Композиция на основе наночастиц диоксида церия и полисахаридов бурых водорослей для лечения ран

Группа изобретений относится к области медицины и предназначена для лечения ран, ожогов, воспалительных состояний кожи и слизистых оболочек. Композиция наружного применения для лечения ран и деструктивных поражений слизистой и кожи млекопитающих содержит эффективное количество наночастиц оксида церия, фармацевтически приемлемый носитель, целевую добавку и воду. Указанный носитель включает водорастворимые производные целлюлозы и водорастворимые полисахариды бурых водорослей - пектин, фукоидин и альгинат. Носитель выполнен в мягкой нетоксичной, биосовместимой и проницаемой для влаги и газов форме. Целевую добавку выбирают из ряда: иммуномодуляторов, антибактериальных препаратов, стимуляторов репаративных процессов, анальгетиков, анестетиков, противовоспалительных агентов, антиоксидантов, витаминов, полисахаридов или их смесей. Компоненты используются в заявленных количествах. Другим воплощением является применение указанной композиции для приготовления лекарственного средства для нанесения на поверхность кожи и раны при лечении и восстановлении кожного покрова и мягких тканей. Также, обеспечивается контейнер для размещения и последующего наружного применения указанной композиции. Использование группы изобретений позволяет повысить эффективность лечения ран, ожогов, воспалительных состояний кожи и слизистых оболочек за счет синергетического действия компонентов композиции, а также обеспечивает простоту и удобство применения в процессе лечения. 3 н. и 6 з.п. ф-лы, 4 ил., 1 табл., 4 пр.

 

Настоящее изобретение относится к области разработки терапевтических композиций и их применению для заживления ран, которые расположены на коже или на влажных эпителиальных тканях, слизистых оболочках млекопитающих. Кроме лечения механического повреждения участка кожи, мышц и мягких тканей млекопитающего, данную композицию можно применять для лечения термических и химических ожогов, некротических и экссудативных ран и язв.

Уровень техники

Плохое заживление ран является причиной многочисленных научных исследований для разработки новых композиций и препаратов для лечения. Сложность лечения состоит в том, что в ходе лечения процесс заживления раны проходит через этапы снятия воспаления, этап восстановления активности клеток, этап пролиферации, этап восстановления кожного покрова, при этом каждый этап содержит свои требования к препарату и способу его применения. Кроме этого необходимо чтобы свойства препарата обеспечивали воздухопроницаемость и защиту раны от внешних вирусов и бактерий.

При экспериментальном исследовании различных средств для лечения ран и дефектов кожи было установлено, что можно значительно повысить эффективность лечения за счет применения эффективных антиоксидантов. Полезные свойства применения антиоксидантов при лечении ран изучаются длительное время. Эффективный пример применения антиоксидантов для лечения ран млекопитающих описан в патенте РФ №2280448 [5]. В изобретении описано средство на основе рекомбинантного белка пероксиредоксина 6 (Prx VI), который обеспечивает эффективную защиту органов от воспалительных процессов, вызванных механическими повреждениями кожи и ткани в результате травм, инъекций лекарственных препаратов или хирургических операций. При лечении поражений кожи раствор композиции наносят тонким слоем и/или делают аппликацию на место поражения. Получение рекомбинантного белка достаточно дорогостоящая процедура, что ограничивает его применение.

К другому типу антиоксиданта, используемого для лечения ран можно отнести наночастицы на основе оксида церия. Известен ряд публикаций, в которых обсуждаются возможности применения наночастиц оксида церия для заживления ран. В статье [6] Revathy Davan использованы наночастицы оксида церия размером 160 нм изготовленных с использованием простого и эффективного золь-гель процесса. Отмечается, что применение 2% наноцерия увеличило ранозаживляющую активность в значительной степени.

В работе Chigurupati S. et al. [7] приведены данные о том, что местное применение водорастворимых наночастиц оксида церия (Nanoceria) ускоряет заживление полнослойной кожной раны у мышей за счет усиления пролиферации и миграции фибробластов, кератиноцитов и эндотелиальных клеток сосудов. В статье О.A. et al. [18] приведены данные о том, что диоксид церия стимулировал заживление ран, что проявлялось в усадке области ожоговой раны (в 1,5 раза) и интенсификации (в 2,4 раза) краевой эпителизации.

Известна заявка на изобретение США № US 2013195927 [8] в которой описана местная композиция, способствующая заживлению раны, содержащая: эффективное количество наночастиц церия для обработки раны, а также фармацевтически приемлемый носитель в форме, предназначенной для местного введения субъекту. Композиция для заживления ран может быть использована в форме, выбранной из группы, состоящей из раствора, суспензии, спрея, крема, геля, пены, мази, лосьона и порошка. Кроме этого наночастицы оксида церия могут быть нанесены на повязку, выбранную из группы, состоящей из трансдермального пластыря, подушечки, порошка, матрицы и повязки. Раствор с наночастицами нанесен внутри и/или нанесен на поверхность повязки с использованием любого подходящего метода, известного в данной области, например, путем покрытия, распыления или погружения.

В работе Naseri-Nosar М. et al. [9] проведено исследование по включению наночастиц оксида церия (CeO₂) в поли (ε-капролактон)/желатиновую пленку для разработки потенциального раневого перевязочного материала. Пленки с содержанием 1.5% наночастиц CeO₂ были выбраны в качестве оптимальных для прижизненного исследования раны у крыс. К недостатку применения желатиновых пленок можно отнести невысокую паропроницаемость и отсутствие в их составе биологически активных компонентов, способствующих заживлению раны.

Основная проблема, которую необходимо решить при использовании наночастиц оксида церия для лечения повреждений кожи, заключается в необходимости обеспечить длительность нахождения препарата на поверхности повреждения. Это может быть достигнуто путем включения частиц диоксида церия в гелевую или мазевую основу, которая бы обеспечивала постепенное высвобождение наночастиц в рану, при этом не уменьшая их антиоксидантных свойств.

Известно изобретение [1] которое рассматривает композиции гидрогелей, которые изготовлены из полисахарида и двух или более дополнительных компонентов. Субъективные гидрогелевые композиции характеризуются тем, что они способны связывать ткань как в мокрой (например, в крови), так и в сухой среде, где адгезия композиции к ткани является физиологически приемлемой. Еще одна особенность этих композиций состоит в том, что они хорошо переносятся и не вызывают существенного воспалительного ответа. Такие композиции могут обеспечивать множество желательных качеств, таких как комбинацию любого из следующих факторов: кровоостанавливающие свойства, адгезионные свойства, повторная васкуляризация, биосовместимость, бактерицидные, бактериостатические и/или фунгицидные свойства, ремоделирование тканей и/или создание каркаса для тканевой инженерии, регенерация и/или клеточный посев, ферментативные или гидролитические пути деградации, набухание, расчетное время пребывания, спроектированные вязкости, активация температуры или энергии, включение агентов для визуализации в условиях визуализации (рентгенография, КТ, МРТ).

Известно изобретение [2], в котором биоадгезивная гидрогелевая композиция для местного, системного или трансдермального применения содержит фармацевтически активный агент, выполненный на основе гидрофильного полисахарида, который получают из группы трав, кустарников и деревьев.

Известны патенты РФ №2180856, №2454242 [3, 4], в которых описано средство в виде геля на основе водорастворимых полисахаридов растительного происхождения. Гель получают путем смешивания с водой при постоянном перемешивании водорастворимого производного целлюлозы и, по меньшей мере одного водорастворимого полисахарида, содержащего анионные группы и образующего в растворе полианионы. В качестве полисахарида, содержащего анионные группы и образующего в растворе полианионы, берут компонент, выбранный из группы, включающей альгиновую кислоту или ее соль, каррагинан, пектин, фукоидин, зостерин, гуммиарабик, экстракт красных и/или бурых водорослей, ксантангам, трагакант или их смесь в любом сочетании и соотношении обеспечивающем терапевтическое действие.

Авторам патента экспериментальным путем удалось подобрать композицию веществ, образующую гель, остающийся достаточно пластичным (полужидким, но не растекающимся) при температуре от 0°C до 50°C в течение достаточно длительного времени, хорошо заполняющий рваные и глубокие раны, адгезирующий к влажной ране и образующий при взаимодействии с эксудатом раны и воздухом эластичное, губчатое, хорошо паропроницаемое покрытие, не требующее дополнительных повязок.

Тем не менее, основным применением данного типа гелевых покрытий приведенных в патентах РФ №2180856 и №2454242 является восстановление больших поверхностей поврежденных кожных покровов после ожогов.

Интенсивность изучения биологической активности полисахаридов выделенных из растений, в том числе морских водорослей, значительно опережает исследования их химической структуры. Поэтому имеется немного данных о связи структуры и биологической активности этих полисахаридов. До настоящего времени не удалось установить свойства выделенных полисахаридов, которые отвечают за проявление той или иной биологической активности.

Задачей изобретения является создание композиции из наночастиц диоксида церия и гидрогеля, которая обеспечивает постепенное и длительное высвобождение из геля наночастиц в место повреждения наряду с обеспечением высокой адгезии к ране и создании эластичного, хорошо паропроницаемого покрытия, обладает высокой проницаемой способностью в глубину раны и повышает эффективность заживления за счет усиления пролиферации и миграции фибробластов, кератиноцитов и эндотелиальных клеток сосудов и обладает иммуномодулирующим, противовирусным и антибактериальным действием, для местного наружного применения при лечении ран, в том числе и гнойно-деструктивных поражений слизистой и кожи.

Техническими результатами, которые могут быть получены при использовании предлагаемого изобретения являются: расширение области применения гелевой композиции, содержащей наночастицы оксида церия в сочетании с полисахаридами выделенными из растений бурых водорослей, повышение эффективности действия геля за счет синергетического воздействия компонентов композиции, удобство и простота применения в процессе лечения.

Для решения поставленной задачи в настоящем изобретении предлагается композиция местного (локального) и наружного применения для лечения ран, в том числе и гнойно-деструктивных поражений слизистой оболочки и кожи, содержащая эффективное количество наночастиц оксида церия и основу, которая представляет собой, по меньшей мере, одно водорастворимое производное целлюлозы, по меньшей мере один водорастворимый полисахарид или их смесь, входящих в группу состоящую из пектина, фукоидина, и необязательно альгината, при этом композиция выполнена в мягкой форме входящей в группу геля, спрея для наружного применения при следующем соотношении компонентов (мас. %): 0,01 до 1,5% пектин, 0.01-1,5% фукоидин, 0,0001 до 1,5% альгинат, 0,00000172-0,000172% - диоксид церия

Перечень чертежей

На фиг. 1 представлены данные по анализу уровня дегидрогеназной активности мезенхимальных стволовых клеток (МСК) человека после инкубации с образцами №1, №3, №5, модифицированными наночастицами CeO₂ в течение 24, 48 и 72 часов.

На фиг. 2 представлены данные по анализу пролиферативной активности МСК человека из которых следует достоверное увеличение пролиферативной активности в образце №3.

На фиг. 3 представлены данные сравнительных гистологических характеристик нормальной кожи и травмированного участка кожи после применения гелевой композиции №2.

На фиг. 4 представлены данные сравнительных гистологических характеристик нормальной кожи и травмированного участка кожи после применения гелевой композиции №3

Основная часть

Из анализа уровня техники следует, что ни одно из известных технических решений по созданию композиций для обработки ран не воздействует на разные слои поверхностного подкожного слоя и не обладает синергетическим эффектом по одновременной длительной защите внешней поверхности кожи и глубокому проникновению высокоэффективного антиоксидантного средства в рану.

Известные составы гелей на основе полисахаридов растительного происхождения [4, 5] проявляют свою эффективность лишь на поверхности ран, формируя воздухопроницаемую структуру и выделяя биологически активные компоненты, содержащиеся в растительных полисахаридах, в верхний слой, граничащий с поверхностью раны.

Известно применение растворов, содержащих наночастицы оксида церия [8], которые обладают возможностью более глубокого проникновения в структуры подкожных слоев и раны. Однако растворы наночастиц быстро высыхают на поверхности раны, что требует увеличения количества нанесений раствора на рану. Кроме того жидкие растворы стекают по поверхности кожи при нанесении, что приводит к неэффективному расходу композиции.

Известно введение наночастиц оксида церия в структуру раневой повязки на основе желатиновой пленки[9] Такое техническое решение приводит к тому, что частицы оксида церия с трудом переносятся из повязки в рану за счет низкой диффузии из-за высокой плотности покрытия.

Наночастицы оксида церия имеют высокую способность к антиоксидантной защите клеток млекопитающих от свободных форм кислорода и выполняют дополнительную функцию по антибактериальной защите. Кроме этого, наночастицы оксида церия позволяют без помех применять методы неинвазивного контроля внутренних слоев раны при использовании рентенографии. В процессе исследования составов гелей для лечения ран было обнаружено, что полисахариды, выделенные из растительного сырья обеспечивают усиление антиоксидантных свойств оксида церия при совместном применении в составе геля, а их мягкая пористая структура с одной стороны обеспечивает проницаемость для газов, с другой стороны задерживает испарение раствора с наочастицами с поверхности раны. В результате формируется высокий синергетический эффект от свойств наночастиц оксида церия и от свойств структуры геля на основе полисахаридов, выделенных из морских водорослей, которые содержат в своем составе биологически активные компоненты, способствующие дополнительному заживлению раны.

Таким образом, местное применение композиции, выполненной в форме геля на основе наночастиц оксида церия, водорастворимых производных целлюлозы и полисахаридных компонентов, выделенных из бурых водорослей входящих в группу, состоящую из фукоидина пектина и необязательно альгината, создает условия для постепенного выхода наночастиц оксида церия в рану, обеспечивая долговременный (до 5 суток) лечебный эффект, дополнительно создает воздухопроницаемый мягкий барьер, препятствующий репликации различных форм бактерий и вирусов и осуществляет иммуномодулирующее воздействие, что повышает эффективность заживления раны за счет усиления пролиферации и миграции фибробластов, кератиноцитов и эндотелиальных клеток сосудов.

Следует отметить, что компоненты композиции совместимы со всеми лекарственными средствами, выбранных из группы, состоящей из: антибиотиков, витаминов, иммуномодуляторов, интерферонов, антиоксидантов, экстрактов растений и гидробионтов, которые могут быть дополнительно введены в состав композиции.

Состав композиции

В качестве активного компонента в состав композиции входит эффективное количество наночастиц оксида церия выполняющих роль антиоксидантов.

Дополнительно в состав композиции входит смесь водорастворимых производных целлюлозы, входящих в группу карбоксиметилцеллюлозы и целлосайза, и водорастворимые полисахариды, выделенные из бурых водорослей, содержащие анионные группы и образующие в растворе полианионы, входящие в группу, состоящую из: пектина, фукоидина, и, необязательно, альгината и их смесей.

Пектины, представляют собой водорастворимые полисахариды растительного происхождения, которые используются для профилактики и лечения различных заболеваний. Пектины обладают антибактериальным действием в отношении многих патогенных и условно-патогенных микроорганизмов, оказывают положительное влияние на основные показатели иммунного статуса больных, улучшая состояние гуморального и клеточного звеньев иммунитета, проявляют антиокислительные свойства [19]. Это позволяет использовать пектины в комплексной антибактериальной терапии гнойно-воспалительных заболеваний и осложнений. Специфической особенностью пектиновых веществ, имеющей важное практическое значение, является их комплексообразующая способность.

Фуциновая (фукоидная) кислота содержится в водорослях преимущественно в виде кальциевой соли - фукоидина. Фукоидин - гомополимер сульфатированной L-фукозы, обнаруженный в составе бурых водорослей и некоторых иглокожих. Состав фуциновой кислоты неизвестен, однако на основании некоторых работ можно предположить наличие в ее молекуле уроновых кислот (от 4 до 20%). Очень важным свойством фукоидина является его онкопротективная способность. Кроме того, установлено, что фукоидин способен ингибировать действие некоторых вирусов [10]. Фукоидин и другие соли фукоидной кислоты составляют группу фукоидантов. Именно этой группе веществ фукус во многом обязан своими целебными свойствами, такими, как иммуномодулирующее, антикоагулянтное, детоксикационное действие и др. [11]. Включение в состав композиции разных типов полисахаридов усиливает иммунный ответ организма за счет разных механизмов воздействия на иммунную систему.

Альгиновая кислота - полисахарид, вязкое резиноподобное вещество, извлекаемое из красных, бурых и некоторых зеленых водорослей. Содержание альгиновой кислоты в ламинарии японской (лат. Laminaria japonica) колеблется от 15 до 30%. Соли альгиновой кислоты - альгинаты, в частности альгинат натрия - это полисахарид растительного происхождения. Альгинат обладает редкими свойствами: медленно тает в воде, адсорбируя ее в сотни раз более своего веса, образуя гель, выдерживающий изменения температуры - замораживание, оттаивание. Соли альгиновой кислоты находят применение в медицине благодаря своим целительным качествам: иммуностимулирующим - защищают от инфекций и опухолей; кровоостанавливающим - лечат геморрой, анальные трещины, кровоточащие раны; адсорбирующим - выводят радионуклиды, тяжелые металлы; регенерирующим - восстанавливают кожу при ожогах, пролежнях; антигистаминным - препятствуют аллергии.

Способ получения наночастиц

Наночастицы в настоящее время имеются в продаже (Nanoceria) в диапазоне размеров от примерно 7 до 20 нм. Такие частицы образуются с помощью высокотемпературного процесса, что приводит к высокой агломерации наночастиц оксида церия. Известен способ получения диоксида церия по которому вводят раствор нитрата церия (III) в качестве католита в катодную камеру электролизера, отделенную мембраной от анодной камеры, заполненной анолитом, и пропускают электрический ток плотностью 2,5-7,5 А/дм² через католит и анолит. Изобретение позволяет получить порошок диоксида церия CeO₂ с размером частиц 8-22 нм [12]. Эти частицы также высокоагломерированы. В заявке США US 20130195927 [8] описан способ получения наночастиц оксида церия которые синтезировали с использованием гексагидрата нитрата церия (99,999% от Sigma-Aldrich). Гексагидрат нитрата церия растворяли в воде (18,2 MB), добавляли стехиометрическое количество перекиси водорода и перемешивали в течение 1 часа. Ионы церия (III) в растворе окисляли до оксида церия (IV) и pH раствора поддерживали ниже 3,5 для поддержания синтезированного оксида церия для предотвращения агломерации.

Более предпочтительно использовать технологии получения наночастиц в диапазоне от 1-10 нм в форме стабильного водного золя. Такие технические решения описаны в патенте США №9585840, в котором описана технология получения наночастиц оксида церия покрытых декстраном [13]. Таким образом, в рамках данного изобретения оксид церия может иметь форму стабильного водного золя стабилизированного стабилизатором, выбранным из группы, состоящей из лецитина, декстрана, цитрата аммония, полиакриловой кислоты, но не ограничиваясь этим. Более предпочтительно использовать оксид церия, который имеет форму стабильного водного золя стабилизированного цитратом аммония [14, 15].

Наночастицы оксида церия обладают бактерицидными свойствами и противовирусной резистентностью, что позволяет снизить концентрацию антибиотиков в составе композиции.

Приготовление композиции

Компоненты, входящие в состав композиции, могут использоваться в различных сочетаниях, которые в зависимости от характера раневого повреждения могут обеспечивать оптимальное сочетание защиты и восстановления раны. За счет свойств геля осуществляется физическая защита раны и осуществляется паро и газопроницаемость покрытия внешнего слоя раны. Дополнительные свойства полисахаридов, выполненных в форме наночастиц, оказывают положительный эффект по связыванию токсинов и деструктирующих ферментов находящихся в ране. Наночастицы оксида церия обеспечивают повышение регенерационных свойств путем создания оптимальных условий для размножения клеток в ране за счет снижения количества свободных форм кислорода.

Концентрация наночастиц оксида церия может быть в пределах от 0,1 мкМ/л до 10 мкМ/л. Предпочтительно использовать концентрацию в диапазоне от 0,1 мкМ/л до 2 мкМ/л.

Испытаны различные варианты состава геля, включая следующие биоактивные компоненты: пектин, фукоидин, альгинат, нанокристаллический диоксид церия. Изготовлены составы гелей содержащие: образец 1 - пектин, альгинат и диоксид церия; образец 2 - альгинат, фукоидин и диоксид церия; образец 3 - фукоидин, альгинат, пектин и диоксид церия; образец 4 - фукоидин и диоксид церия; образец 5 - пектин, фукоидин и диоксид церия; образец 6 - альгинат и диоксид церия.

Сочетаемость компонентов рассматривалась при максимальной используемой концентрации препаратов церия (10 мкМ/л). Компоненты тщательно перемешивались, получающиеся образцы стерилизовались и хранились в герметически закрытых флаконах.

При сравнении образцов было определено, что образцы 1, 3, 5 при изготовлении имеют прогнозируемую консистенцию. В течение недели они сохраняли свое состояние и не изменяли консистенцию. Образцы 2 и 4 после недели хранения имели заметное расслоение. Образец 6 после недельной экспозиции изменял свою консистенцию и выглядел более жидким, чем остальные препараты. Из этого следует, что добавление в гель пектина стабилизирует консистенцию геля и делает его пригодным для применения в качестве лечебного средства.

Совместное применение в одной композиции разных типов полисахаридов входящих в группу, состоящую из: пектина, фукоидина, и, необязательно, альгината, или их смесей, позволяет синергетически воздействовать на разные системы регенерации раневого слоя, поскольку разные типы полисахаридов обладают разной биологической активностью, что повышает эффективность композиции. Смесь полисахаридов и их способ получения подобраны таким образом, что смесь образует в растворе наномицеллы величиной 10-20 нм, что резко усиливает воздействие геля на поверхность раны ввиду значительного увеличения контактной поверхности.

В композиции дополнительно использованы водорастворимые производные целлюлозы - карбоксиметилцеллюлоза и целлосайз.

В композицию могут быть включены дополнительные компоненты входящие в группу: иммуномодуляторов, антибактериальных препаратов, стимуляторов репаративных процессов, анальгетиков, анестетиков, противовоспалительных агентов, антиоксидантов, витаминов, полисахаридов, экстрактов растений.

В качестве иммуномодулятора композиция может включать следующие вещества, но не ограничиваться ими: циклоферон, криданимод, трекрезан, полиоксидоний, глутоксим, галавит, имунофан, рекомбинантные α-, β-, γ-интерфероны или их природные аналоги, рекомбинантный интерлейкин-1b, рекомбинантный интерлейкин-2, миелопид, лизоцим.

В качестве вещества, обладающего антибактериальной активностью в отношении грамположительных и/или грамотрицательных бактерий и других микроорганизмов, предлагаемая композиция может включать следующие вещества, но не ограничиваться ими: антибиотики, лизоамидаза, трилон Б, линкомицин, левомицетин, гентамицин, сульфонамиды, такие как сульфаметизол, сульфизоксазол, сульфамонометоксин, сульфаметизол, хинолоны, такие как налидиксовая кислота, тригидрат пипемидиновой кислоты, эноксацин, норфлоксацин, офлоксацин, тосуфлоксацин тозилат, гидрохлорид ципрофлоксацина, гидрохлорид ломефлоксацина, спарфлоксацин, флероксацин тетрациклингидрохлорид, ампициллин, пиперациллин, дибекацин, каендомицин, ливидомицин, тобрамицин, амикацин, фрадиомицин, сисомицин, тетрациклин, окситетрациклин, ротетрациклин, доксициклин, ампициллин, пиперациллин, тикарциллин, цефалотин, цефапирин, цефаклор, цефалексин, цефадроксил, цефамандолы, цефуроксим аксетил, цефдинир, пивоксил, цефтазидит, цефпирамиды, цефсулодин, цефподоксим проксетил, цефпир, цефепит, цефсулодин, цефинетазол, цефминокс, цефокситин, цефбуперазон, латамоксиф, фломокс, цефазолин, цефотаксим, цефоперазон, цефтизоксим, моксалактам, тиенамицин, сульфазецин, азтреонам и их соли, гризеофульвин, ланкацидин, макролиды, такие как такролимус, и тому подобное.

В качестве стимулятора репаративных процессов предлагаемая композиция может включать следующие вещества, но не ограничиваться ими: метилурацил, ацемин, этаден, пантотенат кальция, солкосерил.

Анальгетики могут в себя включать следующие вещества, но не ограничиваться ими: анальгин, бутадион, амидопирин, фенацетин, парацетамол, пироксикам, димексид, хлотазол, мефенамовая и флуфенамовая кислоты, ибупрофен, флурбипрофен, диклофенак натрия.

В качестве анестетика композиция может включать следующие вещества, но не ограничиваться ими: хиноксикаин, тримекаин, пиромекаин, лидокаин

В качестве противовоспалительного агента композиция может включать, но не ограничиваться следующими веществами: диклофенак, индометацин,, ацетаминофен, феназетин, этхензамид, сульпирин, антипирин, ацетилсалициловую кислоту, мефенамовую кислоту, флуфенаминовую кислоту, локсопрофен натрий, фенилбутазон, ибупрофен, кетопрофен, напроксен, оксапрозин, флурбипрофен, фенбуфен, пранопрофен, флотфафенин, эпирозол, тиарамид гидрохлорид, залтопрофен, габекетат мезилат, каместат мезилат, иулинастатин, колхицин, пробенецид, сульфинпиразон, бензбромарон, аллопуринол, тиомалат натрия натрия, гиалуронат натрия, салицилат натрия, гидрохлорид морфина, салициловая кислота, атропин, скополамин, морфин, петидин, леворфанол, кетопрофен, напроксен, оксиморфон и тому подобное.

В качестве антисептика композиция может включать, но не ограничиваться следующими веществами: мирамистин, хлоргексидин, диоксидин, коллоидное серебро, соль серебра и тому подобное.

В качестве антиоксиданта композиция может включать следующие вещества, но не ограничиваться ими: α-липоевая кислота, метронидазол, элементарные антиоксиданты, β-глюкан, куркумин, эпигаллокатехин галлат, проантоцианидины, прополис, мед и тому подобное.

В качестве витаминов композиция может включать следующие вещества, но не ограничиваться ими: витамин А, витамин С, витамин D, витамин Е.

В качестве полисахаридов композиция может включать в себя следующие вещества, но не ограничиваться ими: каррагинан, зостерин, гуммиарабик, ксантангам, трагакант и тому подобное.

Предлагаемая композиция может быть изготовлена в виде мягких лекарственных форм - геля, спрея. Согласно изобретению гелевую композицию размещают в контейнерах, предпочтительно в асептических условиях. Предпочтительно контейнеры изготавливают из стекла или полимеров, например, из полипропилена или полиэтилена. Объем контейнеров составляет от 2 до 50 мл, предпочтительно до 15 мл. Контейнеры для гелей могут быть снабжены крышкой. Согласно другому варианту контейнеров они могут быть изготовлены с возможностью распределения геля на поверхности кожи под давлением газа размещенного внутри контейнера вместе с раствором геля. Спрей имеет преимущество при лечении больших поверхностей поврежденной кожи и ран. В этом случае в состав спрея могут быть дополнительно введены целевые добавки содержащие обезболивание и снижающие микробные загрязнения. При применении геля в больничных условиях на внешней поверхности контейнера могут быть размещены этикетки с указанием данных о составе и объеме для того чтобы устранить риски ошибок идентификации содержания контейнеров. Для учета даты изготовления композиции могут быть использованы не только указание даты в цифровом виде. Предпочтительно указание дополнительной информации в виде штрих кодов.

Одним из аспектов изобретения является применение композиции состоящей из наночастиц оксида церия, водорастворимых производных целлюлозы и разных типов полисахаридов входящих в группу, состоящую из: пектина, фукоидина, и, необязательно, альгината, или их смесей, для приготовления лекарственного средства для нанесения на поверхность кожи и раны для лечения и восстановления кожного покрова. Предлагаемую композицию можно использовать для применения человеку, комнатным животным, домашним животным и/или птицам.

Применение композиции в форме геля для лечения ран имеет существенные преимущества за счет совместного воздействия наночастиц оксида церия и полисахаридов, выделенных из водорослей в одной композиции на регенерационную систему организма.

Примеры, подтверждающие эффективность композиции при лечении ран включают, но не ограничивают других возможностей композиции.

Примеры

Пример 1 Синтез коллоидного золя с наночастицами CeO₂

Для проведения химического синтеза использовали водную соль церия - Се(NO₃)₃6H₂O (х.ч.), лимонную кислоту (х.ч.) и водный раствор аммиака (ч.). Для получения золя CeO₂ в 25 мл 0.05М водного раствора нитрата церия(III) растворяли 0.24 г лимонной кислоты. Полученный раствор при перемешивании быстро приливали к 100 мл 3М раствора аммиака и выдерживали в течение 2 ч.

Перед использованием наночастиц проводят процедуру отмывки от стабилизатора (лимонной кислоты). Золь титруют 30% соляной кислотой до рН≈3 (до выпадения осадка), после чего центрифугируют при 10000 об /мин в течение 10 минут. Осадок ресуспендируют в деионизованной воде и центрифугируют 10 мин при 10000 об /мин. Ресуспендируют осадок в воде и доводят суспензию до рН=7 путем титрования 10% аммиаком.

Пример 2 Синтез водорастворимого геля и модификация полисахаридных гелей наночастицами CeO₂.

Для изготовления образцов гелей используют карбоксиметилцеллюлозу, целлосайз, фукоидин, альгинат, пектин (все препараты - фирмы Сигма) и наночастицы CeO₂ полученные в соответствии с примером 1. Изготовление гелей производят путем смешивания сухих навесок веществ с дистиллированной водой в течение 30-40 минут при комнатной температуре, отстаиванием 12-18 часов при температуре 2- 4 град и повторном перемешивании в течение 30-40 минут. Гелевые композиции готовили путем внесения золя наночастиц CeO₂ при постоянном перемешивании на магнитной мешалке в течение 10 минут. После чего полученные гели закупоривают и стерилизуют.

Пример 3 Контроль цитотоксичности и пролиферативной активности клеток при применении композиции.

Чтобы определить относительную важность других компонентов геля, проводили опыты на культуре мезенхимальных стволовых клеток человека (МСК), выделенных из пульпы зуба по ортодонтическим показаниям. Контроль цитотоксичности лечебного препарата определяют по уровню дегидрогеназной активности клеток и по соотношению LIVE/DEAD в культуре клеток. В качестве показателя влияния геля на повышение активности клеток использовали оценку уровня дегидрогеназной активности клеток при помощи МТТ-теста. Клетки высевали в 96-луночные планшеты и культивировали в течение 24 и 72 ч в атмосфере, содержащей 5% CO₂ при 37 градусах Цельсия. Через 6 ч после посева клеток в среду вносили 20 мг геля, содержащего наночастицы CeO₂ в концентрациях 1000 и 1 мкМ. В качестве контроля использовали клетки со средой, но без добавления CeO₂. В качестве отрицательного контроля использовали лунки с клетками, в которые вносили 10% ДМСО (10 мкл). Через 24 и 48 ч после внесения гелей с наночастицами CeO₂ среду во всех лунках заменяли на среду, содержащую 3-4,5-диметилтиазол-2-ил-2,5-дифенилтетразол (5 мкг/мл), а затем проводили МТТ-тест по стандартной методике. Оптическую плотность определяли на длине волны А=540 нм с использованием фотоколориметра «BIO-RAD model 680».

Для оценки соотношения живых и мертвых клеток в культуре используют набор L-7007 LIVE/DEAD BacLight Bacterial Viability Kit производства компании Invitrogen, содержащий красители SYTO 9 (окрашивает все клетки, λ=485/498 нм) и пропидий йодид (окрашивает ядра мертвых клеток, λ=535/617 нм). Окраску клеток осуществляют путем замены культуральной среды DMEM/F12 с 5% ЭТС, на среду, содержащую смесь красителей в концентрации 1 мкл/мл. Наблюдение за морфологией и флуоресцентной окраской проводят на инвертированном микроскопе LSM-510 (Carl Zeiss). Подсчет окрашенных клеток проводят с использованием программы Image J.

Модификация полисахаридных гелей цитрат-стабилизированными наночастицами CeO₂ не вызывает цитотоксического действия в культуре МСК человека, сохраняя высокий уровень их жизнеспособности, снижая количество апоптотических клеток в культуре, поддерживая уровень митохондриального потенциала и дегидрогеназной активности клеток на уровне контрольных значений.

На фиг 1 представлены результата анализа уровня дегидрогеназной активности МСК человека после инкубации с гелевыми композициями, модифицированными наночастицами СеО₂ в течение 24, 48 и 72 часов для образцов геля 1, 3, 5 с минимальной 1 мкМ/л и максимальной 10 мкМ/л концентрацией диоксида церия.

Проведенный комплексный анализ биологической активности гелевых композиций, модифицированных наночастицами CeO₂, выявил их высокую степень биосовместимости. Анализ уровня дегидрогеназнной активности в течение 3 дней культивирования выявил достоверное повышение практически во всех тестируемых образцах, но при этом максимальный стимулирующий эффект наблюдался в образце 3 при концентрации наночастиц диоксида церия 1 мкМ.

На фиг. 2 приведены данные по пролиферативной активности клеток МСК человека в образце 3. Данные выявили достоверное увеличение пролиферативной активности клеток, что говорит о том, что клетки имеют оптимальное микроокружение и условия максимально, приближенные к условиям in vivo.

Пример 4 Проверка эффективности лечения ран.

В дальнейшем проводили опыты на лабораторных животных, используя активные вещества в различных соотношениях. Для этого на спину крыс породы Wistar в зоне между лопаток наносили скальпелем крестообразную рану. В случае нанесения круговой раны кожу выстригали хирургическими ножницами. Перед нанесением раны удаляли шерсть в области спины и обрабатывали место имплантации 0,05% раствором хлоргексидина. Рану наносили в стерильных условиях, под эфирным наркозом.

Все манипуляции с животными проводили согласно правилам, принятым Европейской конвенцией по защите позвоночных животных, используемых для исследований и других научных целей.

Для испытаний на животных были изготовлены гели с различным соотношением активных компонентов в концентрации 1 мкМ/л. Во всех гелях количество нанокристаллического диоксида церия было одинаковым и составляло 1 мкМ/л.

В качестве контрольного образца использовалась мазь левомеколь. Левомеколь используется в медицинской практике наружно для лечения гнойных ран и язв на коже, инфицированных патогенной микрофлорой, травматических повреждений кожи, ожогов, трофических язв.

Крыс разделили на 5 групп. Первым трем группам наносили образцы лечебных гелей содержащих композиции полисахаридов №№1-3. Четвертой группе не наносили на рану ничего (контрольная группа 1). Пятой группе наносили на рану левомеколь (контрольная группа 2).

Результаты опытов на разных этапах после нанесения обширной травмы показывают, что композиции №2 и №3 в составе геля оказывают лучший эффект на заживление раны, чем композиция №1. При этом результаты применения композиций №№2-3 были также лучше, чем в обеих контрольных группах.

Гистологические исследования срезов кожи после заживления нанесенных травматических повреждений кожи выявили аналогичную картину. Наиболее эффективны были гели на основе композиции №2 и композиции №3. При их использовании ускоряется заживление раны, снижается площадь рубца, восстанавливаются волосяные фолликулы и жировые железы. Анатомическое строение кожи в области заживления соответствует ее строению на нетравмированных участках.

У животных группы, которым на рану нанесена композиция геля №2 произошло образование рубца с полным восстановлением эпидермиса в раневой области. Дерма в области рубца представлена двумя слоями, при этом сетчатый слой состоит из тяжей коллагеновых волокон, расположенных параллельно поверхности кожи. Зона рубцевания визуально меньше по площади по сравнению с контрольными образцами. На фиг. 3 представлены фотографии гистологического исследования среза кожи до и после заживления с использованием композиции входящей в гель №2. Эпидермис восстановлен, дерма представлена уплотненной соединительной тканью. Волокна параллельны поверхности кожи. Область рубцевания небольшая. В поле зрения в области рубца присутствуют фолликулы и сальные железы. Сосочковый слой дермы слабо выражен. Определяются новообразованные сосуды различного диаметра.

У группы животных, которым нанесена композиция входящая в гель №3 произошло образование рубца с полным восстановлением эпидермиса в раневой области. На фиг. 4 представлена фотография гистологического исследования среза кожи после заживления с использованием геля №3. Эпидермис восстановлен, дерма представлена уплотненной соединительной тканью. Волокна параллельны поверхности кожи. В поле зрения в области рубца присутствуют единичные фолликулы и сальные железы. Сосочковый слой дермы слабо выражен. Определяются новообразованные сосуды различного диаметра.

Промышленная воспроизводимость

Опираясь на полученные экспериментальные данные можно сделать вывод, что все отобранные образцы, содержащие наночастицы оксида церия, не обладают цитотоксическим действием, что определяется высоким уровнем михохондриального потенциала, дегидрогеназной активности, отсутствием апоптотических клеток при инкубации с модифицированными гелевыми композициями.

У животных группы, которым был нанесен гель, содержащий наночастицы оксида церия, обладающие уникальными антиоксидантыми свойствами, и полисахариды, выделенные из бурых водорослей, произошло образование рубца с полным восстановлением эпидермиса в раневой области. Применение композиций содержащих наночастицы оксида церия и полисахариды обеспечивает ускорение репаративных процессов после повреждений кожных покровов.

Проведенный поиск патентных документов не выявил идентичных и сходных технических решений. Вышеуказанная совокупность признаков предлагаемой композиции (состав композиции и количественные соотношения компонентов) ранее не была известна, что говорит о новизне предложенного решения. Совокупность существенных признаков заявляемого композиции для наружного применения на основе комплекса полисахаридов, выделенных из бурых водорослей и наночастиц оксида церия, не следует явным образом из изученного уровня техники, имеет существенные отличия от рассмотренных аналогов. До сих пор аналогичного решения не было предложено, хотя высокие антиоксидантные свойства оксида церия известны с 2008 г. [16], а наночастицы оксида церия использовались с 2008 г. в качестве защиты от ультрафиолетового излучения в кремах для кожи [17]. Поэтому заявитель считает, что заявляемая композиция для местного применения на основе комплекса полисахаридов и наночастиц оксида церия имеет изобретательский уровень. Заявляемая композиция может быть рекомендована при лечении ран, ожогов, трофических язв и некроза тканей.

Литература

1. Gong G, Suresh S. Polysaccharide Based Hydrogels, патент США № US 9700650 (2017-07-11).

2. Nussinovith A. Manon Ben-Zion O. DEPOLYMERIZED POLYSACCHARIDE-BASED HYDROGEL ADHESIVE AND METHODS OF USE THEREOF, заявка США № US 2011190401 (2011-08-04).

3. Гаврилюк Б. К., Гаврилюк В.Б. СРЕДСТВО ДЛЯ ЛЕЧЕНИЯ РАН, патент РФ №2180856 (27.03.2002).

4. Гаврилюк Б.К., Гаврилюк В.Б. СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ СРЕДСТВА ДЛЯ УСТРАНЕНИЯ ДЕФЕКТОВ КОЖИ И ЛЕЧЕНИЯ РАН В ВИДЕ ГЕЛЯ НА ОСНОВЕ ВОДОРАСТВОРИМЫХ ПОЛИСАХАРИДОВ РАСТИТЕЛЬНОГО ПРОИСХОЖДЕНИЯ, патент РФ №2454242 (27.06.2012).

5. Новоселов В.И., Янин В.А., Фесенко Е.Е. КОМПОЗИЦИЯ С АНТИОКСИДАНТНЫМИ СВОЙСТВАМИ И СПОСОБ ЛЕЧЕНИЯ БОЛЕЗНЕЙ МЛЕКОПИТАЮЩИХ, патент РФ №2280448 (27.07.2006).

6. Revathy Davan et al. Cerium Oxide Nanoparticles Promotes Wound Healing Activity in In-Vivo Animal Model, https://www.researchgate.net/publication/273621984 (December 2012).

7. Chigurupati S. et al. Effects of cerium oxide nanoparticles on the growth of keratinocytes, fibroblasts and vascular endothelial cells in cutaneous wound healing. Biomaterials 34, 2194-2201 (2013).

8. Sudipta S. Das S. CERIUM OXIDE NANOPARTICLES AND ASSOCIATED METHODS FOR PROMOTING WOUND HEALING, заявка США № US 2013195927 (2013-08-01).

9. Naseri-Nosar M. 1 et al. Cerium oxide nanoparticle-containing poly (ε-caprolactone)/gelatin electrospun film as a potential wound dressing material: In vitro and in vivo evaluation.

10. Авакова О.Г., Боголицын К.Г. Растительная клетчатка: Структура, свойства, применение. ИВУЗ. Лесной журнал. 2004. №4.

11. ЛЕКАРСТВЕННЫЕ РАСТЕНИЯ И ЛЕКАРСТВЕННОЕ РАСТИТЕЛЬНОЕ СЫРЬЕ, СОДЕРЖАЩИЕ СЛИЗИ https://medinfo.social/farmakognoziya_873/lekarstvennyie-rasteniya-lekarstvennoe-34899.html].

12. Локшин ЭЛ. и др. СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ДИОКСИДА ЦЕРИЯ, патент РФ №2341459 (20.12.2008).

13. Sudipta S. Brenneisen P. Redox active cerium oxide nanoparticles and associated methods, патент США №9585840 (2017-03-07).

14. ЩЕРБАКОВ А.Б. и др. НАНОМАТЕРИАЛЫ НА ОСНОВЕ ДИОКСИДА ЦЕРИЯ: СВОЙСТВА И ПЕРСПЕКТИВЫ ИСПОЛЬЗОВАНИЯ В БИОЛОГИИ И МЕДИЦИНЕ. Биотехнология, т. 4, №1, 2011.

15. Шекунова Т.О. и др. СИНТЕЗ, БИОЛОГИЧЕСКАЯ И ФОТОКАТАЛИТИЧЕСКАЯ АКТИВНОСТЬ ЗОЛЕЙ ДИОКСИДА ЦЕРИЯ, СТАБИЛИЗИРОВАННЫХ ЦИТРАТ-ИОНОМ. НАНОСИСТЕМЫ: ФИЗИКА, ХИМИЯ, МАТЕМАТИКА, 2013, 4 (1), С. 83-89.

16. McGinnis J. et al. Inhibition of reactive oxygen species and protection of mammalian cells, патент США № US 7347987 (25.03.2008).

17. Walenzyk T. et al. Particles Functionalized with Organic Compounds, патент США № US 20080260664 (23.10.2008).

18. O.A. et al. Experimental Study of the Effects of Nanodispersed Ceria on Wound Repair. Bull Exp Biol Med. 2017 Jan; 162(3): 395-399.

19. Лазарева E.Б. и др. СПОСОБ ОЦЕНКИ АНТИБАКТЕРИАЛЬНЫХ СВОЙСТВ ПЕКТИНОВ, патент РФ №2298170 (10.03.2006).

1. Композиция наружного применения для лечения ран и деструктивных поражений слизистой и кожи млекопитающих, содержащая эффективное количество наночастиц оксида церия, фармацевтически приемлемый носитель, отличающаяся тем, что носитель выполнен в мягкой нетоксичной, биосовместимой и проницаемой для влаги и газов форме, при этом носитель включает водорастворимые производные целлюлозы и водорастворимые полисахариды бурых водорослей - пектин, фукоидин и альгинат, при следующем соотношении компонентов, мас. %:

оксид церия	0,00000172-0,000172
водорастворимые производные целлюлозы	1,0-15,0
водорастворимый полисахарид пектин	0,01-1,5
водорастворимый полисахарид фукоидин	0,01-1,5
водорастворимый полисахарид альгинат	0,01-1,5
целевая добавка	0,01-1,0
вода	остальное,

при этом целевую добавку выбирают из ряда: иммуномодуляторов, антибактериальных препаратов, стимуляторов репаративных процессов, анальгетиков, анестетиков, противовоспалительных агентов, антиоксидантов, витаминов, полисахаридов или их смесей.

2. Композиция по п. 1, отличающаяся тем, что оксид церия имеет форму стабильного водного золя, стабилизированного стабилизатором, который выбран из группы, состоящей из лецитина, декстрана, цитрата аммония, полиакриловой кислоты.

3. Композиция по п. 1, отличающаяся тем, что оксид церия имеет форму стабильного водного золя, стабилизированного цитратом аммония.

4. Композиция по п. 1, отличающаяся тем, что водорастворимые производные целлюлозы выбирают из группы, состоящей из карбоксиметилцеллюлозы, целлосайза или их комбинации.

5. Композиция по любому из пп. 1-4, которая используется для применения человеку.

6. Композиция по любому из пп. 1-4, которая используется для применения для комнатных животных, домашнего животного и/или птицы.

7. Применение композиции по любому из пп. 1-4 для приготовления лекарственного средства для нанесения на поверхность кожи и раны при лечении и восстановлении кожного покрова и мягких тканей.

8. Контейнер для размещения и последующего наружного применения композиции по любому из пп. 1-4, при этом контейнер выполнен из пластика, имеет объем от 2 до 50 мл и содержит удаляемый закрывающий элемент.

9. Контейнер по п. 8, отличающийся тем, что имеет объем от 2 до 15 мл.