Антитело против igf-1r и его применение в качестве адресующего переносчика для лечения рака

Авторы патента:

ГЁТШ Лилиан (FR)

РОБЕР Ален (FR)

ШАМПЬЁН Тьерри (FR)

БО-ЛАРВОР Шарлотт (FR)

БРУССА Маттьё (FR)

C07K16/2863 - Иммуноглобулины, например моноклональные или поликлональные антитела

C07K16/28 - против рецепторов, клеточных поверхностных антигенов или клеточных поверхностных детерминантов

A61K47/6851 - Лекарственные препараты, отличающиеся используемыми неактивными ингредиентами, например носителями, инертными добавками

Владельцы патента RU 2698977:

ПЬЕР ФАБР МЕДИКАМЕНТ (FR)

Данное изобретение относится к антителу, в частности к моноклональному антителу, которое способно связываться с IGF-1R. Изобретение относится также к мышиной гибридоме, а также к конъюгату антитело-лекарственное средство для лечения рака. Изобретение позволяет расширить ассортимент антител, способных связываться с IGF-1R. 4 н. и 16 з.п. ф-лы, 33 ил., 16 табл., 15 пр.

Данное изобретение относится к новому антителу, в частности, к моноклональному антителу, которое способно связываться с IGF-1R, а также к амино- и нуклеиновокислотным последовательностям, кодирующим указанное антитело. В одном из аспектов данное изобретение относится к новому антителу или его антигенсвязывающему фрагменту, которое способно связываться с IGF-1R и, индуцируя интернализацию IGF-1R, интернализироваться клеткой. Данное изобретение также включает применение указанного антитела в качестве адресующего продукта или переносчика в конъюгации с другими противораковыми соединениями, такими как токсины, радиоактивные элементы или лекарственные средства, а также применение их для лечения некоторых видов рака.

Рецептор инсулиноподобного фактора роста 1, называемый IGF-1R (также называемый IGF1R или IGF-IR), представляет собой рецептор с тирозинкиназной активностью, имеющий 70% гомологию с рецептором инсулина IR. IGF-1R представляет собой гликопротеин с молекулярной массой примерно 350000. Это гетеротетрамерный рецептор, у которого каждая из половин, связанных дисульфидными мостиками, состоит из внеклеточной α-субъединицы и трансмембранной β-субъединицы. IGF-1R связывает IGF1 и IGF2 с очень высокой аффинностью (Kd 1 нМ), но в равной степени способен связываться с инсулином с аффинностью, которая в 100-1000 раз ниже. И наоборот, IR связывает инсулин с очень высокой аффинностью, хотя IGF связываются только с рецептором инсулина с аффинностью, которая в 100 раз ниже. Тирозинкиназные домены IGF-1R и IR имеют очень высокую степень гомологии последовательностей, хотя зоны более слабой гомологии, соответственно, затрагивают богатые цистеином области, расположенные в α-субъединице и в С-концевой части β-субъединицы. Различия последовательностей, наблюдаемые в α-субъединице, расположены в зоне связывания лигандов и, следовательно, формируют относительную аффинность IGF-1R и IR в отношении IGF и инсулина, соответственно. Различия в С-концевой части β-субъединицы приводят к расхождению в сигнальных путях двух рецепторов; IGF-1R опосредует митогенные, дифференцировочные и антиапоптотические эффекты, в то время как активация IR главным образом включает воздействие на уровне метаболических путей.

Цитоплазматические тирозинкиназные белки активируются путем связывания лиганда с внеклеточным доменом рецептора. Активация киназ, в свою очередь, включает стимуляцию различных внутриклеточных субстратов, в том числе IRS-1, IRS-2, She и Grb 10. Двумя основными субстратами IGF-1R являются IRS и She, которые опосредуют (путем дальнейшей активации многочисленных эффекторов) большинство эффектов роста и дифференцировки, связанных с присоединением IGF с этому рецептору. Следовательно, наличие субстратов может диктовать конечный биологический эффект, связанный с активацией IGF-1R. Когда преобладает IRS-1, клетки имеют тенденцию к пролиферации и трансформации. Когда преобладает She, клетки имеют тенденцию к дифференцировке. По-видимому, основным путем, участвующим в эффектах защиты от апоптоза, является путь фосфатидил-инозит-3-киназ (PI 3-киназ).

Роль системы IGF в канцерогенезе стала предметом интенсивных исследований в течение последних десяти лет. Этому интересу последовало открытие того факта, что в дополнение к своим митогенных и антиапоптотическим свойствам IGF-1R, по-видимому, необходим для создания и поддержания трансформированного фенотипа. В самом деле, хорошо установлено, что сверхэкспрессия или конститутивная активация IGF-1R приводит у большого числа разнообразных клеток к росту клеток независимо от подложки в среде, лишенной фетальной бычьей сыворотки, и к образованию опухолей у голых мышей. Это само по себе не является уникальным свойством, так как клетки могут трансформироваться под действием разнообразных продуктов сверхэкспрессированных генов, включая большое число рецепторов факторов роста. Тем не менее, решающее открытие, которое наглядно продемонстрировало важную роль, которую играет IGF-1R в трансформации, заключалось в том, что IGF-IR^--клетки, в которых ген, кодирующий IGF-1R, был инактивирован, оказались полностью резистентны к трансформации различными агентами, которые обычно способны трансформировать клетки, такими как белок Е5 вируса папилломы крупного рогатого скота, сверхэкспрессия EGFR или PDGFR, Т-антиген SV-40, активированный ras или комбинация этих двух последних факторов.

IGF-1R экспрессируется в большом разнообразии опухолей и опухолевых линий, и IGF усиливают рост опухоли при их прикреплении к IGF-1R. Другие аргументы в пользу роли IGF-1R в канцерогенезе происходят из исследований с использованием мышиных моноклональных антител, направленных против рецептора, или с использованием отрицательных доминант IGF-1R. В самом деле, мышиные моноклональные антитела, направленные против IGF-1R, ингибируют пролиферацию многочисленных клеточных линий в культуре и рост опухолевых клеток in vivo. Также было показано, что отрицательная доминанта IGF-1R способна ингибировать опухолевую пролиферацию.

В таком контексте IGF-1R рассматривался в течение длительного времени в качестве интересной мишени в онкологии. Для разработки антител против IGF-1R для лечения раковых заболеваний было начато большое число проектов, ориентированных на IGF-1R (гуманизированные или человеческие антитела или малые молекулы), и было проведено более 70 клинических испытаний при различных показаниях. Тем не менее, на сегодняшний день ни один из этих проектов не был успешным, и на рынке нет антител против IGF-1R несмотря на частую сверхэкспрессию этой мишени, описанную у многих пациентов при большом разнообразии показаний.

Кроме того, потерпел неудачу ряд клинических испытаний с вовлечением анти-IGF-1R-антител в сочетании с анти-EGFR-антителами для нацеливания как на рецептор эпидермального фактора роста, так и на IGF-1R, поскольку ни одно из этих антител не было способно лечить пациентов с мутацией KRAS.

Как следствие, IGF-1R в настоящее время не рассматривается в качестве основной мишени, и при поиске потенциальных терапевтических антител IGF-1R, по-видимому, больше не вызывает особого интереса.

Тем не менее, следует также отметить, что усилия, направленные на создание IGF-1R-антител, были сосредоточены на голых антител, т.е. антителах, используемых благодаря их собственным свойствам. В этом смысле IGF-1R рассматривается как мишень, не подходящая для создания иммуноконъюгата, такого как конъюгат "антитело - лекарственное средство" (упоминаемый как "ADC"), поскольку IGF-1R описывается как мишень, также широко экспрессируемая нормальными клетками, в том числе клетками кровеносных сосудов. В этом смысле можно отметить, что самое последнее IGF-1R-антитело, т.е. AVE1642, разработано как голое антитело, не вооруженное лекарственным средством. Этот же процесс находится в настоящее время в процессе разработки с другими антителами против IGF-1R и со всеми теми антителами, которые потерпели неудачу в клинических испытаниях.

В одном из аспектов данное изобретение имеет тенденцию к устранению этих проблем и описывает анти-IGF-1R-антитело, способное связываться с IGF-1R определенным образом, так что оно может быть использовано для вооружения лекарственным средством. Более конкретно, данное изобретение относится к IGF-1R-антителу, представляющему особые свойства, такие как то, что оно является идеальным кандидатом для применения в вооруженном виде в контексте иммуноконъюгата.

В первом воплощении данное изобретение относится к антителу или его антигенсвязывающему фрагменту, который i) связывается с человеческим IGF-1R, и ii) интернализируется после связывания с указанным человеческим IGF-1R.

Термины "антитело", "антитела", "ab", "Ab" или "иммуноглобулин" используются взаимозаменяемо в самом широком смысле и включают моноклональные антитела, изолированные, инженерные, химически синтезированные или рекомбинантные антитела (например, полноразмерные или интактные моноклональные антитела), поликлональные антитела, поливалентные антитела или мультиспецифические антитела (например, биспецифические антитела), а также фрагменты антител до тех пор, пока они проявляют нужную биологическую активность. В одном воплощении данное изобретение относится к рекомбинантному антителу.

Более конкретно, такая молекула состоит из гликопротеина, содержащего по меньшей мере две тяжелые (Н) цепи и две легкие (L) цепи, соединенные дисульфидными связями. Каждая тяжелая цепь содержит вариабельную область (или домен) тяжелой цепи (сокращенную здесь как HCVR или VH) и константную область тяжелой цепи. Константная область тяжелой цепи состоит из трех доменов, СН1, СН2 и СН3. Каждая легкая цепь содержит вариабельную область легкой цепи (сокращенную здесь как LCVR или VL) и константную область легкой цепи. Константная область легкой цепи содержит один домен, CL. Области VH и VL можно дополнительно подразделить на области гипервариабельности, называемые участками, определяющими комплементарность (от англ. - complementarity determining region (CDR)), которые перемежаются областями, которые являются более консервативными, называемыми каркасными областями (framework region, FR). Каждая VH и VL состоит из трех CDR и четырех FR, расположенных в направлении от амино-конца к карбокси-конца в следующем порядке: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. Вариабельные области тяжелых и легких цепей содержат связывающий домен, который взаимодействует с антигеном. Константные области антител могут опосредовать связывание иммуноглобулина с тканями или факторами хозяина, включая различные клетки иммунной системы (например, эффекторные клетки) и первый компонент (C1q) классической системы комплемента.

Термины "IGF-IR-связывающий фрагмент" или "антигенсвязывающий фрагмент" антитела согласно изобретению обозначают любой пептид, полипептид или белок, сохраняющий способность связываться с мишенью (также обычно называемой антигеном), как у указанного антитела.

В одном воплощении такие "антигенсвязывающие фрагменты" выбраны из группы, включающей фрагменты Fv, scFv (sc обозначает "одноцепочечный"), Fab, F(ab')₂, Fab', scFv-Fc или димерные антитела или любой их фрагмент, время полужизни которого было увеличено путем химической модификации, такой как добавление поли(алкилен)гликоля, такого как поли(этилен)гликоль ("ПЭГилирование") (пэгилированные фрагменты называют Fv-ПЭГ, scFv-ПЭГ, Fab-ПЭГ, F(ab')2-ПЭГ или Fab'-ПЭГ) ("ПЭГ" означает поли(этилен)гликоль), или путем включения в липосому, при этом указанные фрагменты имеют по меньшей мере одну из характерных CDR антитела согласно изобретению. Предпочтительно, указанные "антигенсвязывающие фрагменты" будут состоять или будут включать частичную последовательность тяжелой или легкой вариабельной цепи антитела, из которого они получены, при этом указанная частичная последовательность является достаточной для сохранения такой же специфичности связывания, что и у антитела, из которого она получена, и достаточной аффинностью по отношению к мишени, предпочтительно равной по меньшей мере 1/100, в более предпочтительном варианте по меньшей мере 1/10 от аффинности антитела, из которого она получена. Более предпочтительно указанные "антигенсвязывающие фрагменты" будут состоять из или будут содержать по меньшей мере три CDR, CDR-H1, CDR-H2 и CDR-H3, тяжелой вариабельной цепи, и три CDR, CDR-L1, CDR-L2 и CDR-L3, легкой вариабельной цепи антитела, из которого они получены.

Под термином "связывание", "связывает" и т.п. подразумевается, что антитело или любой его антигенсвязывающий фрагмент образует с антигеном комплекс, который относительно стабилен в физиологических условиях. Специфическое связывание можно охарактеризовать равновесной константой диссоциации, которая составляет по меньшей мере примерно 1×10^-6 М или менее. Способы определения того, связываются ли две молекулы, хорошо известны в данной области и включают, например, равновесный диализ, поверхностный плазмонный резонанс и т.п. Во избежание сомнений, это не означает, что указанное антитело не может связывать или мешать, на низком уровне, другому антигену. Тем не менее, в качестве одного из воплощений указанное антитело связывается только с указанным антигеном.

Используемое в данном описании выражение "IGF-1R-антитело" следует интерпретировать как аналогичное выражению "антитело против IGF-1R", и оно означает антитело, способное связываться с IGF-1R.

В одном воплощении данной заявки эпитоп антитела локализуется во внеклеточном домене человеческого IGF-1R (также называемом IGF-1R ECD).

В конкретном воплощении указанное антитело или любой его антигенсвязывающий фрагмент способен связываться с IGF-1R с ЕС₅₀, находящейся в диапазоне от 10×10^-10 до 1×10^-10, и более предпочтительно в диапазоне от 8×10^-10 до 2×10^-10 М.

В этом смысле термин "ЕС₅₀" относится к 50% эффективной концентрации. Более точно, термин "половина максимальной эффективной концентрации" (ЕС₅₀) соответствует концентрации лекарственного средства, антитела или токсиканта, индуцирующей реакцию, находящуюся на середине между базальным и максимальным уровнем после некоторого заданного времени экспозиции. Он широко используется в качестве меры силы лекарственного средства. Таким образом, ЕС₅₀ градуированной кривой "доза - ответ" представляет собой концентрацию соединения, при которой наблюдается 50% от его максимального эффекта. ЕС₅₀ в квантовой кривой "доза - ответ" представляет собой концентрацию соединения, при которой 50% популяции демонстрирует ответ после экспозиции в течение указанного времени. Значения концентрации, как правило, следуют сигмовидной кривой, быстро увеличиваясь при сравнительно небольшом изменении концентрации. Их можно определить математически путем выведения линии наилучшего соответствия.

В предпочтительном воплощении ЕС₅₀, определенная в данном изобретении, характеризуется силой связывания антитела с IGF-1R ECD, экспонированным на опухолевых клетках человека. Параметр ЕС₅₀ определяют с помощью анализа FACS. Параметр ЕС₅₀ отражает концентрацию антитела, при которой получается 50% от максимального связывания человеческого IGF-1R, экспрессированного на опухолевых клетках человека. Каждое значение ЕС₅₀ рассчитывали как среднюю точку кривой "доза - ответ" с помощью программы четырехпараметрической подгонки кривой регрессии (Prism Software). Этот параметр был выбран в качестве репрезентативного для физиологических/патологических состояний.

Термин "эпитоп" представляет собой область антигена, которая связывается антигенсвязывающим белком, в том числе антителом. Эпитопы могут быть определены как структурные или функциональные. Функциональные эпитопы, как правило, представляют собой подгруппу структурных эпитопов и имеют те остатки, которые непосредственно способствуют аффинности взаимодействия. Эпитопы также могут быть конформационными, которые состоят из нелинейных аминокислот, другими словами, конформационные эпитопы состоят из непоследовательных аминокислот. В некоторых воплощениях эпитопы могут включать детерминанты, которые являются химически активными поверхностными группировками молекул, такими как аминокислоты, боковые сахарные цепи, фосфорильные группы или сульфонильные группы, а также, в некоторых воплощениях, они могут иметь специфические трехмерные структурные характеристики и/или специфические характеристики заряда.

В конкретном воплощении данное изобретение относится к способу выбора интернализированного антитела или его интернализированного IGF-1R-связывающего фрагмента, который связывается с человеческим рецептором инсулиноподобного фактора роста 1 (IGF-1R) и интернализируется после его связывания с IGF-1R, где указанный способ включает этап выбора антитела:

i) которое связывается с IGF-1R последовательности SEQ ID NO 52, и

ii) которое не связывается с IGF-1R последовательности SEQ ID NO 52 с аминокислотой в позиции 494 в SEQ ID NO 52, отличающейся от гистидина, или с аспарагиновой кислотой (ASP) в позиции 491, предпочтительно, которое не связывается с IGF-1R последовательности SEQ ID NO 52 с аминокислотой, отличающейся от гистидина, в позиции 494 в SEQ ID NO 52 и с аспарагиновой кислотой (ASP) в позиции 491.

В более конкретном воплощении данное изобретение относится к способу выбора интернализированного антитела или его интернализированного IGF-1R-связывающего фрагмента, который связывается с человеческим рецептором инсулиноподобного фактора роста 1 (IGF-1R) и интернализируется после его связывания с IGF-1R, где указанный способ включает этапы:

1) выбора антитела:

i) которое связывается с IGF-1R последовательности SEQ ID NO 52, и

и затем из этих антител

2) выбора интернализированного антитела или его IGF-1R-связывающего фрагмента, процент интернализации которого после его связывания с IGF-1R составляет по меньшей мере 40%, предпочтительно по меньшей мере 50%, по меньшей мере 60%, по меньшей мере 70% или по меньшей мере 80%.

В другом конкретном воплощении данное изобретение относится к способу выбора интернализированного антитела или его интернализированного IGF-1R-связывающего фрагмента, который связывается с человеческим рецептором инсулиноподобного фактора роста 1 (IGF-1R) и интернализируется после его связывания с IGF-1R, где указанный способ включает этапы:

1) выбора интернализированного антитела или его IGF-1R-связывающего фрагмента, процент интернализации которого после его связывания с IGF-1R составляет по меньшей мере 40%, предпочтительно по меньшей мере 50%, по меньшей мере 60%, по меньшей мере 70% или по меньшей мере 80%,

2) и затем выбор из этих антител такого антитела:

i) которое связывается с IGF-1R последовательности SEQ ID NO 52, и

В способе согласно данному изобретению этап выбора антитела по его характеристикам интернализации и связывания или не связывания с IGF-1R может быть выполнен в любом порядке следования.

В соответствии с конкретным воплощением данное изобретение относится к интернализированному антителу или его интернализированному IGF-1R-связывающему фрагменту, который связывается с человеческим рецептором инсулиноподобного фактора роста 1 (IGF-1R), например, полученному с помощью одного из указанных выше способов согласно изобретению.

Для антитела согласно данному изобретению SEQ ID NO 52 соответствует аминокислотной последовательности человеческого рецептора IGF-1R, в которой имеется гистидин в позиции 494, т.е. IGF-1R дикого типа, тогда как SEQ ID NO 82 соответствует мутантной аминокислотной последовательности человеческого рецептора IGF-1R, в которой имеется аргинин в позиции 494, а последовательность SEQ ID NO 92 соответствует мутантной аминокислотной последовательности человеческого рецептора IGF-1R, в которой имеется аланин в позиции 491.

В более конкретном воплощении данное изобретение относится к интернализированному антителу или его интернализированному IGF-1R-связывающему фрагменту, где эпитоп указанного интернализированного антитела содержит аминокислоту гистидин в позиции 494 последовательности SEQ ID NO 52, при этом указанный эпитоп содержит аминокислотную последовательность по меньшей мере из 8 аминокислот.

В более конкретном воплощении данное изобретение относится к интернализированному антителу или его интернализированному IGF-1R-связывающему фрагменту, где эпитоп указанного интернализированного антитела содержит аминокислоту аспарагиновую кислоту в позиции 491 последовательности SEQ ID NO 52, при этом указанный эпитоп содержит аминокислотную последовательность по меньшей мере из 8 аминокислот.

В более конкретном воплощении данное изобретение относится к интернализированному антителу или его интернализированному IGF-1R-связывающему фрагменту, где эпитоп указанного интернализированного антитела содержит аминокислоту гистидин в позиции 494 и аминокислоту аспарагиновую кислоту в позиции 491 последовательности SEQ ID NO 52, при этом указанный эпитоп содержит аминокислотную последовательность по меньшей мере из 8 аминокислот.

- аминокислотную последовательность, идентичную или демонстрирующую по меньшей мере 80% идентичность с аминокислотной последовательностью от аминокислоты в позиции 487 до аминокислоты в позиции 494 последовательности SEQ ID NO 52,

- аминокислотную последовательность, идентичную или демонстрирующую по меньшей мере 80% идентичность с аминокислотной последовательностью от аминокислоты в позиции 488 до аминокислоты в позиции 495 последовательности SEQ ID NO 52,

- аминокислотную последовательность, идентичную или демонстрирующую по меньшей мере 80% идентичность с аминокислотной последовательностью от аминокислоты в позиции 489 до аминокислоты в позиции 496 последовательности SEQ ID NO 52,

- аминокислотную последовательность, идентичную или демонстрирующую по меньшей мере 80% идентичность с аминокислотной последовательностью от аминокислоты в позиции 490 до аминокислоты в позиции 497 последовательности SEQ ID NO 52,

- аминокислотную последовательность, идентичную или демонстрирующую по меньшей мере 80% идентичность с аминокислотной последовательностью от аминокислоты в позиции 491 до аминокислоты в позиции 498 последовательности SEQ ID NO 52,

- аминокислотную последовательность, идентичную или демонстрирующую по меньшей мере 80% идентичность с аминокислотной последовательностью от аминокислоты в позиции 492 до аминокислоты в позиции 499 последовательности SEQ ID NO 52, и

- аминокислотную последовательность, идентичную или демонстрирующую по меньшей мере 80% идентичность с аминокислотной последовательностью от аминокислоты в позиции 493 до аминокислоты в позиции 500 последовательности SEQ ID NO 52.

В более конкретном воплощении данное изобретение относится к интернализированному антителу или его интернализированному IGF-1R-связывающему фрагменту, где эпитоп указанного интернализированного антитела содержит аминокислоту аспарагиновую кислоту в позиции 491 последовательности SEQ ID NO 52, при этом указанный эпитоп содержит аминокислотную последовательность по меньшей мере из 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 или 20 аминокислот.

В более конкретном воплощении данное изобретение относится к интернализированному антителу или его интернализированному IGF-1R-связывающему фрагменту, где эпитоп указанного интернализированного антитела содержит аминокислоту аспарагиновую кислоту в позиции 491 последовательности SEQ ID NO 52, при этом указанный эпитоп содержит аминокислотную последовательность по меньшей мере из 8 аминокислот, где указанный эпитоп содержит аминокислотную последовательность, выбранную из группы, включающей:

- аминокислотную последовательность, идентичную или демонстрирующую по меньшей мере 80% идентичность с аминокислотной последовательностью от аминокислоты в позиции 484 до аминокислоты в позиции 491 последовательности SEQ ID NO 52,

- аминокислотную последовательность, идентичную или демонстрирующую по меньшей мере 80% идентичность с аминокислотной последовательностью от аминокислоты в позиции 485 до аминокислоты в позиции 492 последовательности SEQ ID NO 52,

- аминокислотную последовательность, идентичную или демонстрирующую по меньшей мере 80% идентичность с аминокислотной последовательностью от аминокислоты в позиции 486 до аминокислоты в позиции 493 последовательности SEQ ID NO 52,

В более конкретном воплощении данное изобретение относится к интернализированному антителу или его интернализированному IGF-1R-связывающему фрагменту, где эпитоп указанного интернализированного антитела содержит аминокислоту гистидин в позиции 494 и аминокислоту аспарагиновую кислоту в позиции 491 последовательности SEQ ID NO 52, при этом указанный эпитоп содержит аминокислотную последовательность по меньшей мере из 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 или 20 аминокислот.

В более конкретном воплощении данное изобретение относится к интернализированному антителу или его интернализированному IGF-1R-связывающему фрагменту, где эпитоп указанного интернализированного антитела содержит аминокислоту гистидин в позиции 494 и аминокислоту аспарагиновую кислоту в позиции 491 последовательности SEQ ID NO 52, при этом указанный эпитоп содержит аминокислотную последовательность по меньшей мере из 8 аминокислот, где указанный эпитоп содержит аминокислотную последовательность, выбранную из группы, включающей:

В другом конкретном воплощении данное изобретение относится к интернализированному антителу или его интернализированному IGF-1R-связывающему фрагменту, который связывается с человеческим рецептором инсулиноподобного фактора роста 1 (IGF-1R) последовательности SEQ ID NO 52 и интернализируется после его связывания с IGF-1R, и который не связывается с IGF-1R последовательности SEQ ID NO 82, или где эпитоп указанного интернализированного антитела содержит аминокислоту гистидин в позиции 494 и/или аминокислоту аспарагиновую кислоту в позиции 491 в SEQ ID NO 52, где процент интернализации указанного антитела после его связывания с IGF-1R составляет по меньшей мере 40%, по меньшей мере 50%, по меньшей мере 60%, по меньшей мере 70% или по меньшей мере 80%. Процент интернализации антитела или его антигенсвязывающего фрагмента может быть определен любым способом, известным специалисту в данной области, таким как, например, способ, описанный в данном документе.

В конкретном воплощении данное изобретение относится к интернализированному антителу или его интернализированному IGF-1R-связывающему фрагменту согласно изобретению, где указанная аминокислота в позиции 494 последовательности SEQ ID NO 52, отличающаяся от гистидина, представляет собой аргинин (SEQ ID NO 82).

В конкретном воплощении данное изобретение относится к интернализированному антителу или его интернализированному IGF-1R-связывающему фрагменту согласно изобретению, где указанная аминокислота в позиции 491 SEQ ID NO 52, отличающаяся от аспарагиновой кислоты, представляет собой аланин (SEQ ID NO 92)

В соответствии с одним из воплощений данное изобретение относится к антителу или его антигенсвязывающему фрагменту, который связывается с человеческим рецептором инсулиноподобного фактора роста 1 (IGF-1R) и который интернализируется после его связывания с IGF-1R, где указанное антитело выбрано среди следующих:

i) антитело, содержащее три CDR тяжелой цепи с CDR-H2 последовательности SEQ ID NO 2 и CDR-H3 последовательности SEQ ID NO 3, и три CDR легкой цепи с CDR-L2 последовательности SEQ ID NO 5;

ii) антитело, которое конкурирует за связывание с IGF-1R с антителом i); а также

iii) антитело, которое связывается с тем же эпитопом IGF-1R, с которым связывается антитело i).

Конкуренцию за связывание с IGF-1R можно определить любыми способами или методиками, известными специалистам в данной области, такими как, но не ограничиваясь ими, радиоактивность, Biacore, ELISA (ИФА), проточная цитометрия и т.д., или в соответствии со способом, описанным в данном документе.

Связывание с одним и тем же эпитопом можно определить любыми способами или методиками, известными специалисту в данной области, такими как, но не ограничиваясь ими, радиоактивность, Biacore, ELISA (ИФА), проточная цитометрия и т.д., или в соответствии со способом, описанным в данном документе.

Как упоминалось выше, и в отличие от общих знаний данное изобретение сфокусировано на специфических антителах против IGF-1R, представляющих высокую способность быть интернализированными после связывания с IGF-1R. Используемое в данном документе антитело, которое "интернализировано", представляет собой такое антитело, которое захватывается клеткой (т.е. оно "входит" в клетку) после связывания с IGF-1R на клетке млекопитающего. Такое антитело представляет интерес в качестве одного из компонентов иммуно-лекарственных конъюгатов, так что оно адресует или направляет связанный цитотоксический агент в клетки-мишени, предпочтительно раковые клетки. Будучи интернализированным, цитотоксический агент вызывает гибель раковых клеток.

Предпочтительно все антитела согласно данному изобретению представляют одни и те же последовательности для CDR-H2, CDR-H3 и CDR-L2, остальные 3 CDR различаются. Это наблюдение кажется понятным, так как является частью общих знаний, касающихся специфичности связывания антитела, при этом CDR-H3 описывается как наиболее важный и наиболее причастный к распознаванию эпитоп.

Важными ключами к успеху терапии иммуноконъюгатами считается специфичность "антиген - мишень" и интернализация комплексов антигенсвязывающих белков раковыми клетками. Очевидно, что неинтернализующиеся антигены являются менее эффективными, чем интернализующиеся антигены при доставке цитостатических агентов. Процессы интернализации отличаются среди антигенов и зависят от множества параметров, которые могут находиться под влиянием антител.

В иммуноконъюгате цитотоксический агент несет цитотоксическую активность, а используемое антитело несет специфичность в отношении раковых клеток, как и вектор для входа в клетки для правильной адресации цитотоксического агента. Таким образом, чтобы улучшить иммуноконъюгат, антитело может обладать высокой способностью к интернализации целевыми раковыми клетками. Эффективность, с которой антитело опосредует интернализацию, значительно отличается в зависимости от целевого эпитопа. Выбор мощных интернализирующих антител против IGF-1R требует различных экспериментальных данных, изучающих не только понижающую регуляцию IGF-1R, но и последующую интернализацию антитела против IGF-1R клетками.

В одном из воплощений интернализацию антитела согласно изобретению можно оценить с помощью иммунофлуоресценции (как проиллюстрировано далее в настоящей заявке) или любого способа или процесса, известного специалисту в данной области, специфического для данного механизма интернализации.

Комплекс IGF-1R/антитело интернализируется после связывания антитела с ECD указанного IGF-1R, индуцируется снижение количества IGF-1R на поверхности клеток. Это снижение можно количественно оценить любым способом, известным специалистам в данной области, например, но не ограничиваясь ими, вестерн-блотом, FACS, иммунофлуоресценцией и т.п.

В одном из воплощений это снижение, отражающее таким образом интернализацию, можно предпочтительно измерить с помощью FACS и выразить как разность или дельту между средней интенсивностью флуоресценции (Mean Fluorescence Intensity, MFI), измеренной при 4°С, и MFI, измеренной при 37°С, после 4 часов инкубации с антителом.

В качестве неограничивающего примера эта дельта определяется на основе MFI, полученных с необработанными клетками и с клетками, обработанными антителом, с использованием i) клеток рака молочной железы MCF7 после 4-часового периода инкубации с антителом, описанным в данном документе и ii) вторичного антитела, меченного Alexa 488. Этот параметр рассчитывается по следующей формуле: Δ(MFI_4°C-MFI_37°C).

Эта разница между значениями MFI отражает понижающую регуляцию IGF-1R, так как значения MFI пропорциональны IGF-1R, экспрессированному на поверхности клетки.

В предпочтительном аспекте антитела или любой из их антигенсвязывающих фрагментов состоит из моноклональных антител, дающих Δ(MFI_4°C-MFI_37°C) на клетках MCF7 по меньшей мере 280, предпочтительно по меньшей мере 400.

Более подробно, упомянутая выше дельта может быть измерена в соответствии со следующим процессом, который должен рассматриваться в качестве иллюстративного и неограничивающего примера:

a) обработка и инкубация опухолевых клеток, представляющих интерес, антителом согласно изобретению либо в холодной (4°С), либо в теплой (37°С) полной культуральной среде;

b) параллельная обработка вторичными антителами клеток, обработанных на этапе а), и необработанных клеток,

c) измерение MFI (представляет количество IGF-1R, присутствующего на поверхности) для обработанных и необработанных клеток с помощью вторичного меченого антитела, способного связываться с антителом согласно данному изобретению, и

d) расчет дельты путем вычитания MFI, полученной с обработанными клетками, из MFI, полученной с необработанными клетками.

Из этой дельты MFI процент интернализации может быть определен как: 100×(MFI_4°C-MFI_37°C)/MFI_4°C

Антитела или любые из их антигенсвязывающих фрагментов согласно изобретению присутствуют на MCF7 с процентом интернализации, который составляет от 70% до 90%, предпочтительно от 75% до 87%.

Особое преимущество антител, описанных в данном документе, основано на скорости их интернализации.

Общеизвестно, что для иммуноконъюгата желательно, чтобы используемые антитела демонстрировали высокую скорость интернализации, предпочтительно в течение 24 часов с момента введения антитела in vivo, и более предпочтительно в течение 12 часов, еще более предпочтительно в течение 6 часов.

В данном изобретении скорость интернализации, также определяемая как уменьшение количества антитела, связанного с поверхностью клетки, или как распад антитела на клеточной поверхности, выражается как t1/2 (период полужизни) и соответствует времени, которое необходимо для получения снижения ΔMFI на 50% (этот аспект будет четко понятен в связи с последующими примерами).

Особым преимуществом является то, что антитела согласно изобретению имеют t1/2 от 5 до 25 минут, и предпочтительно от 10 до 20 минут.

Конкретное воплощение данного изобретения относится к антителу, содержащему три CDR тяжелой цепи последовательностей SEQ ID NO 1, 2 и 3, и три CDR легкой цепи последовательностей SEQ ID NO 4, 5 и 6.

Одно из воплощений представляет собой антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, содержащий три CDR тяжелой цепи, которые содержат или состоят из последовательностей SEQ ID NO 1, 2 и 3 или любой последовательности, демонстрирующей по меньшей мере 80%, предпочтительно 85%, 90%, 95% или 98% идентичность с SEQ ID NO 1, 2 и 3; и три CDR легкой цепи, которые содержат или состоят из последовательностей SEQ ID NO 4, 5 и 6 или любой последовательности, демонстрирующей по меньшей мере 80%, предпочтительно 85%, 90%, 95% или 98% идентичность с SEQ ID NO 4, 5 и 6.

В другом воплощении антитело или любой его антигенсвязывающий фрагмент содержит три CDR тяжелой цепи, которые содержат или состоят из последовательностей SEQ ID NO 1, 2 и 3; и три CDR легкой цепи, которые содержат или состоят из последовательностей SEQ ID NO 4, 5 и 6.

Под "CDR-областями" или "CDR" понимают гипервариабельные области тяжелых и легких цепей иммуноглобулинов, определенные согласно IMGT.

Уникальная нумерация IMGT была создана для сравнения вариабельных доменов независимо от антигенного рецептора, типа цепи или вида [Fefranc М.-Р., Immunology Today 18, 509 (1997) / Fefranc М.-Р., The Immunologist, 7, 132-136 (1999) / Fefranc, M.-P., Pommie, C., Ruiz, M., Giudicelli, V., Foulquier, E., Truong, F., Thouvenin-Contet, V. and Fefranc, Dev. Comp. Immunol., 27, 55-77 (2003)]. В уникальной нумерации IMGT консервативные аминокислоты всегда имеют одну и ту же позицию, например, цистеин 23 (1st-CYS), триптофан 41 (CONSERVED-TRP), гидрофобная аминокислота 89, цистеин 104 (2nd-CYS), фенилаланин или триптофан 118 (J-PHE или J-TRP). Уникальная нумерация IMGT предлагает стандартизированное разграничение каркасных областей (FR1-IMGT: позиции с 1 по 26, FR2-IMGT: с 39 по 55, FR3-IMGT: с 66 по 104, и FR4-IMGT: с 118 по 128) и областей, определяющих комплементарность: CDR1-IMGT: с 27 по 38, CDR2-IMGT: с 56 по 65, и CDR3-IMGT: со 105 по 117. Поскольку промежутки представляют незанятые позиции, длины CDR-IMGT (показаны в скобках и разделены точками, например, [8.8.13]) становятся важной информацией. Уникальная нумерация IMGT используется в 20-графических представлениях, как описано в Colliers de Perles [Ruiz, M. and Fefranc, M.-P., Immunogenetics, 53, 857-883 (2002) / Kaas, Q. and Fefranc, M.-P., Current Bioinformatics, 2, 21-30 (2007)], и в 3D-структурах в IMGT/3Dstructure-DB [Kaas, Q., Ruiz, M. and Lefranc, M.-P., T cell receptor and MHC structural data. Nucl. Acids. Res., 32, D208-D210 (2004)].

Необходимо понимать, что, без противоречия описанию в данном документе, области, определяющие комплементарность, или CDR, обозначают гипервариабельные области тяжелых и легких цепей иммуноглобулинов, как они определены согласно системе нумерации IMGT.

Тем не менее, CDR также могут быть определены согласно системе нумерации Кабат (Kabat et al., Sequences of proteins of immunological interest, 5^th Ed., U.S. Department of Health and Human Services, NIH, 1991, и более поздние издания). Существует три CDR тяжелой цепи, и три CDR легкой цепи. Термин "CDR" в единственном или множественном числе применяется здесь для обозначения, в зависимости от случая, одного или более или даже всех этих областей, которые содержат большинство аминокислотных остатков, ответственных за аффинность связывания антитела с антигеном или эпитопом, который оно распознает. Для того чтобы упростить чтение данной заявки, CDR согласно Kabat не определены. Тем не менее, для специалиста в данной области было бы очевидным использовать определение CDR согласно IMGT, чтобы определить CDR в соответствии с Kabat.

В контексте данного изобретения "процент идентичности" двух последовательностей нуклеиновых кислот или аминокислот означает процент идентичных нуклеотидов или аминокислотных остатков в двух сравниваемых последовательностях, полученный после оптимального выравнивания, при этом данный процент является чисто статистическим, и различия между этими двумя последовательностями распределены случайным образом по их длине. Сравнение двух нуклеиновокислотных или аминокислотных последовательностей традиционно проводится путем сравнения последовательностей после их оптимального выравнивания, при этом указанное сравнение можно проводить по сегментам или с помощью "окна выравнивания". Оптимальное выравнивание последовательностей для сравнения может быть осуществлено, помимо сравнения вручную, с помощью алгоритма локальной гомологии Смита и Вотермана (1981) [Ad. Арр. Math. 2: 482], с помощью алгоритма локальной гомологии Нидлмана и Вунша (1970) [J. Mol. Biol. 48: 443], с помощью способа поиска сходства Пирсона и Липмана (1988) [Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 2444] или с помощью компьютерного программного обеспечения с использованием этих алгоритмов (GAP, BESTFIT, FASTA и TFASTA в Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Мэдисон, Висконсин, или с помощью программного обеспечения для сравнения BLAST NR или BLAST Р).

Процентная идентичность двух нуклеиновокислотных или аминокислотных последовательностей определяется путем сравнения двух оптимально выровненных последовательностей, в которых сравниваемая нуклеиновокислотная или аминокислотная последовательность может иметь добавления или делеции по сравнению с референсной последовательностью для оптимального выравнивания двух последовательностей. Процентная идентичность рассчитывается путем определения числа позиций, в которых аминокислоты, нуклеотиды или остатки идентичны в двух последовательностях, предпочтительно в двух полных последовательностях, деления числа идентичных позиций на общее число позиций в окне выравнивания и умножения результата на 100 для получения процентной идентичности двух последовательностей.

Например, программа BLAST "BLAST 2 sequences" (Tatusova et al, "Blast 2 sequences - a new tool for comparing protein and nucleotide sequences", FEMS Microbiol, 1999, Lett. 174: 247-250), доступная на сайте http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/bl2.html, может быть использована с параметрами по умолчанию (в частности, с параметрами "штраф за открытие делеции": 5 и "штраф за удлинение делеции": 2; выбранной матрицей будет, например, матрица "BLOSUM 62", предложенная в программе); процентная идентичность двух последовательностей для сравнения рассчитывается непосредственно программой.

Для аминокислотной последовательности, демонстрирующей идентичность с референсной аминокислотной последовательностью по меньшей мере 80%, предпочтительно 85%, 90%, 95% и 98%, предпочтительные примеры включают те, которые содержат референсную последовательность, определенные модификации, в частности делеции, добавления или замены по меньшей мере одной аминокислоты, усечения или удлинения. В случае замены одной или более последовательных или непоследовательных аминокислот предпочтительными являются те замены, при которых замещаемые аминокислоты заменяются "эквивалентными" аминокислотами. В данном случае выражение "эквивалентные аминокислоты" применяется для обозначения любых аминокислот, которые могут заменить одну из структурных аминокислот без изменения биологической активности соответствующих антител, а также тех конкретных примеров, которые приведены ниже.

Эквивалентные аминокислоты могут быть определены либо по их структурной гомологии с аминокислотами, которых они будут замещать, либо по результатам сравнительных тестов биологической активности различных антител, которые могут быть получены.

В качестве неограничивающего примера, в таблице 1 ниже приведены возможные замещения, которые могут быть проведены без значительного изменения биологической активности соответствующего модифицированного антигенсвязывающего белка; обратные замены, естественно, возможны при тех же условиях.

Конкретным аспектом данного изобретения является то, что данное антитело или любой его антигенсвязывающий фрагмент не связывается с рецептором инсулина (IR). Этот аспект представляет интерес, поскольку антитело, описанное в данном документе, не будет иметь никакого негативного влияния на IR, т.е. на метаболизм инсулина.

В другом воплощении еще одним предпочтительным аспектом антитела согласно изобретению является то, что оно способно связываться не только с человеческим IGF-1R, но также с IGF-1R обезьяны и, более конкретно, с IGF-1R яванского макака. Этот аспект также представляет интерес, поскольку он будет облегчать испытания токсичности и клинические испытания.

В другом воплощении антитело согласно данному изобретению состоит из моноклинального антитела.

Термин "моноклональное антитело" или "МКА" ("Mab"), используемый в данном документе, относится к антителу, полученному из популяции по существу гомогенных антител, т.е. отдельные антитела данной популяции являются идентичными за исключением возможных встречающихся в природе мутаций, которые могут присутствовать в незначительных количествах. Моноклональные антитела являются высоко специфичными, будучи направленными против одного эпитопа. Такое моноклональное антитело может быть получено с помощью одного клона В-клеток или с помощью гибридомы. Моноклональные антитела также могут быть рекомбинантными, т.е. полученными путем белковой инженерии. Моноклональные антитела также могут быть выделены из фаговых библиотек антител. Кроме того, в отличие от препаратов поликлональных антител, которые обычно включают различные антитела, направленные против различных детерминант, или эпитопов, каждое моноклональное антитело направлено против одного эпитопа антигена. Изобретение относится к антителу, выделенному или полученному путем очистки из природных источников или полученному с помощью генетической рекомбинации или химического синтеза.

В одном воплощении моноклональное антитело согласно данному изобретению включает мышиное, химерное и гуманизированное антитело, описанное ниже.

Антитело может быть получено из гибридомы мышиного происхождения, сохраненной во Французской коллекции культур микроорганизмов (CNCM, Институт Пастера, Париж, Франция), при этом указанную гибридому получают путем слияния спленоцитов/лимфоцитов от иммунизированных мышей BALB/C и клеток миеломной клеточной линии Sp2/O-Ag14.

В другом воплощении антитело согласно данному изобретению состоит из рекомбинантного антитела. Термин "рекомбинантное антитело" относится к антителу, которое является результатом экспрессии рекомбинантной ДНК в живых клетках. Рекомбинантное антитело согласно данному изобретению получают с использованием лабораторных способов генетической рекомбинации, хорошо известных специалистам в данной области, путем создания ДНК-последовательностей, которых нет в биологических организмах.

В другом воплощении антитело согласно данному изобретению состоит из химически синтезированного антитела.

В одном из воплощений антитело против IGF-1R согласно данному изобретению состоит из мышиного антитела, также обозначаемого как m[название антитела].

В одном из воплощений антитело против IGF-1R согласно данному изобретению состоит из химерного антитела, также обозначаемого как с[название антитела].

В одном из воплощений антитело против IGF-1R согласно данному изобретению состоит из гуманизированного антитела, также обозначаемого как hz[название антитела].

Во избежание сомнений, в последующем описании выражения "IGF-1R-антитело" и "[название антитела]" являются аналогичными и включают (без противоречия описанию) мышиные, химерные и гуманизированные варианты указанного IGF-IR-антитела и указанного "[название антитела]"-антитела. При необходимости используется префикс m - (мышиное), c - (химерное) или hz-(гуманизированное).

В другом воплощении антитело согласно данному изобретению выбрано среди следующих:

a) антитело, содержащее три CDR тяжелой цепи последовательностей SEQ ID NO 7, 2 и 3, и три CDR легкой цепи последовательностей SEQ ID NO 9, 5 и 11;

b) антитело, содержащее три CDR тяжелой цепи последовательностей SEQ ID NO 7, 2 и 3, и три CDR легкой цепи последовательностей SEQ ID NO 10, 5 и 11;

c) антитело, содержащее три CDR тяжелой цепи последовательностей SEQ ID NO 7, 2 и 3, и три CDR легкой цепи последовательностей SEQ ID NO 9, 5 и 12; и

d) антитело, содержащее три CDR тяжелой цепи последовательностей SEQ ID NO 8, 2 и 3, и три CDR легкой цепи последовательностей SEQ ID NO 9, 5 и 11.

Для большей ясности следующая таблица 2 иллюстрирует последовательности CDR, определенные согласно IMGT, для предпочтительных антител.

Специалисту в данной области будет очевидно, что любую комбинацию этих шести CDR, описанных выше, следует рассматривать как часть данного изобретения.

Как можно видеть в этой таблице 2, все антитела, описанные в таблице, имеют одни и те же последовательности для CDR-H2, CDR-H3 и CDR-L2, причем данное свойство представляет особый интерес, как описано выше.

Конкретный аспект относится к мышиному (m) антителу или любому из его антигенсвязывающих фрагментов, которые характеризуются тем, что указанное антитело также содержит константные области легкой цепи и тяжелой цепи, полученные из антитела вида, гетерологичного по отношению к мыши, в частности, из человеческого антитела.

Другой конкретный аспект относится к химерному (с) антителу или любому из его антигенсвязывающих фрагментов, которые характеризуются тем, что указанное антитело также содержит константные области легкой цепи и тяжелой цепи, полученные из антитела вида, гетерологичного по отношению к мыши, в частности, из человеческого антитела.

В одном воплощении данного изобретения антитело состоит из химерного антитела.

Химерное антитело представляет собой антитело, содержащее природную вариабельную область (легкой цепи и тяжелой цепи), полученную из антитела данного вида, в сочетании с константными областями легкой цепи и тяжелой цепи из антитела другого вида, гетерологичного по отношению к указанному данному виду.

Антитела или их химерные фрагменты могут быть получены с использованием методик рекомбинантной генетики. Например, химерное антитело может быть получено путем клонирования рекомбинантной ДНК, содержащей промотор и последовательность, кодирующую вариабельную область нечеловеческого моноклонального антитела согласно изобретению, в частности мышиного, и последовательность, кодирующую константную область человеческого антитела. Химерное антитело в соответствии с данным изобретением, кодируемое одним из таких рекомбинантных генов, может представлять собой, например, химеру "мышь-человек", при этом специфичность этого антитела определяется вариабельной областью, полученной из мышиной ДНК, а его изотип определяется константной областью, полученной из человеческой ДНК.

В предпочтительном, но не ограничивающем воплощении антитело согласно данному изобретению выбрано среди следующих:

a) антитело, содержащее вариабельный домен тяжелой цепи последовательности SEQ ID NO 13 или любой последовательности, демонстрирующей по меньшей мере 80% идентичность с SEQ ID NO 13, и три CDR легкой цепи последовательностей SEQ ID NO 9, 5 и 11;

b) антитело, содержащее (или состоящее из) вариабельный домен тяжелой цепи последовательности SEQ ID NO 14 или любой последовательности, демонстрирующей по меньшей мере 80%, 85%, 90%, 95% или 98% идентичность с SEQ ID NO 14, и три CDR легкой цепи последовательностей SEQ ID NO 10, 5 и 11;

c) антитело, содержащее (или состоящее из) вариабельный домен тяжелой цепи последовательности SEQ ID NO 15 или любой последовательности, демонстрирующей по меньшей мере 80%, 85%, 90%, 95% или 98% идентичность с SEQ ID NO 15, и три CDR легкой цепи последовательностей SEQ ID NO 9, 5 и 12;

d) антитело, содержащее (или состоящее из) вариабельный домен тяжелой цепи последовательности SEQ ID NO 16 или любой последовательности, демонстрирующей по меньшей мере 80%, 85%, 90%, 95% или 98% идентичность с SEQ ID NO 16, и три CDR легкой цепи последовательностей SEQ ID NO 9, 5 и 11; и

e) антитело, содержащее (или состоящее из) вариабельный домен тяжелой цепи последовательности SEQ ID NO 17 или любой последовательности, демонстрирующей по меньшей мере 80%, 85%, 90%, 95% или 98% идентичность с SEQ ID NO 17, и три CDR легкой цепи последовательностей SEQ ID NO 9, 5 и 12.

Под "любой последовательностью, демонстрирующей по меньшей мере 80%, 85%, 90%, 95% или 98% идентичность с SEQ ID NO 13-17" понимается, соответственно, последовательность, демонстрирующая три CDR тяжелой цепи последовательности SEQ ID NO 1, 2 и 3 и, кроме того, демонстрирующая по меньшей мере 80%, предпочтительно 85%, 90%, 95% или 98% идентичность с полной последовательностью SEQ ID NO 13-17 вне последовательностей, соответствующих CDR (т.е. SEQ ID NO 1, 2 и 3), где под выражением "вне последовательностей, соответствующих CDR" понимается "исключая последовательности, соответствующие CDR".

В другом предпочтительном, но не ограничивающем воплощении антитело согласно данному изобретению выбрано среди следующих:

а) антитело, содержащее вариабельный домен легкой цепи последовательности SEQ ID NO 18 или любой последовательности, демонстрирующей по меньшей мере 80%, 85%, 90%, 95% или 98% идентичность с SEQ ID NO 18, и три CDR тяжелой цепи последовательностей SEQ ID NO 7, 2 и 3;

b) антитело, содержащее вариабельный домен легкой цепи последовательности SEQ ID NO 19 или любой последовательности, демонстрирующей по меньшей мере 80%, 85%, 90%, 95% или 98% идентичность с SEQ ID NO 19, и три CDR тяжелой цепи последовательностей SEQ ID NO 7, 2 и 3;

c) антитело, содержащее вариабельный домен легкой цепи последовательности SEQ ID NO 20 или любой последовательности, демонстрирующей по меньшей мере 80%, 85%, 90%, 95% или 98% идентичность с SEQ ID NO 20, и три CDR тяжелой цепи последовательностей SEQ ID NO 7, 2 и 3;

d) антитело, содержащее вариабельный домен легкой цепи последовательности SEQ ID NO 21 или любой последовательности, демонстрирующей по меньшей мере 80%, 85%, 90%, 95% или 98% идентичность с SEQ ID NO 21, и три CDR тяжелой цепи последовательностей SEQ ID NO 8, 2 и 3; и

e) антитело, содержащее вариабельный домен легкой цепи последовательности SEQ ID NO 22 или любой последовательности, демонстрирующей по меньшей мере 80%, 85%, 90%, 95% или 98% идентичность с SEQ ID NO 22, и три CDR тяжелой цепи последовательностей SEQ ID NO 7, 2 и 3.

Под "любой последовательностью, демонстрирующей по меньшей мере 80%, предпочтительно 85%, 90%, 95% или 98% идентичность с SEQ ID NO 18-22", понимаются последовательности, демонстрирующие три CDR легкой цепи SEQ ID NO 4, 5 и 6 и, кроме того, демонстрирующие по меньшей мере 80%, предпочтительно 85%, 90%, 95% или 98% идентичность с полной последовательностью SEQ ID NO 18-22 вне последовательностей, соответствующих CDR (т.е. SEQ ID NO 4, 5 и 6).

Одно из воплощений согласно данному изобретению относится к антителу, выбранному среди следующих:

a) антитело, содержащее вариабельный домен тяжелой цепи последовательности SEQ ID NO 13 или любой последовательности, демонстрирующей по меньшей мере 80%, 85%, 90%, 95% или 98% идентичность с SEQ ID NO 13, и вариабельный домен легкой цепи последовательности SEQ ID NO 18 или любой последовательности, демонстрирующей по меньшей мере 80%, 85%, 90%, 95% или 98% идентичность с SEQ ID NO 18;

b) антитело, содержащее вариабельный домен тяжелой цепи последовательности SEQ ID NO 14 или любой последовательности, демонстрирующей по меньшей мере 80%, 85%, 90%, 95% или 98% идентичность с SEQ ID NO 14, и вариабельный домен легкой цепи последовательности SEQ ID NO 19 или любой последовательности, демонстрирующей по меньшей мере 80%, 85%, 90%, 95% или 98% идентичность с SEQ ID NO 19;

c) антитело, содержащее вариабельный домен тяжелой цепи последовательности SEQ ID NO 15 или любой последовательности, демонстрирующей по меньшей мере 80%, 85%, 90%, 95% или 98% идентичность с SEQ ID NO 15, и вариабельный домен легкой цепи последовательности SEQ ID NO 20 или любой последовательности, демонстрирующей по меньшей мере 80%, 85%, 90%, 95% или 98% идентичность с SEQ ID NO 20;

d) антитело, содержащее вариабельный домен тяжелой цепи последовательности SEQ ID N016 или любой последовательности, демонстрирующей по меньшей мере 80%, 85%, 90%, 95% или 98% идентичность с SEQ ID NO 16, и вариабельный домен легкой цепи последовательности SEQ ID NO 21 или любой последовательности, демонстрирующей по меньшей мере 80%, 85%, 90%, 95% или 98% идентичность с SEQ ID NO 21; и

e) антитело, содержащее вариабельный домен тяжелой цепи последовательности SEQ ID N017 или любой последовательности, демонстрирующей по меньшей мере 80%, 85%, 90%, 95% или 98% идентичность с SEQ ID NO 17, и вариабельный домен легкой цепи последовательности SEQ ID NO 22 или любой последовательности, демонстрирующей по меньшей мере 80%, 85%, 90%, 95% или 98% идентичность с SEQ ID NO 22.

Химерные антитела, описанные в данном документе, также могут характеризоваться константным доменом, и, более конкретно, указанные химерные антитела могут быть выбраны или сконструированы как IgG1, IgG2, IgG3, IgM, IgA, IgD или IgE, но не ограничиваясь ими. Более предпочтительно в контексте данного изобретения указанные химерные антитела представляют собой IgG1 или IgG4.

Одно из воплощений согласно данному изобретению относится к химерному антителу, содержащему вариабельные домены VH и VL, описанные выше, в формате IgG1. Более предпочтительно, указанное химерное антитело содержит константный домен для VH-последовательности SEQ ID NO 43 и каппа-домен для VL-последовательности SEQ ID NO 45.

Одно из воплощений согласно данному изобретению относится к химерному антителу, содержащему вариабельные домены VH и VL, описанные выше, в формате IgG4. Более предпочтительно, указанное химерное антитело содержит константный домен для VH-последовательности SEQ ID NO 44 и каппа-домен для VL-последовательности SEQ ID NO 45.

a) антитело, содержащее (или состоящее из) тяжелую цепь последовательности SEQ ID NO 23 или любой последовательности, демонстрирующей по меньшей мере 80%, 85%, 90%, 95% или 98% идентичность с SEQ ID NO 23, и легкую цепь последовательности SEQ ID NO 28 или любой последовательности, демонстрирующей по меньшей мере 80%, 85%, 90%, 95% или 98% идентичность с SEQ ID NO 28;

b) антитело, содержащее (или состоящее из) тяжелую цепь последовательности SEQ ID NO 24 или любой последовательности, демонстрирующей по меньшей мере 80%, 85%, 90%, 95% или 98% идентичность с SEQ ID NO 24, и легкую цепь последовательности SEQ ID NO 29 или любой последовательности, демонстрирующей по меньшей мере 80%, 85%, 90%, 95% или 98% идентичность с SEQ ID NO 29;

c) антитело, содержащее (или состоящее из) тяжелую цепь последовательности SEQ ID NO 25 или любой последовательности, демонстрирующей по меньшей мере 80%, 85%, 90%, 95% или 98% идентичность с SEQ ID NO 25, и легкую цепь последовательности SEQ ID NO 30 или любой последовательности, демонстрирующей по меньшей мере 80%, 85%, 90%, 95% или 98% идентичность с SEQ ID NO 30;

d) антитело, содержащее (или состоящее из) тяжелую цепь последовательности SEQ ID NO 26 или любой последовательности, демонстрирующей по меньшей мере 80%, 85%, 90%, 95% или 98% идентичность с SEQ ID NO 26, и легкую цепь последовательности SEQ ID NO 31 или любой последовательности, демонстрирующей по меньшей мере 80%, 85%, 90%, 95% или 98% идентичность с SEQ ID NO 31; и

e) антитело, содержащее (или состоящее из) тяжелую цепь последовательности SEQ ID NO 27 или любой последовательности, демонстрирующей по меньшей мере 80%, 85%, 90%, 95% или 98% идентичность с SEQ ID NO 27, и легкую цепь последовательности SEQ ID NO 32 или любой последовательности, демонстрирующей по меньшей мере 80%,85%, 90%, 95% или 98% идентичность с SEQ ID NO 32.

Для большей ясности следующая таблица 3 иллюстрирует последовательности VH и VL, соответственно, для предпочтительных химерных антител.

Другой конкретный аспект данного изобретения относится к гуманизированному антителу или его антигенсвязывающему фрагменту, характеризующемуся тем, что константные области легкой цепи и тяжелой цепи, полученные из человеческого антитела, являются, соответственно, областями лямбда или каппа и гамма-1, гамма-2 или гамма-4.

В одном из воплощений данного изобретения антитело состоит из гуманизированного антитела.

Под "гуманизированными антителами" понимаются антитела, которые содержат CDR-области, полученные из антитела нечеловеческого происхождения, при этом другие части молекулы антитела получены из одного (или нескольких) человеческих антител. Кроме того, некоторые остатки сегментов скелета (называемые FR) могут быть изменены в целях сохранения аффинности связывания.

Гуманизированные антитела или их фрагменты могут быть получены с помощью методик, известных специалистам в данной области. Такие гуманизированные антитела являются предпочтительными для их применения в способах, используемых в диагностике in vitro, или в профилактическом и/или терапевтическом лечении in vivo. Другой методикой гуманизации, также известной специалистам в данной области, является, например, методика "CDR-прививки", описанная PDL в патентах ЕР 0451261, ЕР 0682 040, ЕР 09127, ЕР 0566647 или US 5530101, US 6180370, US 5585089 и US 5693761. Также можно отметить патенты US 5639641 или US 6054297, US 5886152 и US 5877293.

В качестве конкретного воплощения данного изобретения и как будет пояснено более подробно в следующих примерах, в данном документе описано антитело, состоящее из hz208F2. Такая гуманизация также может быть применена к частям других антител согласно данному изобретению.

В предпочтительном воплощении антитело согласно данному изобретению содержит вариабельный домен тяжелой цепи (VH), имеющий:

i) CDR-H1, CDR-H2 и CDR-H3 последовательностей SEQ ID NO 7, 2 и 3, соответственно,

ii) FR1, FR2 и FR3, полученные из IGHV1-46*01 зародышевой линии человека (SEQ ID NO 46), и

iii) FR4, полученный из IGHJ4*01 зародышевой линии человека (SEQ ID NO 48).

В предпочтительном воплощении антитело согласно данному изобретению содержит вариабельный домен легкой цепи (VL), имеющий:

i) CDR-L1, CDR-L2 и CDR-L3 последовательностей SEQ ID NO 9, 5 и 11, соответственно,

ii) FR1, FR2 и FR3, полученные из IGKV1-39*01 зародышевой линии человека (SEQ ID NO 47), и

iii) FR4, полученный из IGKJ4*01 зародышевой линии человека (SEQ ID NO 49).

В предпочтительном, но не ограничивающем воплощении согласно данному изобретению антитело содержит:

a) тяжелую цепь, имеющую CDR-H1, CDR-H2 и CDR-H3 последовательностей SEQ ID NO 7, 2 и 3, соответственно, и FR1, FR2 и FR3, полученные из IGHV1-46*01 зародышевой линии человека (SEQ ID NO 46), и FR4, полученную из IGHJ4*01 зародышевой линии человека (SEQ ID NO 48); и

b) легкую цепь, имеющую CDR-L1, CDR-L2 и CDR-L3 последовательностей SEQ ID NO 9, 5 и 11, соответственно, и FR1, FR2 и FR3, полученные из IGKV1-39*01 зародышевой линии человека (SEQ ID NO 47), и FR4, полученную из IGKJ4*01 зародышевой линии человека (SEQ ID NO 49).

В одном воплощении антитело согласно данному изобретению содержит вариабельный домен тяжелой цепи (VH) последовательности SEQ ID NO 33 и вариабельный домен легкой цепи (VL) последовательности SEQ ID NO 35. Указанное гуманизированное антитело будет называться далее hz208F2 ("вариант" или "вар." 1).

В другом воплощении антитело согласно данному изобретению содержит вариабельный домен тяжелой цепи (VH) последовательности SEQ ID NO 33, где указанная последовательность SEQ ID NO 33 содержит по меньшей мере 1 обратную мутацию, выбранную среди остатков 20, 34, 35, 38, 48, 50, 59, 61, 62, 70, 72, 74, 76, 77, 79, 82 и 95.

Под выражением "обратная мутация" подразумевается мутация или замена человеческого остатка, присутствующего в зародышевой последовательности, соответствующим остатком, первоначально присутствовавшим в мышиной последовательности.

В другом воплощении антитело согласно данному изобретению содержит вариабельный домен тяжелой цепи (VH) последовательности SEQ ID NO 33, где указанная последовательность SEQ ID NO 33 содержит 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16 или 17 обратных мутаций, выбранных среди остатков 20, 34, 35, 38, 48, 50, 59, 61, 62, 70, 72, 74, 76, 77, 79, 82 и 95.

Для большей ясности в следующей таблице 4 показаны предпочтительные обратные мутации.

В одном из воплощений антитело согласно данному изобретению содержит вариабельный домен легкой цепи (VL) последовательности SEQ ID NO 35, где указанная последовательность SEQ ID NO 35 содержит по меньшей мере 1 обратную мутацию, выбранную среди остатков 22, 53, 55, 65, 71, 72, 77 и 87.

В одном из воплощений антитело согласно данному изобретению содержит вариабельный домен легкой цепи (VL) последовательности SEQ ID NO 35, где указанная последовательность SEQ ID NO 35 содержит 2, 3, 4, 5, 6, 7 или 8 обратных мутаций, выбранных среди остатков 22, 53, 55, 65, 71, 72, 77 и 87.

В другом воплощении антитело согласно данному изобретению содержит:

a) вариабельный домен тяжелой цепи (VH) последовательности SEQ ID NO 33, где указанная последовательность SEQ ID NO 33 содержит по меньшей мере 1 обратную мутацию, выбранную среди остатков 20, 34, 35, 38, 48, 50, 59, 61, 62, 70, 72, 74, 76, 77, 79, 82 и 95; и

b) вариабельный домен легкой цепи (VL) последовательности SEQ ID NO 35, где указанная последовательность SEQ ID NO 35 содержит по меньшей мере 1 обратную мутацию, выбранную среди остатков 22, 53, 55, 65, 71, 72, 77 и 87.

Для большей ясности следующая таблица 5 иллюстрирует предпочтительные обратные мутации.

В таком воплощении антитело согласно данному изобретению содержит все обратные мутации, указанные выше, и соответствует антителу, содержащему вариабельный домен тяжелой цепи (VH) последовательности SEQ ID NO 34 и вариабельный домен легкой цепи (VL) последовательности SEQ ID NO 36. Указанное гуманизированное антитело далее будет называться hz208F2 ("вариант" или "вар." 3).

В другом воплощении все гуманизированные формы, заключенные между вариантом 1 и вариантом 3, также охватываются данным изобретением. Другими словами, антитело согласно данному изобретению соответствует антителу, содержащему вариабельный домен тяжелой цепи (VH) "консенсусной" последовательности SEQ ID NO 41 и вариабельный домен легкой цепи (VL) "консенсусной" последовательности SEQ ID NO 42. Указанное гуманизированное антитело целиком будет далее называться hz208F2 ("вариант" или "вар." 2).

a) антитело, содержащее вариабельный домен тяжелой цепи последовательности SEQ ID NO 33 или любой последовательности, демонстрирующей по меньшей мере 80%, 85%, 90%, 95% или 98% идентичность с SEQ ID NO 33, и три CDR легкой цепи последовательностей SEQ ID NO 9, 5 и 11;

b) антитело, содержащее вариабельный домен тяжелой цепи последовательности SEQ ID NO 34 или любой последовательности, демонстрирующей по меньшей мере 80%, 85%, 90%, 95% или 98% идентичность с SEQ ID NO 34, и три CDR легкой цепи последовательностей SEQ ID NO 9, 5 и 11; и

Под "любой последовательностью, демонстрирующей по меньшей мере 80%, предпочтительно 85%, 90%, 95% или 98% идентичность с SEQ ID NO 33, 34, 56, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76, 78 или 80", понимаются последовательности, демонстрирующие три CDR тяжелой цепи SEQ ID NO 1, 2 и 3 и, кроме того, демонстрирующие по меньшей мере 80%, предпочтительно 85%, 90%, 95% или 98% идентичность с полной последовательностью SEQ ID NO 33, 34, 56, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76, 78 и 80 вне последовательностей, соответствующих CDR (т.е. SEQ ID NO 1, 2 и 3).

a) антитело, содержащее вариабельный домен легкой цепи последовательности SEQ ID NO 35 или любой последовательности, демонстрирующей по меньшей мере 80%, 85%, 90%, 95% или 98% идентичность с SEQ ID NO 35, и три CDR тяжелой цепи последовательностей SEQ ID NO 7, 2 и 3; и

b) антитело, содержащее вариабельный домен легкой цепи последовательности SEQ ID NO 36 или любой последовательности, демонстрирующей по меньшей мере 80%, 85%, 90%, 95% или 98% идентичность с SEQ ID NO 36, и три CDR тяжелой цепи последовательностей SEQ ID NO 7, 2 и 3; и

c) антитело, содержащее вариабельный домен легкой цепи последовательности, выбранной среди SEQ ID NO 57 и 60 или любой последовательности по меньшей мере с 80%, 85%, 90%, 95% или 98% идентичностью с SEQ ID NO 57 или 60; и три CDR тяжелой цепи последовательностей SEQ ID NO 7, 2 и 3.

Под "любой последовательностью, демонстрирующей по меньшей мере 80%, предпочтительно 85%, 90%, 95% или 98% идентичность с SEQ ID NO 35, 36, 57 или 60" понимаются последовательности, демонстрирующие три CDR легкой цепи SEQ ID NO 4, 5 и 6 и, кроме того, демонстрирующие по меньшей мере 80%, предпочтительно 85%, 90%, 95% или 98% идентичность с полной последовательностью SEQ ID NO 35,36, 57 или 60 вне последовательностей, соответствующих CDR (т.е. SEQ ID NO 4, 5 и 6).

Гуманизированные антитела, описанные в данном документе, также могут характеризоваться константным доменом, и, более конкретно, указанные гуманизированные антитела могут быть выбраны или сконструированы как IgG1, IgG2, IgG3, IgM, IgA, IgD или IgE, но не ограничиваясь ими. Более предпочтительно в контексте данного изобретения указанные гуманизированные антитела представляют собой IgG1 или IgG4.

Одно из воплощений согласно данному изобретению относится к гуманизированному антителу, содержащему вариабельные домены VH и VL, описанные выше, в формате IgG1. Более предпочтительно, указанное гуманизированное антитело содержит константный домен для VH-последовательности SEQ ID NO 43 и каппа-домен для VL-последовательности SEQ ID NO 45.

Одно из воплощений согласно данному изобретению относится к гуманизированному антителу, содержащему вариабельные домены VH и VL, описанные выше, в формате IgG4. Более предпочтительно, указанное гуманизированное антитело содержит константный домен для VH-последовательности SEQ ID NO 44 и каппа-домен для VL-последовательности SEQ ID NO 45.

В еще одном воплощении согласно данному изобретению антитело выбрано среди следующих:

a) антитело, содержащее (или состоящее из) тяжелую цепь последовательности SEQ ID NO 37 или любой последовательности, демонстрирующей по меньшей мере 80%, 85%, 90%, 95% или 98% идентичность с SEQ ID NO 37, и легкую цепь, содержащую (или состоящую из) последовательность SEQ ID NO 39 или любую последовательность, демонстрирующую по меньшей мере 80%, 85%, 90%, 95% или 98% идентичность с SEQ ID NO 39;

b) антитело, содержащее (или состоящее из) тяжелую цепь последовательности SEQ ID NO 38 или любой последовательности, демонстрирующей по меньшей мере 80%, 85%, 90%, 95% или 98% идентичность с SEQ ID NO 38, и легкую цепь, содержащую (или состоящую из) последовательность SEQ ID NO 40 или любую последовательность, демонстрирующую по меньшей мере 80%, 85%, 90%, 95% или 98% идентичность с SEQ ID NO 40; и

c) антитело, содержащее вариабельный домен тяжелой цепи последовательности, выбранной среди SEQ ID NO 56, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76, 78 и 80, или любой последовательности по меньшей мере с 80%, 85%, 90%, 95% или 98% идентичностью с SEQ ID NO 56, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76, 78 или 80, и вариабельный домен легкой цепи последовательности, выбранной среди SEQ ID NO 57 и 60 или любой последовательности по меньшей мере с 80%, 85%, 90%, 95% или 98% идентичностью с SEQ ID NO 57 или 60. Для большей ясности следующая таблица 6а иллюстрирует неограничивающие примеры последовательностей VH и VL для варианта 1 (вар. 1) и варианта 3 (вар. 3) гуманизированного антитела hz208F2. Она также содержит консенсусную последовательность для варианта 2 (вар. 2).

a) антитело, содержащее вариабельный домен тяжелой цепи последовательности, выбранной среди SEQ ID NO 56, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76, 78 и 80, или любой последовательности по меньшей мере с 80%, 85%, 90%, 95% или 98% идентичностью с SEQ ID NO 56, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76, 78 или 80; и три CDR легкой цепи последовательностей SEQ ID NO 9, 5 и 11;

b) антитело, содержащее вариабельный домен легкой цепи последовательности, выбранной среди SEQ ID NO 57 и 60, или любой последовательности по меньшей мере с 80%, 85%, 90%, 95% или 98% идентичностью с SEQ ID NO 57 или 60; и три CDR тяжелой цепи последовательностей SEQ ID NO 7, 2 и 3; и

c) антитело, содержащее вариабельный домен легкой цепи последовательности, выбранной среди SEQ ID NO 57 и 60, или любой последовательности по меньшей мере с 80%, 85%, 90%, 95% или 98% идентичностью с SEQ ID NO 57 или 60; и вариабельный домен тяжелой цепи последовательности, выбранной среди SEQ ID NO 56, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76, 78 и 80, или любой последовательности по меньшей мере с 80%, 85%, 90%, 95% или 98% идентичностью с SEQ ID NO 56, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76, 78 или 80.

Еще одно воплощение согласно данному изобретению относится к антителу, выбранному среди антител, содержащих или состоящих из следующих:

а) тяжелая цепь последовательности, выбранной среди SEQ ID NO 58, 63, 65, 67, 69, 71, 73, 75, 77, 79 и 81, или любой последовательности по меньшей мере с 80%, предпочтительно 85%, 90%, 95% или 98% идентичностью с SEQ ID NO 58, 63, 65, 67, 69, 71, 73, 75, 77, 79 или 81; и

b) легкая цепь последовательности, выбранной среди SEQ ID NO 59 и 61, или любой последовательности по меньшей мере с 80%, предпочтительно 85%, 90%, 95% или 98% идентичностью с SEQ ID NO 59 или 61. Еще одно воплощение согласно данному изобретению относится к антителу, выбранному среди следующих: а) антитело, содержащее вариабельный домен тяжелой цепи последовательности, выбранной среди SEQ ID NO 56, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76, 78 и 80, или любой последовательности, демонстрирующей по меньшей мере 80%, 85%, 90%, 95% или 98% идентичность с SEQ ID NO 56, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76, 78 или 80; и вариабельный домен легкой цепи последовательности SEQ ID NO 57 или любой последовательности, демонстрирующей по меньшей мере 80%, 85%, 90%, 95% или 98% идентичность с SEQ ID NO 57; и

b) антитело, содержащее вариабельный домен тяжелой цепи последовательности, выбранной среди SEQ ID NO 56, 64, 68 и 78, или любой последовательности, демонстрирующей по меньшей мере 80%, 85%, 90%, 95% или 98% идентичность с SEQ ID NO 56, 64, 68 или 78, и вариабельный домен легкой цепи последовательности SEQ ID NO 60 или любой последовательности, демонстрирующей по меньшей мере 80% идентичность с SEQ ID NO 60.

Еще одно воплощение согласно данному изобретению относится к антителу, выбранному среди следующих:

a) антитело, содержащее (или состоящее из) тяжелую цепь последовательности SEQ ID NO 58 или любой последовательности, демонстрирующей по меньшей мере 80%, 85%, 90%, 95% или 98% идентичность с SEQ ID NO 58, и легкую цепь, содержащую (или состоящую из) последовательность SEQ ID NO 59 или любую последовательность, демонстрирующую по меньшей мере 80%, 85%, 90%, 95% или 98% идентичность с SEQ ID NO 59;

b) антитело, содержащее (или состоящее из) тяжелую цепь последовательности SEQ ID NO 58 или любой последовательности, демонстрирующей по меньшей мере 80%, 85%, 90%, 95% или 98% идентичность с SEQ ID NO 58, и легкую цепь последовательности SEQ ID NO 61 или любой последовательности, демонстрирующей по меньшей мере 80%, 85%, 90%, 95% или 98% идентичность с SEQ ID NO 61;

c) антитело, содержащее (или состоящее из) тяжелую цепь последовательности SEQ ID NO 63 или любой последовательности, демонстрирующей по меньшей мере 80%, 85%, 90%, 95% или 98% идентичность с SEQ ID NO 63, и легкую цепь, содержащую (или состоящую из) последовательность SEQ ID NO 59 или любую последовательность, демонстрирующую по меньшей мере 80%, 85%, 90%, 95% или 98% идентичность с SEQ ID NO 59;

d) антитело, содержащее (или состоящее из) тяжелую цепь последовательности SEQ ID NO 65 или любой последовательности, демонстрирующей по меньшей мере 80%, 85%, 90%, 95% или 98% идентичность с SEQ ID NO 65, и легкую цепь, содержащую (или состоящую из) последовательность SEQ ID NO 59 или любую последовательность, демонстрирующую по меньшей мере 80%, 85%, 90%, 95% или 98% идентичность с SEQ ID NO 59;

e) антитело, содержащее (или состоящее из) тяжелую цепь последовательности SEQ ID NO 65 или любой последовательности, демонстрирующей по меньшей мере 80%, 85%, 90%, 95% или 98% идентичность с SEQ ID NO 65, и легкую цепь, содержащую (или состоящую из) последовательность SEQ ID NO 61 или любую последовательность, демонстрирующую по меньшей мере 80%, 85%, 90%, 95% или 98% идентичность с SEQ ID NO 61;

f) антитело, содержащее (или состоящее из) тяжелую цепь последовательности SEQ ID NO 67 или любой последовательности, демонстрирующей по меньшей мере 80%, 85%, 90%, 95% или 98% идентичность с SEQ ID NO 67, и легкую цепь, содержащую (или состоящую из) последовательность SEQ ID NO 59 или любую последовательность, демонстрирующую по меньшей мере 80%, 85%, 90%, 95% или 98% идентичность с SEQ ID NO 59;

g) антитело, содержащее (или состоящее из) тяжелую цепь последовательности SEQ ID NO 69 или любой последовательности, демонстрирующей по меньшей мере 80%, 85%, 90%, 95% или 98% идентичность с SEQ ID NO 69, и легкую цепь, содержащую (или состоящую из) последовательность SEQ ID NO 59 или любую последовательность, демонстрирующую по меньшей мере 80%, 85%, 90%, 95% или 98% идентичность с SEQ ID NO 59;

h) антитело, содержащее (или состоящее из) тяжелую цепь последовательности SEQ ID NO 69 или любой последовательности, демонстрирующей по меньшей мере 80%, 85%, 90%, 95% или 98% идентичность с SEQ ID NO 69, и легкую цепь, содержащую (или состоящую из) последовательность SEQ ID NO 61 или любую последовательность, демонстрирующую по меньшей мере 80%, 85%, 90%, 95% или 98% идентичность с SEQ ID NO 61;

i) антитело, содержащее (или состоящее из) тяжелую цепь последовательности SEQ ID NO 71 или любой последовательности, демонстрирующей по меньшей мере 80%, 85%, 90%, 95% или 98% идентичность с SEQ ID NO 71, и легкую цепь, содержащую (или состоящую из) последовательность SEQ ID NO 59 или любую последовательность, демонстрирующую по меньшей мере 80%, 85%, 90%, 95% или 98% идентичность с SEQ ID NO 59;

j) антитело, содержащее (или состоящее из) тяжелую цепь последовательности SEQ ID NO 73 или любой последовательности, демонстрирующей по меньшей мере 80%, 85%, 90%, 95% или 98% идентичность с SEQ ID NO 73, и легкую цепь, содержащую (или состоящую из) последовательность SEQ ID NO 59 или любую последовательность, демонстрирующую по меньшей мере 80%, 85%, 90%, 95% или 98% идентичность с SEQ ID NO 59;

k) антитело, содержащее (или состоящее из) тяжелую цепь последовательности SEQ ID NO 75 или любой последовательности, демонстрирующей по меньшей мере 80%, 85%, 90%, 95% или 98% идентичность с SEQ ID NO 75, и легкую цепь, содержащую (или состоящую из) последовательность SEQ ID NO 59 или любую последовательность, демонстрирующую по меньшей мере 80%, 85%, 90%, 95% или 98% идентичность с SEQ ID NO 59;

l) антитело, содержащее (или состоящее из) тяжелую цепь последовательности SEQ ID NO 77 или любой последовательности, демонстрирующей по меньшей мере 80%, 85%, 90%, 95% или 98% идентичность с SEQ ID NO 77, и легкую цепь, содержащую (или состоящую из) последовательность SEQ ID NO 59 или любую последовательность, демонстрирующую по меньшей мере 80%, 85%, 90%, 95% или 98% идентичность с SEQ ID NO 59;

m) антитело, содержащее (или состоящее из) а тяжелая цепь последовательности SEQ ID NO 79 или любой последовательности, демонстрирующей по меньшей мере 80%, 85%, 90%, 95% или 98% идентичность с SEQ ID NO 79, и легкую цепь, содержащую (или состоящую из) последовательность SEQ ID NO 59 или любую последовательность, демонстрирующую по меньшей мере 80%, 85%, 90%, 95% или 98% идентичность с SEQ ID NO 59;

n) антитело, содержащее (или состоящее из) тяжелую цепь последовательности SEQ ID NO 79 или любой последовательности, демонстрирующей по меньшей мере 80%, 85%, 90%, 95% или 98% идентичность с SEQ ID NO 79, и легкую цепь, содержащую (или состоящую из) последовательность SEQ ID NO 61 или любую последовательность, демонстрирующую по меньшей мере 80%, 85%, 90%, 95% или 98% идентичность с SEQ ID NO 61; и

о) антитело, содержащее (или состоящее из) тяжелую цепь последовательности SEQ ID NO 81 или любой последовательности, демонстрирующей по меньшей мере 80%, 85%, 90%, 95% или 98% идентичность с SEQ ID NO 81, и легкую цепь, содержащую (или состоящую из) последовательность SEQ ID NO 59 или любую последовательность, демонстрирующую по меньшей мере 80%, 85%, 90%, 95% или 98% идентичность с SEQ ID NO 59.

Для большей ясности следующая таблица 6b иллюстрирует неограничивающие примеры последовательностей VH и VL (вариабельного домена и полноразмерную) для различных вариантов гуманизированного антитела hz208F2.

Другой аспект данного изобретения представляет собой антитело, выбранное среди следующих:

i) антитело, продуцируемое гибридомой I-4757, I-4773, I-4775, I-4736 или I-4774, депонированных в CNCM, Национальной коллекции культур микроорганизмов, Институт Пастера, 25, улица Docteur Roux, 75724, Париж, Франция, 30 мая 2013 года, 26 июня 2013, 26 июня 2013, 24 апреля 2013 и 26 июня 2013 года, соответственно,

ii) антитело, которое конкурирует за связывание IGF-1R с антителом согласно i); а также

iii) антитело, которое связывается с тем же эпитопом IGF-1R, что и антитело согласно i).

В соответствии с другим аспектом данное изобретение относится к мышиной гибридоме, выбранной среди гибридом I-4757, I-4773, I-4775, I-4736 или I-4774, депонированных в CNCM, Институт Пастера, Франция, 30 мая 2013 года, 26 июня 2013, 26 июня 2013, 24 апреля 2013 и 26 июня 2013 года, соответственно.

Новый аспект данного изобретения относится к выделенной нуклеиновой кислоте, кодирующей антитело или его антигенсвязывающий фрагмент согласно данному изобретению.

Термины "нуклеиновая кислота", "нуклеиновая последовательность", "нуклеиновокислотная последовательность", "полинуклеотид", "олигонуклеотид", "полинуклеотидная последовательность" и "нуклеотидная последовательность", взаимозаменяемо используемые в данном описании, означают точную последовательность нуклеотидов, модифицированных или нет, определяющую фрагмент или область нуклеиновой кислоты, содержащей или не содержащей неприродные нуклеотиды и являющейся либо двуцепочечной ДНК, либо одноцепочечной ДНК, либо транскрипционными продуктами указанных ДНК.

Последовательности данного изобретения были выделены и/или очищены, т.е. они были отобраны прямо или косвенно, например, путем копирования, и их окружающая среда по меньшей мере частично была изменена. Также здесь следует упомянуть выделенные нуклеиновые кислоты, полученные путем рекомбинантной генетики, например, с помощью клеток-хозяев, или путем химического синтеза.

Также данное изобретение относится к вектору, содержащему нуклеиновую кислоту, кодирующую антитело или его антигенсвязывающий фрагмент согласно данному изобретению.

Изобретение, в частности, направлено на клонирующие векторы и/или экспрессионные векторы, которые содержат такую нуклеотидную последовательность.

Векторы предпочтительно содержат элементы, которые позволяют экспрессировать и/или секретировать нуклеотидные последовательности в данной клетке-хозяине. Вектор, таким образом, должен содержать промотор, сигналы инициации и терминации трансляции, а также подходящие области регуляции транскрипции. Он должен иметь способность стабильно сохраняться в клетке-хозяине и может дополнительно иметь специфические сигналы, которые определяют секрецию транслированного белка. Эти различные элементы отбираются и оптимизируются специалистами в данной области в соответствии с используемой клеткой-хозяином. Для этой цели нуклеотидные последовательности могут быть вставлены в самореплицирующихся векторах в выбранного хозяина или могут быть интегративными векторами выбранного хозяина.

Такие векторы изготавливают, как правило, с помощью способов, использующихся специалистами в данной области, и полученные в результате клоны могут быть введены в подходящего хозяина с помощью стандартных способов, таких как липофекция, электропорация, тепловой шок или химические способы.

Векторы являются, например, векторами плазмидного или вирусного происхождения. Они используются для трансформации клеток-хозяев для клонирования или экспрессии нуклеотидных последовательностей согласно изобретению.

Данное изобретение также относится к выделенным клеткам-хозяевам, трансформированным вектором, описанным выше, или содержащим его.

Клетка-хозяин может быть выбрана среди прокариотических или эукариотических систем, таких как, например, бактериальные клетки, а также дрожжевые клетки или клетки животных, в частности клетки млекопитающих (за исключением человека). Также могут быть использованы клетки насекомых или растений.

Также данное изобретение относится к животным, за исключением человека, которые содержат трансформированную клетку.

Другой аспект относится к способу получения антитела в соответствии с данным изобретением или его антигенсвязывающего фрагмента, при этом указанный способ характеризуется тем, что включает следующие этапы:

a) культивирование клетки-хозяина согласно изобретению в среде в подходящих культуральных условиях; и

b) извлечение указанного антитела или его антигенсвязывающего фрагмента, полученного таким образом, из культуральной среды или из указанных культивируемых клеток.

Трансформированные клетки используются в способах получения рекомбинантных антител в соответствии с данным изобретением. В данное изобретение также входят способы получения антител в рекомбинантной форме с помощью вектора и/или клетки, трансформированной вектором согласно изобретению. Предпочтительно клетку, трансформированную вектором, описанным выше, культивируют в условиях, которые делают возможной экспрессию указанного выше полипептида и извлечение указанного антитела.

Как уже упоминалось, клетка-хозяин может быть выбрана среди прокариотических или эукариотических систем. В частности, можно определить нуклеотидные последовательности, которые облегчают секрецию в такой прокариотической или эукариотической системе. Вектор согласно изобретению, несущий такую последовательность, может быть выгодно использован для продукции секретируемых рекомбинантных белков. Действительно, очистке этих рекомбинантных белков, представляющих интерес, будет способствовать тот факт, что они присутствуют в супернатанте клеточной культуры, а не внутри клеток-хозяев.

Антитело также может быть получено путем химического синтеза. Один такой способ получения также является объектом изобретения. Специалистам в данной области известны способы химического синтеза, такие как твердофазные методики или частично твердофазные методики, путем конденсации фрагментов или путем обычного синтеза в растворе. В изобретение также входят полипептиды, которые получены путем химического синтеза и могут содержать соответствующие неприродные аминокислоты.

В данное изобретение также входит антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, вероятно, полученный описанным выше способом.

В соответствии с конкретным аспектом данное изобретение относится к антителу или его антигенсвязывающему фрагменту, описанному выше, для применения в качестве адресующего переносчика для доставки цитотоксического агента в место-мишень хозяина, при этом указанное место-мишень хозяина состоит из эпитопа, локализованного в IGF-1R, предпочтительно во внеклеточном домене IGF-1R, более предпочтительно в человеческом IGF-1R (SEQ ID NO 50), и еще более предпочтительно во внеклеточном домене человеческого IGF-1R (SEQ ID NO 51), и еще более предпочтительно на N-конце внеклеточного домена человеческого IGF-1R (SEQ ID NO 52), или к последовательности любого их природного варианта.

В предпочтительном воплощении указанное место-мишень хозяина представляет собой место-мишень клетки млекопитающего, более предпочтительно клетки человека, более предпочтительно клетки, которая естественным образом или путем генетической рекомбинации экспрессирует IGF-1R.

Другой аспект данного изобретения представляет собой конъюгат "антитело - лекарственное средство", содержащий антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, описанный выше, конъюгированный с цитотоксическим агентом.

Изобретение относится к иммуноконъюгату, содержащему антитело, описанное в данном документе, конъюгированное с цитотоксическим агентом.

Выражение "иммуноконъюгат" относится в общем случае к соединению, содержащему по меньшей мере один адресующий продукт, такой как антитело, физически связанный с одним или более чем одним терапевтическим агентом (агентами), таким образом, создающему высоко нацеленное соединение.

В предпочтительном воплощении такие терапевтические агенты включают цитотоксические агенты.

Под термином "цитотоксический агент" или "цитотоксический" подразумевается агент, который при введении субъекту лечит или предотвращает пролиферацию ненормальных клеток, предпочтительно, развитие рака в организме субъекта, ингибируя или предотвращая клеточную функцию и/или вызывая гибель клеток.

Многие цитотоксические агенты были выделены или синтезированы и делают возможным ингибирование пролиферации клеток или разрушение или уменьшение опухолевых клеток, если не окончательно, то по меньшей мере значительно. Тем не менее, токсическая активность этих агентов не ограничена активностью в отношении опухолевых клеток, и неопухолевые клетки также страдают и могут быть уничтожены. Более конкретно, побочные эффекты наблюдаются на быстро возобновляющихся клетках, таких как кроветворные клетки или клетки эпителия, в частности, клетки слизистых оболочек. В качестве иллюстрации, клетки желудочно-кишечного тракта в значительной степени поражаются при использовании таких цитотоксических агентов.

Одной из целей данного изобретения также является предоставление цитотоксического агента, который дает возможность ограничить побочные эффекты в отношении нормальных клеток, в то же время сохраняя высокую цитотоксичность в отношении опухолевых клеток.

Более конкретно, цитотоксический агент может предпочтительно включать, но не ограничиваясь ими, лекарственный препарат (т.е. конъюгат "антитело - лекарственный препарат"), токсин (например, "иммунотоксин" или конъюгат "антитело - токсин"), радиоактивный изотоп (т.е. "радиоиммуноконъюгат" или конъюгат "антитело - радиоизотоп") и т.д.

В первом предпочтительном воплощении иммуноконъюгат состоит из антитела, связанного по меньшей мере с лекарственным препаратом или медикаментом. Такой иммуноконъюгат называют конъюгатом "антитело - лекарственный препарат" (или "ADC", antibody-drug conjugate).

В первом воплощении такие лекарственные препараты могут быть описаны относительно режима их действия. В качестве неограничивающего примера можно упомянуть алкилирующие агенты, такие как азотистый иприт, алкилсульфонаты, нитрозомочевина, оксазофорины, азиридины или иминэтилены, антиметаболиты, противоопухолевые антибиотики, ингибиторы митоза, ингибиторы функции хроматина, антиангиогенные агенты, антиэстрогены, антиандрогены, хелатирующие агенты, стимуляторы всасывания железа, ингибиторы циклооксигеназы, ингибиторы фосфодиэстеразы, ингибиторы ДНК, ингибиторы синтеза ДНК, стимуляторы апоптоза, ингибиторы тимидилатсинтазы, ингибиторы Т-клеток, агонисты интерферона, ингибиторы рибонуклеозидтрифосфатредуктазы, ингибиторы ароматазы, антагонисты рецепторов эстрогена, ингибиторы тирозинкиназы, ингибиторы клеточного цикла, таксан, ингибиторы тубулина, ингибиторы ангиогенеза, стимуляторы макрофагов, антагонисты рецепторов нейрокининов, агонисты каннабиноидных рецепторов, агонисты дофаминовых рецепторов, агонисты гранулоцитарного стимулирующего фактора, агонисты рецептора эритропоэтина, агонисты рецептора соматостатина, агонисты LHRH, сенсибилизаторы кальция, антагонисты рецептора VEGF, антагонисты рецепторов интерлейкинов, ингибиторы остеокластов, стимуляторы образования радикалов, антагонисты рецепторов эндотелина, алкалоид барвинка, антигормоны или иммуномодуляторы или любые другие новые препараты, которые содержат полный набор критериев активности цитотоксического агента или токсина.

Такие препараты, например, приведены в VIDAL 2010 на странице, посвященной соединениям, прикрепленным к колонке онкологии и гематологии "Цитотоксические агенты", и эти цитотоксические соединения, приведенные со ссылкой на этот документ, процитированы в данном документе в качестве предпочтительных цитотоксических агентов.

Более конкретно, но не ограничиваясь ими, следующие лекарственные препараты или медикаменты являются предпочтительными согласно изобретению: мехлорэтамин, хлорамбукол, мелфален, хлоридрат, пипобромен, преднимустин, динатрия фосфат, эстрамустин, циклофосфамид, алтретамин, трофосфамид, сульфофосфамид, ифосфамид, тиотепа, триэтиленамин, алтретамин, кармустин, стрептозоцин, фотемустин, ломустин, бусульфан, треосульфан, импросульфан, дакарбазин; цисплатин, оксалиплатин, лобаплатин, гептаплатин, мириплатин гидрат, карбоплатин, метотрексат, пеметрексед, 5-фторурацил, флоксуридин, 5-фтордезоксиуридин, капецитабин, цитарабин, флударабин, цитозинарабинозид, 6-меркаптопурин (6-МР), неларабин, 6-тиогуанин (6-TG), хлордезоксиаденозин, 5-азацитидин, гемцитабин, кладрибин, дезоксикоформицин, тегафур, пентостатин, доксорубицин, даунорубицин, идаруцибин, валрубицин, митоксантрон, дактиномицин, митрамицин, пликамицин, митомицин С, блеомицин, прокарбазин, паклитаксел, доцетаксел, винбластин, винкристин, виндезин, винорелбин, топотекан, иринотекан, этопозид, валрубицин, амрубицин гидрохлорид, пирарубицин, эллиптиния ацетат, зорубицин, эпирубицин, идарубицин и тенипозид, разоксин, маримастат, батимастат, приномастат, таномастат, иломастат, CGS-27023А, галофугинон, COL-3, неовастат, талидомид, CDC 501, DMXAA, L-651582, скваламин, эндостатин, SU5416, SU6668, интерферон-альфа, EMD121974, интерлейкин-12, IM862, ангиостатин, тамоксифен, торемифен, ралоксифен, дролоксифен, иодоксифен, анастрозол, летрозол, эксеместан, флутамид, нилутамид, спиронолактон, ципротерон ацетат, финастерид, цимитидин, бортезомид, велкад, бикалутамид, ципротерон, флутамид, фулвестран, экземестан, дазатиниб, эрлотиниб, гефитиниб, иматиниб, лапатиниб, нилотиниб, сорафениб, сунитиниб, ретиноид, рексиноид, метокссален, метиламинолевулинат, алдеслейкин, ОСТ-43, денилейкин дифлитокс, интерлейкин-2, тазонермин, лентинан, сизофилан, роквинимекс, пидотимод, пегадемаза, тимопентин, поли I:С (полиинозиновая-полицитидиловая кислота), прокодазол, Tic BCG, Corynebacterium parvum, NOV-002, украин, левамизол, 1311-chTNT, Н-101, целмолейкин, интерферон альфа 2а, интерферон альфа 2b, интерферон гамма 1а, интерлейкин-2, мобенакин, рексин-G, тецелейкин, акларубицин, актиномицин, арглабин, аспарагиназа, карцинофилин, хромомицин, дауномицин, лейковорин, мазопрокол, неокарциностатин, пепломицин, саркомицин, соламаргин, трабектедин, стрептозоцин, тестостерон, кунакатехины, синекатехины, алитретиноин, белотекан гидрохлорид, калустерон, дромостанолон, эллиптиния ацетат, этинил эстрадиол, этопозид, флюоксиместерон, форместан, фосфетрол, гозерелин ацетат, гексил аминолевулинат, гистрелин, гидроксипрогестерон, иксабепилон, лейпролид, медроксипрогестерон ацетат, мегестрол ацетат, метилпреднизолон, метилтестостерон, мильтефозин, митобронитол, надролон фенилпропионат, норэтиндрон ацетат, преднизолон, преднизон, темсирролимус, тестолактон, триамконолон, трипторелин, вапреодит ацетат, зиностатин стималамер, амсакрин, триоксид мышьяка, бисантрен гидрохлорид, хлорамбуцил, хлортрианизен, цис-диаминдихлорплатина, циклофосфамид, диэтилстилбестрол, гексаметилмеламин, гидроксимочевина, леналидомид, лонидамин, мехлорэтанамин, митотан, недаплатин, нимустин гидрохлорид, памидронат, пипоброман, порфимер натрия, ранимустин, разоксан, семустин, собузоксан, мезилат, триэтиленмеламин, золедроновая кислота, камостат мезилат, фадрозол HCl, нафоксидин, аминоглютетимид, кармофур, клофарабин, цитозинарабинозид, децитабин, доксифлуридин, эноцитабин, флударабин фосфат, фторурацил, фторафур, урацил горчичный, абареликс, бексаротен, ралтитрексид, тамибаротен, темозоломид, вориностат, мегастрол, клодронат динатрия, левамизол, ферумокситол, железа изомальтозид, целекоксиб, ибудиласт, бендамустин, алтретамин, митолактол, темсиролимус, пралатрексат, TS-1, децитабин, бикалутамид, флутамид, летрозол, клодронат динатрия, дегареликс, торемифен цитрат, гистамин дигидрохлорид, DW-166HC, нитракрин, децитабин, иритекан гидрохлорид, амсакрин, ромидепсин, третиноин, кабазитаксел, вандетаниб, леналидомид, ибандроновая кислота, мильтефозин, витеспен, мифамуртид, надропарин, гранисетрон, ондансетрон, трописетрон, ализаприд, рамосетрон, доласетрон мезилат, фосапрепитант димеглумин, набилон, апрепитант, дронабинол, TY-10721, лизурид гидроген малеат, эпицерам, дефибротид, дабигатран этексилат, филграстим, пегфилграстим, редитукс, эпоэтин, молграмостим, опрелвекин, сипулейцел-Т, M-Vax, ацетил-L-карнитин, донепезил гидрохлорид, 5-аминолевулиновая кислота, метиламинолевулинат, цетрореликс ацетат, икодекстрин, лейпрорелин, метилфенидат, октреотид, амлексанокс, плериксафор, менатетренон, анетол дитиолетион, доксеркальциферол, цинакальцет гидрохлорид, алефацепт, ромиплостим, тимоглобулин, тималфазин, убенимекс, имиквимод, эверолимус, сиролимус, Н-101, лазофоксифен, трилостан, инкадронат, ганглиозиды, пегаптаниб октанатрия, вертопорфин, минодроновая кислота, золедроновая кислота, нитрат галлия, алендронат натрия, этидронат динатрия, памидронат динатрия, дутастерид, стибоглюконат натрия, армодафнил, дексразоксан, амифостин, WF-10, темопорфин, дарбэпоэтин альфа, анцестим, сарграмостим, палифермин, R-744, непидермин, опрелвекин, денилейкин-дифтитокс, кризантаспаза, бусерелин, деслорелин, ланреотид, октреотид, пилокарпин, бозентан, калихеамицин, мейтанзиноиды, циклоникат и пирролобензодиазепины, особенно те, которые описаны в заявке РСТ, опубликованной под номером WO 2011/130598.

В другом воплощении иммуноконъюгат состоит из антитела, связанного по меньшей мере с радиоактивным изотопом. Такой иммуноконъюгат называют конъюгатом "антитело - радиоизотоп" (или "ARC").

Для селективного разрушения опухоли антитело может содержать высоко радиоактивный атом. Для получения ARC доступно множество радиоактивных изотопов, таких как, но не ограничиваясь ими, At²¹¹, С¹³, N¹⁵, О¹⁷, Fl¹⁹, I¹²³, I¹³¹, I¹²⁵, In¹¹¹, Y⁹⁰, Re¹⁸⁶, Re¹⁸⁸, Sm¹⁵³, tc⁹⁹m, Bi²¹², P³², Pb²¹², радиоактивные изотопы Lu, гадолиния, марганца или железа.

Любые способы или процессы, известные специалистам в данной области, могут быть использованы для включения такого радиоизотопа в ARC. В качестве неограничивающего примера, tc⁹⁹m или I¹²³, Re¹⁸⁶, Re¹⁸⁸ и In¹¹¹ могут быть присоединены через остаток цистеина. Y⁹⁰ может быть присоединен через остаток лизина. I¹²³ может быть присоединен с помощью способа IODOGEN.

Чтобы проиллюстрировать знания специалистов в области ARC, можно упомянуть несколько примеров, таких как Zevalin^®, который представляет собой ARC, состоящий из моноклонального анти-СD20-антитела и радиоактивного изотопа In¹¹¹ или Y⁹⁰, связанного тиомочевинным линкером-хелатором; или Mylotarg^®, в состав которого входит анти-СD33-антитело, связанное с калихеамицином (US 4970198; 5079233; 5585089; 5606040; 5693762; 5739116; 5767285; 5773001). Из последних также можно упомянуть ADC, известный как Adcetris (соответствующий брентуксимаба ведотину), который был недавно принят FDA для лечения лимфомы Ходжкина.

В другом воплощении иммуноконъюгат состоит из антитела, связанного по меньшей мере с токсином. Такой иммуноконъюгат называют конъюгатом "антитело - токсин" (или "АТС").

Токсины являются эффективными и специфическими ядами, которые вырабатываются живыми организмами. Они, как правило, состоят из аминокислотной цепи, молекулярная масса которой может варьировать в диапазоне пары сотен (пептиды) и сотни тысяч (белки). Они также могут быть низкомолекулярными органическими соединениями. Токсины производятся многими организмами, например, бактериями, грибами, водорослями и растениями. Многие из них являются чрезвычайно ядовитыми, имея токсичность, которая на несколько порядков выше, чем у нервно-паралитических агентов.

Токсины, используемые в АТС, могут включать, но не ограничиваясь ими, все виды токсинов, которые могут оказывать свое цитотоксическое действие посредством механизмов, включающих связывание тубулина, связывание ДНК или ингибирование топоизомеразы.

Ферментативно активные токсины и их фрагменты, которые могут быть использованы, включают цепь А дифтерийного токсина, несвязывающие активные фрагменты дифтерийного токсина, цепь А экзотоксина (от Pseudomonas aeruginosa), цепь А рицина, цепь А абрина, цепь А модекцина, альфа-сарцин, белки Aleurites fordii, белки-диантины, белки Phytolaca americana (PAPI, РАРП и PAP-S), ингибитор Momordica charantia, курцин, кротин, ингибитор Sapaonaha officinalis, гелонин, митогеллин, рестриктоцин, феномицин, эномицин и трикотецены.

Низкомолекулярные токсины, такие как доластатины, ауристатины, в частности монометилауристатин Е (ММАЕ), трихотецин и СС1065, а также производные этих токсинов, которые обладают активностью токсина, также рассматриваются в данном описании. Было показано, что доластатины и ауристатины нарушают динамику микротрубочек, гидролиз GTP, а также ядерное и клеточное деление, и обладают противораковой и противогрибковой активностью.

Понятия "линкер", "линкерный блок" или "связь" обозначают химическую группировку, содержащую ковалентную связь или цепь атомов, которая ковалентно присоединяет антитело по меньшей мере к одному цитотоксическому агенту.

Линкеры могут быть получены с использованием множества бифункциональных агентов, связывающих белки, таких как N-сукцинимидил-3-(2-пиридилдитио)пропионат (SPDP), сукцинимидил-4-(N-малеимидометил)циклогексан-1-карбоксилат (SMCC), иминотиолан (IT), бифункциональные производные имидоэфиров (такие как диметиладипимидат HCl), активные сложные эфиры (такие как дисукцинимидилсуберат), альдегиды (такие как глутаральдегид), бис-азидо-соединения (такие как бис(п-азидобензоил)гександиамин), бис-диазония производные (такие как бис(п-диазониябензоил)этилендиамин), диизоцианаты (такие как толуол-2,6-диизоцианат) и бис-активные соединения фтора (такие как 1,5-дифтор-2,4-динитробензол). Меченная углеродом-14 1-изотиоцианатобензил-3-метилдиэтилентриаминпентауксусная кислота (MX-DTPA) является примером хелатирующего агента для конъюгации цитотоксических агентов с адресующей системой. Другие связывающие реагенты могут представлять собой BMPS, EMCS, GMBS, HBVS, LC-SMCC, MBS, МРВН, SBAP, SIA, SIAB, SMCC, SMPB, SMPH, сульфо-EMCS, сульфо-GMBS, сульфо-KMUS, сульфо-MBS, сульфо-SIAB, сульфо-SMCC и сульфо-SMPB и SVSB (сукцинимидил-(4-винилсульфон)бензоат), которые являются коммерчески доступными (например, от Pierce Biotechnology, Inc., Рокфорд, Иллинойс, США).

Линкер может быть "нерасщепляемым" или "расщепляемым".

В предпочтительном воплощении он состоит из "расщепляемого линкера", облегчающего высвобождение цитотоксического агента в клетке. Например, может быть использован кислотно-лабильный линкер, чувствительный к пептидазе линкер, фотолабильный линкер, диметиловый линкер или линкер, содержащий дисульфид. В предпочтительном воплощении линкер расщепляется во внутриклеточных условиях таким образом, что расщепление линкера высвобождает цитотоксический агент из антитела во внутриклеточную среду.

Например, в некоторых воплощениях линкер расщепляется расщепляющим агентом, который присутствует во внутриклеточной среде (например, в лизосоме или эндосоме или кавеоле). Линкер может представлять собой, например, пептидильный линкер, который расщепляется внутриклеточным ферментом пептидазой или протеазой, в том числе, но не ограничиваясь ими, лизосомальной или эндосомальной протеазой. Как правило, пептидильный линкер имеет по меньшей мере две аминокислоты в длину или по меньшей мере три аминокислоты в длину. Расщепляющие агенты могут включать катепсины В и D и плазмин, которые, как известно, гидролизуют дипептидные производные лекарственных средств, приводя к высвобождению активного лекарственного средства внутри клетки-мишени. Например, может быть использован пептидильный линкер, который расщепляется тиол-зависимой протеазой катепсином В, которая экспрессируется на высоком уровне в раковой ткани (например, линкер Phe-Leu или Gly-Phe-Leu-Gly). В конкретных воплощениях пептидильный линкер, расщепляемый внутриклеточной протеазой, представляет собой линкер Val-Cit или линкер Phe-Lys. Одно из преимуществ использования внутриклеточного протеолитического высвобождения цитотоксического агента заключается в том, что агент, как правило, ослабляется при конъюгации, и сывороточная стабильность конъюгатов, как правило, является высокой.

В других воплощениях расщепляемый линкер является рН-чувствительным, т.е. чувствительным к гидролизу при определенных значениях рН. Как правило, рН-чувствительный линкер гидролизуется в кислых условиях. Например, может быть использован кислотно-лабильный линкер, который гидролизуется в лизосомах (например, гидразон, семикарбазон, тиосемикарбазон, цис-аконитовый амид, ортоэфир, ацеталь, кеталь и т.п.). Такие линкеры относительно стабильны в нейтральных условиях рН, таких как условия в крови, но нестабильны при рН ниже 5,5 или 5,0, приближенном к рН лизосом. В некоторых воплощениях гидролизуемый линкер представляет собой тиоэфирный линкер, такой как, например, тиоэфир, прикрепленный к терапевтическому агенту через ацилгидразоновую связь.

В других воплощениях линкер расщепляется в восстанавливающих условиях (например, дисульфидный линкер). В данной области известно большое число дисульфидных линкеров, включая, например, те, которые могут быть образованы с использованием SATA (N-сукцинимидил-S-ацетилтиоацетата), SPDP (N-сукцинимидил-3-(2-пиридилдитио)пропионовой кислоты), SPDB (N-сукцинимидил-3-(2-пиридилдитио)бутирата) и SMPT (N-сукцинимидил-алкилоксикарбонил-альфа-метил-альфа-(2-пиридил-дитио)толуола), SPDB и SMPT.

В качестве неограничивающего примера нерасщепляемых или "невосстанавливаемых" линкеров можно упомянуть иммуноконъюгат трастузумаб-DM1 (TDM1), который объединяет трастузумаб со связанным химиотерапевтическим агентом, мейтанзином.

В предпочтительном воплощении иммуноконъюгат согласно данному изобретению может быть получен любым из способов, известных специалистам в данной области, таких как, но не ограничиваясь ими, i) реакция нуклеофильной группы антитела с двухвалентным линкерным реагентом с последующей реакцией с цитотоксическим агентом, или ii) реакция нуклеофильной группы цитотоксического агента с двухвалентным линкерным реагентом с последующей реакцией с нуклеофильной группой антитела.

Нуклеофильные группы на антителе, включают, но не ограничиваясь ими, N-концевые амино-группы, аминогруппы боковой цепи, например, лизина, тиоловые группы боковой цепи и гидроксильные или амино-группы сахаров, когда антигенсвязывающий белок гликозилирован. Амино-, тиоловые и гидроксильные группы являются нуклеофильными и способны вступать в реакцию с образованием ковалентных связей с электрофильными группами на линкерных группировках и линкерных реагентах, включая, но не ограничиваясь ими, активные сложные эфиры, такие как сложные эфиры NHS, сложные эфиры HOBt, галогенформиаты и галогениды кислот; алкил- и бензилгалогениды, такие как галогенацетамиды; альдегиды, кетоны, карбоксильные и малеимидные группы. Антитело может иметь восстанавливаемые межцепочечные дисульфиды, т.е. цистеиновые мостики. Антитело можно сделать реакционноспособным для конъюгации с линкерными реагентами путем обработки восстанавливающим агентом, таким как DTT (дитиотреитол). Каждый цистеиновый мостик, таким образом, будет формировать, теоретически, два реактивных тиоловых нуклеофила. Дополнительные нуклеофильные группы могут быть введены в антитело с помощью любой реакции, известной специалистам в данной области. В качестве неограничивающего примера, реакционноспособные тиоловые группы могут быть введены в антитело путем введения одного или более чем одного остатка цистеина.

Иммуноконъюгаты также могут быть получены путем модификации антитела введением электрофильных группировок, которые могут вступать в реакцию с нуклеофильными заместителями на линкерном реагенте или цитотоксическом агенте. Сахара гликозилированного антитела могут быть окислены с образованием альдегидных или кетоновых групп, которые могут вступать в реакцию с аминогруппой линкерных реагентов или цитотоксического агента. Полученные в результате иминовые группы оснований Шиффа могут формировать стабильную связь или могут быть восстановлены с образованием стабильных амино-связей. В одном из воплощений реакция углеводородной части гликозилированного антитела либо с галактозооксидазой, либо с метапериодатом натрия может давать карбонильные (альдегидные и кетоновые) группы в антителе, которые могут взаимодействовать с соответствующими группами на лекарственном средстве. В другом воплощении антитела, содержащие N-концевые остатки серина или треонина, могут вступать в реакцию с метапериодатом натрия, что приводит к образованию альдегида вместо первой аминокислоты.

В некоторых предпочтительных воплощениях линкерный блок может иметь следующую общую формулу:

--Та-Ww-Yy--,

в которой:

-Т- представляет собой растяжку (растягивающий блок); а равен 0 или 1;

-W- представляет собой аминокислотный блок;

w независимо представляет собой целое число от 1 до 12;

-Y- является спейсерным блоком;

y равен 0, 1 или 2.

Растягивающий блок (-Т-), если он присутствует, связывает антитело с аминокислотным блоком (-W-). Используемые функциональные группы, которые могут присутствовать на антителе либо от природы, либо за счет химических манипуляций, включают сульфгидрильную, амино-, гидроксильную, аномерную гидроксильную группу углеводорода и карбоксильную группу. Подходящими функциональными группами являются сульфгидрильные и амино-группы. Сульфгидрильные группы могут быть получены при восстановлении внутримолекулярных дисульфидных связей антител, если они присутствуют. В качестве альтернативы, сульфгидрильные группы могут быть получены в результате реакции аминогруппы лизина антитела с 2-иминотиоланом или другими образующими сульфгидрил реагентами. В конкретных воплощениях антитело представляет собой рекомбинантное антитело, и оно сконструировано так, чтобы нести один или более чем один лизин. Более предпочтительно, антитело может быть сконструировано так, чтобы нести один или более чем один цистеин (см. ThioMab).

В некоторых конкретных воплощениях растягивающий блок образует связь с атомом серы антитела. Атом серы может быть получен из сульфгидрильной (-SH) группы восстановленного антитела.

В некоторых других конкретных воплощениях растягивающий блок связан с антителом через дисульфидную связь между атомом серы антитела и атомом серы растягивающего блока.

В других конкретных воплощениях реакционноспособная группа растяжки содержит реакционноспособный сайт, который может реагировать с амино-группой антитела. Амино-группа может быть таковой группой аргинина или лизина. Подходящие сайты, способные реагировать с амино-группой, включают, но не ограничиваясь ими, активированные сложные эфиры, такие как сукцинимидный сложный эфир, 4-нитрофениловые эфиры, пентафторфениловые эфиры, ангидриды, кислые хлориды, сульфонилхлориды, изоцианаты и изотиоцианаты.

В еще одном аспекте реакционноспособная функциональная группа растяжки содержит реакционноспособный сайт, который может вступать в реакцию с модифицированной углеводородной группой, которая может присутствовать на антителе. В конкретном воплощении антитело гликозилируется ферментативно, образуя углеводородную группировку. Углеводород может быть слегка окислен таким реагентом как периодат натрия, и полученный в результате карбонильный блок окисленного углеводорода может быть конденсирован с растяжкой, которая содержит функциональную группу, такую как гидразид, оксим, реакционноспособный амин, гидразин, тиосемикарбазид, гидразинкарбоксилат или арилгидразид.

Аминокислотный блок (-W-) связывает растягивающий блок (-Т-) со спейсерным блоком (-Y-), если спейсерный блок присутствует, и связывает растягивающий блок с цитотоксическим агентом, если спейсерный блок отсутствует.

Как упоминалось выше, -Ww- может представлять собой дипептидный, трипептидный, тетрапептидный, пентапептидный, гексапептидный, гептапептидный, октапептидный, нонапептидный, декапептидный, ундекапептидный или додекапептидный блок.

В некоторых воплощениях аминокислотный блок может содержать аминокислотные остатки, такие как, но не ограничиваясь ими, аланин, валин, лейцин, изолейцин, метионин, фенилаланин, триптофан, пролин, защищенный ацетилом или формилом лизин, аргинин, защищенный тозил- или нитро-группами аргинин, гистидин, орнитин, защищенный ацетилом или формилом орнитин и цитруллин. Иллюстративные аминокислотные линкерные компоненты предпочтительно включают дипептид, трипептид, тетрапептид или пентапептид.

Примеры дипептидов включают: Val-Cit, Ala-Val, Ala-Ala, Val-Ala, Lys-Lys, Cit-Cit, Val-Lys, Ala-Phe, Phe-Lys, Ala-Lys, Phe-Cit, Leu-Cit, Ile-Cit, Trp-Cit, Phe-Ala, Phe-N⁹-тозил-Arg, Phe-N⁹-нитро-Arg.

Примеры трипептидов включают: Val-Ala-Val, Ala-Asn-Val, Val-Leu-Lys, Ala-Ala-Asn, Phe-Phe-Lys, Gly-Gly-Gly, D-Phe-Phe-Lys, Gly-Phe-Lys.

Примеры тетрапептидов включают: Gly-Phe-Leu-Gly (SEQ ID NO 53), Ala-Leu-Ala-Leu (SEQ ID NO 54).

Примеры пентапептидов включают: Pro-Val-Gly-Val-Val (SEQ ID NO 55).

Аминокислотные остатки, которые содержат аминокислотный линкерный компонент, включают природные, а также минорные аминокислоты и не встречающиеся в природе аналоги аминокислот, такие как цитруллин. Аминокислотные линкерные компоненты могут быть разработаны и оптимизированы по их селективности в отношении ферментативного расщепления конкретным ферментом, например, ассоциированной с опухолью протеазой, катепсином В, С и D или протеазой плазмином.

Для высвобождения цитотоксического агента аминокислотный блок линкера может быть ферментативно отщеплен с помощью фермента, включая ассоциированную с опухолью протеазу, но не ограничиваясь ею.

Аминокислотный блок может быть разработан и оптимизирован по его селективности в отношении ферментативного расщепления конкретной ассоциированной с опухолью протеазой. Подходящими блоками являются те, расщепление которых катализируется протеазами, катепсином В, С и D и плазмином.

Спейсерный блок (-Y-), если он присутствует, связывает аминокислотный блок с цитотоксическим агентом. Спейсерные блоки бывают двух основных типов: саморазрушающиеся и несаморазрушающиеся. Несаморазрушающийся спейсерный блок является таким, в котором часть или весь спейсерный блок остается связанным с цитотоксическим агентом после ферментативного отщепления аминокислотного блока из иммуноконъюгата. Примеры несаморазрушающегося спейсерного блока включают, но не ограничиваясь ими, спейсерный блок "глицин - глицин" и спейсерный блок "глицин". Для того чтобы высвободить цитотоксический агент, внутри клетки-мишени должна произойти независимая реакция гидролиза, чтобы расщепить связь "глицин - лекарственное средство".

В другом воплощении несаморазрушающийся спейсерный блок (-Y-) представляет собой -Gly-.

В одном из воплощений в иммуноконъюгате отсутствует спейсерный блок (y=0).

В качестве альтернативы, иммуноконъюгат, содержащий саморазрушающийся спейсерный блок, может высвободить цитотоксический агент без необходимости отдельного этапа гидролиза. В этих воплощениях -Y- представляет собой п-аминобензиловый спирт (РАВ), который связан с -Ww- через атом азота группы РАВ и соединен непосредственно с -D через карбонатную, карбаматную или эфирную группу.

Другие примеры саморазрушающихся спейсеров включают, но не ограничиваясь ими, ароматические соединения, которые электронно эквивалентны группе РАВ, такие как производные 2-аминоимидазол-5-метанола и орто- или пара-аминобензилацетали. Могут быть использованы спейсеры, которые легко подвергаются циклизации после гидролиза амидной связи, такие как замещенные и незамещенные амиды 4-аминомасляной кислоты, соответствующим образом замещенные бицикло[2.2.1]- и бицикло[2.2.2]-кольцевые системы и амиды 2-аминофенилпропионовой кислоты.

В альтернативном воплощении спейсерный блок представляет собой разветвленный бис(гидроксиметил)стироловый (BHMS) блок, который может быть использован для включения дополнительных цитотоксических агентов.

Лекарственная загрузка, также называемая соотношением "лекарственное средство - антитело" (DAR), представляет собой среднее число молекул PBD-препаратов на молекулу агента, связывающего клетку.

В случае антитела изотипа IgG1, когда лекарственные средства связываются с цистеинами после частичного восстановления антитела, лекарственная загрузка может находиться в диапазоне от 1 до 8 молекул лекарственного средства (D) на молекулу антитела, т.е. когда 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 и 8 молекул лекарственного средства ковалентно присоединены к антителу.

В случае антитела изотипа IgG2, когда лекарственные средства связываются с цистеинами после частичного восстановления антитела, лекарственная загрузка может находиться в диапазоне от 1 до 12 молекул лекарственного средства (D) на молекулу антитела, т.е. когда 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 и 12 молекул лекарственного средства ковалентно присоединены к антителу.

Композиции ADC включают коллекции агентов, связывающих клетку, например антитела, конъюгированные с диапазоном лекарственных средств, от 1 до 8 или от 1 до 12.

Если лекарственные средства связаны с лизинами, то лекарственная загрузка может находиться в диапазоне от 1 до 80 молекул препарата (D) на молекулу клеточного антитела, хотя предпочтительным может быть верхний предел 40, 20, 10 или 8. Композиции ADC включают коллекции агентов, связывающих клетку, например, антитела, конъюгированные с диапазоном лекарственных средств от 1 до 80, от 1 до 40, от 1 до 20, от 1 до 10 или от 1 до 8.

Среднее число молекул лекарственного средства на молекулу антитела в препаратах ADC из реакций конъюгации можно охарактеризовать обычными средствами. Количественное распределение ADC также может быть определено относительно коэффициента лекарственного средства. Для некоторых конъюгатов "антитело - лекарственное средство" коэффициент лекарственного средства может быть ограничен числом сайтов присоединения на антителе. Например, антитело может иметь только одну или несколько тиоловых групп цистеина или может иметь только одну или несколько достаточно реакционноспособных тиоловых групп, через которые может быть присоединен линкер. Более высокая лекарственная загрузка, например, коэффициент лекарственного средства >5, может вызвать агрегацию, нерастворимость, токсичность или потерю клеточной проницаемости некоторых конъюгатов "антитело - лекарственное средство".

Некоторые антитела имеют восстанавливаемые межцепочечные дисульфиды, т.е. цистеиновые мостики. Антитела можно сделать способными к реакции конъюгации с линкерными реагентами путем обработки восстанавливающим агентом, таким как DTT (дитиотреитол). Таким образом, каждый цистеиновый мостик теоретически будет формировать два реакционноспособных тиоловых нуклеофила. Дополнительные нуклеофильные группы можно вводить в антитела посредством реакции лизинов с 2-иминотиоланом (реагент Траута), что приводит к превращению амина в тиол. Реакционноспособные тиоловые группы можно ввести в антитело (или в его фрагмент) путем инженерии одного, двух, трех, четырех или более остатков цистеина (например, получая мутантные антитела, содержащие один или более чем один ненативный остаток аминокислоты цистеина). В US 7521541 описана инженерия антител путем введения реакционноспособных аминокислот цистеинов.

Аминокислоты цистеины могут быть сконструированы на реакционноспособных сайтах в антителе и могут быть такими, которые не формируют внутрицепочечные или межмолекулярные дисульфидные связи (Junutula, et al., 2008b Nature Biotech., 26 (8): 925-932; Dornan et al (2009) Blood 114 (13): 2721-2729; US 7521541; US 7723485; WO 2009/052249). Тиолы инженерных цистеинов могут вступать в реакцию с линкерными реагентами или реагентами "лекарственное средство - линкер" согласно данному изобретению, которые имеют электрофильные группы, способные реагировать с тиолами, такие как малеимид- или альфа-галоген-амиды, для формирования ADC с цистеин-инженерными антителами и лекарственными группировками PBD. Таким образом, расположение лекарственной группировки может быть разработано, проконтролировано и известно. Лекарственную загрузку можно контролировать, так как инженерные тиоловые группы цистеина, как правило, вступают в реакцию с линкерными реагентами, способными реагировать с тиолами, или с реагентами "лекарственное средство - линкер" с высоким выходом. Инженерия антитела IgG для введения аминокислот цистеинов путем замещения на одном сайте на тяжелой или легкой цепи дает два новых цистеина на симметричном антителе. Лекарственную загрузку с примерным значением 2 можно получить с близкой гомогенностью продукта конъюгации ADC.

Кроме того, данное изобретение также относится к иммуноконъюгату или конъюгату "антитело - лекарственное средство", описанному выше, для применения в качестве лекарственного средства.

Кроме того, данное изобретение также относится к иммуноконъюгату или конъюгату "антитело - лекарственное средство", описанному выше, для применения в лечении рака.

Данное изобретение относится к конъюгату "антитело - лекарственное средство", описанному выше, для применения в качестве лекарственного средства. В конкретном воплощении данное изобретение относится к конъюгату "антитело - лекарственное средство", описанному выше, для применения в лечении рака. В более конкретном воплощении данное изобретение относится к конъюгату "антитело - лекарственное средство", описанному выше, для применения в лечении рака, экспрессирующего IGF-1R, или IGF-1R-связанных видов рака.

IGF-1R-связанные виды рака включают опухолевые клетки, экспрессирующие или сверхэкспресирующие целый IGF-1R или его часть на своей поверхности.

Более конкретно, указанные виды рака включают рак молочной железы, толстой кишки, карциному пищевода, гепатоцеллюлярный рак, рак желудка, глиому, рак легких, меланому, остеосаркому, рак яичников, предстательной железы, рабдомиосаркому, рак почки, щитовидной железы, матки и эндометрия, а также любые явления лекарственной устойчивости.

В другом своем аспекте данное изобретение относится к применению конъюгата "антитело - лекарственное средство" согласно данному изобретению для лечения рака, экспрессирующего IGF-1R.

Другим объектом данного изобретения является фармацевтическая композиция, содержащая антитело согласно данному изобретению или конъюгат "антитело - лекарственное средство" или иммуноконъюгат, описанный в данном документе.

Более конкретно, данное изобретение относится к фармацевтической композиции, содержащей антитело согласно данному изобретению или конъюгат "антитело - лекарственное средство" или иммуноконъюгат, описанный выше, и по меньшей мере эксципиент и/или фармацевтически приемлемый носитель.

Данное изобретение относится к фармацевтической композиции, содержащей антитело или конъюгат "антитело - лекарственное средство", описанный выше, и по меньшей мере эксципиент и/или фармацевтически приемлемый носитель.

В данном описании выражение "фармацевтически приемлемый носитель" или "эксципиент" используется для обозначения соединения или комбинации соединений, входящих в фармацевтическую композицию, не провоцирующих побочных реакций, которая, например, облегчает введение активного соединения (соединений), увеличивает продолжительности его жизни и/или эффективность в организме, увеличивает его растворимость в растворе или улучшает его сохранение. Эти фармацевтически приемлемые носители и эксципиенты хорошо известны и могут быть адаптированы специалистом в данной области в зависимости от природы и способа введения выбранного активного соединения (соединений).

Предпочтительно эти иммуноконъюгаты будут введены системным путем, в частности, внутривенно, внутримышечно, внутрикожно, внутрибрюшинно или подкожно, либо пероральным путем. В более предпочтительном способе композицию, содержащую данные иммуноконъюгаты, будут вводить несколько раз последовательным образом.

Способы введения, дозировки и оптимальные фармацевтические формы могут быть определены в соответствии с критериями, которые обычно принимаются во внимание при разработке лечения, адаптированного к пациенту, например, к возрасту или весу тела пациента, тяжести его/ее общего состояния, устойчивости к лечению и отмеченным побочным эффектам.

В другом аспекте данное изобретение относится к фармацевтической композиции, содержащей антитело согласно данному изобретению или конъюгат "антитело - лекарственное средство" или иммуноконъюгат, описанный выше, и по меньшей мере экципиент и/или его фармацевтически приемлемый носитель, для применения в лечении рака. В более конкретном аспекте данное изобретение относится к фармацевтической композиции, содержащей антитело согласно данному изобретению или конъюгат "антитело - лекарственное средство" или иммуноконъюгат, описанный выше, и по меньшей мере экципиент и/или фармацевтически приемлемый носитель, для применения в лечении рака, экспрессирующего IGF-1R.

Изобретение также относится к способу лечения у субъекта рака и, в частности, лечения IGF-1R-экспрессирующего рака, включающему введение указанному субъекту эффективного количества по меньшей мере конъюгата "антитело - лекарственное средство" согласно изобретению. Данное изобретение также относится к способу лечения у субъекта рака и, в частности, лечения IGF-1R-экспрессирующего рака, включающему введение указанному субъекту эффективного количества фармацевтической композиции согласно изобретению.

В другом воплощении данное изобретение относится к способу доставки лекарственного препарата или медикамента к IGF-IR-экспрессирующей раковой клетке у субъекта, включающему введение указанному субъекту эффективного количества по меньшей мере конъюгата "антитело - лекарственное средство" согласно изобретению или фармацевтической композиции согласно изобретению.

Другие отличительные признаки и преимущества данного изобретения станут ясны в продолжении описания с примерами и графическими материалами, легенды к которым представлены ниже.

Подписи к графическим материалам

Фиг. 1: Пример профиля связывания Biacore, полученного с 3 антителами на hIGF-1R ECD, захваченном анти-His-Tag-антителом.

Фиг. 2: Схема картирования эпитопов, определенных в панели 15 моноклональных анти-hIGF-1R-антител с определенными 5 группами эпитопов. Нумерация групп не связана ни с позицией относительно последовательности, ни с 3D-структурой антигена.

Фиг. 3А-3С: Связывание антител к человеческим нативным IGF-1R в FACS-анализе. Фиг. 3А представляет кривую титрования на клеточной линии MCF-7 одного из химерных анти-IGF-1R-антител, репрезентативных для каждой группы кластеров эпитопов. MFI представляет собой среднюю величину интенсивности флуоресценции. Фиг. 3В представляет ЕС₅₀ как мышиных, так и химерных анти-IGF-1R-антител на клеточной линии MCF-7. Фиг. 3С представляет В_max химерных анти-IGF-1R-антител на клеточной линии MCF-7.

Фиг. 4А и 4В: Оценка распознавания hIGF-IR с помощью трансфицированных и нетрансфицированных клеток. Фиг.4А представляет кривые титрования одного из химерных анти-IGF-lR-антител, репрезентативного для каждой группы кластеров эпитопов, на клеточной линии IGF-1R⁺. MFI представляет собой среднюю величину интенсивности флуоресценции. Фиг.4 В представляет связывание одного из химерных анти-IGF-IR-антител, репрезентативного для каждой группы кластеров эпитопов, на человеческой линии клеток IGF-1R". MFI представляет собой среднюю величину интенсивности флуоресценции.

Фиг. 5А и 5В: Оценка специфичности антител против NGF-1R и hIR с использованием трансфицированных клеток. Фиг. 5А представляет связывание мышиного анти-IGF-1R-антитела на hIR⁺-трансфицированной клеточной линии. Фиг. 5В представляет связывание химерного анти-IGF-1R-антитела на IR⁺ клеточной линии. MFI представляет собой среднюю величину интенсивности флуоресценции. В панели А и В коммерчески доступное анти-hIR-антитело, описанное как GRO5 (Calbiochem), было введено в качестве положительного контроля.

Фиг.6: Связывание мышиного анти-IGF-1R-антитела на клеточной линии IM-9. MFI представляет собой среднюю величину интенсивности флуоресценции. Анти-hlR-MKA GRO5 было введено в качестве положительного контроля.

Фиг. 7А, 7В и 7С: Оценка распознавания обезьяньего IGF-1R. Фиг. 7А представляет кривые титрования одного из химерных анти-IGF-1R-антител, репрезентативного для каждой группы кластеров эпитопов, на клеточной линии COS-7. MFI представляет собой среднюю величину интенсивности флуоресценции. Фиг. 7В представляет ЕС₅₀ как мышиных, так и химерных анти-IGF-1R-антител на клеточной линии COS-7. Фиг. 7С представляет ЕС₅₀ химерных анти-IGF-1R-антител как на hIGF-1R⁺-трансфицированных клетках, так и на клетках COS-7. GR11L (Calbiochem) был введен в качестве положительного контроля.

Фиг. 8: Сравнение связывания C208F2 с hIGF-1R ECD или с hIGF-1R ECD яванского макака с использованием анализа Biacore. Сенсограммы, полученные с помощью Biacore Х100 на основе технологии поверхностного плазмонного резонанса (SPR), используя сенсорный чип СМ5, активированный более 11000 резонансных единиц (РЕ) мышиного анти-Tag His-антитела, химически привитого к карбоксиметидекстрановой матрице. Эксперимент проводят при скорости потока 30 мкл/мин при 25°С с использованием HBS-EP+ в качестве рабочего буфера и буфера для разведения образцов. На этой фиг. представлено наложение 4 независимых сенсограмм, выровненных на оси x по началу первого введения анализируемых веществ и на оси y по базальному уровню, определенному непосредственно перед этим первым введением. Сенсограммы, полученные при захвате последовательности на основе человеческого рекомбинантного растворимого IGF-1R, отмечены ромбами. Сенсограммы, полученные при захвате последовательности на основе рекомбинантного растворимого IGF-1R яванского макака, отмечены треугольниками. Белые символы соответствуют пустым циклам (5 введений рабочего буфера), а черные символы соответствуют введениям растущего диапазона концентраций C208F2 (5, 10, 20, 40 и 80 нм).

Фиг. 9: Оценка собственного влияния анти-hIGF-1R-антител на фосфорилирование рецептора по сравнению с IGF1.

Фиг. 10: Ингибирование фосфорилирования IGF-1R в ответ на IGF-1 мышиным анти-hIGF-1R.

Фиг. 11: Связывание анти-IGF-1R-антител на клеточной поверхности подавляется при температуре 37°С. Клетки MCF-7 инкубировали при 4°С или при 37°С в течение 4 ч с 10 мкг/мл каждого антитела. Фигура представляет ΔMFI.

Фиг. 12А и 12В: Распад антитела на поверхности. Антитело, связанное с поверхностью клетки, оценивали через 10, 20, 30, 60 и 120 мин при 37°С. На фиг. 12А представлен % от оставшегося IGF-1R по сравнению с интенсивностью сигнала, измеренного при температуре 4°С. Фиг. 12В представляет вычисление периода полужизни с помощью программного обеспечения Prims Software и с использованием настроек экспоненциального распада.

Фиг. 13: Кинетика интернализации антител, оцениваемая путем FACS-анализа. Клетки инкубировали с 10 мкг/мл мышиных антител в течение 0, 30 или 60 мин при 37°С. Клетки пермеабилизовали или не пермеабилизовали и инкубировали со вторичным противомышиным антителом IgG, конъюгированным с Alexa 488. Мембранное значение соответствует интенсивности сигнала без пермеабилизации. Общее значение соответствует сигналу интенсивности после клеточной пермеабилизации, а цитоплазматическое значение соответствует интернализированному антителу. Название каждого оцениваемого антитела приведено в верхней части каждого графика.

Фиг. 14А и 14В: Визуализация интернализации антитела. Фиг. 14А: клетки MCF-7 инкубировали с m208F2 в течение 20 мин при 4°С и промывали перед инкубацией [а)] при 37°С в течение 15 [b)], 30 [с)] и 60 [d)] минут. Клетки фиксировали и пермеабилизовали. Антитело m208F2 выявляли с помощью противомышиного IgG-антитела, конъюгированного с Alexa488, a Lamp-1 выявляли с помощью кроличьего анти-Lamp-1-антитела и вторичного противокроличьего IgG, конъюгированного с Alexa 555. Фиг. 14В (части с I по III): клетки MCF-7 инкубировали в течение 30 минут при 37°С с каждым из других анализируемых мышиных анти-hIGF-1R-антител, а затем окрашивали, как описано выше. Колокализацию идентифицировали с помощью плагина для выделения колокализации в программном обеспечении Image J.

Фиг. 15: Участие лизосомального пути в деградации антител.

Фиг. 16: Оценка связывания мышиных анти-hIG-1R-антител при различных значениях рН. ЕС₅₀ связывания различных антител оценивали на MCF-7 с использованием буфера с различным рН в диапазоне от 5 до 8.

Фиг. 17: Оценка способности выбранных анти-IGF-1R-антител индуцировать цитотоксичность в анализе Fab-ZAP. А) Клетки MCF-7 инкубировали с возрастающими концентрациями химерных анти-IGF-1R-антител в сочетании с набором для человеческого Fab-ZAP. Жизнеспособность клеток измеряли с использованием люминесцентного анализа жизнеспособности клеток CellTiter-Glo®. Химерное антитело c9G4 использовали как нерелевантное антитело. В) IC₅₀ из результатов, изображенных на А).

Фиг. 18: Корреляция между i) цитотоксической активностью, ii) влиянием рН на связывание антитело/IGF-1R, iii) влиянием антител на IGF-1-индуцированное фосфорилирование IGF-1R и iv) кластеризацией антител.

Фиг. 19A-19D: Связывающая характеристика первой гуманизированной формы МКА C208F2. Связывающие свойства МКА hz208F2 VH3/VL3 оценивали на человеческой клеточной линии MCF-7 (фиг. 19А), на обезьяньей клеточной линии COS-7 (фиг. 19В) и на трансфицированной мышиной клеточной линии, экспрессирующей рецептор человеческого инсулина (фиг. 19С). Связывание как мышиных, так и химерных МКА 208F2 оценивали в параллели. Клон анти-hIR-антитела GRO5 использовали для проверки экспрессии hIR на трансфицированной клеточной линии (фиг. 19D).

Фиг. 20A-20D: ELISA-валидация поликлонального антитела AF305-NA, которое было использовано для IHC-анализов (т.е. иммуногистохимических анализов). Фиг. 20А: Связывание с hIGF-1R. Фиг. 20В: Связывание с человеческим рекомбинантным IR. Нет распознавания MR EDC и клеточного IR, экспрессированного трансфицированными клетками (фиг. 20D) по сравнению с контрольным антителом GRO5 на этих hIR-трансфицированных клетках (фиг. 20С).

Фиг. 21: Валидация окрашивания hIGF-IR на FFPE-срезах (т.е. зафиксированных в формалине и залитых парафином) ксенотрансплантатов, экспрессирующих различные уровни hIGF-1R. Hs746T был введен в качестве отрицательного контроля.

Фиг. 22А и 22В: Оценка экспрессии hIGF-IR на FFPE-срезах нормальных тканей. Срезы плаценты были использованы в качестве положительного контроля для нормальных тканей, а положительные опухолевые ткани ксенотрансплантатов были введены в каждый цикл, чтобы откалибровать экспрессию hIGF-IR.

Фиг. 23: Оценка экспрессии hIGF-IR на FFPE-срезах ткани NSCL (немелкоклеточного рака легкого). Четыре случая, которые являются репрезентативными для сильного окрашивания, наблюдаемого в большой панели проанализированных тканей.

Фиг. 24: Оценка экспрессии hIGF-IR на FFPE-срезах ткани рака молочной железы. Три случая, которые являются репрезентативными для сильного окрашивания, наблюдаемого в тестируемой панели проанализированных тканей.

Фиг. 25: Оценка экспрессии hIGF-IR на FFPE-срезах тканей различных опухолей.

Фиг. 26: Совмещение сенсограмм, полученных с помощью устройства Biacore Х100 на основе SPR при температуре 25°С с сенсорным чипом СМ5, активированным на обеих проточных ячейках с помощью примерно 12000 РЕ мышиных моноклональных анти-His-Tag-антител, химически привитых к карбоксиметилдекстрановой матрице, с использованием HBS-EP+ в качестве рабочего буфера при скорости потока 30 мкл/мин. Каждая сенсограмма (первая отмечена треугольниками, а вторая отмечена ромбами) соответствует полному циклу:

1 - введение в течение одной минуты раствора рекомбинантного h-IGF-1R (10 мкг/мл) во вторую проточную ячейку.

2 - для первой сенсограммы: 5 введений рабочего буфера, каждое по 90 с.

- для второй сенсограммы: пять введений растворов анти-IGF-1R-антитела C208F2 с возрастающим диапазоном концентраций, каждое по 90 с.

3 - задержка 300 с для определения кинетических скоростей диссоциации.

4 - регенерация поверхности с помощью введения буфера с 10 мМ глицином, HCl рН 1,5, в течение 45 с.

Фиг. 27: Сенсограмма, соответствующая вычитанию фоновой сенсограммы (5 введений HBS-EP+) из сенсограммы, полученной с растворами анти-IGF-1R-антитела C208F2 с возрастающим диапазоном концентраций, представлена в сером цвете. Теоретическая сенсограмма, соответствующая модели 1:1 со следующими параметрами: k_on=(1,206±0,036)×10⁶ М^-1.с^-1, k_off=(7,81±0,18)×10^-5 с^-1, Rmax=307,6±0,3РЕ, представлена тонкой черной линией. Рассчитанные концентрации C208F2 представлены на графике: только самая высокая концентрация (24 нМ) рассматривается как константа.

Фиг. 28: Константы диссоциации соответствуют среднему значению от четырех экспериментов для каждого антитела и соответствуют соотношению: k_off/k_on×10¹², будучи выраженными в единицах "пМ". Столбцы ошибок соответствуют стандартной ошибке (n равно 4).

Фиг. 29: Периоды полужизни соответствуют среднему значению от четырех экспериментов для каждого антитела и соответствуют соотношению: Ln(2)/k_off/3600, будучи выраженными в единицах "час". Столбцы ошибок соответствуют стандартной ошибке (n равно 4).

Фиг. 30: Совмещение двух сенсограмм, соответствующих двум циклам эксперимента, проведенным на устройстве Biacore Х100 при скорости потока 30 мкл/мин и при 25°С.

Первый этап цикла соответствует введению раствора антитела C208F2 в концентрации 10 мкг/мл в течение 60 с во вторую проточную ячейку микрочипа СМ5, активированного присоединением более 10500 РЕ мышиного моноклонального антитела против человеческого Fc IgG, химически связанного с карбоксиметилдекстрановой матрицей за счет его функциональных амино-групп. Второй этап соответствует введению растворов внеклеточного домена либо h-IGF-1R (заштрихованные ромбы), либо m-IGF-1R (незаштрихованные ромбы) из неочищенных клеточных культуральных супернатантов в течение 120 секунд с задержкой 120 секунд. Двунаправленные стрелки указывают точки измерения уровня захвата антитела и уровня связывания IGF-1R, используемые в данном исследовании.

Фиг. 31: Гистограммы, представляющие соотношение уровня связывания IGF-1R, полученного для каждой из химерных h/m IGF-1R-конструкций, и уровня C208F2, захваченного на второй проточной ячейке на сенсорном чипе в течение соответствующего цикла.

Фиг. 32А и В: Гистограммы, представляющие ЕС₅₀ для hz208F2 H076/L024 при значениях рН от 5 до 8, кислый рН снижает связывающую способность гуманизированных IGF-1R-антител hz208F2 H076/L024 (А) и hz208F2 (H077/L018 (В).

Фиг. 33: Связывание Hz208F2 (10 мкг/мл) на 170 РЕ растворимой версии h-IGF1R дикого типа (черный ромб) или на 120 РЕ мутанта С29 (Asp491>Ala) этого рецептора. Каждый рецептор был захвачен на сенсорном чипе СМ5 через его С-концевую 66His-метку. Эксперимент проводили на устройстве Biacore Х100 при 25°С со скоростью потока 30 мкл/мин с использованием классического HBS-EP+ в качестве рабочего буфера.

Примеры

Все гибридомы, упомянутые в данном изобретении, сохранены в CNCM (Институт Пастера, Франция) и указаны в следующей таблице 7.

Таблица 7

Пример 1: Создание IGF-1R-антител

Для создания мышиных моноклональных антител (МКА) против внеклеточного домена (ECD) человеческого рецептора IGF-1 (hIGF-1R) 5 мышей BALB/c иммунизировали 3 раза подкожно 10 мкг белка rhIGF-1R (R&D Systems, кат. №391-GR). В качестве альтернативы, некоторым животным были выполнены три дополнительных иммунизации с использованием 10 мкг мышиного внеклеточного домена (ECD) IGF-1R (R&D Systems, кат. №6630-GR/Fc). Первую иммунизацию проводили в присутствии полного адъюванта Фрейнда (Sigma, Сент-Луис, Мэриленд, США). К последующим иммунизациям добавляли неполный адъювант Фрейнда (Sigma). За три дня до слияния иммунизированных мышей бустировали с использованием 10 мкг белка rhIGF-1R. Затем получали спленоциты и лимфоциты путем перфузии селезенки и измельчения проксимальных лимфатических узлов, соответственно, собранных от 1 из 5 иммунизированных мышей (выбранной после титрования сывороток всех мышей), и сливали их с клетками миеломы SP2/0-Ag14 (АТСС, Роквилл, Мэриленд, США). Протокол слияния описан Kohler и Milstein (Nature, 256: 495-497, 1975). Затем гибридные клетки подвергали НАТ-селекции (селекции с использованием гипоксантина, аминоптерина и тимидина). Как правило, для получения моноклональных антител или их функциональных фрагментов, особенно мышиного происхождения, можно обратиться к методикам, которые описаны, в частности, в руководстве "Antibodies" (Harlow and Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor NY, pp. 726, 1988). Примерно через 10 дней после слияния колонии гибридных клеток подвергали скринингу. Для первичного скрининга супернатанты гибридом оценивали на предмет секреции МКА, выработанных против белка rhIGF-1R ECD, с помощью FACS-анализа с использованием клеток человеческой опухоли молочной железы MCF7 (АТСС) и/или клеток обезьяны COS7 (клетки почки африканский зеленой мартышки, трансформированные SV40), которые экспрессируют обезьяний IGF-1R на своей клеточной поверхности. Более точно, для отбора с помощью проточной цитометрии 105 клеток (MCF7 или COS7) высевали в каждую лунку 96-луночного планшета в PBS, содержащем 1% BSA и 0,01% азид натрия (FACS-буфере), при 4°С. После 2 мин центрифугирования при 2000 об/мин буфер удаляли и добавляли гибридомные супернатанты, которые нужно было проанализировать. Через 20 мин инкубации при температуре 4°С клетки дважды промывали и добавляли Alexa 488-конъюгированное козлиное противомышиное антитело, разведенное 1/500 в FACS-буфере (№ А11017, Molecular Probes Inc., Юджин, США), и инкубировали в течение 20 мин при температуре 4°С. После финальной промывки FACS-буфером клетки анализировали с помощью FACS (FACSCalibur, Becton-Dickinson) после добавления пропидия йодида в каждую пробирку в конечной концентрации 40 мкг/мл. Лунки, содержащие только клетки, и лунки, содержащие клетки, инкубированные с вторичным Alexa 488-конъюгированным антителом, были включены в качестве отрицательных контролей. Изотипические контроли использовали в каждом эксперименте (Sigma, № M90351MG). Для вычисления среднего значения интенсивности флуоресценции (MFI) оценивали по меньшей мере 5000 клеток.

Кроме того, проводили анализ интернализации для того, чтобы выбрать только интернализированные антитела. Для этого анализа линию опухолевых клеток MCF7 культивировали в RMPI 1640 без фенола красного, с 1% L-глутамином и 10% FACS в течение 3 дней до начала эксперимента. Затем клетки отделяли с помощью трипсина, и 100 мкл клеточной суспензии с плотностью 4×10⁵ клеток/мл высевали в 96-луночные планшеты в RPMI 1640 без фенола красного, с 1% L-глутамином и 5% FBS. После 2 мин центрифугирования при 2000 об/мин клетки ресуспендировали в 50 мкл гибридомного супернатанта или растворов контрольных антител (положительные и изотипические контроли в концентрации 1 мкг/мл). После инкубации в течение 20 мин при 4°С клетки центрифугировали 2 мин при 2000 об/мин и ресуспендировали либо в холодной (4°С), либо в теплой (37°С) полной культуральной среде. Затем клетки инкубировали в течение 2 часов либо при 37°С, либо при 4°С. Затем клетки промывали три раза FACS-буфером. Alexa 488-меченное козлиное противомышиное IgG антитело инкубировали в течение 20 мин и клетки промывали три раза перед FACS-анализом популяции клеток, отрицательных при окрашивании пропидия йодидом.

После FACS-анализа определяли два параметра: (i) разность флуоресцентного сигнала, обнаруженного на поверхности клеток, инкубированных при 4°С, и сигнала, полученного с клетками, инкубированными при 37°С, с супернатантом одной гибридомы и (и) процент оставшегося IGF-1R на поверхности клетки.

Процент оставшегося hIGF-1R рассчитывается следующим образом:

% оставшегося IGF-1R = (MFI_{при 37°C}/MFI_{при 4°C})×100

Помимо этого, проводили три ELISA (либо до, либо после клонирования) для изучения связывания антител с рекомбинантным человеческим (hIGF-1R) и мышиным (mIGF-IR) белками, а также с белком рекомбинантного человеческого рецептора инсулина (MR). Сохраняли гибридомы, секретирующие антитела, которые демонстрировали связывание с rh- и/или rm-IGF-1R и не связывались с rhIR. Вкратце, 96-луночные планшеты для ELISA (Costar 3690, Corning, Нью-Йорк, США) покрывали 100 мкл/лунка либо раствора белка rhIGF-1R (R&D Systems, кат. №391-GR) с концентрацией 0,6 мкг/мл, либо раствора белка rmIGF-1R (R&D Systems, кат. №6630-GR/Fc) с концентрацией 1 мкг/мл, либо раствора белка rhIR (R&D Systems, кат. №1544-, IR/CF) с концентрацией 1 мкг/мл в PBS в течение ночи при температуре 4°С. Затем планшеты блокировали с помощью PBS, содержащего 0,5% желатин (№22151, Serva Electrophoresis GmbH, Гейдельберг, Германия) в течение 2 ч при 37°С. Сразу после удаления буфера насыщения путем стряхивания планшетов в лунки добавляли по 100 мкл каждого разведения супернатанта (либо неразведенного супернатанта от гибридомы, либо серийных разведений супернатантов) и инкубировали в течение 1 ч при 37°С. После трех промывок добавляли 100 мкл конъюгированного с пероксидазой хрена поликлонального козлиного противомышиного антитела IgG (№115-035-164, Jackson Immuno-Research Laboratories, Inc., Вест-Гров, Пенсильвания, США) в разведении 1/5000 в PBS, содержащем 0,1% желатин и 0,05% Tween 20 (по массе) на 1 ч при температуре 37°С. Затем ELISA-планшеты промывали 3 раза и добавляли субстрат ТМВ (№ UP664782, Uptima, Interchim, Франция). После 10-минутного периода инкубации при комнатной температуре реакцию останавливали с помощью 1 М серной кислоты и измеряли оптическую плотность при длине волны 450 нм.

Гибридому, секретирующую представляющее интерес антитело, размножали и клонировали путем серийных разведений. После изотипирования один клон каждого кода размножали и замораживали. Каждое антитело, представляющее интерес, получали в системах продукции in vitro под названием CellLine (Integra Biosciences) для дальнейшей характеризации.

Дополнительные анализы для определения специфичности связывания проводили с помощью FACS-анализа на клетках IM9 (человеческие IR-экспрессирующие В-лимфобласты), а также на hIGF-IR-трансфицированных клетках в сравнении с нетрансфицированными клетками.

Все данные, соответствующие выбранным антителам, суммированы в таблице 8. Интересно отметить, что среди антител, выбранных i) на основании их селективности по отношению к hIGF-1R в сравнении с hIR и ii) на основании их способности индуцировать интернализацию IGF-1R, некоторые были способны распознавать свою мишень как в ELISA, так и в FACS-условиях, тогда как другие очень хорошо связывались при исследовании путем цитометрии и очень плохо связывались при исследовании путем ELISA. m280F2, m212A11, m213B10, m214F8 и m219D6 принадлежат к этой последней группе, которая хорошо не распознает белок, связанный с планшетом для ELISA.

Пример 2: Характеристика кластеризации эпитопов анти-IGF-1R-антитела в экспериментах по картированию с использованием технологии BIAcore на основе SPR

Для того чтобы изучить разнообразие ответов против IGF-1R, выбранные антитела картировали с помощью Biacore и выполняли кластеризацию этих антител в соответствии с конкурентными свойствами.

Вкратце, эксперименты по картированию эпитопов проводили на устройстве Biacore X с использованием сенсорного чипа СМ5, активированного анти-His-Tag-антителом (набор His Capture Kit от GE Healthcare, кат. номер 28-9950-56). Более 11000 РЕ антител химически присоединяли к карбоксиметилдекстрановой матрице с использованием набора для аминовой химической реакции. Эксперименты проводили при 25°С со скоростью потока 1 мкл/мин с использованием буфера HBS-ЕР (GE Healthcare) в качестве рабочего буфера и буфера для разведения образцов.

Эксперимент по картированию эпитопов проводили по той же схеме:

1 - Раствор растворимого варианта гетеротетрамера hIGF-IR (цепи 2α и внеклеточные домены цепей 2β, экспрессированные с дополнительной С-концевой 10-His-меткой (R&D Systems, каталожный номер 305-GR)) вводят в концентрации 5 мкг/мл в расчете на обе проточные ячейки в течение 1 минуты.

2 - Затем раствор анализируемого анти-hIGF-IR-антител а (классически 50 мкг/мл) вводят только в проточную ячейку 1 в течение 60-90 секунд, чтобы достигнуть насыщения сайтов связывания hIGF-1R (или по меньшей мере приблизиться к этому).

3 - Раствор второго антитела, используемого в качестве потенциального конкурента, вводят в тех же условиях либо в обе проточные ячейки, либо только во вторую проточную ячейку.

4 - Наконец, раствор третьего антитела может быть введен в тех же условиях в обе проточные ячейки.

5 - Затем поверхность регенерируют введением буфера с 10 мМ глицином, HCl, рН 1,5, в течение 30 с.

Этот тип эксперимента ясно показывает, могут ли два антитела связываться одновременно с одной и той же молекулой hIGF-1R, демонстрируя, что связывающие области (эпитопы) каждого антитела достаточно удалены друг от друга, чтобы позволить это. Напротив, если связывание антитела с NGF-1R предотвращает связывание второго антитела, то предполагается, что оба антитела распознают один и тот же эпитоп. Наконец, в случае частичной конкуренции можно заподозрить перекрывание эпитопов, распознаваемых двумя анализируемыми антителами. Таким образом определяются группы областей эпитопов. Сложность результата, как правило, возрастает с увеличением размера панели антител, используемых в эксперименте.

На фиг. 1 приведен пример типичного цикла эксперимента по картированию эпитопов с использованием устройства Biacore X на основе SPR. Сенсограммы показывают ответ (РЕ - в резонансных единицах) как функцию от времени (в секундах) на проточной ячейке 1 (черные ромбы) и 2 (белые ромбы). В фазе 1 раствор антигена - растворимый рекомбинантный hIGF-IR с двумя С-концевыми 10-His-метками - вводится в обе проточные ячейки сенсорного чипа СМ5 с мышиным анти-His-Tag-антителом, химически связанным с карбоксиметилдекстрановой матрицей, в концентрации 5 мкг/мл и со скоростью потока 10 мкл/мин.

В фазе 2 раствор первого анализируемого антитела (219D6) в концентрации 50 мкг/мл вводят в проточную ячейку 1. Затем в фазе 3 раствор второго антитела (101Н8) в концентрации 50 мкг/мл вводят в проточную ячейку 2, а затем в фазе 4 вводят раствор третьего антитела (201F1) в концентрации 50 мкг/мл в обе проточные ячейки. Ответ на это введение ясно показывает, что связывание 201F1 с IGF-1R предотвращается антителом 101Н8, но не антителом 219D6. Антитела 201F1 и 219D6, очевидно, принадлежат к разным группам эпитопов. Кластеризация, приводящая к целому анализу 15 отобранных кандидатов, описана на фиг. 2, и показано, что иммунизация мышей hIGF-1R дает повышение серии антител, демонстрирующих хорошее разнообразие. Действительно, были получены 5 различных групп моноклональных антител, распознающих различные эпитопы.

Пример 3: Связывание антител с человеческим нативным IGF-1R в FACS-анализах

Связывающие свойства серии анти-IGF-1R-антител оценивали с помощью FACS-анализов на клеточной линии человеческой аденокарциномы молочной железы MCF-7 (АТСС № НТВ-22) с использованием возрастающих концентраций антитела. Для этой цели клетки (1×10⁶ клеток/мл) инкубировали с анти-IGF-1R-антителами в течение 20 мин при 4°С в FACS-буфере (PBS, 0,1% BSA, 0,01% NaN₃). Затем их промывали 3 раза и инкубировали с соответствующим вторичным антителом, конъюгированным с Alexa 488, в течение 20 дополнительных минут при 4°С в темноте, а затем промывали 3 раза FACS-буфером. Связывание анти-IGF-1R-антител немедленно проводили на жизнеспособных клетках, которые идентифицировали с помощью пропидия йодида (который окрашивает мертвые клетки). Максимум интенсивности сигнала, полученный с каждым антителом, обозначали как B_max и выражали в средней интенсивности флуоресценции (MFI). ЕС₅₀ связывания выражали в молярности (М), которую рассчитывали с помощью нелинейного регрессионного анализа (GraphPad Prims 4.0).

Кривые титрования каждого мышиного или химерного антитела показали, что все созданные антитела способны распознавать нативную форму IGF-1R с типичным профилем насыщения (фиг. 3А). Для того чтобы ранжировать антитела и сравнить связывающие свойства мышиных и химерных антител, для каждого соединения определяли ЕС₅₀ связывания с использованием нелинейного регрессионного анализа. Сравнение ЕС₅₀ каждого мышиного антитела с ЕС₅₀ его соответствующей химерной формы показало, что две формы демонстрировали одни и те же связывающие свойства, показывая, что химеризация антитела не влияла на распознавание IGF-1R (фиг. 3В). ЕС₅₀ колебались в диапазоне от 1,2×10^-8 до 4,4×10^-10. Антитела, принадлежащие к группе 2, и с102Н8, принадлежащее к группе 3А, показали лучшую ЕС₅₀. Что касается анализов В_max (фиг. 3С), три антитела (414Е1 (G3B), 105G2 (G4) и 832Е5 (G5)) имели более низкий В_max по сравнению с другими. Значения В_max и ЕС₅₀ суммированы в таблице 9.

Пример 4: Подтверждение специфичности антител с использованием IGF-1R- или IR-трансфицированных клеток или клеток IM9, которые естественным образом экспрессируют существенные уровни IR

Для того чтобы подтвердить специфичность созданных антител в отношении hIGF-1R по сравнению с MR, стабильные трансфектанты, экспрессирующие либо hIGF-1R, либо MR, оценивали с помощью FACS-анализа. Вкратце, возрастающие концентрации химерных моноклональных антител инкубировали с клетками в течение 20 мин при 4°С в FACS-буфере (PBS, 0,1% BSA, 0,01% NaN₃). Затем клетки промывали 3 раза и инкубировали с соответствующим вторичным антителом, конъюгированным с Alexa 488, и инкубировали в течение 20 дополнительных минут при 4°С в темноте, а затем промывали 3 раза в FACS-буфере. ЕС₅₀ связывания выражали в молярности (М), которую рассчитывали с помощью нелинейного регрессионного анализа (GraphPad Prims 4.0).

Кривые титрования, полученные на клеточной линии, трансфицированной hIGF-1R (фиг. 4А), в сравнении с нетрансфицированными клетками (фиг. 4В) подтвердили специфичность связывания химерных антител с человеческим IGF-1R. Значения В_max и ЕС₅₀ суммированы в таблице 10. В этом анализе антитела из групп G2 и G3a показали лучшие ЕС₅₀.

Для того чтобы подтвердить отсутствие связывания мышиных и химерных антител с hIR, использовали клеточную линию, стабильно экспрессирующую человеческий IR. Распознавание человеческого hIR клеточной поверхности как мышиным, так и химерным антителом проводили путем FACS-анализов. Возрастающие концентрации мышиных или химерных моноклональных антител инкубировали с hIR⁺-трансфицированной клеточной линией в течение 20 мин при 4°С в FACS-буфере (PBS, 0,1% BSA, 0,01% NaN₃). Затем клетки промывали 3 раза и инкубировали с соответствующим вторичным антителом, конъюгированным с Alexa 488, и инкубировали в течение 20 дополнительных минут при 4°С в темноте, а затем промывали 3 раза в FACS-буфере. Связывание анти-IGF-1R-антител немедленно проводили на жизнеспособных клетках, которые идентифицировали с помощью пропидия йодида (который окрашивает мертвые клетки). ЕС₅₀ связывания выражали в молярности (М), которую рассчитывали с помощью нелинейного регрессионного анализа (GraphPad Prims 4.0). Коммерческое специфическое анти-IGF-IR-антитело, клон GR11L, и анти-hIR-антитело, клон GRO5, использовали в качестве положительных контролей. c9G4 вводили в качестве нерелевантного антитела (изотипического контроля).

Высокий уровень экспрессии hIR на клеточной поверхности трансфицированных клеток подтверждали с использованием коммерческого анти-hIR-антитела GRO5. Даже с использованием высоких концентраций либо мышиного (фиг. 5А), либо химерного (фиг. 5В) анти-hIGF-IR-антител никакого связывания на клеточной поверхности hIR⁺-трансфицированных клеток не наблюдалось. Эти результаты показали, что ни мышиные, ни химерные анти-hIGF-IR-антитела не распознают hIR.

Эта специфичность распознавания hIGF-1R в сравнении с IR также была продемонстрирована с использованием клеток IM9, клеточной линии В-лимфомы, которая экспрессирует hIR (фиг. 6). Для этого FACS-анализа протокол был таким же, как описанный выше, а мышиные анти-IGF-1R-антитела использовали для того, чтобы предотвратить перекрестную реактивность вторичного противочеловеческого антитела (клетки IM9 экспрессируют человеческий иммуноглобулин на своей клеточной поверхности). Результаты, представленные на фиг. 6, еще раз показали, что ожидаемый сигнал наблюдался при использовании анти-hIR-антитела GRO5, в то время как ни одно из оцениваемых мышиных антител не демонстрировало какого-либо существенного сигнала связывания на этой клеточной линии.

Пример 5: Связывание антитела с нативным обезьяньим IGF-1R в анализах FACS и Biacore

Одной из первых предпосылок для контрольных токсикологических исследований является выявление релевантного вида животного для оценки выбранного соединения. Поскольку серия антител, описанных в данном документе, не способна распознавать мышиный IGF-1R, то, скорее всего, видом для токсикологической оценки будет примат, не являющийся человеком (поп human primate, NHP).

Для того чтобы оценить связывание анти-IGF-l R-антител с обезьяньим IGF-1R, оценивали связывание как мышиных, так и химерных анти-hIGF-IR-антител с помощью FACS-анализа на линии клеток COS-7 с использованием возрастающих концентраций антител. Клетки (1×10⁶ клеток/мл) инкубировали с анти-IGF-1R-антителами в течение 20 минут при 4°С в FACS-буфере (PBS, 0,1% BSA, 0,01% NaN₃). Затем клетки промывали 3 раза и инкубировали с соответствующим вторичным антителом, конъюгированным с Alexa 488, а затем инкубировали в течение 20 дополнительных минут при 4°С в темноте, и затем промывали 3 раза в FACS-буфере. Связывание анти-IGF-1R-антител немедленно проводили на жизнеспособных клетках, которые идентифицировали с помощью пропидия йодида (который окрашивает мертвые клетки). ЕС₅₀ связывания выражали в молярности (М), которую рассчитывали с помощью нелинейного регрессионного анализа (GraphPad Prims 4.0).

Кривые титрования, полученные на линии клеток обезьян COS-7, показали, что все анти-hIGF-IR-антитела, за исключением МКА 832Е5, специфически распознавали IGF-1R, экспрессированный на поверхности линии клеток обезьян (фиг. 7А). Определение ЕС₅₀ для каждого из мышиных и химерных антител показало, что два из них являются сравнительно хорошими касательно их свойств связывания обезьяньего IGF-1R (фиг. 7В). Эти результаты показали, что все созданные анти-hIGF-IR-MKA, за исключением МКА 832Е5, распознают обезьяний IGF-1R.

Сравнение ЕС₅₀ связывания на клетках COS-7 и IGF-1R-трансфицированных клетках проводили с целью проверки величины распознавания химерного антитела на человеческом IGF-1R по сравнению с обезьяньим IGF-1R. Результаты, показанные на фиг. 7В, продемонстрировали аналогичное распознавание человеческого и обезьяньего IGF-1R всеми антителами, за исключением МКА 832Е5.

Для того чтобы подтвердить распознавание на другом типе обезьян, клетки трансфицировали IGF-1R от яванского макака, получая растворимый обезьяний IGF-1R ECD, и выполняли эксперименты Biacore с одним из химерных антител (C208F2), чтобы сравнить его связывающие свойства либо на hIGF-IR, либо на IGF-1R яванского макака/

Эксперименты по распознаванию проводили на устройстве Biacore X с использованием сенсорного чипа СМ5, активированного анти-His-Tag-антителом (набор His Capture Kit от GE Healthcare, кат. номер 28-9950-56). Более 11000 РЕ антител химически присоединяли к карбоксиметилдекстрановой матрице с использованием набора для аминовой химической реакции. Эксперименты проводили при 25°С со скоростью потока 30 мкл/мин с использованием буфера HBS-EP (GE Healthcare) в качестве рабочего буфера и буфера для разведения образцов. Кинетическую схему с одним циклом использовали для определенных кинетических параметров связывания химерной формы анти-IGF-IR-антитела 208F2 (C208F2) на NGF-1R в сравнении с IGF-1R макаки.

Раствор растворимого рекомбинатного варианта гетеротетрамера hIGF-IR, состоящего из цепей 2β и внеклеточных доменов цепей 2α, экспрессированных с дополнительной С-концевой 10-His-меткой, основанного либо на человеческой последовательности (R&D Systems, кат. номер 305-GR-50), либо последовательности яванского макака (получен самостоятельно), вводили в течение 1 минуты во вторую проточную ячейку в разведении, определенном для захвата примерно 160 РЕ антигена. Раствор второго антитела вводили в тех же условиях либо в обе проточные ячейки, либо только во вторую проточную ячейку. После фазы захвата 5 раз вводили либо рабочий буфер (каждое введение по 90 с), либо возрастающий диапазон 5 концентраций C208F2 (каждое введение по 90 с) в обе проточные ячейки. В конце пятого введения прогоняли рабочий буфер для определения скорости диссоциации. Затем поверхность подвергали регенерации путем введения буфера с 10 мМ глицином, HCl, рН 1,5, в течение 30 с.

Вычисленный сигнал соответствует разности между ответом из проточной ячейки 2 (с захваченным IGF-1R) и ответом из проточной ячейки 1 (без каких-либо молекул IGF-1R) (фиг. 8).

Для каждой молекулы IGF-1R (человека или обезьяны) сигнал от введения растущего диапазона концентраций C208F2 корректировали путем вычитания сигнала, полученного с 5 введениями буфера (двойной референс). Полученные сенсограммы анализировали с использованием программного обеспечения BIAevaluation с моделью 1:1. Кинетические показатели оценивали либо независимо (2 кинетические скорости связывания C208F2 на каждом IGF-1R) или вместе (одни и те же кинетические скорости связывания C208F2 на IGF-1R человека и яванского макака). Качество подгонки оценивали по соотношению Chi2/Rmax ниже 0,05 РЕ.

Кинетические скорости связывания (см. таблицу 11), определенные по отдельности для каждого IGF-1R, были близкими, и подгонка обеих сенсограмм с одинаковыми кинетическими скоростями имеет хорошее качество. Антитело C208F2 распознает рекомбинантные IGF-1R человека и яванского макака с константой диссоциации (KD) примерно 0,2 нМ. Аффинности, определенные в данном исследовании, соответствуют функциональным аффинностям (или авидностям) антител с уровнем захваченного IGF-1R человека и яванского макака в районе 160 РЕ.

Пример 6: Собственное влияние созданных антител на фосфорилирование IGF-1R

Хорошо известно, что антитела могут индуцировать агонистическое действие, когда они связываются с тирозинкиназными рецепторами. Поскольку мы не хотели выбирать такие антитела-агонисты, мы проводили оценку фосфорилирования hIGF-IR с использованием химерных антител.

Для этой цели клетки MCF-7 инкубировали в бессывороточной среде в течение ночи. Затем добавляли либо IGF-1 (100 нМ), либо анализируемые антитела (10 мкг/мл) на 10 минут при 37°С. Среду отбрасывали и клетки соскабливали в лизирующий буфер (рН 7,5), содержащий 10 мМ буфер Tris-HCl (рН 7,5), 15% раствор NaCl (1 М), 10% смесь детергентов (10 мМ Tris-HCl, 10% лизирующий буфер Igepal) (Sigma Chemical Co.), 5% дезоксихолат натрия (Sigma Chemical Co.), 1 таблетку смеси ингибиторов протеаз ТМ (Roche), 1% смесь ингибиторов фосфатаз Cocktail Set II (Calbiochem), на 90 минут при температуре 4°С. Лизаты осветляли центрифугированием при 4°С, нагревали в течение 5 мин при 100°С и хранили при -20°С или сразу загружали в 4-12% SDS-PAGE-гель. Инкубацию с первичным антителом проводили в течение 2 ч при комнатной температуре, а затем проводили инкубацию с HRP-связанными вторичными антителами в течение 1 ч при комнатной температуре. Мембраны промывали в TBST, а затем визуализировали белки с помощью ECL. Блоты оценивали количественно, используя программное обеспечение Image J. Значения "фосфор - белок" нормировали по GAPDH. Фосфорилирование hIGF-1R в ответ на IGF-1 рассматривали как 100% стимуляции. Влияние анти-hIGF-IR-антител на фосфорилирование hIGF-1R определяли как % фосфорилирования, индуцированный IGF-1.

Результаты, описанные на фиг. 9, представляют собой среднее значение от % pIGF-1R в ответ на химерные анти-IGF-IR-антитела из трех независимых экспериментов +/-S.D. в сравнении с IGF-1. Как было показано, при инкубации клеток MCF-7 с 10 мкг анти-IGF-1R-антител не было обнаружено никакого существенного или минорного (<20%) фосфорилирования hIGF-1R.

Пример 7: Ингибирование фосфорилирования IGF-1R в ответ на 1GF-1 мышиными анти-hIGF-IR-антителами

Чтобы охарактеризовать выбранные антитела, исследовали их способность ингибировать IGF1-индуцированное фосфорилирование. Для этой цели клетки MCF-7 инкубировали в бессывороточной среде в течение ночи. Затем клетки инкубировали в течение 5 минут с мышиным анти-hlGF-IR-антителами, а затем добавляли IGF-1 на 2 мин при 37°С. Среду отбрасывали и клетки соскабливали в лизирующий буфер (рН 7,5), содержащий 10 мМ буфер Tris-HCl (рН 7,5), 15% раствор NaCl (1 М), 10% смесь детергентов (10 мМ Tris-HCl, 10% лизирующий буфер Igepal) (Sigma Chemical Co.), 5% дезоксихолат натрия (Sigma Chemical Co.), 1 таблетку смеси ингибиторов протеаз ТМ (Roche), 1% смесь ингибиторов фосфатаз Cocktail Set II (Calbiochem), на 90 мин при температуре 4°С. Лизаты осветляли центрифугированием при 4°С, нагревали в течение 5 мин при 100°С и хранили при -20°С или сразу загружали в 4-12% SDS-PAGE-гели. Инкубацию с первичным антителом проводили в течение 2 ч при комнатной температуре, а затем проводили инкубацию с HRP-связанными вторичными антителами в течение 1 ч при комнатной температуре. Мембраны промывали в TBST, а затем визуализировали белки с помощью ECL. Блоты оценивали количественно, используя программное обеспечение Image J. Значения "фосфор - белок" нормировали по GAPDH. Фосфорилирование hlGF-1R в ответ на IGF-1 рассматривали как 100% стимуляции. Влияние анти-hIGF-IR-антител на фосфорилирование NGF-1R определяли как % фосфорилирования, индуцированный IGF-1.

Добавление m105G2, m101H8 или m9G4, нерелевантных мышиных антител, не ингибировало фосфорилирование hIGF-1R в ответ на IGF-1 (фиг. 10). Добавление m201F1 умеренно снижало фосфорилирование hIGF-1R в ответ на IGF-1 (примерно 40% снижение). Все другие анти-IGF-1R-антитела сильно ингибировали фосфорилирование MGF-1R в ответ на IGF-1 (снижение >80%). Лучшими ингибиторами IGF1-индуцированного фосфорилирования hIGF-1R являются МКА m208F2, m212A11 и m214F8.

Пример 8: Исследование интернализации IGF-1R после связывания с созданными анти-IGF-1R-антителами с помощью FACS-анализа

Клетки MCF-7 инкубировали с 10 мкг/мл химерных антител при 4°С в течение 20 мин. Затем клетки промывали и инкубировали при 4°С или 37°С в течение 4 ч. Количество антител, связанных с клеточной поверхностью, определяли с помощью вторичного антитела на проточном цитометре FACSCalibur (Becton Dickinson). ΔMFI, которое определяли как разность между MFI, измеренной при 4°С, и MFI, измеренной при 37°С, по истечении периода инкубации 4 часа, соответствовало количеству интернализированного антитела. ΔMFI представлено на фиг. 11А и 11В и в таблице 12. Процент интернализации при 10 мкг/мл антитела рассчитан как 100*(MFI при 4°С - MFI при 37°C)/MFI при 4°С и представлен в таблице 11. Максимум ΔMFI, рассчитанный для каждого химерного антитела (фиг. 11А и 11В), не показал никакой корреляции между группой и максимумом интернализации.

Чтобы определить, могут ли антитела, которые также распознают обезьяний IGF-1R, интернализовать этот рецептор, проводили такой же эксперимент по интернализации. Результаты, суммированные в таблице 13, показывают, что все проанализированные антитела способны опосредовать интернализацию обезьяньего IGF-1R.

Также оценивали кинетику уменьшения количества антитела, связанного с клеточной поверхностью. С этой целью клетки MCF-7 высевали в 96-луночные планшеты и инкубировали с 10 мкг/мл мышиного антитела в течение 20 минут при температуре 4°С. Затем клетки промывали для удаления несвязанного антитела и в средах при температуре 37°С в течение 10, 20, 30, 60 или 120 мин. В каждый момент времени клетки центрифугировали, а затем на льду метили поверхность вторичным противомышиным антителом IgG-Alexa488 для определения количества антитела, оставшегося на поверхности клетки. Интенсивность флуоресценции для каждого мышиного антитела и для каждой временной точки нормировали по сигналу, полученному при 4°С (% оставшегося IGF-1R), и подводили к экспоненциальному затуханию, чтобы определить период полужизни (t1/2). t1/2 рассматривали как время, необходимое для получения уменьшения на 50% сигнала, измеренного при 4°С. Как показано на фиг. 12А и 12В, поверхностный уровень всех мышиных антител быстро падал в течение первых 30 минут, и снижение было почти максимальным через 60 минут инкубации (фиг. 12А). Рассчитанный период полужизни находился в диапазоне от 10 до 18 мин касательно мышиного антитела (фиг. 12В). Между распадом антитела на поверхности и группой антител не было выявлено никакой корреляции.

Для того, чтобы подтвердить, что уменьшение сигнала с клеточной поверхности обусловлено интернализацией антитела, а не слущиванием рецептора, клетки инкубировали с мышиными антителами в течение 0, 30 и 60 мин при 37°С (фиг. 13). Затем клетки фиксировали и пермеабилизовали или не пермеабилизовали для того, чтобы определить сигнал от антитела, связанного с клеточной поверхностью (без пермеабилизации), и общий сигнал от антитела, который соответствует антителу, связанному с клеточной поверхностью + интернализированному антителу (с пермеабилизацией). Количество интернализированного антитела (цитоплазматический сигнал) определяли следующим образом: MFI после пермеабилизации - MFI без пермеабилизации. Этот эксперимент показал, что уменьшение антитела, связанного с клеточной поверхностью, было связано с увеличением цитоплазматических антител, доказывая, что антитела были интернализованы (фиг. 13). Кроме того, деградация антител начиналась через 1 ч инкубации, что показано уменьшением сигнала после пермеабилизации (общий сигнал).

Пример 9: Исследование интернализации IGF-1R после связывания созданных анти-IGF-1R-антител путем конфокальных анализов

Для дальнейшего подтверждения интернализации антител проводили конфокальную микроскопию, чтобы оценить субклеточное распределение антител после клеточного перемещения. Клетки инкубировали с анти-hIGF-IR-антителами при 37°С, фиксировали и пермеабилизировали. Затем клетки окрашивали с помощью вторичного антитела Alexa-488 и кроличьего анти-Lamp-1-антитела, которое обнаруживали с помощью вторичного противокроличьего антитела IgG, конъюгированного с Alexa 555. Перед инкубацией при 37°С мышиное антитело 208F2 локализовали на мембране клеток MCF-7 (фиг. 14А), и при использовании плагина для выделения колокализации в программном обеспечении Image J с лизосомным маркером, lamp-1, колокализация не была замечена. Количество связанных с поверхностью клетки антител резко уменьшалось после 15-минутной инкубации. Одновременно с уменьшением количества антитела, связанного с клеточной поверхностью, внутриклеточное антитело определялось в везикулах. Можно было наблюдать редкую колокализацию с lamp-1. После 30-минутной инкубации антитело, связанное с клеточной поверхностью, почти не обнаруживалось. Тем не менее, колокализация антитела в лизосомах увеличивалась. Через 1 ч инкубации внутриклеточное окрашивание антитела уменьшалось, как и уровень колокализации с lamp-1. Кинетика антитела, связанного с клеточной поверхностью, и его внутриклеточное накопление коррелировало с кинетикой распада поверхностного антитела, измеренной путем FACS. Кроме того, как уже было описано в FACS-исследованиях, деградация мышиных антител начиналась через 1 ч инкубации по результатам конфокальной микроскопии.

Также оценивали интернализацию всех других мышиных анти-hIGF-IR-антител и их колокализацию с lamp-1 (фиг. 14В).

Пример 10: Ингибирование деградации антител с помощью лизосомального ингибитора, бафиломицина А1

Для того чтобы подтвердить, что антитела, которые достигли лизосомы, были деградированы, клетки обрабатывали или не обрабатывали бафиломицином А1, сильным ингибитором лизосомфальной функции. Затем клетки инкубировали с 10 мкг/мл анализируемого антитела при 4°С, промывали и инкубировали в течение 2 ч при 37°С. Интернализированное антитело обнаруживали после клеточной пермеабилизации с использованием вторичного противомышиного антитела IgG-Alexa 488. Добавление бафиломицина А1 предотвращало деградацию внутриклеточного антитела (фиг. 15), что указывало на то, что антитела были эффективно интернализованы и деградировали в лизосомах.

Пример 11: Влияние рН на связывание IGF-1R-антитела и корреляция с цитотоксической активностью

Поскольку антитела выбирали на основании их потенциала интернализации, и ранее была показана колокализация с ранними эндосомами перед входом в лизосомальный компартмент, интересующий подход заключался в выборе антител, для которых стабильность связывания "hIGF-1R - антитело" модулируется относительно рН среды, и предпочтительными являются такие антитела, которые предпочтительно диссоциируют от IGF-1R, когда рН среды становится кислым. В самом деле, основное различие между ранними эндосомами и лизосомами заключается в их полостном рН. в эндосомальном компартменте рН составляет примерно 6, в то время как в лизосомальном компартменте рН составляет примерно 4,5.

Хорошо известно, что hIGF-IR, однажды интернализированный после связывания лиганда (IGF1), возвращается обратно на поверхность клетки через путь рециркуляции.

Без связи с какой-либо теорией, описанная в данном документе гипотеза заключается в том, что антитела, более склонные к раннему освобождению от их мишеней при кислом рН, вероятно, будут благоприятствовать рециркуляции мишени к мембране, и, следовательно, их можно рассматривать в качестве более подходящих кандидатов для подходов с использованием иммуноконъюгатов. Для того чтобы исследовать некоторые из наших антител, демонстрирующих такое свойство, и чтобы соотнести это свойство с цитотоксической активностью, было проведено связывание мышиных анти-hIGF-IR-MKA на клеточной линии MCF-7 в буферах с различными значениями рН. Возрастающие концентрации мышиных МКА инкубировали на клеточной линии MCF-7 в течение 20 минут при 4°С и при различных рН в диапазоне от 5 до 8. Затем эти клетки промывали 3 раза и инкубировали с соответствующим вторичным антителом, конъюгированным с Alexa 488, в FACS-буфере. Клетки инкубировали в течение 20 дополнительных минут при 4°С в темноте, а затем промывали 3 раза FACS-буфером. Связывание анти-hIGF-1R-антител немедленно проводили на жизнеспособных клетках, которые идентифицировали с помощью пропидия йодида, который окрашивает мертвые клетки. ЕС₅₀ связывания выражали в молярности (М), которую рассчитывали с помощью нелинейного регрессионного анализа (GraphPad Prims 4.0).

ЕС₅₀ анти-hIGF-1R, принадлежащего к группе кластеров эпитопов 3В, по существу не зависела от рН (фиг. 16). Связывающая способность анти-hIGF-IR-антител, принадлежащих к группе кластеров эпитопов 3а, часто усиливалась при кислом рН. Напротив, связывающая способность анти-hIGF-IR-антител, принадлежащих к группе кластеров эпитопов 1, 2 и 4, уменьшалась при кислом рН.

Для определения того, оказывает ли кислый рН положительное влияние на цитотоксичность, индуцированную иммуноконъюгатом, использовали коммерчески доступный анализ для человеческого Fab-ZAP (ATS BIO). Вкратце, клетки MCF7 высевали в количестве 2000 клеток/лунка в 96-луночные планшеты и оставляли на ночь для прикрепления. На следующий день клетки обрабатывали 0,45 мкг/мл Fab-ZAP и возрастающими концентрациями химерных анти-IGF-l R-антител. Моноклональное антитело c9G4, которое не связывается с поверхностью клетки, использовали в качестве отрицательного контроля. На 6-й день жизнеспособность клеток измеряли с помощью анализа CellTiter Glo Luminesence Cell Viability от Promega (Мэдисон, Висконсин). Как показано на фиг. 17А, анти-IGF-1R-антитела из групп 4 и 5 не индуцировали никакую цитотоксичность на клетках MCF-7, в то время как в остальных группах была измерена цитотоксичностиь от умеренной (группы 1, 3а и 3b) до высокой (группа 2). На фиг. 17В определение IC₅₀ показало, что группа 2 имеет самую высокую цитотоксическую активность, подтверждая, что эти антитела будут наиболее подходящими для подхода с использованием ADC (конъюгат "антитело - лекарственное средство") или АТС.

Результаты, представленные на фиг. 17, показали, что среди 15 оцениваемых химерных МКА лучшего цитотоксического эффекта достигли C208F2, C219D5, с212А11, с213В10 и C214F8, при этом все они принадлежат к группе 2. Тем не менее, другие антитела из группы 1 и 4, которые также демонстрировали чувствительность к кислому рН при связывании IGF-1R, не были кластеризованы как лучшие кандидаты для цитотоксичности, подтверждая, что это свойство может быть необходимым, но не достаточным для объяснения конкретных свойств антител из группы 2. Для того чтобы лучше понять особые характеристики этого набора антител, были проведены исследований корреляций касательно данных, имеющихся для всех созданных антител. Результаты этого анализа подтвердили, что и ингибирование фосфорилирования, и снижение способности связывания с hlGF-1R при кислом рН среды необходимы, чтобы получить лучшую цитотоксическую активность (фиг.18). Действительно, 101Н8 (G1), 201F1 (G1) и 105G2 (G4), связывание которых было снижено в кислой среде, но которые были плохими ингибиторами фосфорилирования, показали низкие цитотоксические активности. С другой стороны, 102Н8 (G3a), 110G9 (G3a), 415А8 (G3a), 410G4 (G3b), 414E1 (G3b) и 433H9 (G3b) были мощными ингибиторами IGF1-индуцированного фосфорилирования, но были не чувствительными к изменению рН или такими, чье связывание усиливалось при кислом рН, показывая лишь умеренную цитотоксическую активность в анализе для человеческого Fab-ZAP.

Связывание гуманизированных анти-IGF-1R-MKA на клеточной линии MCF-7 было проведено в буферах с различными значениями рН. Возрастающие концентрации гуманизированных МКА инкубировали на клеточной линии MCF-7 в течение 20 мин при 4°С и при различных рН в диапазоне от 5 до 8. Затем эти клетки промывали 3 раза и инкубировали с соответствующим вторичным антителом, конъюгированным с Alexa 488, в FACS-буфере. Клетки инкубировали в течение 20 дополнительных минут при 4°С в темноте, а затем промывали 3 раза FACS-буфером. Связывание анти-IGF-1R-антител немедленно проводили на жизнеспособных клетках, которые идентифицировали с помощью пропидия йодида, который окрашивает мертвые клетки. ЕС₅₀ связывания выражали в молярности (М), которую рассчитывали с помощью нелинейного регрессионного анализа (GraphPad Prims 4.0). Гуманизированные анти-IGF-1R-антитела показали более низкую связывающую способность при кислом рН, как показано на фиг. 32А и 32В.

Пример 12: Оценка гуманизированных форм МКА 208F2

12.1 Оценка связывания и интернализации первой гуманизированной формы hz208F2 VH3/VL3 (также упоминаемой как hz208F2 H026/L024)

Связывание первой гуманизированной формы МКА C208F2 оценивали на клеточных линиях MCF-7, COS-7 и NIH-3T3 IR⁺. Возрастающие концентрации m208F2, c208F2 или hz208F2 VH3VL3 добавляли к каждой клеточной линии в течение 20 минут при 4°С. Затем клетки промывали и связывание анализируемого МКА обнаруживали с помощью соответствующего вторичного антитела. Для валидации экспрессии человеческого IR на трансфицированной клеточной линии использовали коммерческое анти-hIR-антитело, клон GRO5, и его профиль распознавания, проиллюстрированный на фиг. 19D.

Сравнение гуманизированной формы либо с мышиной, либо с химерной формой на MCF-7 (фиг. 19А) или обезьяньих клетках COS-7 (фиг. 19В) показало близкие профили для трех проанализированных форм. Процесс гуманизации не изменял специфичность распознавания антитела, которая была отлично сравнима с мышиной и химерной формами касательно отсутствия перекрестной реактивности с рецептором человеческого инсулина (фиг. 19С).

Рассчитанные ЕС₅₀ первой гуманизированной формы C208F2 на линии клеток человека MCF-7 и линии клеток обезьяны COS-7 были похожи на те, которые были определены для мышиной или химерной формы 208F2.

Способность МКА hz208F2 VH3/VL3 быть интернализированным оценивали с помощью проточной цитометрии. Клетки MCF-7 инкубировали с 10 мкг/мл антител при 4°С в течение 20 мин. Затем клетки промывали и инкубировали при 4°С или 37°С в течение 4 ч. Количество антител, связанных с клеточной поверхностью, определяли с помощью вторичного антитела. ΔMFI, которое определяли как разность между MFI, измеренной при 4°С, и MFI, измеренной при 37°С, по истечении периода инкубации 4 часа, соответствовало количеству интернализированного антитела. ΔMFI представлено в таблице 14а. Процент интернализации при 10 мкг/мл антитела рассчитан как 100*(MFI при 4°С - MFI при 37°C)/MFI при 4°С и представлен в таблице 14а. Таким образом, гуманизированное hz208F2 VH3/VL3 имело свойства связывания и интернализации, сходные с измеренными у соответствующего мышиного и химерного антител 208F2.

12.2 Оценка связывания последующих гуманизированных форм hz208F2

МКА 208F2 гуманизировали и оценивали связывающие свойства шестнадцати гуманизированных вариантов (в том числе первой формы, описанной в 12.1). Связывающие свойства гуманизированных вариантов оценивали путем FACS-анализов на клеточной линии человеческой аденокарциномы молочной железы MCF-7 и линии клеток обезьяны COS-7 с использованием возрастающих концентраций антител. Для этой цели клетки (1*106 клеток/мл) инкубировали с гуманизированными анти-IGF-1R-антителами в течение 20 минут при 4°С в FACS-буфере (PBS, 0,1% BSA, 0,01% NaN₃). Затем эти клетки промывали 3 раза и инкубировали с соответствующим вторичным антителом, конъюгированным с Alexa 488, в течение 20 дополнительных минут при 4°С в темноте, а затем промывали 3 раза FACS-буфером. Связывание анти-IGF-1R-антител немедленно проводили на жизнеспособных клетках, которые идентифицировали с помощью пропидия йодида (который окрашивает мертвые клетки). ЕС₅₀ связывания выражали в молярности (М), которую рассчитывали с помощью нелинейного регрессионного анализа (GraphPad Prims 4.0).

ЕС₅₀ гуманизированных вариантов показали, что все гуманизированные варианты демонстрируют эквивалентные связывающие свойства как на человеческой, так и на обезьяньей линии клеток.

ЕС₅₀ гуманизированных антител суммированы в таблице 14b.

12.3 Оценка интернализации другой гуманизированной формы hz208F2

Клетки MCF-7 инкубировали с 10 мкг/мл гуманизированных антител при 4°С в течение 20 мин. Затем клетки промывали и инкубировали при 4°С или 37°С в течение 4 ч. Количество антител, связанных с клеточной поверхностью, определяли с помощью вторичного антитела на проточном цитометре FACSCalibur (Becton Dickinson). ΔMFI, которое определяли как разность между MFI, измеренной при 4°С, и MFI, измеренной при 37°С, по истечении периода инкубации 4 часа, соответствовало количеству интернализированного антитела. ΔMFI представлено в таблице 14 с. Процент интернализации при 10 мкг/мл антитела рассчитан как 100*(MFI при 4°С - MFI при 37°C)/MFI при 4°С. Гуманизированное антитело hz208F2 H077/L018 способно индуцировать значительную интернализацию IGF-1R.

Пример 13: IGF-1R в качестве мишени для подхода с применением иммуноконъюгатов

IHC-исследования были разработаны для того, чтобы валидировать hIGF-1R в качестве мишени для подхода с применением иммуноконъюгатов. Действительно, полезная мишень для такого подхода требует значительной сверхэкспрессии на опухолевых клетках по сравнению с нормальными клетками. Еще одно свойство подходящей мишени для подхода с применением иммуноконъюгатов заключается в ее превалирующей сверхэкспрессии у значительного процента пациентов в популяции при многих показаниях.

Для того, чтобы оценить, можно ли рассматривать hIGF-IR в качестве подходящей мишени для подхода с применением иммуноконъюгатов, было выбрано коммерчески доступное поликлональное антитело (AF305-NA от R&D Systems), описанное как специфический внеклеточный домен (EDC) hIGF-IR, в сравнении с hIR. Первым этапом нашего процесса было проверить специфичность AF305-NA в отношении MGF-1R ECD и отсутствие распознавания hIR. С этой целью был выполнен ряд тестов ELISA на человеческих белках IGF-1R и hIR ECD с использованием протоколов, уже описанных выше.

Результаты, описанные на фиг. 20А, показали, что поликлональное анти-hIGF-IR-антитело эффективно распознавало hIGF-1R ECD. Антитело GR11L (Calbiochem), которое использовали в качестве положительного контроля, давало ожидаемый профиль. Как было описано, на фиг. 20В показано, что AF305-NA не распознает hIR в отличие от анти-hIR-MKA GRO5 (Calbiochem), используемого в качестве положительного контроля в ELISA. Точно так же оценка связывания поликлонального AF305-NA на hIR⁺-трансфицированных клетках путем FACS-анализа подтвердила, что оно не распознает клеточную форму hIR (фиг. 20D), в то время как анти-hIR-антител о GRO5 (фиг. 20С) представляло ожидаемый профиль на трансфицированных клетках, демонстрируя, что они экспрессируют hIR на высоком уровне. Как и ожидалось, GR11L, распознающий hIGF-1R и введенный в эксперимент в качестве отрицательного контроля, не показывает никакого сигнала на hIR⁺-трансфицированных клетках (фиг. 20С)

Когда антитело AF305-NA было полностью валидировано для исследования распределения hIGF-1R, был разработан протокол IHC на Discovery Ultra autostainer Ventana. Вкратце, после депарафинизации проводили демаскировку антигена с помощью раствора СС1, соответствующего EDTA-буферу с рН 8, в течение 32 минут при температуре 96°С. Первичное антитело (AF305-NA) инкубировали в течение 1 ч при 37°С. После промывания инкубировали полимер HRP-Omap противокозлиный IgG (Ventana) в течение 16 минут при температуре 37°С, и затем выявляли с помощью хромогена DAB. Наконец, окрашивали ткани с использованием гематоксилина. Затем срезы заливали в среду Eukitt. Для валидации IHC-окрашивания была выбрана панель опухолевых тканей ксенотрансплантатов, касающаяся экспрессии hIGF-1R in vitro. Как показано на фиг. 21, сильное мембранозное окрашивание наблюдается в 3 положительных тканях (MCF-7, NCI-H23 и NCI-H82). Мембранозное окрашивание не наблюдалось в опухоли Hs746t, выбранной в качестве отрицательного контроля. Для анализа окрашивания срезы сканировали с помощью сканера НТ от Roche Ventana, и окрашивание IGF-1R количественно оценивали с использованием программного обеспечения Virtuoso (Roche Ventana). Для анализа ткани оценивали 4 поля зрения (fields of view, FOV) в каждой опухоли, когда это было возможно, с более чем 50 клетками с целью повышения статистической точности алгоритма. Ткани оценивали как +++ (также обозначается как 3+), от ++ до +++ (также обозначается как от 2+ до 3+ или ++/+++), ++ (также обозначается как 2+), + (также обозначается как 1+) в соответствии с мембранозным алгоритмом HER2. Оценку проводили согласно руководству для тестирования CAP/ASCO как (+) для слабого или неполного окрашивания мембраны или слабого полного окрашивания мембраны в менее чем 10% клеток в образце. Оценка (++) описывалась как полное окрашивание мембраны, которое является неоднородным или слабым, но с очевидным периферическим распределением по меньшей мере в 10% клеток, или как интенсивное полное мембранное окрашивание 30% или менее опухолевых клеток. Оценка (+++) соответствует равномерному интенсивному окрашиванию мембраны более 30% инвазивных опухолевых клеток. Если оценка опухоли составляла от (++) до (+++), это означало гетерогенность в проанализированной опухолевой ткани, (-) означает, что не было обнаружено никакой экспрессии hIGF-1R, а (с) означает, что окрашивание было исключительно цитоплазматическим. Цитоплазматическое окрашивание характеризуется отсутствием мембранозного окрашивания, которое имеют отдельные клетки.

Затем проводили углубленное исследование на нормальных и опухолевых тканях с использованием описанного выше протокола (фиг. 22А и В).

Для этих исследований были использованы человеческие нормальные и опухолевые ТМА от Superbiochips для проведения исследований по распределению и распространенности. Два различных контроля были введены в каждый цикл автоокрашивания. Один контроль состоял из срезов плаценты, известной как положительный контроль на предмет экспрессии IGF-1R и предоставленной с нормальными тканями ТМА. Вторая серия контролей состояла из трех срезов тканей опухолевых ксенотрансплантатов, представляющих оценку 2+ или 3+ (MCF-7 и NCI-H23, NCI-H82, соответственно). Этот последний контроль добавляли в каждом цикле окрашивания для калибровки экспрессии.

Как и следовало ожидать, плацента и ткани от ксенотрансплантатов были положительными в отношении hIGF-1R. В этих 4 контролях наблюдалось сильное мембранозное окрашивание. В первой панели нормальных тканей человека (фиг. 22А) в желудочно-кишечном тракте (пищевод, тонкая кишка, толстая кишка и прямая кишка) наблюдалось незначительное мембранозное обнаружение IGF-1R, которое никогда не превышало 1+. Во всех остальных анализируемых тканях мембранозная экспрессия IGF-1R не наблюдалась. Во второй панели нормальных тканей человека (фиг. 22В) легкое мембранозное обнаружение IGF-1R, никогда не превышающее 1+, наблюдалось в почечных структурах. Сильное мембранное окрашивание (++) наблюдалось в эпителии предстательной железы и в уротелии. За исключением этих обеих тканей сильное мембранозное окрашивание не наблюдалось. Этот паттерн экспрессии значительно подтвердил, что hIGF-IR может быть хорошей мишенью для подходов с применением ADC или АТС.

Для того чтобы определить потенциальные показания к применению иммуноконъюгатов, нацеленных на IGF-1R, были проанализированы образцы от пациентов с опухолью легких, молочной железы, головы и шеи, мочевого пузыря и почек на предмет экспрессии ими IGF-1R с использованием протокола, описанного выше.

Из 69 исследованных образцов легких 67 случаев были интерпретированы. Экспрессию IGF-1R оценивали количественно, как описано выше. Как показано на фиг. 23, сильнае мембранозная экспрессия обнаруживается на многих карциномах по сравнению с нормальными окружающими тканями, которые являются отрицательными в соответствии с тем, что мы уже описали выше на нормальных тканях. Все проанализированные случаи суммированы в таблице 15. Наблюдалось 55% случаев с оценкой ++ или +++, включая все подтипы рака легких. Плоскоклеточные карциномы легких были наиболее высоко экспрессирующими hIGF-IR опухолями с 70% случаев с оценкой ++, ++/+++ или +++ и 43% случаев, содержащих только опухоли +++ и ++/+++. Эти результаты согласуются с литературными данными, описывающими частые высокие полисомии или амплификации hIGF-IR у пациентов с плоскоклеточной карциномой легкого.

Другое исследование экспрессии IGF-1R проводили на серии из 10 образцов рака молочной железы. Результаты показаны на фиг. 24, которая показывает, что IGF-1R высоко экспрессируется в раковых тканях по сравнению с окружающими нормальными тканями. Данные по окрашиванию суммированы в таблице 16, которая показывает, что 66% проанализированных случаев имели оценку ++, ++/+++ или +++, а 22% проанализированных случаев имели оценку +++ или ++/+++.

Наконец, сверхэкспрессия IGF-1R была показана в серии опухолей, включая опухоли головы и шеи, мочевого пузыря и почек (фиг. 25). Опять же, высокая сверхэкспрессия IGF-1R была отмечена в образцах опухолей по сравнению с нормальными окружающими тканями.

Взятые вместе, эти результаты согласуются с подходом с применением иммуноконъюгатов для лечения многих IGF-1R-положительных опухолей, в том числе опухолей легких, молочной железы, головы и шеи, мочевого пузыря и почек.

Пример 14: Определение константы диссоциации (K_D) связывания пяти химерных анти-IGF-1R-антител (c208F2, с213В10, с212А11, C214F8 и с219Р6) и гуманизированной версии (VH3/VL3) антитела 208F2 на растворимом рекомбинантном человеческом IGF-1R

Константы диссоциации (K_D) связывания антител на рекомбинантном растворимом человеческом IGF-1R определяли по соотношению между скоростью диссоциации (k_off) и скоростью ассоциации (k_on). Кинетические эксперименты проводили на устройстве Biacore X100 с использованием сенсорного чипа СМ5, активированного мышиным моноклинальным анти-His-Tag-антителом. Примерно 12000 РЕ антител химически присоединяли к карбоксиметилдекстрановой матрице с использованием набора для аминовой химической реакции.

Эксперименты проводили при 25°С со скоростью потока 30 мкл/мин с использованием буфера HBS-EP+ (GE Healthcare) в качестве рабочего буфера и буфера для разведения образцов.

Кинетическую схему с одним циклом использовали для определения кинетических параметров связывания анти-IGF-1R-антител на растворимом рекомбинатном человеческом hIGF-1R, захваченном с помощью двух его С-концевых 10-His-меток.

1 - Раствор растворимого рекомбинатного варианта человеческого гетеротетрамера hIGF-IR: цепи 2α и внеклеточные домены цепей 2β, экспрессированные с дополнительной С-концевой 10-His-меткой (R&D Systems, кат. номер 305-GR-50) вводили в течение 1 минуты во вторую проточную ячейку в концентрации 10 мкг/мл. В среднем 587 РЕ (со стандартным отклонением 24 РЕ) растворимого рецептора было захвачено в каждом из 24 циклов, реализованных в данном исследовании.

2 - После фазы захвата в обе проточные ячейки вводили либо рабочий буфер 5 раз (каждое введение по 90 с), либо возрастающий диапазон из 5 концентраций одного из шести антител (каждое введение по 90 с). В конце пятого введения рабочий буфер прогоняли в течение 5 минут для определения скорости диссоциации.

3 - Затем поверхность подвергали регенерации введением буфера с 10 мМ глицином, HCl, рН 1,5, в течение 45 с.

Вычисленный сигнал соответствует разности между ответом из проточной ячейки 2 (с захваченным IGF-1R) и ответом из проточной ячейки 1 (без каких-либо молекул IGF-1R).

Для каждого IGF-1R сигнал от введения возрастающего диапазона концентраций одного антитела корректировали путем вычитания сигнала, полученного с 5 введениями буфера (двойной референс), см. фиг. 26.

Полученные сенсограммы анализировали с использованием программного обеспечения BIAevaluation с моделью 1:1.

Для каждого антитела были проведены четыре опыта с использованием двух различных диапазонов концентраций: 40, 20, 10, 5 и 2,5 нМ для двух первых экспериментов и 24, 12, 6, 3 и 1,5 нМ для двух последних экспериментов для каждого антитела.

В этом эксперименте для 6 анализируемых антител экспериментальные данные подводили с моделью 1:1 со значительными значениями k_off, когда более высокая концентрация была определена как константа, а остальные четыре концентрации вычислены (см. фиг. 27).

Константы диссоциации (K_D), рассчитанные как отношение: k_off/k_on, и периоды полужизни комплексов, рассчитанные как отношение Ln(2)/k_off, представлены на фиг. 28 и 29. Они соответствуют среднему значению от четырех независимых экспериментов, проведенных для каждого антитела. Столбцы ошибок соответствуют стандартным ошибкам (n=4) значений.

Константы диссоциации находятся в диапазоне от 10 до 100 пМ. Антитело C208F2 показывает более слабую аффинность (более высокое значение константы диссоциации) в отношении hIGF-1R (с K_D примерно 75 пМ), а его гуманизированный вариант является по меньшей мере таким же хорошим, как химерный вариант (с K_D примерно 60 пМ). Четыре других химерных анти-IGF-1R-антитела показывают весьма похожую аффинность в отношении hlGF1-R (с K_D примерно 30 пМ). Разница в аффинности главным образом связана со скоростью диссоциации или результирующим периодом полужизни комплексов. У 208F2 период полужизни комплекса составляет от 2 до 3 ч для химерной и гуманизированной (VH3/VL3) версий. Для четырех других химерных антител средние периоды полужизни составляют от 7,0 до 9,4 ч.

Эти очень низкие значения кинетики диссоциации однозначно связаны с двухвалентной структурой антител, которые способны связываться одновременно обеими своими Fab-ветвями с двумя соседними h-IGF-1R-молекулами. В этом случае уровень захваченных молекул IGF-1R может оказать влияние на скорость диссоциации. Аффинности, определенные в данном исследовании, соответствуют функциональным аффинностям (или авидностям) антител на уровне захваченного h-IGF-1R примерно 600 РЕ. 3-кратная разница K_D, которая наблюдалась между данными, приведенными выше (таблица 10), и значениями, представленными в примере 13, связана с изменением уровня захвата hIGF-1R (600РЕ по сравнению с 160 РЕ в примере 5).

Пример 15: Определение мышиных IGF-1R-специфических остатков, которые предотвращают связывание C208F2, с использованием растворимых форм химерных h/m рекомбинантных белков IGF-1R

Связывание растворимых форм химерных h/m рекомбинантных белков IGF-1R в экспериментах с антителом C208F2 выполняли на устройстве Biacore Х100 с использованием сенсорного чипа СМ5, активируемого мышиным противочеловеческим IgG Fc моноклональным антителом. Более 10500 РЕ анти-Fc-антитела химически присоединяли к карбоксиметилдекстрановой матрице обеих проточных ячеек с использованием набора для аминовой химической реакции.

Эксперименты проводили при 25°С со скоростью потока 30 мкл/мин с использованием буфера HBS-EP+ в качестве рабочего буфера и буфера для разведения образцов.

Условия эксперимента были следующими:

1 - Раствор C208F2 в концентрации 10 мкг/мл вводили в течение 60 с во вторую проточную ячейку.

2 - Анализируемые конструкции IGF-1R соответствовали концентрированным супернатантам культуральной среды, разведенным в 10 раз в рабочем буфере. Одну конструкцию вводили в каждом цикле в течение 120 сек с задержкой 120 сек.

3 - Обе проточные ячейки подвергали регенерации путем введения буфера с 10 мМ глицином, HCl, рН 1,5, в течение 30 с.

На фиг. 30 показано наложение двух циклов. В течение первого и второго циклов, соответственно, вводили супернатанты h-IGF-1R и m-IGF-1R. Этот эксперимент наглядно показывает неспособность m-IGF-1 связываться с позициями антитела C208F2, используемыми для определения уровня захвата C208F2, и уровень связывания IGF-1R помечен двунаправленными стрелками.

Внеклеточные домены IGFR (без сигнального пептида) состоят из 805 и 806 аминокислот для человеческой и мышиной последовательности, соответственно.

869 остатков (96%) являются одинаковыми в обеих структурах. 37 остатков мышиной последовательности отличаются от соответствующей человеческой последовательности. Одно из отличий соответствует разрыву.

Как показано на фиг. 31, среди семи химерных проанализированных конструкций четыре (С1 (SEQ ID NO 83), С4 (SEQ ID NO 86), C7 (SEQ ID NO 88) и C8 (SEQ ID NO 89)) связываются, как и h-IGF-1R, с C208F2, три конструкции (С2 (SEQ ID NO 84), C3 (SEQ ID NO 85) и C6 (SEQ ID NO 87)), как и mIGF-1R (SEQ ID NO 91), не связываются с C208F2.

Связывание C1 и отсутствие связывания С2 подтверждает, что мышиные специфические остатки, блокирующие связывание C208F2, расположены на N-концевой половине белка. Таким образом, последние одиннадцать специфических мышиных аминокислот, расположенные в С-концевой половине, не имеют никакого влияния на связывание C208F2.

Отсутствие связывания С3 демонстрирует большой вклад одного мышиного специфического остатка Arg вместо His в позиции 494. Этот результат подтверждается отсутствием связывания С6, который содержит два мышиных специфических остатка: His494>Arg и Ser501>Trp.

Связывание С4 подтверждает, что только мышиный специфический остаток Trp в позиции 501 данного химерного IGF-1R не несет ответственности за отсутствие связывания С2 и С6.

Связывание С7 подтверждает, что ни один из 17 мышиных специфических остатков, присутствующих в этих конструкциях, не имеет никакого влияния на блокирование связывания C208F2.

Точно так же связывание С8 исключает 4 других мышиных специфических остатка.

С12-мутант человеческого IGF1R, который имеет три мышиных остатка в домене L1, т.е. Phe в позиции 28 вместо Tyr, IIe в позиции 125 вместо Val и Leu в позиции 156 вместо Met, связывает C208F2 с субнаномолярной константой диссоциации. Этот эксперимент подтверждает, что домен L1 не участвует в связывании антитела, или что по меньшей мере 3 позиции, которые отличаются в мышиной и человеческой последовательностях, не несут ответственности за отсутствия связывания антитела с мышиной формой IGF1R.

Как показано на фиг. 33, hz208F2 не способно связываться с 120 РЕ мутанта С29 (Asp491>Ala) растворимой формы h-IGF1, захваченной на сенсорном чипе СМ5 через его С-концевую 6His-метку (белые ромбы), тогда как тот же раствор антитела четко связывает (черные ромбы) до 170 РЕ формы растворимого рецептора дикого типа. Как и His 494, Asp 491 имеет решающее значение для аффинности hz208F2 в отношении IGF1R. Кристаллографические данные показывают, что оба остатка экспонированы на поверхности рецептора в домене FnR3.

В совокупности эти результаты показывают, что hz208F2 связывается с доменом FnR3 IGF-1R, и эпитоп, распознаваемый этим антителом, содержит His 494 и Asp 491, которые имеют решающее значение для связывания антитела.

1. Интернализированное моноклональное антитело или его интернализированный IGF-1R-связывающий фрагмент, которое связывается с человеческим рецептором инсулиноподобного фактора роста 1 (IGF-1R) последовательности SEQ ID NO 52 и интернализируется после связывания с IGF- 1R и которое не связывается с IGF-1R последовательности SEQ ID NO 82 и/или SEQ ID NO 92, где указанное антитело содержит: три CDR тяжелой цепи последовательностей SEQ ID NO 7, 2 и 3 и три CDR легкой цепи последовательностей SEQ ID NO 9, 5 и 11, где указанные CDR определены согласно IMGT.

2. Интернализированное моноклональное антитело по п. 1 или его интернализированный IGF-1R-связывающий фрагмент, где эпитоп указанного интернализированного моноклонального антитела содержит аминокислоту гистидин в позиции 494 последовательности SEQ ID NO 52 и/или аминокислоту аспарагиновую кислоту в позиции 491 последовательности SEQ ID NO 52.

3. Интернализированное моноклональное антитело по п. 2 или его интернализированный IGF-1R-связывающий фрагмент, в котором указанный эпитоп содержит аминокислотную последовательность, состоящую по меньшей мере из 8 аминокислот.

4. Интернализированное моноклональное антитело по п. 1 или его интернализированный IGF-1R-связывающий фрагмент, процент интернализации которого после его связывания с IGF-1R составляет по меньшей мере 40%.

5. Интернализированное моноклональное антитело по п. 1 или его интернализированный IGF-1R-связывающий фрагмент, в котором указанная аминокислота в позиции 494 последовательности SEQ ID NO 52, отличающаяся от гистидина, представляет собой аргинин и/или указанная аминокислота в позиции 491 последовательности SEQ ID NO 52, отличающаяся от аспарагиновой кислоты, представляет собой аланин.

6. Интернализированное моноклональное антитело по п. 1, где указанное антитело является химерным антителом.

7. Интернализированное антитело по п. 6, где указанное антитело выбрано среди следующих: а) антитело, содержащее вариабельный домен тяжелой цепи последовательности SEQ ID NO 13 или любой последовательности, которая демонстрирует по меньшей мере 80% идентичность с SEQ ID NO 13, и три CDR легкой цепи последовательностей SEQ ID NO 9, 5 и 11; и b) антитело, содержащее вариабельный домен легкой цепи последовательности SEQ ID NO 18 или любой последовательности, которая демонстрирует по меньшей мере 80% идентичность с SEQ ID NO 18, и три CDR тяжелой цепи последовательностей SEQ ID NO 7, 2 и 3.

8. Интернализированное антитело по п. 6 или 7, где указанное антитело содержит или состоит из тяжелой цепи последовательности SEQ ID NO 23 и легкой цепи последовательности SEQ ID NO 28.

9. Интернализированное антитело по п. 1, где указанное антитело представляет собой гуманизированное антитело.

10. Интернализированное антитело по п. 9, где указанное антитело содержит: а) тяжелую цепь, имеющую CDR-H1, CDR-H2 и CDR-H3 последовательностей SEQ ID NO 7, 2 и 3 соответственно, и FR1, FR2 и FR3, полученные из IGHV1-46*01 зародышевой линии человека (SEQ ID NO 44), и FR4, полученный из IGHJ4*01 зародышевой линии человека (SEQ ID NO 46); и b) легкую цепь, имеющую CDR-L1, CDR-L2 и CDR-L3 последовательностей SEQ ID NO 9, 5 и 11 соответственно, и FR1, FR2 и FR3, полученные из IGKV1-39*01 зародышевой линии человека (SEQ ID NO 45), и FR4, полученный из IGKJ4*01 зародышевой линии человека (SEQ ID NO 47).

11. Интернализированное антитело по п. 10, где указанное антитело выбрано среди следующих: а) антитело, содержащее вариабельный домен тяжелой цепи последовательности SEQ ID NO 33 или любой последовательности, которая демонстрирует по меньшей мере 80% идентичность с SEQ ID NO 33, и три CDR легкой цепи последовательностей SEQ ID NO 9, 5 и 11; b) антитело, содержащее вариабельный домен тяжелой цепи последовательности SEQ ID NO 34 или любой последовательности, которая демонстрирует по меньшей мере 80% идентичность с SEQ ID NO 34, и три CDR легкой цепи последовательностей SEQ ID NO 9, 5 и 11; и c) антитело, содержащее вариабельный домен тяжелой цепи последовательности, выбранной среди SEQ ID NO 56, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76, 78 и 80, или любой последовательности, которая демонстрирует по меньшей мере 80% идентичность с SEQ ID NO 56, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76, 78 и 80, и три CDR легкой цепи последовательностей SEQ ID NO 9, 5 и 11.

12. Интернализированное антитело по п. 10, где указанное антитело выбрано среди следующих: а) антитело, содержащее вариабельный домен легкой цепи последовательности SEQ ID NO 35 или любой последовательности, которая демонстрирует по меньшей мере 80% идентичность с SEQ ID NO 35, и три CDR тяжелой цепи последовательностей SEQ ID NO 7, 2 и 3; b) антитело, содержащее вариабельный домен легкой цепи последовательности SEQ ID NO 36 или любой последовательности, которая демонстрирует по меньшей мере 80% идентичность с SEQ ID NO 36, и три CDR тяжелой цепи последовательностей SEQ ID NO 7, 2 и 3; и c) антитело, содержащее вариабельный домен легкой цепи последовательности, выбранной среди SEQ ID NO 57 и 60, или любой последовательности, которая демонстрирует по меньшей мере 80% идентичность с SEQ ID NO 57 или 60, и три CDR тяжелой цепи последовательностей SEQ ID NO 7, 2 и 3.

13. Интернализированное антитело по п. 10, где указанное антитело выбрано среди следующих: а) антитело, содержащее тяжелую цепь последовательности SEQ ID NO 37 или любой последовательности, которая демонстрирует по меньшей мере 80% идентичность с SEQ ID NO 37, и легкую цепь последовательности SEQ ID NO 39 или любой последовательности, которая демонстрирует по меньшей мере 80% идентичность с SEQ ID NO 39; b) антитело, содержащее тяжелую цепь последовательности SEQ ID NO 38 или любой последовательности, которая демонстрирует по меньшей мере 80% идентичность с SEQ ID NO 38, и легкую цепь последовательности SEQ ID NO 40 или любой последовательности, которая демонстрирует по меньшей мере 80% идентичность с SEQ ID NO 40; и c) антитело, содержащее вариабельный домен тяжелой цепи последовательности, выбранной среди SEQ ID NO 56, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76, 78 и 80, или любой последовательности, которая демонстрирует по меньшей мере 80% идентичность с SEQ ID NO 56, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76, 78 или 80, и вариабельный домен легкой цепи последовательности, выбранной среди SEQ ID NO 57 и 60, или любой последовательности, которая демонстрируют по меньшей мере 80% идентичность с SEQ ID NO 57 или 60.

14. Интернализированное антитело по п. 10, где указанное антитело содержит:

а) вариабельный домен тяжелой цепи (VH) последовательности SEQ ID NO 33, где указанная последовательность SEQ ID NO 33 содержит по меньшей мере 1 обратную мутацию, выбранную среди остатков 20, 34, 35, 38, 48, 50, 59, 61, 62, 70, 72, 74, 76, 77, 79, 82 и 95; а также b) вариабельный домен легкой цепи (VL) последовательности SEQ ID NO 35, где указанная последовательность SEQ ID NO 35 содержит по меньшей мере 1 обратную мутацию, выбранную среди остатков 22, 53, 55, 65, 71, 72, 77 и 87.

15. Интернализированное антитело по п. 1, где указанное антитело продуцируется гибридомой I-4757, депонированной в CNCM, Институт Пастера, Франция, 30 мая 2013 года.

16. Мышиная гибридома I-4757, депонированная в CNCM, Институт Пастера, Франция, 30 мая 2013 года, для получения антитела по п. 1.

17. Интернализированное моноклональное антитело по п. 1 или его интернализированный антигенсвязывающий фрагмент для применения в качестве адресующего переносчика для доставки цитотоксического агента в место-мишень хозяина, при этом указанное место-мишень хозяина состоит из эпитопа, локализованного во внеклеточном домене белка IGF-1R, предпочтительно во внеклеточном домене человеческого белка IGF-1R (SEQ ID NO 51), более предпочтительно на N-конце внеклеточного домена человеческого IGF-1R (SEQ ID NO 52), или в последовательности любого их природного варианта.

18. Конъюгат "антитело - лекарственное средство" для лечения экспрессирующего IGF-1R рака, содержащий интернализированное моноклональное антитело по п. 1 или его интернализированный антигенсвязывающий фрагмент, конъюгированный с цитотоксическим агентом.

19. Фармацевтическая композиция для лечения экспрессирующего IGF-1R рака, содержащая интернализированное моноклональное антитело по п. 1 или конъюгат "антитело - лекарственное средство" по п. 18 и по меньшей мере эксципиент и/или фармацевтически приемлемый носитель.

20. Конъюгат "антитело - лекарственное средство" по п. 18 или фармацевтическая композиция по п. 19 для применения для доставки лекарственного средства или медикамента к раковой клетке, экспрессирующей IGF-1R, у субъекта.

Изобретение относится к области биохимии, в частности к способу получения терапевтически активного слитого белка, содержащего группировку направленного взаимодействия с опухолью и, по меньшей мере, одну иммуномодулирующую группировку, а также к препарату для ослабления Т-клеточной активации в раковых клетках, содержащему эффективное количество гомогенных терапевтически активных слитых белков, полученных вышеуказанным способом.

Варианты fc-области с улучшенной способностью связываться с белком а // 2698969

Изобретение относится к области биотехнологии и может быть использовано для получения антител. Способ включает культивирование клетки-хозяина, содержащей нуклеиновые кислоты, кодирующие антитело в условиях, пригодных для экспрессии антитела, и выделение антитела из клетки или культуральной среды.

Слитые серпиновые полипептиды и способы их применения // 2698655

Настоящее изобретение относится к области иммунологии. Предложены способы очистки слитого белка.

Антитела к поверхностным детерминантам s. aureus // 2698131

Изобретение относится к области биохимии, в частности к фармацевтической композиции, содержащей выделенное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, которое специфично связывается с альфа-токсином (AT) S.aureus, и выделенное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, которое специфично связывается с антигеном S.aureus, являющимся поверхностной детерминантой, выбранным из группы, состоящей из IsdH и ClfA.

Особые моноклональные антитела антигена м метапневмовируса человека (hmpv) и способ их использования в методе диагностики // 2698052

Настоящее изобретение относится к биотехнологии, а именно к мышиным моноклональным антителам, которые соответствуют моноклональным антителам, выделяемым клеточными линиями гибридом 3G8/C11 и 7G4/A12, и которые реагируют на М-антиген hMPV.

Применение антагонистов il-17 для торможения прогрессирования структурных повреждений у пациентов с псориатическим артритом // 2697383

Настоящее изобретение относится к ингибированию прогрессирования структурных повреждений у пациентов с псориатическим артритом. Описан способ такого ингибирования, в котором ежемесячно подкожно вводят примерно 150 мг или примерно 300 мг анти-IL-17 антитела с соответствующими аминокислотными последовательностями VH и VL.

Антитела к альфа-синуклеину и способы применения // 2697098

Настоящее изобретение относится к области иммунологии. Предложены антитела, связывающиеся с человеческим альфа-синуклеином, а также конъюгат антитела с челночным модулем для гематоэнцефалического барьера.

Сайты антител, специфично связывающие egfrviii // 2696892

Изобретение относится к EGFRvIII-связывающему белку, содержащему EGFRvIII-связывающий сайт, и его использованию. Предложен EGFRvIII-связывающий белок, содержащий EGFRvIII-связывающий сайт, и, необязательно, (i) содержащий по меньшей мере один дополнительный функциональный домен или (ii) являющийся мультиспецифичным.

Молекулярные конструкции с нацеливающими и эффекторными элементами // 2696378

Изобретение относится к области биотехнологии, конкретно к линкерному звену, и может быть использовано в качестве сшивающего средства для объединения различных антител или иных биологически активных агентов в конъюгаты и построения молекулярных конструкций с конкретной комбинацией нацеливающих и эффекторных элементов с применением химического синтеза, либо рекомбинантной технологии.

Гуманизация антител кролика с использованием универсального каркаса антитела // 2696202

Изобретение относится к биотехнологии. Описана иммуносвязывающая молекула, содержащая: CDR1, CDR2 и CDR3 легкой цепи от донорной иммуносвязывающей молекулы зайцеобразного и CDR1, CDR2 и CDR3 тяжелой цепи от донорной иммуносвязывающей молекулы зайцеобразного; каркас вариабельной области легкой цепи человека и каркас вариабельной области тяжелой цепи человека, который по меньшей мере на 85% идентичен последовательности SEQ ID NO: 4 и содержит треонин (T) в положении 24 (нумерация AHo).

Слитые иммуномодулирующие белки и способы их получения // 2698975

Афукозилированные антитела к рецептору фактора роста фибробластов fgfr2iiib // 2698061

Изобретение относится к области биохимии, в частности к композиции для лечения рака, где рак включает солидную опухоль, которая сверхэкспрессирует FGFR2IIIb. Также раскрыты афукозилированное антитело к FGFR2IIIb, клетка-хозяин, для экспрессии указанного антитела.

Антитела к альфа-синуклеину и способы применения // 2697098

Сайты антител, специфично связывающие egfrviii // 2696892

Антитело-подобные связывающие белки с двойными вариабельными областями, имеющие ориентацию связывающих областей крест-накрест // 2695880

Изобретение относится к области биохимии, в частности к конструкции нуклеиновой кислоты для получения биспецифического антитело-подобного связывающего белка, связывающего пару антигенов.

Лечение аутоиммунных заболеваний антителами cd154 // 2695443

Изобретение относится к биотехнологии и решает задачу лечения заболеваний, в частности системной красной волчанки, фрагментом антитела, специфически связывающимся с CD154.

Лечение аутоиммунных заболеваний антителами cd154 // 2695443

Антитела со встроенным в легкие цепи гистидином и генетически модифицированные отличные от человека животные для их получения // 2694728

Изобретение относится к области биохимии, в частности к рекомбинантной нуклеиновой кислоте легкой цепи иммуноглобулина, содержащей по меньшей мере два нереаранжированных генных сегмента VL человека и по меньшей мере один нереаранжированный генный сегмент JL человека, функционально связанный с последовательностью константной области легкой цепи иммуноглобулина.

Ковалентные линкеры в конъюгатах антитело-лекарственное средство, способы их получения и применение // 2698727

Группа изобретений относится к медицине и касается линкер-активного агента для получения конъюгата антитело-лекарственное средство, содержащего соединение формулы I или его фармацевтически приемлемую соль.