Антигены

Авторы изобретения неожиданно обнаружили, что адъюванты по данному изобретению способны обеспечивать достаточную защиту от заболевания ящуром, даже когда доза антигена снижена с 10 мкг вируса FMD до 0,5 мкг. Так, в различных воплощениях изобретения количество вируса FMD может составлять 0,5 мкг, приблизительно 1 мкг, приблизительно 2 мкг, приблизительно 3 мкг, приблизительно 4 мкг, приблизительно 5 мкг, приблизительно 6 мкг, приблизительно 7 мкг, приблизительно 8 мкг, приблизительно 9 мкг или приблизительно 10 мкг. Количество антигена может составлять от 0,5 до 1 мкг, от 1 до 2 мкг, от 2 до 3 мкг, от 3 до 4 мкг, от 4 до 5 мкг, от 5 до 6 мкг, от 6 до 8 мкг, от 8 до 10 мкг вируса FMD (частицы 140 S).

В настоящее время выделено семь серотипов вируса FMD. Из семи серотипов данного вируса А, С, О, Asia 1 и SAT3 по-видимому, являются разными линиями; SAT 1 и SAT 2 являются неопределенными кладами. В каждый серовар входит множество штаммов. Например, А24 Cruzeiro принадлежит серотипу А, а O1 Campos принадлежит серотипу О.

В данном изобретении в качестве антигена можно использовать вирус FMD любого серотипа, при условии, что такой вирус не является патогенным. Патогенность можно снизить посредством инактивации вируса, например, обработкой формальдегидом или BEI.

В некоторых воплощениях вирус может быть аттенуирован путем пассажей в культуре или рекомбинантными способами. Например, ранее было продемонстрировано, что делеция области, кодирующей лидерный белок Lpro, позволяет получить вирус FMD, который аттенуирован для крупного рогатого скота и свиней. См., например, US 5824316, US 8765141, Virology 1997 227(1): 96-102, J. Virol 2012 86: 11675-11685. Точечные мутации в положениях 55 и 58 в составе домена SAP белка L также приводили к образованию жизнеспособного вируса, который демонстрировал умеренно аттенуированный фенотип в клеточной культуре и обеспечивал защиту на модели FMD у свиней. См. патент US 8846057.

В некоторых воплощениях вирус также содержит отрицательные антигенные маркеры, которые делают возможным проведение тестов, позволяющих дифференцировать инфицированных и вакцинированных животных (DIVA). В некоторых воплощениях отрицательные антигенные маркеры внедряют в белки 3D и/или 3В. См., например, SEQ ID NO 19, 20, 21, 22.

Как и другие вирусы, вирус FMD непрерывно эволюционирует и мутирует, таким образом одной из проблем вакцинации является выраженная изменчивость между серотипами и даже внутри серотипов. Между серотипами не существует перекрестного иммунитета (вакцина для одного серотипа не обязательно будет защищать против любых других) и, кроме того, два штамма заданного серотипа могут иметь нуклеотидные последовательности, у которых различия по заданному гену достигают 30%. Это означает, что противоящурные вакцины должны быть высокоспецифичны в отношении предполагаемого штамма.

Так, в некоторых воплощениях в геном вируса встраивают сайты рестрикционных эндонуклеаз, таким образом делая возможным внедрение белков (например, белков, формирующих внешние капсиды) из гетерологичных штаммов вируса FMD.

В некоторых воплощениях антигенный компонент содержит штамм вируса FMD А24 Cruzeiro, который необязательно может быть модифицирован путем делеции лидерного белка, отрицательные маркерные мутации в белках 3В и/или 3D, и путем внедрения сайтов рестрикционных эндонуклеаз для более удобного внедрения последовательностей антигенов (например, белков капсида) из гетерологичных штаммов. Подходящие не являющиеся исчерпывающими примеры антигенов описаны в US 8765141. Последовательности ДНК, соответствующие РНК-геному генетически модифицированного вируса FMD, представлены в SEQ ID NO: 15 (A24LL3DYR) и в SEQ ID NO: 17 (A24LL3BPVKV3DYR). Так, последовательность ДНК, комплементарная последовательности ДНК, представленной, например, в SEQ ID NO: 15, является матрицей, т.е. является комплементарной или «кодирует» РНК-геном вируса FMD (т.е. РНК, которая кодирует вирус, вызывающий заболевание FMD). В некоторых воплощениях вирус содержит белок(ки) капсида гетерологичных штаммов (т.е. штаммов вируса FMD, отличных от А24 Cruzeiro, включая, без ограничений, штаммы линий С, О, Asia 1, SAT3, SAT 1 и SAT 2, Turkey 06 и другие штаммы линии А). Не исчерпывающие примеры таких гетерологичных антигенов представлены в SEQ ID NO: 23 (Asia1-A24LL3BPVKV3DYR) и SEQ ID NO: 24 (A/Turkey/06-A24LL3BPVKV3DYR). Кроме того, O1 campos-A24LL3BPVKV3DYR (полный геном, также обозначается O1campos), С3 Indaial-A24LL3BPVKV3DYR (полный геном) и капсид Argentina 2001 iso93 (капсид и частичная последовательность 2А) представлены в SEQ ID NOs 25, 26 и 27, соответственно.

Изобретение также охватывает варианты этих антигенов. Варианты по меньшей мере на 80% идентичны (например, на 85% идентичны, на 90% идентичны, на 95% идентичны, на 96% идентичны, на 97% идентичны, на 98% идентичны или на 99% идентичны) референтной последовательности при использовании одной из описанных программ для выравнивания со стандартными параметрами. Для определения идентичности последовательностей существует множество средств для выравнивания, включая, без ограничений, BLAST, CLUSTAL или PHILIP.

Специалисту в области техники понятно, что указанные значения можно скорректировать надлежащим образом для определения соответствующей идентичности белков, кодируемых двумя нуклеотидными последовательностями, с учетом выраженности кодонов, сходства аминокислот, положения рамки считывания и т.п.

В некоторых воплощениях варианты охватывают больше, чем конкретные приведенные в качестве примера нуклеотидные или аминокислотные последовательности и включают их функциональные эквиваленты. Изменения фрагмента нуклеиновой кислоты, которые приводят к образованию химически эквивалентной аминокислоты в заданном сайте, но не влияют на функциональные свойства кодируемого полипептида, хорошо известны в области техники. Так, кодон аминокислоты аланина, гидрофобной кислоты, может быть замещен кодоном, кодирующим другой менее гидрофобный остаток, такой как глицин, или более гидрофобный остаток, такой как валин, лейцин или изолейцин. Аналогично, можно ожидать, что изменения, которые приведут к замене одного отрицательно заряженного остатка на другой, такие как замена аспарагиновой кислоты на глутаминовую кислоту, или одного положительно заряженного остатка на другой, такие как замена лизина на аргинин, позволят получить функционально эквивалентный продукт. Также полагают, что нуклеотидные замены, которые приводят к изменению N-концевой и С-концевой частей молекулы полипептида, не приведут к изменению активности полипептида. Каждая из предложенных модификаций известна в области техники, также, как и определение сохранности биологической активности кодируемых продуктов.

Полипептиды по изобретению могут быть также изменены различными способами, включая аминокислотные замены, делеции, укорочения и вставки. Новые белки, имеющие свойства, представляющие интерес, можно создать путем комбинации элементов и фрагментов белков по данному изобретению, а также других белков. Способы для осуществления таких манипуляций хорошо известны в области техники. Так, гены и нуклеотидные последовательности по изобретению включают как последовательности естественного происхождения, так и мутантные формы. Аналогично, белки по изобретению охватывают белки естественного происхождения, а также их измененные и модифицированные формы. Такие варианты будут по-прежнему обладать желаемой модифицированной активностью родительского вируса FMD. В результате мутаций, производимых в ДНК, кодирующей вариант, последовательность не должна выходить за пределы рамки считывания и, предпочтительно, не будут создаваться комплементарные области, которые могут приводить к образованию вторичных структур мРНК.

Способы получения и выделения антигенов, подходящих для данного изобретения, хорошо известны в области техники и включают, без ограничения, фильтрацию с использованием полых волокон и преципитацию ПЭГ. Указанные способы позволяют получить несколько различные антигенные композиции. Например, при преципитации ПЭГ антигенная композиция обедняется неструктурными белками. В других способах, например, при фильтрации с использованием полых волокон, антигенная композиция содержит как структурные, так и неструктурные белки вируса FMD. Соответственно, в некоторых воплощениях антиген вируса FMD содержит структурные белки. В других воплощениях, например, таких, где антиген вируса FMD получают при помощи фильтрации с использованием полых волокон, антиген вируса FMD содержит как структурные, так и неструктурные белки, в частности, белок 3D.

При использовании существующих платформ для создания вакцин, лишенных свойственных им антигенных маркеров для дифференциации вакцинированных и инфицированных животных, удаление неструктурных белков желательно, поскольку присутствие антител к неструктурным белкам позволяет идентифицировать инфицированных животных. Однако, в случае платформы FMDLL3B3D присутствие неструктурных белков в препарате антигена не мешает дифференциации вакцинированных и инфицированных животных. В этой связи данная композиция антигена, включающая неструктурные белки и адъювант, будет обеспечивать защиту против клинически проявляющегося заболевания, в более низких дозах по сравнению с композициями очищенного антигена, а также более эффективно предупреждать установление персистирующей инфекции у жвачных животных.

Композиции

Композиции по данному изобретению могут быть составлены согласно общепринятым методикам и включать носители, приемлемые для животных, включая человека, такие как стандартные буферы, стабилизаторы, разбавители, консерванты и/или растворители, и также могут быть составлены для облегчения пролонгированного высвобождения. Разбавители включают воду, физиологический раствор, декстрозу, этанол, глицерин и т.п. Изотонические добавки включают, помимо прочих, хлорид натрия, декстрозу, маннит, сорбит и лактозу. Стабилизаторы включают, помимо прочих, альбумин. Другие подходящие наполнители и добавки, включая наиболее подходящие для составления модифицированных живых вакцин, известны или будут очевидны специалистам в области техники. См., например, Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th ed., 1990, Mack Publishing, включенный путем ссылки.

Композиции по данному изобретению могут дополнительно включать один или более дополнительных иммуномодулирующих компонентов, например, таких как дополнительный адъювант или цитокин, помимо прочих. Неисчерпывающие примеры таких дополнительных адъювантов, которые можно применять в вакцинах по данному изобретению, включают адъювантную систему RIBI (Ribi Inc., Hamilton, Mont.), полный и неполный адъюванты Фрейнда, блок-сополимер (CytRx, Atlanta Ga.), QS-21 (Cambridge Biotech Inc., Cambridge Mass.), SAF-M (Chiron, Emeryville Calif.), адъювант AMPHIGEN®, сапонин, Quil А или другие фракции сапонина, монофосфорил липид А и адъювант авридин липид-амин. Другие иммуномодулирующие агенты, которые можно включать в состав вакцины, включают, например, один или более интерлейкинов, интерферонов или других известных цитокинов.

Способы введения адъювантных композиций включают парентеральное, пероральное, ороназальное, интраназальное, интратрахеальное, поверхностное, подкожное, внутримышечное, чрескожное, внутрикожное, внутрибрюшинное, внутриглазное, внутривенное и лингвальное введение. Для введения композиций можно использовать любое подходящее устройство, включая шприцы, капельницы, безыгольные инъекционные устройства, пластыри и т.п. Способы введения и устройства, выбираемые для применения в зависимости от композиции адъюванта, антигена и субъекта, хорошо известны специалисту в области техники.

Ввиду высокой инфективности вируса FMD необходимо принимать меры для ограничения и/или устранения вспышки FMD, регламентируемые компетентными органами, например, такими как государственные министерства сельского хозяйства, и утверждаемые международными организациями, такими как Международное бюро по борьбе с эпизоотиями. Меры, которые необходимо принимать в связи со вспышкой заболевания, могут включать, без ограничения, остановку перемещения животных, эффективный контроль перемещения продуктов животного происхождения, включая молоко, мясо, шкуры, и т.д., политику санитарного убоя животных (убой животных в пораженном заболеванием стаде и, в необходимых случаях, животных из других стад, которые подверглись действию инфекции при непосредственном контакте животного с животным или при опосредованном контакте с патогеном). Зачастую животных в соседних стадах вакцинируют и впоследствии забивают.

Авторы изобретения неожиданно обнаружили, что некоторые иммуногенные композиции, описанные в данном документе, предупреждают персистенцию, которую определяют, как присутствие или выделение вируса ящура в течение более 28 суток после инфицирования. В некоторых воплощениях такие иммуногенные композиции содержат антигенный компонент и адъювантный компонент, где адъювантный компонент содержит (или по существу состоит из, или состоит из) эмульсию, содержащую маслянистую фазу, указанная маслянистая фаза составляет по меньшей мере 50% об./об. указанной иммуногенной композиции, иммуностимулирующий олигонуклеотид в количестве 75-200 мкг на дозу и поликатионный полимер в количестве 75-200 мг на дозу; а антигенный компонент содержит антиген вируса FMD в количестве, эквивалентном по меньшей мере 6 мкг вируса FMD на дозу.

В некоторых воплощениях антиген может присутствовать в количестве, эквивалентном 6-20 мкг вируса FMD на дозу, например, 8-20, 10-20, 12-20, 14-20, 16-20, 18-20, 6-10, 6-12, 6-18, 8-12 или 8-10 мкг вируса FMD на дозу. Количество иммуностимулирующего олигонуклеотида может, например, составлять 75-100, 75-125, 75-150, 75-150, 100-200, 100-150, 125-200, 125-175 или 125-150 мкг на дозу. Поликатионный полимер может присутствовать в количестве, например, 75-100, 75-125, 75-150, 75-150, 100-200, 100-150, 125-200, 125-175 или 125-150 мг на дозу.

Таким образом, в изобретении также предложен способ снижения частоты персистенции вируса FMD у жвачного животного, инфицированного вирусом FMD, включающий введение указанному жвачному животному перед инфицированием иммуногенных композиций, содержащих антигенный компонент и адъювантный компонент, где адъювантный компонент содержит (или по существу состоит из, или состоит из) эмульсию, содержащую маслянистую фазу, указанная маслянистая фаза составляет по меньшей мере 50% об./об. указанной иммуногенной композиции, иммуностимулирующий олигонуклеотид в количестве 75-200 мкг на дозу и поликатионный полимер в количестве 75-200 мг на дозу; а антигенный компонент содержит антиген вируса FMD (ящура) в количестве, эквивалентном по меньшей мере 6 мкг вируса FMD на дозу.

В различных воплощениях количество антигена может быть эквивалентно 6-20 мкг вируса FMD на дозу, например, 8-20, 10-20, 12-20, 14-20, 16-20, 18-20, 6-10, 6-12, 6-18, 8-12 или 8-10 мкг вируса FMD на дозу. Количество иммуностимулирующего олигонуклеотида может, например, составлять 75-100, 75-125, 75-150, 75-150, 100-200, 100-150, 125-200, 125-175 или 125-150 мкг на дозу. Поликатионный полимер может присутствовать в количестве, например, 75-100, 75-125, 75-150, 75-150, 100-200, 100-150, 125-200, 125-175 или 125-150 мг на дозу.

Введение указанных иммуногенных композиций жвачным животным (например, крупному рогатому скоту, овцам, верблюдам и т.д.) позволяет изменять практику содержания стада. В некоторых воплощениях вакцинированных представителей стада не забивают после подозрения на контакт с вирусом FMD.

В альтернативных (или дополнительных) воплощениях вакцинированных животных содержат на карантине в течение более короткого периода времени. Так, в некоторых воплощениях животных, подозреваемых в контактировании с вирусом FMD, можно держать на карантине в течение менее 30 суток, например, 28 суток или 29 суток.

Кроме того, обозначение территории зоной локализации распространения болезни означает строгие ограничения перемещения животных или продуктов животного происхождения из зоны локализации, как правило, на 30 суток или более. Так, в некоторых воплощениях животных, подозреваемых в контактировании с вирусом FMD, можно выводить из зоны локализации распространения заболевания в течение менее 30 суток, например, 28 суток или 29 суток после подозреваемого контакта с вирусом FMD.

В воплощениях, где антигенный компонент содержит в себе генетически модифицированный антиген вируса FMD, например, как описано выше, возможно дифференцировать вакцинированных и инфицированных животных. Таким образом, в дополнительных воплощениях предложены способы содержания стада (или способы снижения частоты персистенции вируса FMD у жвачных животных, инфицированных вирусом FMD).

Другими словами, в некоторых воплощениях при содержании стада можно применять иммуногенные композиции, которые содержат антигенный компонент и адъювантный компонент, где адъювантный компонент содержит (или по существу состоит из, или состоит из) эмульсию, содержащую маслянистую фазу, указанная маслянистая фаза составляет по меньшей мере 50% об./об. указанной иммуногенной композиции, иммуностимулирующий олигонуклеотид в количестве 75-200 мкг на дозу и поликатионный полимер в количестве 75-200 мг на дозу; а антигенный компонент содержит антиген вируса FMD в количестве, эквивалентном по меньшей мере 6 мкг вируса FMD на дозу, где при подозрении на контакт с инфекцией FMD не забивают вакцинированных членов указанного стада; и/или содержат на карантине в течение 0 - 30 суток после подозреваемого контакта и/или перемещают за пределы инфицированной территории в срок, не превышающий 30 суток после подозреваемого контакта.

В различных воплощениях количество антигена может быть эквивалентно 6-20 мкг вируса FMD на дозу, например, 8-20, 10-20, 12-20, 14-20, 16-20, 18-20, 6-10, 6-12, 6-18, 8-12 или 8-10 мкг вируса FMD на дозу. Количество иммуностимулирующего олигонуклеотида может, например, составлять 75-100, 75-125, 75-150, 75-150, 100-200, 100-150, 125-200, 125-175 или 125-150 мкг на дозу. Поликатионный полимер может присутствовать в количестве, например, 75-100, 75-125, 75-150, 75-150, 100-200, 100-150, 125-200, 125-175 или 125-150 мг на дозу.

Далее изобретение будет описано более подробно на примерах, которые не являются исчерпывающими.

ОПИСАНИЕ ПРИМЕРОВ ОСУЩЕСТВЛЕНИЯ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Пример 1. Получение антигенов

Для получения антигенов использовали два способа: фильтрацию с использованием полых волокон и преципитацию ПЭГ.

Способы преципитации ПЭГ (полиэтиленгликолем) известны в области техники. Вкратце, клетки BHK-21 инфицировали вирусом FMD. Затем (через 24-36 часов) клетки лизировали путем замораживания - оттаивания и клеточный лизат освобождали от клеточного дебриса путем центрифугирования при низкой скорости (500×g). К надосадочной жидкости, содержащей структурные и неструктурные белки, добавляли ПЭГ (8% мас./об.). Смесь инкубировали в течение 12-18 ч при 4°C. В ходе этой инкубации частицы вируса FMD ассоциировались с ПЭГ. Антиген выделяли путем центрифугирования при 16000×g и собирали преципитировавший осадок, содержащий ПЭГ и вирус. Надосадочную жидкость, содержащую клеточные и неструктурные белки вируса, отбрасывали. Затем осадок, с которым были связаны частицы вируса, отмывали небольшими объемами буфера для элюирования частиц вируса FMD от ПЭГ.

Дополнительный способ, описанный в данном документе, основан на концентрировании надосадочной жидкости культур вируса FMD с использованием полых волокон. Стадии данного способа представляют собой последовательное фильтрование для удаления вначале клеточного дебриса и крупных элементов из культур (клетки BHK-21, инфицированные вирусом FMD и лизированные путем замораживания-оттаивания). Культуральный материал постепенно прогоняли через капсульный фильтр 10 мкм, капсульный фильтр 4,5 мкм и, наконец, через фильтр 0,8 мкм/0,2 мкм. Затем этот фильтрат концентрировали с помощью половолоконного картриджа для ультрафильтрации, позволяющего проходить через мембрану частицам менее 0,01 мкм. Частицы вируса FMD и многие неструктурные белки оставались в цепи колонок, тогда как жидкость и более мелкие белки проходили через мембрану в слив. Концентрат пропускали через цепь колонок до достижения желаемого объема, обычно концентрируя в 10 раз.

На Фиг. 1 продемонстрировано различие в качестве антигенов, преципитированных ПЭГ и концентрированных с использованием полых волокон по методу Вестерн-блоттинга. Антиген, концентрированный с использованием полых волокон, содержит большое количество структурных и неструктурных белков, как показано на данной Фиг., иллюстрирующей окрашивание вестерн-блота с использованием антитела, специфичного к белку 3D, самому крупному из неструктурных белков вируса FMD, и антитела, специфичного к белку капсида (структурному белку). Напротив, ПЭГ-концентрированные антигены (9 дорожка) содержали структурный белок, но не содержали определяемого уровня белка 3D.

Пример 2. Эффект противоящурных вакцин с адъювантом ТХО

Животные и сбор образцов

В данном исследовании использовали бычков Голштин в возрасте от шести до восьми месяцев весом 180-230 кг. Как показал последующий анализ образцов сыворотки, взятых на 0 сутки, методом 3D ELISA, у животных перед вакцинацией не определялись свободные антитела, реагирующие с вирусом FMD. Все 28 животных находились в одном помещении для содержания лабораторных животных уровня биологической безопасности BSL-3-Ag. Животные получали полный рацион в виде гранулированного корма и брикеты люцерны, а также воду и соль в блоках ad libitum. Животным давали акклиматизироваться в помещении в течение пяти дней до 0 суток. Животные предварительно получали Bovi-Shield GOLD® 5, Micotil® 300, Liquamycin®LA-200® и Dectomax®. Группам животных (по 4 в каждой) с прикрепленными к ушам бирками с последовательной нумерацией назначали соответствующее воздействие.

После вакцинации не отмечалось каких-либо нежелательных явлений.

У всех животных получали образцы сыворотки на 0 сутки (перед вакцинацией), 4, 7, 14, 21 (перед заражением), 24, 28, 31 и 42 сутки, используя пробирки для отделения сыворотки крови. Образцы сыворотки хранили в замороженном состоянии до исследования на наличие нейтрализующих антител против вируса FMD в реакции сывороточной нейтрализации (выражая результаты, как величину, обратную последнему разведению сыворотки, нейтрализующему 100 TCID50 гомологичного вируса FMD в 50% лунок) или до исследования гуморального иммунного ответа на анти-3Dpol (с помощью конкурентного ИФА).

В соответствии с рекомендациями Международного бюро по борьбе с эпизоотиями («Руководство по диагностическим тестам и вакцинам для наземных животных»), заражение вакцинированного крупного рогатого скота для оценки эффективности вакцины осуществляли при помощи инокуляции игольным способом внутрикожно лингвально. Через 21 сутки после вакцинации всем вакцинированным и не получавшим вакцины животным инокулировали внутрикожно лингвально 10000 BTID50 (50% инфицирующая доза при инъекции в язык быка) гомологичный штамм вируса FMD А24 Cruzeiro, разделенный на 4 инокуляции по 0,1 мл каждая, по 2500 BTID50/0,1 мл. Все животные находились под наблюдением в течение 10 дней после заражения для оценки развития клинических проявлений заболевания, лихорадки, выделения носового секрета, слюнотечения, потери аппетита и/или хромоты. Для выявления везикул в области копыт проводили клинический осмотр с применением седативного средства (ксилазин внутримышечно по 0,22 мг/кг для поддержания животного в стернальном положении на протяжении процедуры) на 21 сутки (перед инокуляцией) и на 24, 28 и 31 сутки. Для снятия седативного эффекта использовали толазолин внутривенно в дозе 2 мг/кг.

Вакцины

Антигены получали, как описано в Примере 1. Маточные растворы антигенов содержали 5,51 мкг/мл антигена, полученного с помощью фильтрации с использованием полых волокон (препарат А) или 10,26 мкг/мл антигена, полученного с помощью ПЭГ преципитации (Препарат Б).

Подробное описание иммуногенных композиций, которые вводили животным, представлено в Таблице 1. Каждая группа включала 4 животных.

Иммуногенные композиции для групп Т02-Т06 гомогенизировали в день вакцинации и вводили животным на 0 сутки.

Персистенцию определяли, как присутствие или отсутствие вируса (РНК вируса FMD и/или инфекционного вируса FMD), используя как выделение вируса, так и количественную ОТ-ПЦР в реальном времени. Праймеры для количественной ОТ-ПЦР в реальном времени были следующими:

Прямой

Обратный

Зонд Taqman: (краситель FAM, тушитель TAMRA, SEQ ID NO: 30)

Сывороточные титры нейтрализующих антител представлены в Таблице 2.

a,b,c Группы воздействия, имеющие одинаковые буквенные обозначения внутри каждого дня, достоверно не различались при уровне значимости α=0,05.

Признаки FMD оценивали в баллах как наличие (1) или отсутствие (0) везикул в области копыт, т.е. наличие везикул у одного копыта обозначали 1 баллом, наличие везикул только в области только 2 копыт обозначали 2 баллами, а везикулы у всех 4 копыт обозначали 4 баллами. Животное, которому однажды присвоили 4 балла, считали имеющим 4 балла на протяжении всего исследования.

Баллы, присвоенные отдельным животным по каждому копыту при каждом осмотре, представлены в Таблице 3. В Таблице 4 представлены сводные данные по каждому животному, в зависимости от наличия пораженных копыт.

* 1 балл присваивали автоматически, т.к. у животного ранее обнаружили везикулы на всех четырех копытах

* автоматически присваивали положительную оценку, т.к. у животного ранее обнаружили везикулы на всех четырех копытах.

У всех животных в группе Т01 (отрицательный контроль) везикулы в области копыт появлялись, начиная с 24 суток. На 28 и 31 сутки везикулы обнаруживали на всех копытах у всех животных в группе Т01. Напротив, во всех группах, кроме T03 (преципитированный ПЭГ вирус FMD в дозе 2 мкг), в которой одно животное (R14-77) получило 1 балл на 24, 28 и 31 сутки, достигалась полная защита (т.е. отсутствие везикул в области копыт). Влияние исследуемых иммуногенных композиций на персистенцию вируса проиллюстрировано в Таблицах 5 и 6. Персистенцию определяли как присутствие инфекционных вирусных частиц или вирусной РНК в эзофагально-фарингеальной жидкости (полученной с использованием гибкого зонда Probang) через 28 суток после заражения (49 сутки после вакцинации, как показано в Таблицах 5 и 6). В Таблице 5 приведены результаты количественной ОТ-ПЦР в реальном времени для отдельных животных и для групп воздействия - обратно преобразованные средние значения, рассчитанные по методу наименьших квадратов, числа копий РНК вируса FMD на мл образца, полученного с использованием Probang. В Таблице 6 результаты анализа на вирус, выделенный из образцов, полученных с помощью гибкого зонда, приведены как положительные или отрицательные. Значения ниже 1,87 в Таблице 5 считали «отрицательными», поскольку они были ниже предела обнаружения.

В Группе 1 (контроль физиологический раствор) трое животных были положительными по вирусу FMD по результатам ОТ-ПЦР по меньшей мере однократно, а у двоих животных результаты выделения вируса всегда были положительными.

В Группе Т02 ни у одного животного не было выявлено носительства вируса FMD по результатам ОТ-ПЦР, но у одного животного (R14-74) результаты выделения вируса оказались положительными в один момент времени (42 сутки: 21 сутки после заражения), но впоследствии были отрицательными (49 и 52 сутки), свидетельствуя об отсутствии персистирующей инфекции. Ни ОТ-ПЦР, ни вирусологическое исследование не выявили носительства вируса FMD у других животных на 38 сутки и позднее.

В группе Т03 одно животное (R14-79) было полностью защищено от инфекции вируса FMD, двое животных демонстрировали присутствие вируса FMD (либо по результатам ОТ-ПЦР, либо по результатам выделения вируса) на третий или четвертый день исследования и одно животное (R14-77) демонстрировало присутствие вируса FMD в обоих исследованиях на 38 и 42 сутки, но не позднее.

В группе Т04 у всех четырех животных обнаруживалась персистенция вируса FMD по результатам одного или обоих тестов вплоть до 52 суток.

В группе Т05 у одного животного (R14-62) выявили присутствие вируса только на 38 сутки по результатам ОТ-ПЦР, но не по результатам выделения вируса и впоследствии вирус не выявлялся ни одним из тестов. У других трех животных в группе Т05 ни ОТ-ПЦР, ни вирусологическое исследование не выявили вируса FMD ни в один момент времени.

В группе Т06 двое животных были полностью защищены от персистенции, тогда как у двух других результаты ОТ-ПЦР или выделения вируса оказались положительными при каждом исследовании.

В группе Т07 три из четырех животных были полностью защищены от вируса, тогда как у одного животного (R14-71) результаты ОТ-ПЦР и выделения вируса оказались положительными в каждый момент времени.

В Таблице 7 приведены сводные результаты экспериментов по выявлению персистенции. Если ни ОТ-ПЦР, ни вирусологические исследования не детектировали вирус FMD на 49 сутки (28 сутки после заражения) и на 52 сутки (31 сутки после заражения), считали, что у животных персистенция отсутствует.

Только у двух животных из восьми, которым вводили 8 мкг антигена (группы Т02 и Т05), когда-либо обнаруживали присутствие вируса и только в течение одного дня (у одного на 37 сутки, у другого на 42 сутки). Другие животные в этих группах были полностью защищены. С учетом того, что присутствие вируса не детектировали на 28 и на 31 сутки после инфицирования, ни одно из животных, получивших 8 мкг антигена не считали персистентно инфицированным. Персистенция вируса наблюдалась у пяти из восьми животных, которым вводили 2 мкг антигена (Группы Т03 и Т06). Персистенция вируса наблюдалась у четырех из восьми животных, которым вводили 0,5 мкг антигена (Группы Т034 и Т07).

В совокупности, данные результаты свидетельствуют о защите от персистирующей вирусной инфекции FMD животных, которым вводили 8 мкг антигена, а также о том, что очистка антигена фильтрованием с использованием полых волокон обладает преимуществом по сравнению с преципитацией ПЭГ. Основным различием между двумя композициями антигенов является наличие неструктурных белков в дополнение к структурным в композиции, полученной фильтрованием с использованием полых волокон. Таким образом, не ограничиваясь какой-либо теорией, полагают, что вакцины, где антиген содержит как структурные, так и неструктурные белки, и, в частности, белок 3D, индуцируют более эффективный иммунный ответ, предупреждающий персистенцию вируса FMD, что проиллюстрировано в Таблице 8.

Все публикации, процитированные в описании, как патентные публикации, так и не относящиеся к патентам документы, отражают уровень компетентности специалиста в области техники, к которой относится изобретение. Все указанные публикации включены путем ссылки в том же объеме, как если бы для каждой отдельной публикации было непосредственно указано, что она включена путем ссылки.

При том, что изобретение изложено в данном описании со ссылкой на конкретные воплощения, следует понимать, что данные воплощения являются простой иллюстрацией принципов и применений данного изобретения. Таким образом, следует понимать, что возможны многочисленные модификации приведенных в качестве иллюстрации воплощений и другие варианты реализации изобретения, без отступления от существа и объема настоящего изобретения, суть которого выражена следующей формулой.

1. Иммуногенная композиция, содержащая антигенный компонент и адъювантный компонент, где

а) адъювантный компонент содержит эмульсию, содержащую масло, иммуностимулирующий олигонуклеотид, содержащий CpG, и диэтиламиноэтил(ДЭАЭ)-декстран, и

б) антигенный компонент содержит 0,5-10 мкг композиции вируса FMD (ящур) на дозу.

2. Иммуногенная композиция по п. 1, где ДЭАЭ-декстран присутствует в количестве 6-200 мг на дозу.

3. Иммуногенная композиция по п. 1, где иммуностимулирующий олигонуклеотид присутствует в количестве 6-200 мкг на дозу.

4. Иммуногенная композиция по п. 3, где иммуностимулирующий олигонуклеотид содержит по меньшей мере 15 смежных нуклеотидов из SEQ ID NO: 8.

5. Иммуногенная композиция по п. 1, где указанная масляная фаза присутствует в количестве до 80% об./об. композиции.

6. Иммуногенная композиция по п. 1, где масляная фаза составляет 50,01-55% об./об. композиции.

7. Иммуногенная композиция по п. 1, дополнительно содержащая один или более эмульгаторов.

8. Иммуногенная композиция по п. 1, где адъювантный компонент содержит SEQ ID NO: 8.

9. Иммуногенная композиция по п. 8, где ДЭАЭ-декстран присутствует в количестве 6-200 мг на дозу.

10. Иммуногенная композиция по п. 9, где иммуностимулирующий олигонуклеотид присутствует в количестве 6-200 мкг на дозу.

11. Иммуногенная композиция по п. 10, где указанная композиция вируса FMD представляет собой препарат вируса FMD штамма Cruzeiro.

12. Иммуногенная композиция по п. 11, где указанный штамм вируса FMD Cruzeiro генетически модифицирован.

13. Иммуногенная композиция по п. 12, где указанный штамм вируса FMD Cruzeiro содержит делецию области, кодирующей лидерный белок (LL).

14. Иммуногенная композиция по п. 13, где указанный штамм вируса FMD Cruzeiro содержит отрицательные антигенные маркеры, встроенные в один или более неструктурных вирусных белков 3Dpol и 3B.

15. Иммуногенная композиция по п. 14, где указанный штамм вируса FMD Cruzeiro содержит гетерологичный белок капсида.

16. Иммуногенная композиция по п. 15, где штамм, отличный от Cruzeiro, выбран из Asia1, Turkey06, O1Campos, C3Indaial и A2001-Argentina.

17. Иммуногенная композиция по п. 1, где антигенный компонент содержит 0,5-6 мкг вируса FMD на дозу.

18. Иммуногенная композиция по п. 1, где антигенный компонент содержит 0,5-4 мкг вируса FMD на дозу.

19. Иммуногенная композиция по п. 1, где антигенный компонент содержит 0,5-2 мкг вируса FMD на дозу.

20. Иммуногенная композиция по п. 1, где антигенный компонент содержит 0,5–1,5 мкг вируса FMD на дозу.

21. Иммуногенная композиция по п. 1, где композиция вируса FMD содержит как структурные, так и неструктурные белки FMD.

22. Способ лечения или предупреждения поражений, индуцированных FMD, у животного, нуждающегося в этом, включающий введение указанному животному иммуногенной композиции по любому из пп. 1-21.

23. Способ содержания стада, включающий введение каждому члену указанного стада иммуногенной композиции по любому из пп. 1-16, где в указанной композиции:

а) антигенный компонент составляет 6-10 мкг композиции вируса FMD (ящура) на дозу;

б) иммуностимулирующий олигонуклеотид составляет 75-200 мкг на дозу;

в) указанный ДЭАЭ-декстран составляет 75-200 мг на дозу

и где впоследствии, при подозрении на контакт с инфекцией FMD вакцинированных членов указанного стада

1) не забивают; или

2) помещают на карантин на 0-30 суток; или

3) перемещают за пределы инфицированной территории.

24. Способ по п. 23, где поликатионный носитель представляет собой диэтиламиноэтил(ДЭАЭ)-декстран и где указанный вирус FMD содержит делецию области, кодирующей лидерный белок (LL), и маркер для дифференциации вакцинированных и инфицированных животных (DIVA-маркер).

25. Способ по п. 24, где указанный вирус FMD содержит гетерологичный белок капсида.

26. Способ снижения частоты персистенции FMD у жвачного животного, инфицированного FMD, включающий введение перед инфицированием указанному жвачному животному иммуногенной композиции по любому из пп. 1-16, где, в указанной композиции:

а) антигенный компонент составляет 6-10 мкг композиции вируса FMD (ящура) на дозу;

б) иммуностимулирующий олигонуклеотид составляет 75-200 мкг на дозу;

в) указанный ДЭАЭ-декстран составляет 75-200 мг на дозу.

27. Способ по п. 23, где вакцинированных членов стада не забивают и помещают на карантин на 0-30 суток.

28. Способ по п. 23, где стадо представляет собой коровье стадо.

29. Способ по п. 22, где композицию вируса FMD получают путем фильтрации с использованием полых волокон.



 

Похожие патенты:

Изобретение относится к соединению гидрохлорид 1,7,7-триметилбицикло[2.2.1]гептан-2-ил 3-(пиперидин-1-ил)пропионат формулы I ,у которого выявлена биологическая активность, заключающаяся в ингибировании репродукции вируса Эбола.

Группа изобретений относится к области медицины, а именно к инфекционным болезням, и предназначена для ингибирования одной или более микробных инфекций у субъекта.

Группа изобретений относится к медицине и касается пептида, подходящего для индукции интерферона, содержащего аминокислотную последовательность согласно общей формуле (I) X1EKKRRETVEREX2X3 (SEQ ID No: 5), причем каждый из X1, X2 и X3 представляет собой остаток неполярной аминокислоты.

Изобретение относится к медицине, а именно к ветеринарии, и может быть использовано при получении антигена вируса бешенства для серологической диагностики. Для этого получают суспензию из мозга белых мышей, экспериментально зараженных вирусом бешенства.

Изобретение относится к фармацевтической промышленности и представляет собой средство для лечения природных вирусных инфекций собак, представленное в виде раствора для инъекций и включающее в качестве активного начала одну высокоочищенную форму рекомбинантного интерферона собаки, относящуюся к субтипу альфа, в концентрации, достаточной для обеспечения терапевтически эффективной дозы при введении препарата животному, и вспомогательные компоненты.

Настоящее изобретение относится к соединениям формулы (I), где R1 - R8 такие, как определено в настоящем описании, или их фармацевтически приемлемым солям, в качестве ингибиторов убиквитин-C-концевой гидролазы L1 (UCHL1).

Изобретение относится к новому соединению формулы (Iе), обладающему противовирусной РНК-активностью, в частности активностью против пикорнавируса, например парэховируса, кардиовируса, энтеровируса, такого как вирус ЕV, Коксаки, полиемилита, риновируса, и гепатовируса.

Группа изобретений относится к ветеринарии и касается вакцинных композиций. Предложены: эмульгированная вакцинная композиция для иммунизации птиц к вирусу репродуктивно-респираторного синдрома свиней (PRRS), содержащая: (i) антигены вируса PRRS, (ii) легкое минеральное масло Marcol и (iii) дисперсный адъювант, выбранный из группы, состоящей из биоразлагаемых полимерных частиц, микрочастиц или наночастиц, представляющий собой хитозан, причем антигены имеют титр выше, чем DIE50% 104/мл, её применение при приготовлении концентрированной композиции иммуноглобулинов IgY для лечения PRRS; концентрированная композиция иммуноглобулинов IgY, нейтрализующих вирус, вызывающий PRRS, способ её получения и её применение для производста лекарственного средства для лечения PRRS.

Изобретение относится к технологии создания нового лекарственного средства в форме ректальных свечей широкого спектра действия на основе интерферона для лечения инфекционно-воспалительньгх заболеваний.

Изобретение относится к соединению, имеющему структуру: или к его фармацевтически приемлемой соли. Изобретение также относится к способу лечения состояния у животного при помощи указанного соединения, которое связывает LANCL2.

Группа изобретений относится к области медицины и касается композиции для местного лечения перелома кости или дефекта кости и соответственно содержащих такую композицию накладки, инъецируемого состава, образующего депо in situ, костнозамещающего заполнителя или покрытия для костнозамещающего заполнителя, медицинского устройства и/или костного имплантата, а также костного имплантата и медицинского устройства (выбранного из группы, состоящей из костного винта, костной пластинки, костного штифта, спинального имплантата) с вышеуказанным покрытием, способа лечения переломов или дефектов кости с использованием вышеуказанных средств и устройств.

Изобретение относится к области фармацевтики, а именно к получению микрокапсул фурацилина. Раскрыт способ повышения антимикробной активности фурацилина in vitro путем диспергирования капсулируемого вещества в растворе полимера и осаждения полимера на поверхности частиц дисперсии.

Изобретение относится к медицине, в частности к пероральному препарату цилостазола с замедленным высвобождением. Препарат содержит цилостазол в качестве активного ингредиента, гидроксипропилметилцеллюлозу в качестве гидрофильного полимера, карбомер в качестве носителя с замедленным высвобождением и лаурилсульфат натрия в качестве солюбилизирующего агента.

Описан способ снижения концентрации растворителя во множестве биоразлагаемых микрочастиц. Способ включает в себя контактирование смеси, содержащей множество микрочастиц и растворитель, с водой, для образования водной суспензии.

Группа изобретений относится к области фармацевтики. Первое изобретение представляет собой таблетку, содержащую: (a) экструдат, включающий: (i) полимерную матрицу, которая представляет собой водорастворимый сополимер винилпирролидона и винилацетата; (ii) диспергирующий агент; и (iii) соединение Формулы I или его фармацевтически приемлемую соль: Формула Iгде Ra независимо -H или -F, при этом диспергирующий агент и соединение Формулы I диспергированы в вышеуказанной полимерной матрице; и (b) систему, способствующую распаду, включающую порошкообразный хлорид натрия и кроскармеллозу натрия.

Настоящее изобретение относится к композиционному препарату и способу его получения, где композиционный препарат включает внутреннюю часть, содержащую первый активный ингредиент, выбранный из ингибитора фосфодиэстеразы-5 или тамсулозина или его фармацевтически приемлемой соли, и слой пленочного покрытия, содержащий второй активный ингредиент, выбранный из ингибитора 5-α-редуктазы, причем слой пленочного покрытия включает графт-сополимер поливинилового спирта и полиэтиленгликоля и поливиниловый спирт, при этом массовое отношение количества графт-сополимера поливинилового спирта и полиэтиленгликоля к количеству поливинилового спирта составляет от 7:3 до 4:6.

Группа изобретений относится к химико-фармацевтической промышленности и представляет собой способ получения съедобных частиц и сами съедобные частицы для подавления аппетита, обеспечения чувства сытости, снижения массы тела и/или для предотвращения, и/или лечения ожирения или заболевания, или состояния, связанного с ожирением, имеющие ситовый диаметр в диапазоне от 0,05 до 3 мм, содержащие набухающий в воде или водорастворимый полимерный компонент, и первый липидный компонент, который содержит средне- или длинноцепочечную жирную кислоту, причем указанный набухающий в воде или водорастворимый полимерный компонент заключен внутри указанного липидного компонента и/или покрыт указанным липидным компонентом.

Изобретение относится к фармацевтической промышленности, а именно: к стерильной композиции, которая включает белок и алифатический сложный полиэфир. Стерильная композиция, которая включает белок и алифатический сложный полиэфир и которая стерилизована облучением, в которой белок диспергирован в виде частиц в алифатическом сложном полиэфире непосредственно или в виде смеси с фармацевтически приемлемыми добавками, содержание белковых частиц в стерильной композиции составляет не более 50 масс.%, и стерильная композиция находится в форме волокна или пленки.

Группа изобретений относится к медицине и раскрывает нетканое полотно, способ его получения и пленку для доставки одного или более активных компонентов, полученную из нетканого полотна.

Настоящее изобретение относится к способу лечения и профилактики паразитозов птиц с оптимизацией их обмена веществ и неспецифической резистентности, включающему применение комбинированного препарата, содержащего активно действующие вещества и вспомогательные компоненты - антиоксидант, консервант, базовый растворитель, сорастворитель, эмульгатор при следующем содержании компонентов, в мас.%: ивермектин - 0,2-2,0, бутафосфан - 5,0-35,0, вспомогательные компоненты: респланта Жожоба - 5,0-10,0, бензиловый спирт - 1,0-2,0, диэтиленгликоля моноэтиловый эфир - 20,0-30,0, твин-80 - 19,0-20,0, вода дистиллированная – остальное, и который применяют перорально в виде раствора групповым способом с водой для поения, в суточной дозе 400 мкг ивермектина на 1 кг массы птицы.

Изобретение относится к области медицины, а именно к ветеринарной вирусологии и биотехнологии, и может быть использовано для получения вакцины инактивированной эмульсионной против ящура типа О.

Группа изобретений относится к медицине и касается иммуногенной композиции, содержащей антигенный компонент и адъювантный компонент. При этом а) адъювантный компонент содержит эмульсию, содержащую масло, иммуностимулирующий олигонуклеотид, содержащий CpG, и диэтиламиноэтил-декстран и б) антигенный компонент содержит 0,5-10 мкг композиции вируса FMD на дозу. Также предложны способ лечения или предупреждения поражений, индуцированных FMD у животного, способ содержания стада и способ снижения частоты персистенции FMD у жвачного животного. Группа изобретений обеспечивает 100 эффективную защиту жвачного животного от ящура при использовании указанной композиции, содержащей низкое количество антигенного компонента композиции вируса FMD на дозу. 4 н. и 25 з.п. ф-лы, 1 ил., 8 табл., 2 пр.

Наверх