Композиция для лечения или профилактики нейродегенеративных расстройств

Изобретение относится к фармацевтической промышленности, а именно к способу лечения и/или профилактики нейродегенеративного расстройства или заболевания у страдающего от него субъекта. Способ лечения и/или профилактики нейродегенеративного расстройства или заболевания у страдающего от него субъекта включает введение указанному субъекту композиции Vertigoheel® в количестве от 1 мл/кг до 2 мл/кг массы тела субъекта, которого лечат, в день. Вышеуказанный способ позволяет эффективно лечить и/или профилактировать нейродегенеративное расстройство или заболевание. 7 з.п. ф-лы, 12 ил., 1 табл., 7 пр.

 

Настоящее изобретение относится к фармацевтически полезным композициям растительного происхождения. В частности, оно относится к композиции для применения в лечении и/или профилактике нейродегенеративного расстройства или заболевания, причем указанная композиция содержит экстракты Anamirta cocculus (Анамирта коккулюсовидная), Conium maculatum (болиголов пятнистый), Ambra grisea (серая амбра) и Petroleum rectificatum (петролеум ректификатум), и при этом композиция содержит указанные экстракты в дозировке по меньшей мере приблизительно 1 мл/кг массы тела субъекта, которого лечат, в день. Настоящее изобретение также относится к указанной композиции для применения в улучшении обучаемости и памяти. Кроме того, предложено лекарственное средство, содержащее указанную композицию, а также способ лечения и/или профилактики нейродегенеративного расстройства или заболевания у субъекта, страдающего им, причем указанный способ включает введение указанному субъекту композиции в терапевтически эффективном количестве.

Нейродегенеративные заболевания и расстройства в настоящее время находятся в центре внимания различных научных и медицинских исследований. Ввиду неизвестной этиологии такие сложные и многофакторные заболевания ЦНС с трудом поддаются лечению. Они представляют собой развивающиеся заболевания, чаще возникающие у пожилых людей. Вследствие демографического развития нашего общества в сторону старения населения существует выраженная медицинская потребность в лечении таких заболеваний. Соответственно, в настоящее время предпринимаются различные усилия для более эффективной профилактики или лечения такого заболевания. Однако на сегодняшний день терапевтические возможности ограничены симптоматическим лечением. Лекарственные средства лишь снижают симптомы, однако одобренные для применения при нейродегенеративных заболеваниях лекарственные средства, модифицирующие течение заболевания, отсутствуют.

Нейродегенеративным заболеванием, имеющим особое значение в развитых странах со стареющим населением, является болезнь Альцгеймера. Болезнь Альцгеймера в настоящее время является наиболее распространенной причиной деменции. Она представляет собой неизлечимое прогрессирующее дегенеративное терминальное заболевание, которое было впервые описано Алоисом Альцгеймером (Alois Alzheimer) в начале 20-го века. Она является четвертой по распространенности причиной смерти после сердечно-сосудистых заболеваний, рака и инсульта. Болезнь Альцгеймера в большинстве случаев диагностируется в возрасте старше 65 лет. Однако деменция может проявляться значительно раньше. С эпидемиологической точки зрения данная болезнь также имеет важное значение, так как в 2006 году от болезни Альцгеймера страдало около 26 миллионов пациентов в мире, и существует прогноз, что к 2050 году от указанного заболевания будет страдать 1 из каждых 85 человек в мире. Этиология болезни Альцгеймера до сих пор неизвестна, однако достигнут большой прогресс в понимании клеточных и молекулярных механизмов указанного многофакторного заболевания. Полагают, что болезнь Альцгеймера вызывается несколькими событиями, приводящими к конвергентным и сложным патофизиологическим явлениям (Bolognesi 2009, Curr Pharm Des 15(6):601-613, Leon 2011, Curr Med Chem 18(4):552-576. Galimberti 2011, CNS Neurol Disord Drug Targets 10(2):163-174, Niedermeyer 2011, Am J Electroneurodiagnostic Technol 51(2):82-91).

Течение болезни Альцгеймера индивидуально и различается у всех пациентов. Тем не менее, есть некоторые общие симптомы, наиболее ранние из которых чаще всего неверно приписываются влиянию других факторов, например, возраста или стрессовых условий. Болезнь Альцгеймера характеризуется тремя отличительными признаками: диффузной гибелью нейронов, в основном в холинергической системе, внутриклеточными отложениями белка, которые называются нейрофибриллярными клубками, и внеклеточным накоплением амилоидных бляшек. Предполагается, что указанные факторы являются причиной болезни Альцгеймера, на них основаны другие теории, объясняющие патогенез болезни Альцгеймера, например, холинергическая гипотеза (Bartus 1982, Science. 1982 Jul 30; 217(4558):408-14), гипотеза амилоидного каскада (Hardy 1992, Trends Neurosci. 1992 Jun; 15(6):200-1) и гипотеза гиперфосфорилирования (Grundke-Iqbal 1986, J Alzheimers Dis. 2006; 9(3 Suppl):219-42). На ранних стадиях распространенным симптомом заболевания является ухудшение памяти, в частности, о более поздних событиях (краткосрочной памяти). Данное заболевание можно подтвердить с помощью МРТ или ПЭТ-сканирования головного мозга и анализа поведения, а также тестов когнитивных способностей.

Симптомы более поздних стадий заболевания включают спутанность сознания, раздражительность, агрессивность, перепады настроения, нарушенную речь, потерю долгосрочной памяти и общий аутизм пациента по мере усиления нарушения восприятия. На конечной стадии происходит нарушение важных функций организма в связи с дегенерацией нейронов, и это нарушение в конечном итоге приводит к смерти.

У болезни Альцгеймера плохой прогноз, и большинство пациентов проживают не более десяти лет после первичной постановки диагноза. Ведение болезни является большой проблемой, поскольку пациентам необходимы требуются особые виды помощи.

Причины и факторы, влияющие на заболевание, до сих пор мало изучены. Данное заболевание первоначально идентифицировали по гистопатологическим результатам, т.е. присутствию так называемых бляшечных структур головного мозга. Существует веское научное доказательство нарушения процессинга белка-предшественника амилоида бета (АРР) у пациентов с болезнью Альцгеймера, и это нарушение приводит к продукции таких разновидностей молекул, как белок амилоида бета (Аβ) или его олигомеры, например, диффундирующие лиганды амилоида (ADDL), влияющие на связь между нейронами (Palop 2010, Neuromolecular Med. 2010 Mar; 12(1):48-55., Zhang 2011, APP processing in Alzheimer's disease. Mol Brain 4:3, Duyckaerts 2009, Acta Neuropathol. 2009 Jul; 118(1):5-36).

В настоящее время предпринимаются значительные усилия по разработке лекарств от болезни Альцгеймера, а также других нейродегенеративных расстройств. Например, в 2008 году выполнено около 500 клинических исследований лекарств от болезни Альцгеймера. К сожалению, проблемы токсичности и неэффективности лекарств ограничивают разработку новых терапевтических средств, и в настоящее время доступно только симптоматическое лечение, а лекарственные средства, модифицирующие ход заболевания, отсутствуют.

Кроме вышеупомянутой болезни Альцгеймера, существуют и другие тяжелые нейродегенеративные заболевания, которые также включают нарушение связи между нейронами. Такое нарушение связи между нейронами не обязательно приводит к когнитивным нарушениям, но может влиять и на другие функции организма, регулируемые нервной системой. Примеры таких заболеваний включают боковой амиотрофический склероз (Sica 2011, Arq Neuropsiquiatr. 2011 Aug; 69(4):699-706), ограниченную предстарческую атрофию головного мозга, кортикобазальную дегенерацию, дегенерацию нервной системы, вызванную алкоголем, неопределенное дегенеративное заболевание нервной системы, дегенеративный синдром, диабетическую полинейропатию, эпилепсию, атаксию Фридрейха, лобно-височную деменцию и паркинсонизм 17 хромосомы, болезнь Хантингтона (Vonsattel 2011, Handb Clin Neurol. 2011; 100:83-100), умеренные когнитивные нарушения, болезнь Пика, неклассифицированные дегенеративные заболевания или расстройства нервной системы, прогрессирующую изолированную афазию, прогрессирующий надъядерный паралич, неклассифицированную сенильную дегенерацию головного мозга, спинально-церебеллярную атаксию/дегенерацию, умственную отсталость, повреждение спинного мозга, забывчивость и болезнь Паркинсона (Coskun 2011, Biochim Biophys Acta. 2011 Aug 16, Gruber 2011, Postepy Hig Med Dosw (Online). 2011 Aug 19; 65:542-51).

Сообщалось, что фитофармацевтические средства являются эффективными лекарствами при многих заболеваниях. Фитофармацевтические средства, например, в течение длительного времени используются в качестве гомеопатических лекарственных средств. Гомеопатические лекарственные средства являются сильно разбавленными препаратами природных ингредиентов, чаще всего соединений растительного происхождения или их сложных смесей. Фитофармацевтические средства на основе Ginkgo biloba упоминались в качестве потенциальных лекарственных средств для лечения деменции. Однако их фармацевтическая эффективность до сих пор находится под вопросом. Аналогичным образом, сообщалось, что лекарственные средства растительного происхождения, например, ресвератрол, женьшень и экстракт зеленого чая являются лекарственными средствами для лечения нейродегенеративных расстройств.

Сообщалось, что более сложные фитофармацевтические средства, например, Vertigoheel®, улучшают микроциркуляцию в целом и, таким образом, могут быть полезны для улучшения некоторых симптомов, сопровождающих нейродегенеративные заболевания, в гомеопатической дозировке (см., например, Issing 2005, J Alter Compl Med 11(1):155-160; Klopp 2005, Microvascular Rev 69:10-16; Weiser 1998, Arch Otolaryngol Head Nech Surg 124:879-885; Schneider 2005, Arzneim.-Forsch/Drug Res 55(1):23-29); Heinle 2010, Clinical hemorheology and microcirculation 46, 23-25; Wolscher 2001, Biologische Medizin, 30, 184-190; Seeger-Schellerhof 2009, J Integrative Medicine 1:231; Zenner s. Biological Ther. X:281-288, 1992.

Тем не менее все еще существует потребность в дополнительных композициях для эффективного лечения и/или профилактики нейродегенеративных заболеваний или расстройств.

Техническая задача, лежащая в основе настоящего изобретения, может рассматриваться как обеспечение средств и способов для удовлетворения указанных выше потребностей. Данная техническая задача решается с помощью вариантов реализации, охарактеризованных в формуле изобретения и ниже в настоящем документе.

Соответственно, настоящее изобретение относится к композиции для применения в лечении и/или профилактике нейродегенеративного расстройства или заболевания, причем указанная композиция содержит экстракты Conium maculatum, получаемые в соответствии со способом 2а согласно Немецкой гомеопатической фармакопее, Ambra grisea (серой амбры), получаемые в соответствии с информацией в монографии «Ambra grisea» Немецкой гомеопатической фармакопеи, Petroleum rectificatum (Петролеум ректификатум), получаемые в соответствии со способом 5а и дополнительной информацией в монографии «Petroleum rectificatum» Немецкой гомеопатической фармакопеи, и Anamirta cocculus, получаемые в соответствии со способом 4а и дополнительной информацией в монографии «Anamirta cocculus» Немецкой гомеопатической фармакопеи, и при этом композиция содержит указанные экстракты в концентрации по меньшей мере приблизительно 1 мл/кг массы тела субъекта, которого лечат, в день.

Термин "композиция" в настоящем документе относится к смеси экстрактов из, в частности, таких биологических источников, как растения, которые дополнительно определены в других разделах настоящего документа. В предпочтительном варианте указанная композиция может дополнительно содержать другие ингредиенты или разбавители. В предпочтительном варианте такие дополнительные ингредиенты могут являться стабилизаторами, увлажнителями, фармацевтическими носителями, дополнительными фармацевтически активными агентами, регуляторами высвобождения и т.п. Предпочтительные разбавители включают воду, спирты, физиологические растворы NaCl, буферы, например, физиологические растворы с фосфатным буфером, сироп, масло, воду, эмульсии, различные типы увлажнителей и т.п. В предпочтительном варианте настоящего изобретения предложена композиция, дополнительно содержащая по меньшей мере один фармацевтически приемлемый носитель и/или разбавитель. Носитель(и) должен быть «приемлемым» в смысле совместимости с другими ингредиентами состава и физиологически безвредным для реципиента. Используемый фармацевтический носитель может включать твердое вещество, полужидкое вещество (например, гель) или жидкость. Примерами твердых носителей являются лактоза, каолин, сахароза, тальк, желатин, агар, пектин, гуммиарабик, стеарат магния, стеариновая кислота и т.п. Аналогично, носитель или разбавитель может включать материал, обеспечивающий замедленное высвобождение, хорошо известный в технике, например, глицерилмоностеарат или глицерилдистеарат, по отдельности или вместе с воском. Указанные подходящие носители включают вышеупомянутые и другие носители, хорошо известные в технике, см., например, Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Company, Easton, Pennsylvania. Фармацевтически приемлемый разбавитель выбирают таким образом, чтобы он не влиял на биологическую активность комбинации. Примерами таких разбавителей являются дистиллированная вода, физиологический раствор, раствор Рингера, раствор декстрозы и раствор Хэнка. Кроме того, фармацевтическая композиция или состав может также включать другие носители, адъюванты или нетоксичные, нетерапевтические, неиммуногенные стабилизаторы и т.п.

Композицию следует адаптировать для применения в лечении и/или профилактике нейродегенеративного заболевания или расстройства. Соответственно, следует понимать, что в зависимости от желаемого способа введения композицию следует готовить в форме для системного или местного применения. В предпочтительном случае композицию, описанную в настоящем документе, составляют для системного перорального применения. Однако, в зависимости от природы и способа действия, композицию можно вводить другими путями, в том числе внутримышечно, внутрибрюшинно, подкожно, перорально или внутривенно. В предпочтительном случае композиция может быть приготовлена в форме для болюсного введения или для непрерывного применения, как подробно изложено в настоящем описании. В предпочтительном варианте композицию по настоящему изобретению готовят в форме лекарственного средства, как подробно изложено в настоящем описании.

Термин "лечение" в настоящем документе относится к любому улучшению нейродегенеративного заболевания или расстройства, которое происходит у субъекта, получающего лечение, по сравнению с субъектом, не получающим лечения. Такое улучшение может представлять собой предотвращение ухудшения или прогрессирования указанного заболевания или расстройства. Кроме того, такое улучшение может также являться облегчением или излечением нейродегенеративного заболевания или расстройства, или сопровождающих его симптомов. Следует понимать, что лечение может не быть успешным у 100% субъектов, которых лечат. В то же время данный термин требует, чтобы лечение было успешным у статистически значимой части субъектов (например, когорты в групповом исследовании). Статистическую значимость части может легко определить специалист, используя различные хорошо известные инструменты статистической оценки, например, определение доверительных интервалов, определение - значения, t-критерий Стьюдента, критерий Манна-Уитни, однофакторный дисперсионный анализ апостериорных тестов, двухфакторный дисперсионный анализ, критерий Уилкоксона и т.д. Подробности содержатся в Dowdy and Wearden, Statistics for Research, John Wiley & Sons, New York, 1983. Предпочтительные доверительные интервалы составляют по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99%. Значения p предпочтительно составляют 0,05, 0,01, 0,005 или 0,0001.

Термин "профилактика" в настоящем документе относится к предотвращению возникновения нейродегенеративного заболевания или расстройства, описанного в настоящем документе, или сопровождающих его синдромов. Следует понимать, что профилактика относится к предотвращению проявления нейродегенеративного заболевания или расстройства в течение определенного временного окна в будущем. Указанное временное окно предпочтительно должно начинаться после введения соединения согласно изобретению и продолжаться в течение по меньшей мере 1 месяца, по меньшей мере 6 месяцев, по меньшей мере 9 месяцев, по меньшей мере 1 года, по меньшей мере 2 лет, по меньшей мере 5 лет, по меньшей мере 10 лет или даже в течение оставшейся физиологической жизни субъекта. Следует понимать, что профилактика может не быть успешной у 100% субъектов, подлежащих профилактическому лечению. В то же время данный термин требует, чтобы профилактика была успешной у статистически значимой части субъектов (например, когорты в групповом исследовании). Статистическую значимость части может легко определить специалист, используя различные хорошо известные инструменты статистической оценки, также подробно обсуждаемые в настоящем документе.

Термин "нейродегенеративное заболевание или расстройство" в настоящем документе относится к любому заболеванию или расстройству, вызванному нарушением роста нейронов, гибелью нейронов в результате апоптоза, интоксикации или некроза, или нарушением функции нейронов из-за дефектов дендритов или аксонов. В предпочтительном варианте указанное нейродегенеративное расстройство или заболевание ассоциировано с когнитивными нарушениями. В более предпочтительном варианте указанные когнитивные нарушения предотвращают или облегчают с помощью композиции согласно настоящему изобретению. В предпочтительном варианте рост нейронов усиливается в результате введения композиции.

Соответственно, предпочтительные нейродегенеративные заболевания или расстройства в соответствии с настоящим изобретением, представляют собой болезнь Альцгеймера, амнезию, дефицит обучаемости и памяти, боковой амиотрофический склероз, ограниченную предстарческую атрофию головного мозга, кортикобазальную дегенерацию, дегенерацию нервной системы, вызванную алкоголем, неспецифическое дегенеративное заболевание нервной системы, дегенеративный синдром, диабетическую полиневропатию, эпилепсию, атаксию Фридрейха, лобно-височную деменцию и паркинсонизм 17 хромосомы, болезнь Хантингтона, умеренные когнитивные нарушения, болезнь Пика, неклассифицированные дегенеративные заболевания или расстройства нервной системы, прогрессирующую изолированную афазию, прогрессирующий надъядерный паралич, неклассифицированную сенильную дегенерацию головного мозга, спинально-церебеллярную атаксию/дегенерацию, умственную отсталость, повреждение спинного мозга, забывчивость и болезнь Паркинсона. Симптомы, сопровождающие вышеуказанные заболевания и расстройства, хорошо известны специалистам и подробнее описаны в стандартных учебниках по медицине, например, Stedman или Pschyrembl.

В конкретном предпочтительном варианте реализации композиции согласно изобретению указанная композиция предназначена для применения в лечении и/или профилактике болезни Альцгеймера как нейродегенеративного заболевания или расстройства. Болезнь Альцгеймера, как известно, сопровождается неправильным процессингом белка-предшественника бета-амилоида (АРР). В предпочтительном варианте процессинг белка-предшественника бета-амилоида (АРР), сопутствующий болезни Альцгеймера, снижается при введении композиции согласно настоящему изобретению.

Растения, упоминаемые в связи с настоящим изобретением, т.е. Conium maculatum и Anamirta cocculus, хорошо известны специалисту области и охарактеризованы с ботанической точки зрения. Соответственно, указанные растения, используемые в качестве исходного материала для получения композиции в соответствии с настоящим изобретением, можно идентифицировать, культивировать и/или собрать без лишних затруднений. В частности, данные растения, предпочтительно, получают путем выращивания развивающихся сеянцев в теплице при стандартной влажности, температуре и освещенности, культивирования указанных растений в течение определенного периода времени, достаточного для обеспечения наработки вторичных метаболитов растений, и сбора растений или их частей, необходимых для процесса экстракции, описанного в настоящем документе.

Conium maculatum (болиголов пятнистый) для применения в изготовлении композиции в соответствии с изобретением представляет собой спиртовой экстракт, получаемый в соответствии со способом 2а Немецкой гомеопатической фармакопеи. Осуществление способа 2а в соответствии с Немецкой гомеопатической фармакопеей хорошо известно в технике. В предпочтительном варианте экстракт Conium macculatum для применения в композиции согласно настоящему изобретению получают следующим образом: матричную настойку получают из свежей травы Conium maculatum, содержащей менее 70% отжатого сока и более 60% влаги (потеря во время сушки) и не содержащей эфирного масла или смолы. Подходящий сырой растительный материал затем измельчают при 105°C в течение 2 часов в эксикаторе. Измельченный растительный материал смешивают с количеством этанола (90% об./об.), составляющим не менее половины массы растительного материала. Точное добавляемое количество этанола необходимо рассчитывать согласно следующей формуле: масса сырого растительного материала (кг), умноженная на процент потери при сушке (который можно определить путем анализа потерь в процессе сушки образца растительного материала), разделенная на 100. Затем смесь хранят в закрытых контейнерах при комнатной температуре (не более 20°C) в течение по меньшей мере 10 дней с периодическим перемешиванием путем раскручивания. Затем смесь отжимают и фильтруют полученную жидкость. Фильтрат доводят этанолом (50% об./об.). Количество этанола для упомянутой доводки рассчитывают следующим образом: массу фильтрата (кг) умножают на [процентную долю сухого остатка или процентное содержание фильтрата, полученное при анализе, минус процентная доля сухого остатка или содержание, полученное при анализе, необходимое в соответствии с монографией] и делят на процентную долю сухого остатка или содержание, полученное при анализе, необходимое в соответствии с монографией. Отрегулированную смесь оставляют при комнатной температуре (не более 20°C) не менее чем на 5 дней и возможно вновь фильтруют с получением матричной настойки. D-разведения матричной настойки можно получить путем применения следующей схемы разбавления: 2 части матричной настойки смешивают с 8 частями этанола (50% об./об.), получая разведение D1. 1 часть разведения D1 смешивают с 9 частями этанола (50% об./об.) для получения разведения D2.

В предпочтительном варианте экстракт Conium macculatum для применения в композиции согласно изобретению характеризуют по аналитическим параметрам, приведенным в соответствующей монографии. Экстракт Conium macculatum предпочтительно представлен в виде матричной настойки или разведения D2. Вышеупомянутый экстракт Conium macculatum включают в состав композиции согласно изобретению предпочтительно в виде разведения D3 и в количестве 10% (масс/масс).

Anamirta cocculus для применения в изготовлении композиции в соответствии с изобретением представляет собой спиртовой экстракт, получаемый в соответствии со способом 4а и дополнительной информацией в монографии «Anamirta cocculus» Немецкой гомеопатической фармакопеи. Осуществление способа в соответствии с Немецкой гомеопатической фармакопеи хорошо известно в технике. В предпочтительном варианте экстракт Anamirta cocculus для применения в соответствии с композицией согласно настоящему изобретению получают следующим образом: сырой растительный материал измельчают и добавляют 10 частей этанола (90% об./об.) на 1 часть высушенного растительного материала. Затем смесь хранят в закрытых контейнерах при комнатной температуре (не более 20°C) в течение достаточного времени. Остатки отделяют от этанола и прессуют. Две жидкости, полученные таким образом, объединяют в виде мацерата. Для перколяции смесь получают, как описано выше, и хранят в закрытых контейнерах при комнатной температуре (не более 20°C) в течение достаточного времени. Смесь переносят в перколятор, и позволяют перколяту медленно стекать при комнатной температуре таким образом, что растительный материал всегда покрыт оставшимся этанолом. Остаток можно спрессовать, а отжатую жидкость объединить с перколятом. Перколят и мацерат объединяют и доводят этанолом (90% об./об.). Количество этанола соответствующей концентрации для доводки рассчитывают согласно следующей формуле: массу перколята или мацерата (кг) умножают на [процентную долю сухого остатка или процентное содержание перколята или мацерата, полученное при анализе, минус процентная доля сухого остатка или содержание, полученное при анализе, необходимое в соответствии с монографией] и делят на процентную долю сухого остатка или содержание, полученное при анализе, необходимое в соответствии с монографией. Полученная отрегулированная смесь перколята и мацерата является материнской тинктурой, также соответствующей разведению D1.

Разведение D2 можно получить путем смешивания 1 части матричной настойки/разведения D1 с 9 частями этанола соответствующей концентрации.

В предпочтительном варианте экстракт Anamirta cocculus для применения в композиции согласно изобретению характеризуют аналитическими параметрами, приведенными в соответствующей монографии. Экстракт Anamirta cocculus предпочтительно представлен в виде матричной настойки или разведения D3. Вышеупомянутый экстракт Anamirta cocculus включают в состав композиции согласно изобретению предпочтительно в виде разведения D4 в количестве 70% (масс/масс).

Petroleum rectificatum (петролеум ректификатум), получаемый в соответствии со способом 5а и дополнительной информацией в монографии «Petroleum rectificatum» Немецкой гомеопатической фармакопеи, представляет собой очищенную фракцию нефтепродуктов, полученную из сырой нефти путем последовательной дистилляции, называемой ректификацией. Получение petroleum rectificatum хорошо известно в технике и описано в вышеупомянутой монографии «Petroleum rectificatum». Последовательные D-разведения можно получить следующим образом: разведение D1 получают путем смешивания 1 части petroleum rectificatum с 9 частями 90% (об./об.) этанола. Одну часть разведения D1 затем смешивают с 9 частями этанола (50% об./об.) для получения разведения D2. Последующие разведения, например, разведения D3-D7, можно получить, как описано для разведения D2, в каждом случае используя предыдущее разведение в качестве исходного материала.

В предпочтительном варианте petroleum rectificatum для применения в композиции согласно настоящему изобретению характеризуют аналитическими параметрами, приведенными в соответствующей монографии. Petroleum rectificatum предпочтительно используют в разведении D8. Petroleum rectificatum включают в состав композиции согласно изобретению в количестве приблизительно 10% (масс/масс).

Ambra grisea (Серая амбра), получаемая в соответствии с информацией в монографии «Ambra grisea» Немецкой гомеопатической фармакопеи, представляет собой вещество, находящееся в кишечнике кашалота. Получение серой амбры хорошо известно в технике и описано в вышеупомянутой монографии «Ambra grisea». В частности, 10 частей измельченного материала амбры смешивают с 100 частями безводного этанола и нагревают смесь до кипения в течение 1 часа с обратным холодильником. После охлаждения смеси ее фильтруют, получая матричную настойку, также соответствующую разведению D1. Последовательные разведения D2-D4 можно получить путем смешивания 1 части матричной настойки или предыдущего разведения с 9 частями этанола (90% об./об.). С разведения D5 и далее 1 часть предыдущего разведения смешивают с 9 частями этанола (50% об./об.).

В предпочтительном варианте серую амбру для применения в композиции согласно настоящему изобретению характеризуют аналитическими параметрами, приведенными в соответствующей монографии. Серую амбру предпочтительно используют в разведении D6. Серую амбру включают в состав композиции согласно изобретению предпочтительно в количестве приблизительно 10% (масс/масс).

Предпочтительно композицию для применения в соответствии с настоящим изобретением получают путем смешивания вышеупомянутых ингредиентов следующим образом: для 100 г жидкой композиции смешивают 10 г серой амбры в разведении D6 с 70 г Anamirta cocculus в разведении D4, 10 г Conium maculatum в разведении D3, и 10 г petroleum rectificatum в разведении D8. Такую композицию можно применять для лечения и/или профилактики нейродегенеративного заболевания согласно настоящему изобретению. В более предпочтительном варианте указанную композицию Vertigoheel® применяют в сверхвысоких дозах, т.е. дозах, по меньшей мере приблизительно в 60-130 раз, предпочтительно по меньшей мере в 64 раза или по меньшей мере в 127 раз превышающих рекомендуемую дозировку современных гомеопатических вариантов их применения.

Композицию следует готовить и/или применять или вводить, обеспечивая дозировку экстрактов по меньшей мере приблизительно 1 мл/кг массы тела субъекта в сутки, предпочтительно, дозировку по меньшей мере от 1 мл/кг массы тела в сутки до приблизительно 2 мл/кг массы тела в сутки. В предпочтительном варианте вышеупомянутая дозировка может быть доставлена путем однократного введения (болюсного) или достигаться за счет более чем одного этапов введения в сутки. Более того, предполагается также, что указанную дозировку предпочтительно обеспечивают с помощью устройств для непрерывного высвобождения, которые обеспечивают непрерывное введение дозировки в течение суток. Правильное составление композиции с целью обеспечения указанной ежесуточной дозировки хорошо известно в технике. Например, композиции, обеспечивающие низкую дозировку, содержащие ингредиенты композиции согласно настоящему изобретению и, предпочтительно, коммерчески доступную композицию Vertigoheel®, можно вводить неоднократно и, таким образом, получать требуемую дозировку. В качестве альтернативы, можно представить композицию, обогащенную отдельными ингредиентами. Такая композиция в предпочтительном случае обеспечивает дозировку за счет однократного болюсного введения. В предпочтительном варианте композицию, обеспечивающую высокую дозировку за счет однократного болюса, можно получить путем увеличения количеств, указанных выше для композиции с низкой дозой для многократного введения, по меньшей мере приблизительно в 60-130 раз, предпочтительно по меньшей мере в 64 раза или по меньшей мере в 127 раз.

Как обсуждалось ранее, композиция согласно настоящему изобретению также может включать дополнительные ингредиенты, например, фармацевтически активные ингредиенты. Такие дополнительные ингредиенты могут содержаться в самой композиции, т.е. являться компонентом смеси, или могут быть представлены для комбинированного применения в виде физически отдельного элемента так, что композиция для лечения и/или предотвращения нейродегенеративного заболевания или расстройства фактически образуется в процессе объединенного введения в организме субъекта. Предпочтительные дополнительные ингредиенты представляют собой соединения или композиции, которые в настоящее время применяются в терапии или профилактике вышеупомянутых нейродегенеративных заболеваний или расстройств. В частности, следующие классы фармацевтических ингредиентов: ингибиторы ацетилхолинэстеразы, антагонисты NMDA, ингибиторы ангиотензин-превращающего фермента (АПФ), ФНО-альфа, предшественники дофамина, агонисты дофамина, ингибиторы МАО или химические соединения растительного происхождения, обладающие нейропротективной активностью. В предпочтительном варианте композиции согласно настоящему изобретению содержит по меньшей мере один фармацевтически активный ингредиент, выбранный из группы, состоящей из: донепезила, ривастигмина, галантамина, такрина, мемантина, каптоприла, этанерцепта, Gingko biloba, витамина В12, ресвератрола, женьшеня, экстракта зеленого чая, витамина Е, леводопа, прамипексола дигидрохлорида моногидрата и разагилина.

В исследованиях, лежащих в основе настоящего изобретения, было обнаружено, что композицию, содержащую вышеуказанные ингредиенты, можно применять в определенной дозировке для эффективного и улучшенного лечения вышеуказанных нейродегенеративных заболеваний. В частности, данная композиция, по-видимому, хорошо подходит для лечения болезни Альцгеймера. Хотя применение композиций, содержащих ингредиенты в соответствии с настоящим изобретением, уже известно в технике в рамках их применения в низких дозах в гомеопатии (например, Vertigoheel®), неожиданно было обнаружено, что в отличие от концепции разведений, используемой в гомеопатических подходах, значительное увеличение количества ингредиентов, вводимых субъекту, приводит к эффективному лечению и/или профилактике нейродегенеративных заболеваний. В частности, эффективная дозировка в соответствии с настоящим изобретением приблизительно в 64-127 превышала дозировку, используемую в гомеопатии, т.е. являлась сверхвысокой дозировкой. Кроме того, установлено, что в таких высоких дозах данная композиция эффективно и напрямую стимулирует рост нейронов и, таким образом, восстанавливает функции нейронов при нейродегенеративных заболеваниях или расстройствах. Кроме того, данный положительный эффект также можно использовать у внешне здоровых субъектов для улучшения обучаемости и памяти.

Таким образом, настоящее изобретение дополнительно относится к композиции для применения в улучшении обучаемости и памяти, причем указанная композиция является композицией, содержащей экстракты Conium maculatum (болиголов пятнистый), получаемый в соответствии со способом 2а согласно Немецкой гомеопатической фармакопее, Ambra grisea (серая амбра), получаемый в соответствии с информацией в монографии «Ambra grisea» Немецкой гомеопатической фармакопеи, petroleum rectificatum (петролеум ректификатум), получаемый в соответствии со способом 5а и дополнительной информацией в монографии «Petroleum rectificatum» Немецкой гомеопатической фармакопеи, и «Anamirta cocculus», получаемый в соответствии со способом 4а и дополнительной информацией в монографии «Anamirta cocculus» Немецкой гомеопатической фармакопеи, и композиция содержит указанные экстракты в дозировке, равной по меньшей мере приблизительно 1 мл/кг массы тела субъекта, которого лечат, в день.

Термин "обучаемость и память" в настоящем документе относится к способности субъекта анализировать и понимать определенный контекст (обучаемость) или хранить и запоминать определенную информацию (память). Обучаемость, как она понимается в настоящем документе» можно улучшить за счет способности субъекта более эффективно анализировать и понимать определенный контекст или понимать и анализировать контекст быстрее. Память можно улучшить за счет способности субъекта хранить и помнить информацию или путем предотвращения природного забывания. В предпочтительном случае в целях улучшения обучаемости и памяти согласно настоящему изобретению при введении композиции снижается природное забывание. В предпочтительном варианте указанные обучаемость и память также улучшается согласно изобретению у субъекта, являющегося внешне здоровым, по меньшей мере, в отношении нейродегенеративных заболеваний или расстройств.

Настоящее изобретение, кроме того, относится к лекарственному средству, содержащему композицию, содержащую экстракты Conium maculatum, получаемые в соответствии со способом 2а согласно Немецкой гомеопатической фармакопее, Ambra grisea, получаемые в соответствии с информацией в монографии «Ambra grisea» Немецкой гомеопатической фармакопеи, petroleum rectificatum, получаемые в соответствии со способом 5а и дополнительной информацией в монографии «Petroleum rectificatum» Немецкой гомеопатической фармакопеи, и Anamirta cocculus, получаемые в соответствии со способом 4а и дополнительной информацией в монографии «Anamirta cocculus» Немецкой гомеопатической фармакопеи, и при этом композиция содержит указанные экстракты в дозировке, равной по меньшей мере приблизительно 1 мл/кг массы тела субъекта, которого лечат, в день.

Термин "лекарственное средство" в настоящем документе относится к фармацевтической композиции, содержащей вышеуказанные ингредиенты в терапевтически эффективной дозе, указанной в настоящем документе, и, предпочтительно, по меньшей мере один фармацевтически приемлемый носитель и/или разбавитель. Лекарственное средство может быть изготовлено в форме для различных путей введения, как подробно изложено в настоящем описании. Терапевтически эффективная доза относится к количествам ингредиентов, используемых для изготовления лекарственного средства, которое предотвращает, облегчает или лечит заболевание или расстройство, упоминаемое в настоящем документе, или по меньшей мере симптомы, сопровождающие указанные заболевания или расстройства. Терапевтическую эффективность и токсичность соединения можно определить с использованием стандартных фармацевтических процедур на культурах клеток или экспериментальных животных, например, ED₅₀ (дозы, терапевтически эффективной для 50% особей популяции) и LD₅₀ (дозы, смертельной для 50% особей популяции). Соотношение доз, оказывающих терапевтическое и токсическое действие, представляет собой терапевтический индекс и может выражаться в виде отношения LD₅₀/ED₅₀. Схему приема может определить лечащий врач с учетом других клинических факторов. Как известно в области медицины, дозировки для каждого пациента зависят от многих факторов, включая размеры пациента, площадь поверхности тела, возраст, конкретное вводимое соединение, пол, время и путь введения, общее состояние здоровья и другие одновременно вводимые препараты. Прогресс можно отслеживать путем периодических оценок. Конкретные дозировки, указанные в настоящем описании, рассчитаны для субъекта средних лет и средней массы (приблизительно 70 кг).

Конкретные лекарственные средства на основе композиции согласно изобретению получают способом, хорошо известным в фармацевтике, они содержат активные ингредиенты, указанные выше в настоящем описании, смешанные или иным образом объединенные с по меньшей мере одним фармацевтически приемлемым носителем или разбавителем. Для изготовления указанных конкретных лекарственных средств активные ингредиенты обычно смешивают и, возможно, объединяют с носителем или разбавителем. Полученные составы следует адаптировать к способу введения. Процедуры приготовления лекарственного средства, указанные в настоящем документе, могут включать по мере необходимости смешивание, гранулирование, прессование или растворение ингредиентов для образования желательной композиции. Следует принять во внимание, что форма и характер фармацевтически приемлемого носителя или разбавителя определяется количеством активного ингредиента, с которым его собъединяют, путем введения, а также другими хорошо известными факторами. Рекомендации по дозировке следует указать в инструкциях для медработников или пользователей с целью планирования корректировки дозы в зависимости от предполагаемого реципиента. Наконец, следует понимать, что приготовление композиции в соответствии с изобретением, используемой в качестве лекарственного средства происходит, предпочтительно, в стандартных условиях GMP и т.п. для обеспечения качества, фармацевтической безопасности и эффективности лекарственного средства.

Таким образом, настоящее изобретение относится к способу изготовления лекарственного средства, предпочтительно для применения в лечении и/или профилактике нейродегенеративного расстройства или заболевания, включающему этапы:

(a) получения композиции, содержащей экстракты Conium maculatum (болиголов пятнистый), получаемый в соответствии со способом 2а согласно Немецкой гомеопатической фармакопее, Ambra grisea (серая амбра), получаемый в соответствии с информацией в монографии «Ambra grisea» Немецкой гомеопатической фармакопеи, Petroleum rectificatum (петрооейм ректификатум), получаемый в соответствии со способом 5а и дополнительной информацией в монографии «Petroleum rectificatum» Немецкой гомеопатической фармакопеи, и Anamirta cocculus (Анамирта коккулюсовидная), получаемый в соответствии со способом 4а и дополнительной информацией в монографии «Anamirta cocculus» Немецкой гомеопатической фармакопеи, при этом композиция содержит указанные экстракты в дозировке, равной по меньшей мере приблизительно 1 мл/кг массы тела субъекта, которого лечат, в день; и

(b) составления указанной композиции в форме лекарственного средства в фармацевтически приемлемым способом.

Способы изготовления вышеупомянутых экстрактов Conium maculatum, Ambra grisea, petroleum rectificatum или Anamirta cocculus согласно соответствующим монографиям подробно изложены в настоящем документе. Кроме того, описаны способы приготовления композиции в качестве лекарственного средства с целью обеспечения предусмотренной выше дозировки.

Наконец, настоящее изобретение относится к способу лечения и/или профилактики нейродегенеративного расстройства или заболевания у страдающего им субъекта, причем указанный способ включает введение указанному субъекту терапевтически эффективного количества композиции, содержащей экстракты Conium maculatum, получаемый в соответствии со способом 2а согласно Немецкой гомеопатической фармакопее, с Ambra grisea, получаемые в соответствии с информацией в монографии «Ambra grisea» Немецкой гомеопатической фармакопеи, petroleum rectificatum, получаемый в соответствии со способом 5а и дополнительной информацией в монографии «Petroleum rectificatum» Немецкой гомеопатической фармакопеи, и «Anamirta cocculus», получаемый в соответствии со способом 4а и дополнительной информацией в монографии «Anamirta cocculus» Немецкой гомеопатической фармакопеи, и композиция содержит указанные экстракты в дозировке по меньшей мере приблизительно 1 мл/кг массы тела субъекта, которого лечат, в день.

Способы введения вышеупомянутой композиции подробно описаны в настоящем документе. Кроме того, специалист в технике знает, как обеспечить терапевтически эффективное количество в подходящей форме для настоящего способа. Подробная информация по данной теме содержится в настоящем описании.

Все цитируемые здесь источники включены в настоящий документ посредством ссылок в отношении конкретного содержания раскрытия, упоминаемого, а также во всей их полноте.

ФИГУРЫ

Фигура 1: Данные показывают дозо- и времязависимое влияние Vertigoheel® на частоту электрической активности головного мозга крыс, определенное путем измерения ЭЭГ

Фигура 2: Запись активности нейронов после однократного стимула (SS) и тета-импульсной стимуляции (TBS) после обработки Vertigoheel.

Фигура 3: Активность нейронов под действием Vertigoheel® (1 мл) в присутствии нескольких антагонистов глутамата.

Фигура 4: Количественный анализ роста нейронов PHN после инкубирования с Vertigoheel® (разведение 1:3, однократная обработка). ** Р<0,01, *** Р<0,001 по сравнению с физиологическим раствором Saline Heel.

Фигура 5: Уровни sAPP-α после обработки Vertigoheel® в клеточной линии нейробластомы SHSY-5Y. * Р<0,05, ** Р<0,01, *** Р<0,001 по сравнению с физиологическим раствором Saline Heel.

Фигура 6: Уровни sAPP-β после обработки Vertigoheel® в клеточной линии нейробластомы SHSY-5Y. * Р<0,05, ** Р<0,01, *** Р<0,001 по сравнению с физиологическим раствором Saline Heel.

Фигура 7: Влияние Vertigoheel® на обонятельную память измеряли в тесте социальной передачи пищевых предпочтений, * Р<0,05, *** p<0,001 по сравнению с соответствующей пищей-раздражителем.

Фигура 8: Формирование контекстного страха - влияние Vertigoheel® на память о раздражителе.

Фигура 9: Влияние Vertigoheel® на долговременную память измеряли с помощью теста пассивного избегания, * Р<0,05 по сравнению с соответствующей контрольной группой.

Фигура 10: Влияние Vertigoheel® на естественное забывание (время на исследование нового объекта) в задаче распознавания нового объекта * Р<0,05 по сравнению с 24-ч группой.

Фигура 11: Влияние Vertigoheel® на естественное забывание (количество контактов с новым объектом) в задаче распознавания нового объекта * Р<0,05 по сравнению с 24-ч группой.

Фигура 12: Влияние Vertigoheel® на кратковременную память у мышей с недостаточностью познавательных функций с помощью теста Т-лабиринта, * р<0,001 по сравнению с группой с дефектом познавательных функций.

ПРИМЕРЫ

Пример 1: Исследование телеЭЭГ - влияние Vertigoheel® на кривую ЭЭГ у крыс

Задача состояла в изучении характеристик Vertigoheel® с использованием электрофармакограмм на основе электроэнцефалографии (ЭЭГ) у свободно передвигающихся крыс и сравнение картины ЭЭГ с ЭЭГ под действием ряда лекарственных средств, влияющих на центральную нервную систему, уже протестированных в этой системе. Определенные потенциалы поля содержат информацию о более крупных локальных сетях электрически активных нейронов, отражая взаимодействие лекарственных средств с их мишенями при согласованной передаче нервных импульсов. Данная методика дает представление о профиле фармакологического время- и дозозависимого действия различных препаратов как по отдельности, так и при сравнении друг с другом.

В обеих сериях экспериментов использовали перекрестное исследование с по меньшей мере 1-недельным периодом вымывания между введениями. Vertigoheel®, состоящий из 4 природных ингредиентов и физиологического раствора NaCl, использовали в качестве контрольного лечения. Протестировали три дозировки обоих препаратов: Vertigoheel® вводили по 0,5, 1,0 и 2,0 мл/кг внутрибрюшинно. Применяемые дозировки являлись сверхвысокими дозировками, по меньшей мере приблизительно в 32, 64 или 127 раз превышая дозировку, применяемую в гомеопатических вариантах применения композиции Vertigoheel® для людей. После 45-минутного периода до введения дозы для записи исходного уровня наблюдали влияние препаратов непрерывно в течение 245 минут, разделенных на 15-минутные периоды, начиная через 5 минут после внутрибрюшинного введения. Изменения электрической мощности (мкВ2) выражали в процентах от абсолютных значений спектральной мощности, зарегистрированных в течение 45 минут перед введением дозы в пределах каждого диапазона частот. Данные усредняли на основании записей для животных в конкретный день эксперимента. Данные выражали как средние значения по 10-11 животным для каждой из 2 последовательных серий экспериментов.

Двадцати двум взрослым крысам Fisher (в возрасте 6-8 месяцев, содержавшимся по меньшей мере в течение 2 месяцев при обращенном цикле день-ночь: 12/12 ч, начиная с 6:00; приобретенным в Charles River Laboratories) имплантировали 4 биполярных концентрических стальных электрода с использованием стереотаксической хирургической процедуры. Все четыре электрода помещали на 3 мм латеральнее в пределах левого полушария. Дорсовентральные координаты составляли 4,0, 6,0, 4,2 и 8,0 мм, а антериальные координаты составляли 3,7, 9,7, 5,7 и 12,2 мм для фронтальной коры, полосатого тела, гиппокампа и ретикулярной формации, соответственно (по данным атласа Paxinos). Заранее сконструированную базовую плату, несущую 4 биполярных полумикроэлектрода из нержавеющей стали (неврологические электроды "SNF 100"; Rhodes Medical Instruments, Inc, Саммерленд, штат Калифорния, США) и 5-штырьковый разъем, фиксировали на черепе зубным цементом, взаимодействующим с 3 стальными винтами, расположенными на некотором расстоянии в кости. Удаленный записывающий элемент электрода являлся активным электродом, а проксимальные круговые элементы 4 электродов были соединены друг с другом, образуя общий электрод сравнения. Ретикулярную формацию выбрали, поскольку она содержит источник дофаминергической передачи (вентральную области покрышки). С ним соединены нигростриальный (к полосатому телу), мезолимбический (к гиппокампу) и мезокортикальный (к лобной коре) пути. Разъем для передатчика фиксировали на базовой плате (масса 5,2 г [с аккумулятором]; размер 26×12×6 мм).

Во время записи крысы могли свободно передвигаться, не получая пищи (жевание генерировало бы слишком много артефактов). Эксперименты начали в 6:30 в темноте во время активной фазы животных. Животным позволили восстановиться после процедуры в течение 2 недель. После этого включали передатчик для адаптации и проведения контрольных экспериментов с физиологическим раствором. Принципы лабораторного ухода за животными соблюдали во всех испытаниях, и местные органы, ответственные за уход за животными, разрешили данное исследование в соответствии с руководящими принципами здравоохранения Германии.

Сигналы ЭЭГ записывали от лобной коры, гиппокампа, полосатого тела и ретикулярной формации в комнате, полностью экранированной медным экраном. Сигналы передавали по беспроводной связи радиотелеметрической системой (Rhema Labortechnik, Хофхайм, Германия), с использованием 40 МГц в качестве несущей частоты, усиливали и обрабатывали, как описано выше, получая спектры мощности с разрешением 0,25 Гц, согласно Dimpfel и Suter. Вкратце, после автоматического артефакта, сигналы отторжения регистрировали с интервалом в 4 секунды и трансформировали, используя методику быстрого преобразования Фурье. Частота регистрации составляла 512 Гц. Четыре значения усредняли, получая окончательную частоту регистрации 128 Гц, что значительно выше частоты Найквиста. Полученные спектры электрической мощности делили на 6 специально заданных частотных диапазонов: дельта, 0,80-4,50 Гц; тета, 4,75-6,75 Гц; альфа1, 7,00-9,50 Гц; альфа2, 9,75-12,50 Гц; бета1, 12,75-18,50 Гц; и бета 2, 18,75-35,00 Гц. Во всех более ранних исследованиях было обнаружено, что указанные частотные диапазоны менялись независимо друг от друга. Спектры усредняли по 3-минутным интервалам и отображали в режиме онлайн. В оффлайн процедуре спектры усредняли, получая 30-минутные или более продолжительные периоды для дальнейшего анализа и представления данных. В пределах этих более длительных периодов усредняли краткосрочные колебания изменений, подчеркивая фармакологические эффекты. Этот тип изменений полевого потенциала в присутствии лекарственных средств сравнивали с исходным уровнем и называли электрофармакограммой.

Животную модель "теле-стерео-ЭЭГ", состоящую из непрерывной записи внутримозговых полевых потенциалов, использовали в сочетании с системой видеонаблюдения для обнаружения изменений подвижности (GJB Datentechnik GmbH, Лангевизен, Германия). Данная система распознавала передвижение и стереотипное поведение, отслеживая различие в контрастности черного передатчика на голове животного по сравнению с окружающей средой.

Валидацию системы выполнили в предыдущем исследовании с использованием различных дозировок кофеина.

Значения рассчитывали в процентах от исходного уровня. Указанные значения логарифмически преобразовывали для достижения нормального многомерного распределения и выполнения предпосылок для статистического анализа. Расчет состоял из определения статистической значимости для каждой полосы частот в пределах каждой области мозга по отдельности для облегчения интерпретации по отношению к взаимодействию с рецепторами нейромедиатора. В ходе анализа всегда сравнивали каждый период с аналогичным периодом изменений после введения физиологического раствора. Статистические показатели рассчитывали в соответствии с тестом Уилкоксона (Манна-Уитни) и дискриминантным анализом. При этой математической процедуре препараты с аналогичными клиническими показаниями группировали вместе в пространстве, соответствующем результатам первых 3 дискриминантных функций, проецируемых в пространство x-y-z. Во-первых, 3-мерное пространство свидетельствовало о схожести или несхожести действия лекарственных средств. Во-вторых, близкие цвета указывали на аналогичный механизм действия. Результаты следующих 3 дискриминантных функций кодировали согласно аддитивной цветовой смеси красного (четвертая функция), зеленого (пятая функция) и синего (шестая функция), которую использовали для регистрации дополнительных небольших различий между действием лекарственных веществ (известный способ формирования телевизионных изображений). Положение и цвет эталонных соединений с известными клиническими показаниями перечислены на фигуре вместе с дозировкой и временем записи. Близкое соседство и близкие цвета указывали на сходство действия. Согласно указанной системе, контрольные соединения можно группировать по изменениям активности, специфическим по отношению к показаниям, и в кластеры с известным клиническим применением.

Результаты

Влияние физиологического раствора: через 4 часа после введения физиологического раствора, следующего за 45-минутной регистрацией исходного уровня, не обнаруживали существенных изменений спектральной мощности в пределах 4 областей мозга.

Влияние Vertigoheel® (сверхвысокая дозировка): на первом этапе определили влияние Vertigoheel® на электрическую мощность. Vertigoheel® демонстрировал дозо- и время зависимое действие на КПД нейронной сети в 4 оцениваемых областях головного мозга. В течение первого часа наиболее выраженное влияние на изменение спектральной частоты измеряли после обработки Vertigoheel® в дозировке 1 и 2 мл/кг.

В присутствии 1 мл Vertigoheel® альфа2- и дельта-частоты значительно снижались в лобной коре, гиппокампе и полосатом теле в течение первого часа измерения. В гиппокампе значительно ослаблялись бета1-волны, а в лобной коре - бета1- и тета-волны. В ходе эксперимента влияние 1 мг Vertigoheel® исчезло. Введение максимальной дозы 2,0 мл/кг привело к сильным изменениям полос спектральной частоты, в основном в гиппокампе, лобной коре и ретикулярной формации. Дельта-, тета-, альфа- и бета-волны значительно снизились. В полосатом теле наблюдали менее выраженное влияние на КПД нейронной сети. Минимальная доза Vertigoheel®, 0,5 мг/кг, не демонстрировала значительных изменений. Данные показывают дозо- и времязависимое действие Vertigoheel® на частоту электрической активности (Фиг. 1).

Дискриминантный анализ электрофармакограмм: данные Vertigoheel® проецировали в 3-мерные координаты в соответствии с изменениями частоты на ЭЭГ. Эталонные лекарства, вводимые внутрибрюшинно, анализировали в течение первого получаса после введения. Внутрибрюшинно вводимый препарат Vertigoheel® анализировали в течение 5-65 минут после введения. Vertigoheel® представляли в виде 1 дозировки - 1 мл/кг. Положение Vertigoheel® было близким к лекарственным средствам, улучшающим познавательные способности, и анальгетикам, например, метаникотину и трамадолу; и к лекарствам против болезни Паркинсона, например, разагилину и селегилину. Это указывает на действие данного лекарственного средства, аналогичное действию вышеупомянутых медикаментов.

Такой подход обеспечил доказательства того, что Vertigoheel® в сверхвысокой дозировке непосредственно влиял на ЦНС. Можно показать, что Vertigoheel® демонстрировал время- и дозозависимое действие и главным образом влиял на лобную кору и гиппокамп, одну из ключевых областей мозга для обработки и хранения поступающей информации (=обучаемости). Дальнейшее сравнение Vertigoheel® с другими фармакологическими лекарственными средствами выявило сходство данного медикамента с лекарственными средствами, улучшающими познавательные способности, и анальгетиками, например, метаникотином и трамадолом; и с лекарствами против болезни Паркинсона, например, разагилином и селегилином. Это было первым научным свидетельством того, что Vertigoheel® влияет на важные области головного мозга, участвующие в когнитивных функциях.

Пример 2: Получение срезов гиппокампа: действие Vertigoheel® на активность нейронов в гиппокампе

В первом эксперименте (ТелеЭЭГ) продемонстрировали, что Vertigoheel® влиял на активность нейронов и на электрические частоты в гиппокампе, с помощью измерений электроэнцефалограммы. Для получения дополнительных знаний о возможной непосредственной мишени Vertigoheel® получали нейрофизиологические записи со срезов гиппокампа in vitro. Влияние Vertigoheel® на локальную синаптическую схему и активацию нейронов, а также на различные типы рецепторов глутамата в данной области, значимой для познавательных способностей, исследовали с помощью указанной системы ex vivo.

Срезы гиппокампа получили из 47 взрослых самцов крыс Sprague-Dawlay (Charles River Wiga, Зульцбах, Германия). Крыс содержали при обращенном цикле день/ночь в течение 2 недель до экспериментов для записи активности срезов in vitro во время активной фазы их циркадного ритма. Животных обескровливали под эфирным наркозом, целиком удаляли головной мозг и выделяли формацию гиппокампа под стереомикроскопом. Использовали четыре-пять срезов от каждого животного. Среднюю часть гиппокампа устанавливали на столике вибрационного микротома (Rhema Labortechnik, Хофхейм, Германия) с помощью цианакрилатного клея, погружали в охлажденный физиологический раствор с бикарбонатным буфером (искусственную цереброспинальную жидкость (ИЦСЖ): NaCl: 124 мМ, KCl: 5 мМ, NaH₂PO4: 1,25 мМ; CaCl₂: 2 мМ, MgSO₄: 2 мМ, NaHCO₃: 26 мМ, глюкоза: 10 мМ, и нарезали срезами толщиной 400 мкм. Осмолярность ИЦСЖ составляла 260-270 мОсмоль/л (осмолярность плазмы составляет 288+/-5). Перед использованием все срезы предварительно инкубировали в ИЦСЖ, насыщенной карбогеном (pH 7,4) в предкамере в течение по меньшей мере 1 ч.

В ходе эксперимента срезы держали и обрабатывали в специальной орошаемой камере (List Electronics, Дармштадт, Германия) при 35°C. Использовали четыре среза от одной крысы в день в одном из вариантов условий тестирования (контроль или различные концентрации тестируемого препарата). Препарат орошали искусственной спинномозговой жидкостью (ИЦСЖ) со скоростью 180-230 мл/ч. Электрическую стимуляцию (импульсы постоянного тока 200 мкА с шириной импульса 200 мкс) коллатералей Шеффера в области СА2 и запись внеклеточных полевых потенциалов от слоя пирамидных клеток СА1 выполняли в соответствии с обычными электрофизиологическими способами, используя компьютерную систему "Labteam" и программный пакет "NeuroTool" (MediSyst GmbH, Линден, Германия). Измерения проводили с 10-минутными интервалами для устранения потенцирования. Четыре стимуляции - через каждые 20 сек - усредняли для каждой временной точки. После получения стабильных ответов на одиночные раздражители (SS) индуцировали долгосрочное потенцирование путем стимуляции тета-импульсами. Среднюю амплитуду трех сигналов, регистрируемых через каждые 20 секунд, усредняли, получая средние значения абсолютного напряжения (в микровольтах) ± стандартная ошибка среднего значения для каждого варианта условий эксперимента (одинократного стимула или тета-импульсной стимуляции).

Для блокирования рецепторов глутамата использовали 8 антагонистов: CGS 19755 (BN0142, 1А/33087), динатриевую соль NBQX (BN0608, 06088BN/02), GYKI 52466 (BN0380, BN0380, 1А/35052), гидрохлорид YM 298198 (BN0553, 0553BN/01), SYM 2206 (0961, 7А/34998), UBP 301 (BN0532, 0532BN/01), (RS)-APICA (BN0092, 0092BN/01), MSOP (BN0349 0349BN/01), приобретенные в BIO TREND Chemikalien. Их тестировали в пилотных экспериментах с целью выявления концентрации, по существу не меняющей амплитуду популяционного спайка в присутствии одиночных раздражителей и тета-импульсной стимуляции.

Результаты

Влияние Vertigoheel® на активность нейронов: после однократного применения электрического стимула к коллатералям Шеффера ответы пирамидных клеток увеличивались в зависимости от концентрации Vertigoheel®. Амплитуда популяционного спайка увеличивалась приблизительно на 50% с максимумом при 2 мг/л Vertigoheel® (амплитуда увеличивалась от 1,07 до 1,73 мВ). Возрастание статистически значимо отличалось от контрольного значения без лекарственного средства (р<0,01).

После электрической тета-импульсной стимуляции присутствие Vertigoheel® приводило лишь к незначительному увеличению амплитуды популяционного спайка (от 2,06 мВ до 2, 24 мВ).

Антагонизм Vertigoheel® за счет стимуляции глутаматергическими антагонистами: для исследования конкретных мишеней Vertigoheel® к среде, орошающей срез гиппокампа, добавляли несколько антагонистов рецепторов глутамата. Соответствующие дозы определяли путем экспериментальных исследований. Эффективные концентрации Vertigoheel® были взяты из первой серии экспериментов (1 мл/л для Vertigoheel®, Фиг. 3).

Функциональные помехи со стороны сигнала, опосредованного NMDA-рецептором: для проверки возможных помех Vertigoheel® со стороны изменений сигнала, активированного NMDA-рецептором, глутаматергическую передачу нервных импульсов модулировали CGS 19755, очень мощным и селективным антагонистом NMDA-рецепторов. В присутствии 250 нМ CGS 19755 измеряли лишь очень незначительное снижение амплитуды сигнала. Концентрация 250 нМ не увеличивала амплитуду в присутствии Vertigoheel® после однократной стимуляции. Таким образом, после обработки Vertigoheel® помех со стороны передачи сигнала, опосредованного NMDA-рецептором, не наблюдали.

Функциональные помехи со стороны сигнала, опосредованного АМРА-рецептором: для проверки возможных помех Vertigoheel® со стороны изменений сигнала, активированного АМРА-рецептором, глутаматергическую передачу нервных импульсов модулировали NBQX, очень мощным и селективным конкурентным антагонистом АМРА-рецепторов. В присутствии 50 нМ NBQX отдельно от других препаратов измеряемые изменения амплитуды сигнала отсутствовали. В то же время концентрация 50 нМ значимо блокировала повышенную амплитуду популяционного спайка в присутствии Vertigoheel® после однократных раздражений. Таким образом, можно было наблюдать четкие помехи для действия Vertigoheel® со стороны передачи сигнала, опосредованного АМРА-рецептором.

Функциональные помехи за счет неконкурентной модуляции АМПА-рецептора GYKI 52466 и SYM 2206: для проверки возможных помех Vertigoheel® со стороны изменений сигнала, активированного неконкурентным АМРА-рецептором глутамата, глутаматергическую передачу нервных импульсов модулировали GYKI 52466, очень мощным и селективным неконкурентным антагонистом АМРА-рецепторов. В присутствии 500 нМ GYKI 52466 отдельно от других препаратов измеряли лишь очень незначительное снижение амплитуды сигнала. GYKI 52466 (500 нМ) не увеличивал амплитуду в присутствии Vertigoheel® после однократной стимуляции. Таким образом, антагонизма с передачей сигнала, опосредованного неконкурентным АМРА-рецептором, не наблюдали. Аналогичные эффекты получили в присутствии SYM 2206, еще одного неконкурентного антагониста АМРА-рецептора.

Функциональные помехи за счет модуляции рецептора каината UBP 301: для проверки возможных помех Vertigoheel® со стороны каинатных рецепторов глутаматергическую передачу нервных импульсов модулировали UBP 301, очень мощным и селективным конкурентным антагонистом каинатного рецептора. В присутствии 50 нМ UBP 301 отдельно от других препаратов измеряемое изменение амплитуды сигнала отсутствовало. Концентрация 50 нМ полностью подавляла значимое повышение амплитуды популяционного спайка в присутствии Vertigoheel® после однократных раздражений. Таким образом, данные указывают на четкие помехи Vertigoheel® со стороны каинатных рецепторов.

Функциональные помехи за счет модуляции метаботропного рецептора Glu₁ с помощью YM 298198: для проверки возможных помех Vertigoheel® со стороны метаботропного рецептора глутамата 1 класса, глутаматергическую передачу нервных импульсов модулировали YM 298198, очень мощным и селективным антагонистом метаботропного рецептора глутамата 1 класса. При орошении 50 нМ YM 298198 отдельно от других препаратов измеряли лишь очень незначительное снижение амплитуды сигнала после обработки TBS. Значения амплитуды после одиночных раздражений не изменялись в присутствии Vertigoheel® в сочетании с антагонистом. Однако во время TBS наблюдалось небольшое повышение амплитуды в присутствии Vertigoheel® в сочетании с антагонистом. Таким образом, действие Vertigoheel® не опосредовано метаботропным рецептором глутамата 1.

Функциональные помехи за счет модуляции метаботропного рецептора Glu₂ с помощью (RS)-APICA: антагонист метаботропного рецептора глутамата 2 класса (RS)-APICA в концентрации 100 нМ отдельно от других соединений не ингибировал амплитуду сигнала Vertigoheel®. Влияние Vertigoheel® после одиночной импульсной стимуляции не изменялось.

Функциональные помехи за счет модуляции метаботропного рецептора Glu₃ с помощью MSOP: антагонист метаботропного рецептора глутамата 3 класса MSOP в концентрации 50 нМ отдельно от других соединений не ингибировал амплитуду сигнала Vertigoheel® послеоднократного импульса или TBS. Влияние Vertigoheel® после одиночной импульсной стимуляции не изменялось за счет указанного соединения.

Таким образом, Vertigoheel® демонстрировал очень специфичный профиль мишени. Повышенная активность нейронов после инкубирования с Vertigoheel® может подавляться конкурентным АМРА и антагонистом рецептора каината. Предполагается, что влияние Vertigoheel® частично опосредовано указанными рецепторами нейронов, участвующими в процессах запоминания и обучения в гиппокампе.

Пример 3: Влияние Vertigoheel® на функционирование нейронов

Целью исследования было изучение существования потенциального влияния различных доз Vertigoheel® на функционирование нейронов in vitro. Исследовали три различные функции: целостность и жизнеспособность нейронов (анализ МТТ и ЛДГ). морфологию нейронов (рост первичных нейронов гиппокампа) и влияние на процессинг и метаболизм АРР (среднемасштабный твердофазный ИФА).

Исследовали влияние Vertigoheel® на целостность и жизнеспособность нейронов, поскольку токсическое повреждение клеток может вызвать гибель отдельных клеток, и потеря достаточного количества клеток может приводить к недостаточности и дисфункции ткани или органа и, в конечном итоге, к гибели организма. Данный эффект исследовали в первичных нейронах гиппокампа мыши и линии клеток нейробластомы человека с помощью анализа ЛДГ и МТТ.

Изменение морфологии нейронов и синаптсов имеет важное значение для функционирования нейронов и может обеспечить понимание того, действует ли Vertigoheel® как церебральный активатор и поддерживает ли он передачу нервных импульсов.

Влияние на процессинг АРР и другие аспекты метаболизма, связанные с БА, имеет важное значение в связи с деменцией. Секретазы действуют на белок-предшественник амилоида (АРР), расщепляя его на три фрагмента. Последовательное расщепление β-секретазой (ВАСЕ) и γ-секретазой продуцирует β-амилоид, пептидный фрагмент, который образует агрегаты, называемые "бляшками", в головном мозге пациентов с болезнью Альцгеймера. α-секретазы действуют на АРР, не образуя β-амилоида, поскольку α-секретазы распознают последовательность белка-мишени, расположенную ближе к поверхности клетки, чем ВАСЕ. В следующем исследовании изучили влияние Vertigoheel® на процессинг и метаболизм АРР.

Для первичной культуры клеток использовали мышей C57BL/6J в эмбриональный день 18. Беременных мышей умерщвляли в соответствии с общими руководящими принципами для экспериментов на животных путем смещения шейных позвонков. Эмбрионы Е18 извлекали из матки и умерщвляли путем декапитации. Целый мозг извлекали из черепа и переносили в чашку для культивирования, содержащую ледяной 1х HBSS с феноловым красным. Следующие этапы проводили на льду. Полушария разделяли, удаляли мягкие мозговые оболочки и иссекали гиппокамп из оставшейся ткани головного мозга с помощью одного атравматического пинцета и стереомикроскопа Zeiss Stemi 2000-С. Выделенные гиппокампы собирали в стерильную 15-мл пробирку, содержащую 1х HBSS с феноловым красным. Для диссоциации гиппокампы промывали 1х HBSS без фенолового красного. 1х HBSS удаляли до объема 2 мл и добавляли 0,2 мл 2,5% трипсина.

Затем гиппокампы инкубировали и промывали. 1х HBSS удаляли, добавляли ДНКазу I (65 ед/мл), гиппокампы механически диссоциировали с помощью пипетки. Добавляли среду DMEM, дополненную 10% FCS, 2 мМ L-глутамина, 100 ME пенициллина и 0,1 мг/мл стрептомицина. Количество клеток определяли с помощью камеры Нейбауэра для подсчета клеток. Суспензию клеток корректировали до желательной плотности 10*104 клеток на мл и высевали в 24-луночные планшеты для культивирования клеток, содержащие 13-мм круглые покровные стекла с поли-L-лизиновым покрытием. Общая концентрация клеток составила 2,5*104 клеток на см².

Первичные нейроны гиппокампа использовали для исследования целостности и жизнеспособности нейронов и для исследования роста нейронов после обработки Vertigoheel®.

Линия клеток SH-SY5Y представляет собой трижды клонированную нейробластому. Данные клетки содержат аномальную хромосому 1, несущую дополнительную копию сегмента 1q, что называется трисомией 1q. Известно, что клетки SH-SY5Y являются активными по дофамин-бета-гидроксилазе, ацетилхолинергическими, глутаматергическими и аденозинергическими. У данных клеток очень сильно отличаются фазы роста. Клетки размножаются путем митоза и дифференцируются путем роста нейритов в окружающую среду. Делящиеся клетки могут образовывать кластеры клеток, которые напоминают об их раковой природе, но обработка некоторыми веществами, например, ретиноевой кислотой и BDNF, может вызвать рост дендритов и дифференцировку клеток.

SHSY-5Y использовали для исследования целостности и жизнеспособности нейронов и для исследования влияния на процессинг и метаболизм АРР после обработки Vertigoheel®.

Первичные нейроны гиппокампа поддерживали при 37°C в атмосфере 5% CO2. Среду меняли через 3-18 часов после посева. Среду DMEM удаляли и добавляли 600 мкл нейробазальной культуральной среды, дополненной 10% В27, 2 мМ L-глутамина, 100 ед. пенициллина и 0,1 мг/мл стрептомицина. Раз в неделю нейробазальную культуральную среду добавляли по 200 мкл в лунки 24-луночного планшета для культивирования тканей и по 50 мкл в лунки 96-луночного планшета для культивирования тканей.

Клетки SHSY-5Y поддерживали при 37°C в атмосфере 5% СО₂. Среду меняли каждые 3 дня, клетки разделяли раз в неделю.

Влияние на целостность и жизнеспособность нейронов измеряли с использованием анализа МТТ: анализ МТТ представляет собой колориметрический анализ для измерения метаболической активности ферментов, которые восстанавливают МТТ или близкие красители (ХТТ, МТС, WST) до формазановых красителей, дающих пурпурную окраску. Основной вариант применения позволяет оценить жизнеспособность (подсчет клеток) и пролиферацию клеток (анализ клеточных культур). Его также можно использовать для определения цитотоксичности потенциальных лекарственных агентов и токсичных материалов, поскольку эти агенты должны стимулировать или подавлять жизнеспособность и рост клеток.

Первичные нейроны гиппокампа мыши и клетки SHSY-5Y инкубировали с Vertigoheel®, Saline Heel и Saline Ulm (см. главу 2.1) в течение различного времени в 96-луночных планшетах (Таблица 1а/b) и обрабатывали МТТ (3-(4,5-диметилтиазол-2-ил-2,5-дифенилтетразолийбромидом) в течение 3 часов. После добавления солянокислого изопропанола (0,04 н. HCl в изопропаноле) в лунки планшеты считывали на Power Wave 200, BioTek Instruments, используя рабочую длину волны 570 нм и длину волны сравнения 630 нм. 10 мкМ ротенона в ДМСО использовали в качестве положительного контроля, а необработанные клетки - в качестве отрицательного контроля.

Анализ ЛДГ: лактатдегидрогеназа (ЛДГ) представляет собой растворимый цитозольный фермент, который высвобождается в культуральную среду после нарушения целостности мембраны в результате апоптоза или некроза. Активность ЛДГ, следовательно, можно использовать в качестве индикатора целостности клеточных мембран и в качестве общего средства для оценки цитотоксичности химических соединений или токсических факторов окружающей среды.

Первичные нейроны гиппокампа мыши и клетки SHSY-5Y инкубировали с Vertigoheel®, Saline Heel и Saline Ulm в течение различного времени в 96-луночных планшетах (Таблица 2а/b) и собирали надосадочную жидкость. После добавления соли тетразолия планшеты инкубировали в течение 30 минут. Соль тетразолия восстанавливали до интенсивно окрашенного формазана и измеряли при 490 нм с помощью Power Wave 200, BioTek Instruments (Фиг. 4). 10 мкМ ротенона в ДМСО использовали в качестве положительного контроля, а необработанные клетки - в качестве отрицательного контроля.

Изменение морфологии нейронов и синапсов: первичные нейроны гиппокампа мыши в количестве 8×10⁴ клеток/лунку инкубировали с Vertigoheel®, Saline Heel (бидистиллированная вода и NaCl, приобретенные в Heel и приготовленные университетом Ульма) и Saline Ulm (0,9% физиологический раствор, приобретенный в Sigma Aldrich) с концентрацией 1:3 и 3:1 в течение 3-7 дней с целью исследовать изменения длины и ветвления аксонов и обеспечить понимание пролиферативного или ингибирующего влияния Vertigoheel®. Клетки PHN высевали на покровные стекла в 24-луночных планшетах, инкубировали и фиксировали. Клетки окрашивали α МАР2 для обнаружения дендритов и синапсов. С помощью флуоресцентной микроскопии и анализа Шолля обнаруживали изменения длины аксонов и числа дендритов.

Затем определяли влияние на процессинг АРР и другие аспекты метаболизма, связанные с БА.

Электрохемилюминесцентный анализ (sAPP): процессинг АРР: α-секретаза и γ-секретаза образуют р3, не образующий бляшек, а γ-секретаза и β-секретаза образуют Аβ, образующий амилоидные бляшки. Указаны различные области белка АРР.

SHSY-5Y инкубировали с Vertigoheel®, Saline Heel и Saline Ulm (Таблица 3). Супернатант среды собирали, инкубировали с антителами против АРР в формате твердофазного ИФА и измеряли с помощью Sektor Imager 2400 (среднемасштабного) для обнаружения изменений в процессинге АРР (sAPP).

Для проверки значимых различий между группами применяли непараметрические тесты. Для сравнения двух групп выполняли расчет t-критерия и непараметрического критерия суммы рангов Уилкоксона (Программное обеспечение: Sigma stat 3.5) для всех экспериментов. Различия с p<0,05 считали значимыми.

Результаты

Анализ жизнеспособности для PHN: анализы МТТ в PHN продемонстрировали, что клетки переносили обработку Vertigoheel® в разведении 1:3 и 3:1 до 5 дней. Эта обработка не влияла на жизнеспособность и пролиферацию клеток по сравнению с контрольными. Протестированное разведение Vertigoheel® и Saline использовали для дальнейших экспериментов по измерению роста нейронов. Анализы ЛДГ давали аналогичные результаты для используемых разведений 1:3 и 3:1 для PHN.

Анализ жизнеспособности для SHSY-5Y: анализы МТТ и ЛДГ в SHSY-5Y продемонстрировали, что клетки переносили обработку при разведении 1:5, 1:4, 1:3 и 1:2 и времени инкубирования 1 ч, 3 ч, 5 ч, 12 ч и 24 ч. Клетки показали хорошую жизнеспособность после обработки. Для длительных экспериментов переносимым являлось разведение 3:1 (см. доклад СК3031, университет Ульма).

Таким образом, для экспериментов по росту нейронов в PHN продолжительностью от 3 до 5 дней использовали разведение 3:1. Исследование продуктов процессинга АРР в SHSY-5Y выполняли с использованием более высоких коэффициентов разбавления 1:3 и 1:4. (см. также Фиг. 4-6).

Морфология нейронов и синапсов: обработка первичных нейронов гиппокампа Vertigoheel® в течение 5-7 дней продемонстрировала значительное увеличение длины аксонов по сравнению с клетками, обработанными контрольным соединением. После 3 дней инкубирования клетки, обработанные Vertigoheel®, продемонстрировали удлинение аксонов в среднем на 6 мкм, через 5 дней - в среднем на 12 мкм, а после 7 дней - в среднем на 14 мкм, но только изменения через 5 и 7 дней являлись статистически значимыми.

Процессинг АРР: твердофазный ИФА АРР для клеток SHSY-5Y продемонстрировал значительное снижение sAPPα и sAPPβ после инкубирования в течение 5 ч, 12 ч, 24 ч и 72 ч при коэффициенте разбавления 1:4 (графики 6 и 7). Продолжительное инкубирование с коэффициентом разбавления 3:1 продемонстрировало лишь тенденцию к снижению уровней sAPP, однако указанный эффект возрастал при увеличении времени инкубирования и особенно при ежедневной обработке (данные не показаны).

sAPP-β и sAPP-α являются продуктами расщепления АРР секретазами. Физиологически sAPP-α обладает нейротрофными и нейропротективными свойствами и улучшает LTP и пространственную память. Роль sAPP-β изучена недостаточно. В то же время предполагают, что высокие уровни белка β-амилоида (Аβ) в головном мозге приводят к первичному токсическому инсульту, что через многочисленные механизмы продуцирует когнитивную недостаточность при болезни Альцгеймера (БА). Широко распространено мнение, что накопление Aβ, небольшого пептида с высокой склонностью к образованию агрегатов (бляшек), занимает центральное место в патогенезе БА. Поскольку количество обоих продуктов можно снизить с помощью Vertigoheel®, предполагается, что Vertigoheel® благотворно влияет на продукцию указанных нейротоксических разновидностей и, следовательно, может предотвращать образование бляшек в головном мозге.

Пример 4: Влияние Vertigoheel® на скополамин-индуцированное формирование контекстного страха и дефект социальной передачи пищевых предпочтений у мышей C57BL/6

Целью данного исследования было изучение способности Vertigoheel® облегчить скополамин-индуцированную когнитивную недостаточность у самцов мышей C57BL/6 в тестах формирования контекстного страха (CFC) и социальной передачи пищевых предпочтений (STFP). Обе модели широко используются в фармакологической промышленности для исследования памяти и обучения у животных после медикаментозного лечения. STFP оценивал производительность обонятельной памяти, в то время как CFC определял влияние Vertigoheel® на контекстную память и память о страхе.

Все эксперименты на животных проводили в соответствии с руководством Национального института здравоохранения США (NIH) по использованию лабораторных животных и уходу за ними, и были одобрены Государственным губернским управлением Южной Финляндии, номер лицензии 605/01/2006. В эксперименте использовали в общей сложности 90 самцов C57BL/6 (Charles River, Германия) в возрасте 12 недель. Животных содержали при стандартной температуре (22±1°C) и в среде с контролируемым освещением (свет включали с 7:00 до 20:00) при свободном доступе к пище и воде.

Животных распределяли по группам следующим образом:

Фаза 1, тест CFC:

15 мышей обрабатывали носителем (10 мл/кг, в/б) в течение 3 дней и носителем для скополамина (10 мл/кг, в/б) 30 мин до обучения при CFC

15 мышей обрабатывали носителем (10 мл/кг, в/б) в течение 3 дней и скополамином (1 мг/кг, 10 мл/кг, в/б) 30 мин до обучения при CFC

15 мышей обрабатывали VERTIGOHEEL® (1 мл/кг, 10 мл/кг, в/б) и скополамином (1 мг/кг, 10 мл/кг, в/б) 30 мин до обучения при CFC

15 мышей обрабатывали VERTIGOHEEL® (2 мл/кг, 10 мл/кг, в/б) и скополамином (1 мг/кг, 10 мл/кг, в/б) 30 мин до обучения при CFC

15 мышей обрабатывали VERTIGOHEEL® (1 мл/кг, 10 мл/кг, в/б) в течение 3 дней и скополамином (1 мг/кг, 10 мл/кг, в/б) 30 мин до обучения при CFC

15 мышей обрабатывали донепезилом (1 мг/кг, 10 мл/кг, в/б) и скополамином (1 мг/кг, 10 мл/кг, в/б) 30 мин до обучения при CFC

Фаза 2, тест STFP:

15 мышей обрабатывали носителем (10 мл/кг, в/б) в течение 3 дней и носителем для скополамина (10 мл/кг, в/б) 30 мин до фазы взаимодействия при STFP

15 мышей обрабатывали носителем (10 мл/кг, в/б) в течение 3 дней и скополамином (1 мг/кг, 10 мл/кг, в/б) 30 мин до фазы взаимодействия при STFP

15 мышей обрабатывали Vertigoheel® (1 мл/кг, 10 мл/кг, в/б) и скополамином (1 мг/кг, 10 мл/кг, в/б) 30 мин до фазы взаимодействия при STFP

15 мышей обрабатывали Vertigoheel® (2 мл/кг, 10 мл/кг, в/б) и скополамином (1 мг/кг, 10 мл/кг, в/б) 30 мин до фазы взаимодействия при STFP

15 мышей обрабатывали Vertigoheel® (1 мл/кг, 10 мл/кг, в/б) в течение 3 дней и скополамином (1 мг/кг, 10 мл/кг, в/б) 30 мин до фазы взаимодействия при STFP

15 мышей обрабатывали донепезилом (1 мг/кг, 10 мл/кг, в/б) и скополамином (1 мг/кг, 10 мл/кг, в/б) 30 мин до фазы взаимодействия при STFP

Введение скополамина: у животных вызывали амнезию путем внутрибрюшинного (в/б) введения (-) скополамина-HBr (1 мг/кг, в/б), за 30 мин до теста CFC и теста STFP.

Способность соединения Vertigoheel® купировать скополамин-индуцированную амнезию определяли путем его однократного (-30 мин) или 3-дневного введения до обучения в рамках теста CFC. Носитель (стерильный физиологический раствор) вводили в/б в объемной дозировке 10 мл/кг. Донепезил (1 мг/кг) вводили в/б. Для достижения конечной объемной дозировки 10 мл/кг Vertigoheel® дополнительно разбавляли стерильным физиологическим раствором в соотношении 1:4 для группы, получавшей 2 мл/кг, и 1:9 для группы, получавшей 1 мл/кг. Таким образом, доза Vertigoheel® составляла 1 и 2 мл/кг, а объемная дозировка - 10 мл/кг.

Тест контекстного формирования страха: тест контекстного формирования страха (CFC) модифицировали по сравнению с описанным в Comery et al. (2005). Обучение и тестирование проводили в течение двух дней подряд, используя систему Coulbourn FreezeFrame (Coulbourn, Уайтхолл, штат Пенсильвания, США). Тест CFC является одним из когнитивных тестов, наиболее часто используемых на грызунах, а именно на генетически модифицированных мышах с болезнью Альцгеймера. Тест основан на естественном поведении грызунов, т.е. ожидается, что животное будет оставаться полностью неподвижным ("замирание"), столкнувшись с вызывающими страх ситуацией или раздражителем. Широко исследовано участие областей мозга, отвечающих за различные аспекты тестирования CFC. Обнаружено, что миндалина участвует в регуляции памяти о страхе (памяти о раздражителе, а также памяти о контексте), тогда как гиппокамп регулирует память о контексте, в котором произошло вызвавшее страх событие (память о контексте) (LeDoux, 1994). Клинически тест CFC имеет отношение к поведению человека не только за счет его когнитивных аспектов, но и в том отношении, что формирование страха может быть достигнуто у людей, а повреждение миндалины предотвращает формирование страха (LeDoux, 2000). Его также использовали в качестве модели посттравматического стрессового расстройства (Layton and Krikorian, 2002). Показано, что различные фармакологические агенты, например, эстроген, донепезил и росиглитазон, улучшают поведение при CFC у грызунов (Gemma et al., 2004; Dong et al., 2005; Dong et al., 2006).

День 1

Обучение состояло в том, что мышь помещали в камеру, включали яркое освещение и позволяли осмотреться в течение 2 мин. Затем подавали слуховой раздражитель (1700 Гц, 80 дБ, условный раздражитель (УР)) в течение 15 с. В течение последних 2 с УР подавали 2-е электроболевое раздражение на стопы (1,5 мА; безусловный раздражитель (БР)). Данную процедуру повторяли, и спустя 30 с мышь удаляли из камеры.

День 2

Приблизительно через 20 часов после обучения мышь возвращали в ту же камеру, в которой происходило обучение (память о контексте), и регистрировали замирание с помощью компьютеризированной системы камер слежения. Для количественной оценки замирания применяли автоматизированную систему FreezeFrame, оцифровывающую видеосигнал с частотой 4 Гц и покадрово сравнивающую движение мыши. В конце 5-мин контекстного теста мышь возвращали в ее клетку. Через час регистрировали замирание в новом окружении (измененном контексте) и в ответ на раздражитель (память о раздражителе). Новое окружение представляло собой модульную тестовую камеру с другими условиями освещения, окраской и текстурами на стенах и другим материалом пола. Мышь помещали в новое окружение и использовали дискретизацию по времени для оценки замирания в течение 3 мин. Затем подавали слуховой раздражитель (1700 Гц, 80 дБ, УР) в течение 3 мин и снова оценивали замирание. Балльные оценки замирания для каждого субъекта выражали в процентах для каждой части теста (памяти о контексте, измененного контекста, памяти о раздражителе).

Социальная передача пищевых предпочтений у мышей: тест социальной передачи пищевых предпочтений выполняли через 4 недели после завершения теста CFC (период вымывания).

Парадигма социальной передачи пищевых предпочтений (STFP) включала двух социально знакомых мышей, одна из которых играла роль наблюдателя, а другая - демонстратора. Демонстратор передавал обонятельную информацию о независимо полученном опыте новой пищи наблюдателю во время социального взаимодействия после получения указанного опыта. Через 24 ч после социального взаимодействия наблюдателя тестировали на сохранение переданной информации о запахе: мышам-наблюдателям предоставляли выбор между запахом пищи, которую ел демонстратор, и некоторыми другими новыми запахами. Нормальные, здоровые мыши-наблюдатели предпочитали запах пищи, которую ел демонстратор. Это явление опирается на естественное поведение грызунов: поедание новой пищи, запах которой присутствует в дыхании здорового члена группы, является безопасным. Память в указанной задаче чувствительна к повреждениям областей мозга, имеющих решающее значение для формирования памяти у грызунов. Конкретно, поражения гиппокампа до обучения приводят к нарушениям поведения (Bunsey and Eichenbaum, 1995); кроме того, показано, что холинергические базальные отделы переднего мозга имеют важное значение для успешного выполнения задачи (Berger-Sweeney et al., 2000). Память гиппокампа, имеющую решающее значение для успешного поведения в тесте STFP, можно сравнить с вербальной памятью человека. Это память именно того типа, которая нарушается, например, уже на ранней стадии болезни Альцгеймера. Показано, что, например, эстроген и вальпроевая кислота эффективно регулируют поведение при STFP у грызунов (Sgobio et al., 2010; Clipperton et al., 2007).

Протокол модифицировали по сравнению со способом, описанным Wrenn (2004). Мышей содержали по группам в соотношении не более четырех мышей-наблюдателей на одного демонстратора. До эксперимента животных кормили группами с неограниченным доступом к подножному корму и воде. В конце фазы группового кормления подножный корм удаляли из клетки и заменяли двумя чашками порошкового корма, которые помещали в клетки, где содержались мыши, так что мыши привыкали есть порошковый корм из чашек. Указанная фаза приучения занимала 4 дня.

День 0

После фазы приучения мышь-демонстратора удаляли из клетки и размещали отдельно без доступа к пище. Мышей-демонстраторов не включали ни в одну из экспериментальных групп в данном эксперименте.

День 1

Клетки мышей-наблюдателей заменяли на чистые и удаляли из клеток всю пищу. Это происходило за 4 ч до запланированного взаимодействия с мышью-демонстратором.

После 24-ч периода лишения пищи каждую мышь-демонстратора помещали в пустую клетку с чашкой порошкового корма, ароматизированного корицей (1% масс/масс) или какао (2% масс/масс). Всех мышей и группы делили поровну на получавших пищу, ароматизированную корицей и какао. Каждой мыши-демонстратору давали 1 ч 30 мин на поедание ароматизированной пищи. Непосредственно после этого их помещали обратно в исходные клетки с мышами-наблюдателями и позволяли взаимодействовать с наблюдателями - соседями по клетке в течение 30 мин. Затем демонстраторов удаляли, а мышей-наблюдателей оставляли в покое на 24 ч.

День 2

Через 24 ч после этапа взаимодействия каждую мышь-наблюдателя помещали в свою отдельную тестовую клетку и позволяли питаться в течение 1 ч 30 мин. Тестовые клетки содержали по одной чашке каждого ароматизированного корма (т.е. ароматизированного корицей и какао). Один из запахов, какао или корица, являлся «пищей с раздражителем» (представленной демонстратором за 24 часа до этого), а другой являлся «пищей без раздражителя» (новый запах, не знакомый ранее). Расположение новой пищи в клетке (в передней или задней части клетки) было уравновешено среди мышей. Через 1 ч 30 мин мышей-наблюдателей возвращали в их домашние клетки и к свободному кормлению подножным кормом.

Для анализа данных все чашки с ароматизированной пищей взвешивали до и после еды как для мышей-демонстраторов, так и наблюдателей. Данные выражали в виде 1) процентов от общего потребления, приходившихся на пищу с раздражителем, и 2) количество (г) съеденной пищи с раздражителем по сравнению с неориентирной.

Все соединения (носитель, скополамин, донепезил; в/б, 10 мл/кг) вводили за 30 мин до фазы взаимодействия между мышью-демонстратором и наблюдателем в день 1. Vertigoheel® однократно вводили в то же время, что и скополамин, либо Vertigoheel® (1 мл/кг, в/б) вводили за 3 дня до Дня 1 теста STFP, как и в тесте CFC.

Все значения представлены как среднее±стандартное отклонение (СО) или стандартная ошибка среднего (SEM); различия считали статистически значимыми на уровне Р<0,05. Статистический анализ проводили с применением статистического программного обеспечения StatsDirect. Для теста CFC различия между средними значениями анализировали с помощью однофакторного дисперсионного анализа с последующим апостериорным тестом Даннетта (сравнение с контрольной (= носитель с обработкой скополамином) группой) и двухвыборочного t-критерия для независимых выборок (носитель+носитель по сравнению со скополамином+носитель). Для теста STFP количество съеденной пищи с раздражителем по сравнению с пищей без раздражителя анализировали с использованием двустороннего t-критерия в каждой экспериментальной группе.

Результаты

Социальная передача пищевых предпочтений у мышей: тест контекстного формирования страха проводили в возрасте 12 недель. Влияние обработки Vertigoheel® на замирание в тесте CFC представлены на Фигуре 1. Мыши, обработанные скополамином, проводили значительно меньше времени в замершем состоянии для памяти о контексте по сравнению с мышами, обработанными носителем, что указывало на нарушение когнитивных функций, вызванное обработкой скополамином (двухвыборочный t-критерий для независимых выборок, * p<0,05). В группах, получавших скополамин, существенные различия в балльных оценках замирания отсутствовали, хотя существовала незначимая тенденция к усилению замирания в памяти о контексте у мышей, получавших Vertigoheel® в течение 3 дней (двухвыборочный t-критерий для независимых выборок: р=0,168) и у мышей, получавших Донепезил (двухвыборочный t-критерий для независимых выборок: р=0,075) и в памяти о раздражителе у мышей, получавших однократную дозу 1 мл/кг Vertigoheel® (двухвыборочный t-критерий для независимых выборок: р=0,090) по сравнению с мышами, получавшими скополамин (однофакторный дисперсионный анализ: p>0,05); см. также Фиг. 7.

Контекстное формирование страха: тест контекстного формирования страха проводили в возрасте 12 недель. Мыши, обработанные скополамином, проводили значительно меньше времени в замершем состоянии при вспоминании контекста по сравнению с мышами, обработанными носителем, что указывало на нарушение когнитивных функций, вызванное обработкой скополамином (двухвыборочный t-критерий для независимых выборок, * р<0,05, данные не показаны). В группах, получавших скополамин, существенные различия в балльных оценках замирания отсутствовали, хотя существовала незначимая тенденция к усилению замирания в памяти о контексте у мышей, получавших Vertigoheel® в течение 3 дней (двухвыборочный t-критерий для независимых выборок: р=0,168) и у мышей, получавших Донепезил (двухвыборочный t-критерий для независимых выборок: р=0,075). Влияние обработки Vertigoheel® на замирание в тесте "памяти о раздражителе" представлено на Фигуре 8. Мышей обрабатывали однократной дозой 1 мл/кг Vertigoheel® (двухвыборочный t-критерий для независимых выборок: р=0,090) демонстрировали увеличение времени замирания по сравнению с мышами, получавшими скополамин (однофакторный дисперсионный анализ: р>0,05), что указывает на улучшение памяти после Vertigoheel® (см. также Фиг. 8).

Таким образом, обработка скополамином вызывала ухудшение как в контекстной памяти в тесте формирования контекстного страха, так и в тесте социальной передачи пищевых предпочтений. В тесте CFC существенное влияние обработки Vertigoheel® на дефекты памяти, вызванные скополамином, отсутствовало, хотя существовала незначимая тенденция к усилению контекстной памяти у мышей, получавших 1 мл/кг Vertigoheel® в течение 3 дней и к усилению памяти о раздражителе у мышей, получавших однократную дозу 1 мл/кг Vertigoheel®. Таким образом, возможно, что лечение однократной дозой Vertigoheel® влияло на функции миндалины, тогда как более длительное, 3-дневное лечение, оказывало более мощное воздействие на функции гиппокампа. Кроме того, существовала незначимая тенденция к усилению контекстной памяти при лечении эталонным соединением, донепезилом. Указанное частичное купирование скополамин-индуцированной амнезии находилось в пределах нормального диапазона, обычно наблюдаемого при лечении донепезилом. В тесте STFP скополамин-индуцированный дефект памяти об ориентирной пище купировали как у мышей, получавших однократную дозу 2 мл/кг Vertigoheel®, так и у мышей, получавших 1 мг/кг донепезила. Поскольку считается, что приблизительно 70% доля съеденной пищи с раздражителем от общего потребления указывает на хорошее предпочтение по отношению к ориентирной пище, то обработка скополамином довольно часто не приводила к значимому снижению доли съеденной пищи с раздражителем от общего потребления. Это объясняется главным образом тем, что уже 50% доля съеденной пищи с раздражителем является уровнем возможности. Эти данные свидетельствуют, что Vertigoheel® улучшает обонятельную память.

Пример 5: Влияние Vertigoheel® на пассивное избегание при дефекте, вызванном скополамином, у крыс Wistar.

Целью исследования было изучение возможности облегчения когнитивного дефицита, вызванного введением скополамина, с помощью лечения Vertigoheel®. Дефицит обучаемости и памяти анализировали с помощью теста пассивного избегания (РА). Этот тест, в частности, исследует долговременную память.

Все эксперименты на животных проводили в соответствии с руководством Национального института здравоохранения США (NIH) по использованию лабораторных животных и уходу за ними, и были одобрены Государственным губернским управлением Южной Финляндии, номер лицензии 605/01/2006. В эксперименте использовали в общей сложности 90 взрослых самцов крыс Wistar (Charles River, Германия) массой 225-350 г. Животных содержали при стандартной температуре (22±1°C) и в среде с контролируемым освещением (свет включали с 7:00 до 20:00) при свободном доступе к пище и воде.

Фаза 2, тест РА:

15 крыс обрабатывали носителем (2 мл/кг, в/б) в течение 3 дней и носителем для скополамина (2 мл/кг, в/б) 30 мин до РА

15 крыс обрабатывали носителем (2 мл/кг, в/б) в течение 3 дней и скополамином (1 мг/кг, 2 мл/кг, в/б) 30 мин до РА

15 крыс однократно обрабатывали VERTIGOHEEL® (2 мл/кг, в/б) в день тестирования совместно с обработкой скополамином (1 мг/кг, 2 мл/кг, в/б) 30 мин до РА

15 крыс обрабатывали VERTIGOHEEL® (1 мл/кг, в/б) в течение 3 дней и скополамином (1 мг/кг, 2 мл/кг, в/б) 30 мин до РА

15 крыс обрабатывали VERTIGOHEEL® (2 мл/кг, в/б) в течение 3 дней и скополамином (1 мг/кг, 2 мл/кг, в/б) 30 мин до РА

15 крыс обрабатывали донепезилом (1 мг/кг, 2 мл/кг, в/б) и скополамином (1 мг/кг, 2 мл/кг, в/б) 30 мин до РА

Введение скополамина: у животных вызывали амнезию путем внутрибрюшинного (в/б) введения скополамина (1 мг/кг, 2 мл/кг, в/б) за 30 минут до обучения в Т-образном лабиринте или тесте пассивного избегания (РА).

Доставка лекарственных средств: все препараты (носитель, скополамин, донепезил; в/б, 2 мл/кг) вводили за 30 мин до теста PA. Vertigoheel® (1 или 2 мл/кг) вводили либо однократно в то же время, что и скополамин, либо Vertigoheel® (1 или 2 мл/кг, в/б) вводили за 3 дня до теста РА.

Пассивное избегание: поведение пассивного избегания тестировали в системе Gemini Avoidance (San Diego Instruments, США). Данный поведенческий тест состоял из однократного обучающего испытания с последующим тестовым испытанием 24 ч спустя. При обучающем испытании каждую крысу помещали в начальную камеру на 15 с для адаптации, после чего начальную камеру освещали и открывали гильотинную дверь в темную камеру. Когда крыса переходила на темную сторону, гильотинную дверь закрывали, и животное получало 0,4-мА электроболевое раздражение стоп в течение 3 с. Время перехода в темную камеру записывали. Тестовое испытание выполняли спустя 24 ч; оно было идентично обучающему испытанию за исключением того, что если крыса входила в темную камеру, гильотинную дверь закрывали, но электроболевое раздражение не подавали. Максимальная продолжительность теста составляла 600 с в каждый день тестирования. Значения задержки выхода во все дни, а также различие задержки выхода между испытаниями при приобретении и удержании в памяти использовали в статистических анализах.

Все значения представлены как среднее±стандартная ошибка среднего (SEM); различия считали статистически значимыми на уровне р<0,05. Статистический анализ проводили с применением статистического программного обеспечения StatsDirect. Различия между средними значениями анализировали с помощью однофакторного дисперсионного анализа с последующим тестом Даннетта (сравнение с контрольной (=носитель) группой) и двухвыборочного t-критерия для независимых выборок (носитель+носитель по сравнению со скополамином+носителем). Кроме того, оценку двухвыборочного t-критерия для независимых выборок проводили между группами, получавшими скополамин+носитель и лекарственное средство+скополамин.

Результаты

В 1 день обучения группа, получавшая скополамин, не отличалась от крыс, получавших носитель, по отношению к входу в темную камеру в тесте пассивного избегания при измерении времени задержки (двухвыборочный t-критерий для независимых выборок, р>0,1). Кроме того, группы, получавшие лекарственное средство, не отличались от группы, получавшей скополамин в день 1, что указывало на нормальное поведение крыс. В испытании удерживания во 2 день тестирования крысы, получавшие скополамин, продемонстрировали снижение задержки по сравнению с крысами, обработанными носителем, что указывало на ухудшение удержания данных в памяти в данной задаче (двухвыборочный t-критерий для независимых выборок, р<0,0001). В то же время для групп, получавших лекарственное средство, дисперсионный анализ был неэффективен. В дозе 2 мл/кг Vertigoheel® мог купировать скополамин-индуцированное нарушение памяти (двухвыборочный t-критерий для независимых выборок между группами, получавшими скополамин и 2 мл/кг Vertigoheel®, р<0,05, Фиг. 9).

Полученные результаты показывают, что острое лечение Vertigoheel® (в/б) в дозе 2,0 мл/кг несколько облегчало нарушение памяти, индуцированное скополамином, при тестировании взрослых крыс Wistar в тесте пассивного избегания. Можно предположить, что Vertigoheel® влиял на области гиппокампа, поскольку для удерживания в тесте РА необходимо функционирование гиппокампа.

Пример 6: Влияние Vertigoheel® в тесте распознавания нового объекта

Влияние Vertigoheel® на когнитивную деятельность крыс оценивали с помощью теста распознавания нового объекта. Распознавание измеряли по способности крыс различать знакомый и новый объекты после 24-ч задержки удерживания для индуцирования естественного забывания у здоровых животных.

Внутрибрюшинное введение Vertigoheel® (0,1, 1 и 2 мл/кг) выполняли за 40 мин перед испытанием по приобретению памяти.

Получение лекарственного средства: Vertigoheel® поставлялся Heel в виде готового рабочего раствора. Все составы при необходимости получали в свежем виде с помощью Neurofit SAS каждый день.

Vertigoheel® тестировали в дозах 0,1, 1 и 2 мл/кг, вводимых в/б. Для получения доз 0,1, 1 и 2 мл/кг у крыс при использовании объемной дозировки 2 мл/кг рабочий раствор дополнительно разбавляли в 20 и 2 раза для получения 0,1 и 2 мл/кг, соответственно. Разбавление проводили 0,9% NaCl (физиологическим раствором). Обработку выполняли за 40 мин до испытания по приобретению памяти. Донепезил растворяли в физиологическом растворе was и вводили п/о в объеме 2 мл/кг. Эталонное соединение вводили за 30 мин до испытания по приобретению памяти.

Тестируемые животные: в исследовании использовали 72 самцов крыс Wistar. Их приобрели в (Жанвье; Ля Жене Сен Иль - Франция). Их погруппно содержали в клетках (12-14 животных на клетку), содержащих подстилку (Mixal, Safe, Эпине-сюр-Орж, Франция) и в комнате с контролируемой температурой (21-22°C), при относительной влажности 26-41% и обращенном цикле свет-темнота (12 ч/12 ч; освещение включено: 17:30-05:30; освещение выключено: 05:30-17:30). Доступ к пище (А04; Safe, Эпине-сюр-Орж, Франция) и воде предоставляли без ограничений.

Аппарат: аппарат состоял из открытой клетки из акрилового стекла (100 см × 100 см со стенками 45 см), в которой животные могли свободно перемещаться. Одним из объектов являлся металлический шар, а другим - черный ящик. Указанные объекты обладали аналогичным объемом. Приближение животного к объектам записывали с помощью системы видеонаблюдения (Viewpoint, Франция).

Экспериментальная процедура: крыс случайным образом назначали в одну из различных экспериментальных групп. Каждое животное идентифицировали по названию группы, номеру клетки, серии (дню) эксперимента и количеству (1-10) меток, нанесенных несмываемыми чернилами на хвост.

За день до тестирования крысам позволяли обследовать открытое поле в течение 15-мин ознакомительной сессии. На следующий день на периферию воображаемого центрального квадрата (30 см × 30 см) открытого поля помещали объект А, называемый "знакомым объектом". Крыс вводили в указанную экспериментальную ситуацию (испытание приобретения памяти) на 10 минут. Животных, не проявлявших двигательной активности (полная неподвижность) или не обследовавших объект, исключали. После 24-ч задержки для индукции естественного забывания (Roncarati et al., 2009) рядом с объектом А, который оставался на том же месте, что и при испытании приобретения памяти, помещали объект В ("новый объект"). Каждое животное вводили в указанную ситуацию на 10 мин. Время на обследование каждого из 2 объектов во время испытания удержания (tA и tB, соответственно), регистрировали раздельно. Обследованием считалось направление носа на объекты с расстояния ≤2 см.

Животных, не проявлявших двигательной активности (полностью неподвижных) или не обследовавших объекты дольше чем в течение общего времени 5 с (время на объект А+время на объект В), исключали.

В одной группе крыс (группа №1, см. Таблицу), испытание по удержанию проводили через 30 ми после приобретения памяти вместо 24 ч. Деятельность указанных крыс считали оптимальным уровнем распознавания, поскольку спонтанное забывание еще не произошло.

Расчет: память о распознавании оценивали с помощью индекса распознавания (RI), соответствующего доле (%) времени, потраченного в испытании удерживания на исследование объекта В, по отношению к общему времени, потраченному на исследование знакомого объекта А и нового объекта В (Bohme et al., 2004). RI рассчитывали следующим образом: RI=tB/(tA+tB)×100, где t - время.

Индекс распознавания также выражали в виде доли от количества визитов (контактов) к новому объекту, с поправкой на общее количество визитов к обоим объектам, и рассчитывали следующим образом: RI=nB/(nA+nB)×100, где n - количество контактов.

Однофакторный дисперсионный анализ (ANOVA) с последующей оценкой минимального защищенного значимого различия Фишера применяли для сравнения пар групповых средних, p≤0,05 считали значимым.

Результаты

24-ч задержка между испытаниями приобретения и удержания памяти приводила к значительному ухудшению распознавания нового объекта крысами. Данное снижение составляло 27 и 32% для индекса распознавания, рассчитываемого по времени (Фиг. 10) по визитам (Фиг. 11), соответственно. Указанное естественное забывание купировали обработкой донепезилом. Донепезил ассоциирован с увеличением индекса распознавания, рассчитываемого по времени и по визитам, на 11 и 18%, соответственно. Влияние донепезила было значимым для индекса распознавания, рассчитываемого по визитам.

Vertigoheel® вызывал зависимое от дозы повышение распознавания нового объекта. Фактически, индекс распознавания, рассчитываемый по времени, возрастал на 5, 9 и 16% при дозах 0,1, 1 и 2 мл/кг Vertigoheel®, соответственно (Фиг. 10). Данный эффект был значимым для дозы 2 мл/кг (Фиг. 11). Кроме того, индекс распознавания, рассчитываемый по визитам, возрастал на 3, 17 и 18% при дозах 0,1, 1 и 2 мл/кг Vertigoheel®, соответственно. Данный эффект был значимым для доз 1 и 2 мл/кг.

Настоящее исследование проводили с целью оценки когнитивного эффекта Vertigoheel® в тесте распознавания нового объекта у крыс. При использовании протокола с 24-ч задержкой удержания для стимулирования естественного забывания, в/б введение Vertigoheel® вызывало дозозависимое увеличение распознавания нового объекта, что указывает на свойство данного соединения улучшать память. Данный эффект был значимым для доз 1 и 2 мл/кг.

Задача распознавания объекта является способом измерения специфических форм эпизодической памяти у крыс и мышей. Она основана на спонтанном поведении грызунов и может считаться тестом удержания в памяти, полностью свободным от компонентов долговременной памяти. Кроме того, она не основана на обычных положительных или отрицательных подкрепляющих стимулах, например, пище или электроболевом раздражении, которые усложняют интерпретацию влияния лекарственных средств на память. Распознавание объекта преимущественно применяют в качестве доклинического теста для исследования улучшения памяти за счет ингибиторов ацетилхолинэстеразы (АХЭИ), например, допенезила, применяемых для лечения БА. Показано, что ингибиторы АХЭ стимулируют процессы приобретения памяти, а не консолидации или восстановления информации об объекте. В настоящем исследовании Vertigoheel® вызывал явное улучшение приобретения информации об объекте со степенью, сопоставимой с влиянием донепезила.

Пример 7: Влияние Vertigoheel® на тест чередования в Т-образном лабиринте у мышей

Настоящую работу выполняли с целью оценки способности Vertigoheel® купировать дефект памяти, вызванный скополамином у мышей, измеряемой по увеличению чередования в тесте с Т-образным лабиринтом. Спонтанное чередование Т-образного лабиринта является поведенческим тестом для измерения исследовательского поведения у животных, в особенности моделей расстройств ЦНС у грызунов. Спонтанное чередование является врожденным стремлением грызунов чередовать свободный выбор в Т-лабиринте в серии поочередных пробегов. Эта последовательная процедура основывается на кратковременной памяти и чувствительна к различным фармакологическим манипуляциям с процессами памяти. Указанный тест основан на желании грызунов исследовать новое окружение (например, они предпочитают посещать новую ветку лабиринта, а не знакомую ветку). В указанной задаче участвуют различные части головного мозга, в том числе гиппокамп, септа, базальные структуры переднего мозга и префронтальная кора. Вначале животных помещали в начальную ветку лабиринта. Первое испытание являлось принудительным испытанием с последующими 14 испытаниями свободного выбора, в которых животные могли выбирать левую или правую ветку. При повторных испытаниях животные должны демонстрировать меньшее стремление идти в ранее посещенную ветку. Указанный тест применяют для количественной оценки когнитивных дефектов у мышей и оценки влияния медикаментов на познавательную способность.

Vertigoheel® поставлялся Heel в виде готового рабочего раствора. Vertigoheel® тестировали в дозах 1 и 2 мл/кг, вводимых в/б. Для получения доз 1 и 2 мл/кг у мышей при использовании объемной дозировки 10 мл/кг рабочий раствор дополнительно разбавляли в 10 и 5 раз, соответственно. Разбавление проводили 0,9% NaCl (физиологическим раствором).

Донепезил растворяли в физиологическом растворе и вводили в/б в объеме 10 мл/кг.

Все растворы, за исключением раствора донепезила, получал и кодировал лаборант, не являвшийся лаборантом, проводившим тест Т-образного лабиринта.

Скополамин (-(-)скополамина гидрохлорид) приобрели в Sigma (Франция), растворяли в физиологическом растворе и вводили в/б в объемной дозировке 10 мл/кг. Донепезил получили в подарок от Galantos Pharma GmbH (Германия).

Тестируемые животные: в исследовании использовали 4-5-недельных самцов мышей CD-1 (Жанвье; Ля Жене Сен Иль - Франция). Их погруппно (10 мышей на клетку) содержали в комнате с контролируемой температурой (21-22°C), при обращенном цикле свет-темнота (12 ч/12 ч; освещение включено: 17:30-05:30; освещение выключено: 05:30-17:30); и неограниченном доступе к пище и воде.

Расписание обработки: при остром лечении Vertigoheel® или носитель (физиологический раствор) в/б вводили за 40 мин перед испытанием в Т-образном лабиринте. При субхроническом лечении Vertigoheel® или носитель (физиологический раствор) в/б вводили в течение 3 дней один или два раза в день. Последнюю обработку выполняли за 40 мин до испытания в Т-образном лабиринте. Донепезил (0,3 мг/кг) в/б вводили за 20 мин до испытания в Т-образном лабиринте; скополамин (1 мг/кг) или его носитель (физиологический раствор) в/б вводили за 20 мин до испытания в Т-образном лабиринте.

Экспериментальная процедура: мышей случайным образом назначали в одну из различных экспериментальных групп. Каждое животное идентифицировали по названию группы, номеру клетки, серии (дню) эксперимента и количеству (1-10) меток, нанесенных несмываемыми чернилами на хвост. Аппарат Т-образный лабиринт был сделан из серого плексигласа и содержал главный коридор (55 см длины × 10 см ширины × 20 см высоты) и две ветви (30 см длины × 10 см ширины × 20 см высоты), расположенные под углом 90 градусов по отношению к основному коридору. Начальная камера (15 см длины × 10 см ширины) отделялась от основного коридора сдвижной дверью. Кроме того, сдвижные двери использовали для закрывания конкретных ветвей во время задачи принудительного чередования.

Протокол эксперимента состоял из одной сессии, которая начиналась с 1 "принудительного" испытания с последующими 14 испытаниями "свободного выбора". Во время первого испытания "свободного выбора" животное удерживали в течение 5 с в начальной ветке, а затем выпускали, блокируя левую или правую целевую ветку с помощью горизонтальной двери. Затем животное преодолевало лабиринт, в конечном итоге проходя в открытую целевую ветку, и возвращалось в исходное положение. Сразу после возвращения животного в исходное положение открывали левую или правую целевую дверь и позволяли животному свободно выбирать между левой и правой целевыми ветками (испытания "свободного выбора"). Животное считали вошедшим в одну из веток, когда оно входило в данную ветку 4 лапами. Сессию завершали и животное выпускали из лабиринта после выполнения 14 испытаний свободного выбора или по истечении 10 мин, в зависимости от того, какое из этих событий происходило раньше.

После каждого животного аппарат чистили спиртом (70°). Из лабиринта удаляли мочу и фекалии. Во время испытаний по возможности минимизировали манипуляции с животным и видимость оператора.

Долю чередования по 14 испытаниям свободного доступа определяли для каждой мыши и использовали в качестве показателя функционирования кратковременной памяти. Указанную долю выражали как количество входов в другую ветку Т-образного лабиринта в последовательных испытаниях (т.е. левую-правую-левую-правую и т.д.).

К полученным данным применяли дисперсионный анализ (ANOVA). Для попарного сравнения применяли минимальное защищенное значимое различие Фишера. Р≤0,05 считали значимым. Купирование вызванного скополамином дефекта памяти рассчитывали путем принятия соответствующего ответа при введении физиологического раствора/носителя за 100%, а ответа в группе, получавшей скополамин/носитель, - за 0% купирование.

Результаты

Концентрация 1 мг/кг скополамина была ассоциирована со значимым снижением спонтанного чередования (приблизительно на 34%) по сравнению с мышами, получавшими инъекции физиологического раствора.

Дезорганизацию чередования, вызванную скополамином, купировали путем обработки 0,3 мг/кг донепезила, повышавшей чередование на 24%. Степень восстановления поведения мышей, ассоциированная с лечением с применением донепезила, составила 72%.

Лечение с применением Vertigoheel® вызывало повышение чередования у мышей, обработанных скополамином. Данное повышение составило 24 и 25% для острых доз 1 и 2 мл/кг, соответственно. Восстановление познавательной деятельности составило 72 и 74% для доз 1 и 2 мл/кг, соответственно. Данное повышение составило 26 и 24% для субхронического лечения в дозе 1 мл/кг один или два раза в день, соответственно. Восстановление познавательной деятельности составило 77 и 72% для субхронического лечения в дозе 1 мл/кг один или два раза в день, соответственно. Статистически значимые различия между эффектами, вызванными различной обработкой Vertigoheel®, отсутствовали.

Изменения, вызванные Vertigoheel®, статистически не отличались от изменений в группе, получавшей скополамин/донепезил (см. также Фиг. 12).

В настоящем исследовании мы пытались оценить усиление познавательных способностей, вызванное препаратом Vertigoheel®. Исследования проводили на мышах, обработанных скополамином, путем измерения возрастания спонтанного чередования в Т-образном лабиринте.

Как и в результатах, описанных в литературе, донепезил приводил к значительному увеличению спонтанного чередования у мышей, обработанных скополамином, что указывает на улучшение памяти в анализе Т-образного лабиринта.

Vertigoheel® вызывал значительное увеличение спонтанного чередования у мышей, обработанных скополамином, что указывает на улучшение памяти мышей, обработанных скополамином, в анализе Т-образного лабиринта с помощью Vertigoheel®. Кроме того, влияние Vertigoheel® было сравнимым с влиянием 0,3 мг/кг донепезила.

Отмечено, что однократной 1-ч предварительной обработки Vertigoheel® достаточно для того, чтобы произвести эффект, сравнимый с эффектом субхронического лечения. Таким образом, очень вероятно, что Vertigoheel® содержит быстродействующее(ие) начало(а), ответственные за улучшение познавательных функций у мышей в парадигме Т-образного лабиринта. Кроме того, данный эффект, по-видимому, является оптимальным уже после однократной обработки Vertigoheel®. В то же время, пока неизвестно, достижима ли более высокая эффективность в диапазоне более низких доз. Требуются дополнительные эксперименты для разрешения указанного вопроса.

Указанные данные подтверждают роль сверхвысоких дозировок Vertigoheel® как церебрально-активного препарата, связанную с повышенной эффективностью обработки нейронов и производительностью памяти. Эти данные обеспечивают механистическое доказательство усиления познавательной активности под действием Vertigoheel®. Таким образом, Vertigoheel® является потенциальным препаратом, применимым в качестве дополнительной фармакологической терапии при деменции.

1. Способ лечения и/или профилактики нейродегенеративного расстройства или заболевания у страдающего от него субъекта, причем указанный способ включает введение указанному субъекту композиции Vertigoheel® в количестве от 1 мл/кг до 2 мл/кг массы тела субъекта, которого лечат, в день.

2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что указанное нейродегенеративное расстройство или заболевание ассоциировано с нарушением когнитивных функций.

3. Способ по п. 2, отличающийся тем, что указанное нарушение когнитивных функций предотвращают или облегчают.

4. Способ по любому из пп. 1-3, отличающийся тем, что указанное нейродегенеративное заболевание или расстройство представляет собой болезнь Альцгеймера.

5. Способ по п. 4, отличающийся тем, что процессинг белка-предшественника бета-амилоида, сопутствующий болезни Альцгеймера, снижается.

6. Способ по любому из пп. 1-4, отличающийся тем, что указанное нейродегенеративное заболевание или расстройство представляет собой амнезию, дефицит обучаемости и памяти, боковой амиотрофический склероз, ограниченную атрофию головного мозга, кортикобазальную дегенерацию, дегенерацию нервной системы, вызванную алкоголем, неспецифическое дегенеративное заболевание нервной системы, дегенеративный синдром, диабетическую полиневропатию, эпилепсию, атаксию Фридрейха, лобно-височную деменцию и паркинсонизм 17 хромосомы, болезнь Хантингтона, умеренные когнитивные нарушения, болезнь Пика, неклассифицированные дегенеративные заболевания или расстройства нервной системы, прогрессирующую изолированную афазию, прогрессирующий надъядерный паралич, неклассифицированную сенильную дегенерацию головного мозга, спинально-церебеллярную атаксию/дегенерацию, умственную отсталость, повреждение спинного мозга, забывчивость и болезнь Паркинсона.

7. Способ по любому из пп. 1-6, отличающийся тем, что за счет введения композиции усиливается рост нейронов.

8. Способ по любому из пп. 1-7, отличающийся тем, дополнительно включает введение по меньшей мере одного дополнительного фармацевтически активного ингредиента, выбранного из группы, состоящей из: донепезила, ривастигмина, галантамина, такрина, мемантина, каптоприла, этанерцепта, Gingko biloba, витамина В12, ресвератрола, женьшеня, экстракта зеленого чая, витамина Е, леводопы, прамипексола дигидрохлорида моногидрата и разагилина.