Штамм glomus iranicum var. tenuihypharum var. nov. и его использование в качестве бионематоцида

Изобретение относится к штамму Glomus iranicum var. tenuihypharum var. nov., используемому для включения в композицию бионематоцида. Предложен штамм Glomus iranicum var. tenuihypharum var. nov., депонированный под депонентным номером 54871 в ВССМ. Штамм включает последовательность SEQ ID №: 1. Штамм может быть использован в составе композиции бионематоцида, обладающей эффективностью в отношении смертности нематод. 2 ил., 20 табл., 2 пр.

 

Область изобретения

Изобретение относится к агрономии. В частности, настоящее изобретение относится к композиции, состоящей из штамма Glomus iranicum var. tenuihypharum var. nov. и прочих компонентов, используемой в качестве бионематоцида.

Уровень техники

Микоризные композиции, имеющиеся на настоящий момент, имеют естественное ограниченное количество микоризных отростков. Указанное количество главным образом ограничивается за счет используемого штамма и способа получения микоризных композиций.

Фитопаразитические нематоды представляют собой глобальную угрозу для сельскохозяйственного производства. Существует более 40 родов, которые являются облигатными паразитами высших растений. Одним из способов защиты сельскохозяйственных культур является использование синтетических химических веществ, но многие из этих веществ оказывают неблагоприятное воздействие на организм человека и могут быть токсичными для окружающей среды. С другой стороны, фермеры могут использовать биологические методы, такие как микоризные грибы, которые колонизируют корни сельскохозяйственных культур и уменьшают степень повреждения, вызванного нематодами, благодаря компенсации и увеличению корневой системы, а также увеличению поглощения питательных веществ. Однако микоризообразующие грибы, имеющиеся в настоящее время, не производят мицелий регулярно, не достигают высокой степени микоризной колонизации и не помогают добиться высокой эффективности выращивания сельскохозяйственных культур при интенсивном сельском хозяйстве. Описываемое изобретение представляет собой новый штамм микоризообразующих грибов, обладающих улучшенными характеристиками по сравнению с другими грибами и препаратами, описанными в уровне техники.

Описание изобретения

Один вариант осуществления изобретения представляет собой штамм Glomus iranicum var. tenuihypharum var. nov., депонированный под депонентным номером 54871 в Бельгийских координированных коллекциях микроорганизмов (ВССМ), включающий последовательность, обозначаемую идентификатором последовательности SEQ ID №: 1.

Штамм изобретения Glomus iranicum var. tenuihypharum var. nov., выделенный из засоленной натриевой почвы в г. Фортуна, Мурсия (Испания), депонирован 19.04.2013 в международном органе по депонированию - Бельгийские координированные коллекции микроорганизмов (ВССМ), расположенном по адресу: Лувенский католический университет, кафедра микологии Лувенского католического университета (MUCL), Круа дю Сюд 2, а/я L7.05.06, 1348 Лувен-ла-Нев, компанией Symborg, S.L. («Сумборг, СЛ.»), расположенной по адресу: корпус Ceeim, территория университета, б/н, 30100 Мурсия, Испания.

Штамм Glomus iranicum var. tenuihypharum var. nov. идентифицирован депонентом по ссылочному номеру SYMBORG-001 и получил депонентный номер 54871, присвоенный международным органом по депонированию.

Спорокарпии штамма изобретения Glomus iranicum var. tenuihypharum var. nov. неизвестны. Споры указанного штамма встречаются поодиночке или в рыхлых гроздьях в почве, они также могут время от времени формироваться в корнях. Споры от прозрачного до светлого красновато-желтого цвета, округлой до шаровидной (редко неровной) формы, имеют относительно небольшой диаметр (24,0) 30,7±3,7 (42) микрон, а их стенки (толщиной 1-4 м) состоят из двух слоев: внутреннего расщепленного компактного слоя (0,5-1,5 м) и внешнего полупостоянного слоя с шероховатостью в местах образования молодых спор и несколько шероховатого в местах нахождения взрослых спор, в толщину достигающего от 0,5 до 2,0 м. Стенки внутреннего слоя молодых спор имеют красновато-коричневый цвет, который придает им реагент Мельцера, но цвет взрослых пор менее выражен, и споры имеют слабый оттенок. Гифа, удерживающая спору, от прозрачного до бледного красновато-желтого цвета, в диаметре достигает от 2,5 до 4,5 микрон (в среднем 3,0 микрон), имеет ровную или неровную, цилиндрическую и в некоторых местах конусообразную форму, соединяется со слоями открытых пор споровой стенки, которую как минимум образуют взрослые споры. Структура прорастания: ростковая трубочка, которая растет и развивается через соединенную гифу и спору. Она образует пузырчатые древовидные микоризы.

Мицелий образует обширную сеть. Внематричный мицелий от прозрачного до бледно-желтого цвета, массивный, и споры всегда появляются в почвенной основе, образуя большое количество спорокарпиев в группе (от 2 до 8 отдельных спор). Уникальной особенностью этого вида является расширенная внешняя сеть мицелия и неспособность расти в лабораторных условиях вместе с трансформированными корнями.

Штамм был выделен из засоленной оглеенной почвы (солонца). Главной особенностью этих почв является то, что они очень переувлажнены, уплотнены и имеют большое количество солевых отложений на поверхности.

Штамм был выделен из почвы, расположенной в городе Фортуна, Мурсия (Испания).

В следующей таблице приведены некоторые химические свойства изначальной почвы, из которой был выделен штамм Glomus iranicum var. tenuihypharum var. nov.

Согласно принципам филогенетики, на основании 813 пар оснований гена 18S рибосомной РНК (частичная последовательность), ITS1 (внутренний транскрибирующийся спейсер 1, полная последовательность) и гена 5.8S рибосомной РНК 5. (частичная последовательность), штамм изобретения относится к категории монофилетического таксона, состоящего из Rhizophagus (перед группой Glomus Ab, представленной грибами Rhizophagus irregularis, Glomus intraradices и Rhizophagus bistratum).

Согласно принципам филогенетики, грибы Glomus indicum и Glomus achrum являются ближайшими родственниками. Около пятидесяти последовательностей некультивированных копий Glomus spp. с высокой идентичностью (99%) с последовательностью штамма изобретения можно найти на сервере Национального центра биотехнологической информации (NCBI) (банка генов).

Поэтому получается, что новый таксон распространен повсеместно и имеет широкий круг хозяев. Очень похожие последовательности возникли в Японии (Огура-Тсудзита Й. и соавт. 2013. Формирование древовидной микоризы в сердцевидных гаметофитах двух папоротников - Angiopteris lygodiifolia и Osmunda japonica. Журнал «Journal of Plant Research». 126 (1): 41-50; Ямато M. и соавт. 2011. Древовидные микоризные грибы в корнях нефотосинтезирующих растений - Sciaphila japonica и Sciaphila tosaensis (Риурисовые). Журнал «Mycoscience» 52: 217-223), Новой Зеландии, Африке и Северной Америке (Апполони С. и соавт. 2008. Молекулярный анализ сообщества древовидных микоризных грибов в корнях, находящихся в геотермальных почвах в Йеллоустонском национальном парке (США). Журнал «Microbial Ecology» 56 (4): 649-659).

Наиболее поразительным морфологическим признаком штамма изобретения является небольшой размер спор и цвет в диапазоне от прозрачного до светлого красновато-желтого, а также то, что грибы этого штамма встречаются по отдельности или небольшими группами в почве.

Единственным штаммом грибов Glomus sp. с прозрачными спорами, которые похожи по размеру и цвету на штамм изобретения, является Glomus iranicum (Блажковский Я. и соавт. (2010) Glomus africanum и G. iranicum - два новых вида древовидных микоризных грибов (Гломеромицеты). Журнал «Mycologia» 102: 1450-1462.) (Таблица 1). Три слоя споровой стенки морфологически неотличимы от трех слоев стенки спор штамма изобретения. Существует четкое отличие штамма изобретения, и оно заключается в очень маленьком размере гиф, прикрепленных к споре.

1 слой споровой стенки Glomus iranicum (Блажковский Я. и соавт. (2010) Glomus africanum и G. iranicum - два новых вида древовидных микоризных грибов (Гломеромицеты). Журнал «Mycologia» 102: 1450-1462.) разрушается быстро и последовательно, с сильной гликогенной активностью, однако в случае штамма изобретения, это явление наблюдается только в очень молодых спорах, таким образом, можно сделать вывод о том, это разновидность Glomus iranicum, и мы предлагаем новую разновидность tenuihypharum.

Это штамм, который приспосабливается и хорошо переносит соленую среду и жидкие удобрения с высокой электропроводимостью.

Вид образует большое количество внематричного мицелия, обеспечивающего надлежащее симбиотическое функционирование.

Вид достигает высоких концентраций внутренней колонизации за короткие промежутки времени, особенно в сельскохозяйственных культурах в условиях интенсивного ведения сельского хозяйства, что свидетельствует о его высокой эффективности в этих условиях.

Благодаря небольшому размеру спор и большому количеству внематричного мицелия, а также способности к восстановлению вида из-за физических повреждений, штамм можно обработать и измельчить до менее 80 микрон, при этом он будет оставаться полностью жизнеспособным в глинистом субстрате в течение более чем двух лет с доказанной эффективностью в диапазоне от 1,2×10⁴ до 1×10⁸ контагиозных ростков/100 мл^-1 почвы.

Применение этого вида способствует эффективному увеличению урожайности сельскохозяйственных культур при интенсивном ведении сельского хозяйства, и сохраняет высокий уровень физиологической активности за счет небольших затрат энергии, учитывая малую величину транспирации, что способствует рациональному и эффективному использованию воды.

Штамм способствует радикальному изменению строения корня, способствуя развитию другой корневой системы, развивая ее в горизонтальном направлении и с большим дихотомическим ветвлением, что вызвано быстрой внутренней и внешней микоризной колонизацией, и потребностью в большем количестве корневых клеток-хозяев, которые также способствуют лучшему развитию корней в краткосрочной и долгосрочной перспективе.

Другим важным аспектом, который предстоит оценить, является микробная активность, осуществляемая этим организмом в ризосфере. Этот штамм вызывает постоянную стимуляцию ризосферных микробиотов в обработанных растениях. Этот факт обусловлен выделением собственных питательных элементов через мелкие корни, микоризы и гифы, стимулирующих как активность микроризосферы, так активность ризосферы в непосредственной близости от внешнего мицелия штамма Glomus iranicum var. tenuihypharum var. nov., создающего более высокую микробную концентрацию в каждый момент испытания.

Glomus iranicum var. tenuihypharum var. nov. - вид грибов, который прекрасно формирует микоризу.

Другой вариант осуществления изобретения представляет собой композицию, которая содержит штамм Glomus iranicum var. tenuihypharum var. nov, депонированный под депонентным номером 54871 в ВССМ, содержащий последовательность, обозначаемую идентификатором SEQ ID №: 1, смектитные глины 2:1, ионы металлов и хитин.

В частности, указанные смектитные глины 2:1 являются диоктаэдрическими или триоктаэдрическими. И, кроме того, в частности, указанные смектитные глины 2:1 выбраны из группы, состоящей из сепиолита, аттапульгита, нонтронита и сапонита.

В настоящем изобретении используется глина типа диоктаэдрического или триоктаэдрического смектита, сепиолита и аттапульгита, каждый из которых обладает высокой пластичностью при смачивании и состоит из очень тонкого зернистого материала, состоящего из очень мелких частиц, размер которых составляет менее 4 микрон, и его основным свойством является расширение в системах с небольшим количеством воды, поскольку он может служить субстратом для размножения микоризных грибов. С другой стороны, это очень важно для образования и распада коллоидных частиц при наличии большого количества воды в случае применения в локальных оросительных системах. Эти типы глин по завершении одного из этапов образования инокулята обеспечивают образование микоризных ростков со спорами, внематричным мицелием и колонизированными мелкими корнями; возникновение стрессовых ситуаций способствует последующему ускорению процессов проращивания сразу после инокуляции в условиях интенсивного и экологического выращивания сельскохозяйственных культур.

Другой вариант осуществления изобретения представляет собой композицию изобретения, в которой концентрация указанного штамма Glomus iranicum var. tenuihypharum var. nov. составляет от 0,05 до 4% по весу. В частности, концентрация составляет от 0,1 до 3% по весу.

Другой вариант осуществления изобретения представляет собой композицию изобретения, в которой концентрация хитина составляет от 2 до 10% по весу.

Другой вариант осуществления изобретения представляет собой композицию изобретения, в которой указанные ионы металлов выбраны из группы, в которую входят Fe, Ca и Mg.

В частности, композиция изобретения включает Fe, Ca и Mg.

Другой вариант осуществления изобретения представляет собой композицию изобретения, в которой концентрация Fe составляет от 3 до 12% по весу, концентрация Ca - от 0,5 до 5% по весу и концентрация Mg - от 0,2 до 2% по весу.

Благодаря микоризной экспрессии гена, необходимо подчеркнуть образование большого количества внематричного мицелия и легко извлекаемого гломалина, которое происходит при наличии вида Glomus iranicum var. tenuihypharum var. nov. независимо от используемого удобрения, что свидетельствует об адаптации данного микроорганизма к различным соленым средам.

У растений, обработанных Glomus iranicum var. tenuihypharum var. nov., увеличивается скорость образования листьев и корневой биомассы, что в свою очередь связано с более высокой концентрацией питательных веществ в листьях при наибольших дозах удобрений, что свидетельствует о высокой переносимости этих условий.

Применение Glomus iranicum var. tenuihypharum var. nov. приводит к высокой фотосинтетической активности за счет меньшей скорости испарения, в результате чего обработанные растения более эффективно используют воду на протяжении всего периода созревания урожая при 50% и 100% дозах используемого удобрения

Штамм Glomus iranicum var. tenuihypharum var. nov. обладает высокой активностью штамма Glomus iranicum var. tenuihypharum var. nov. по отношению к остальной части инокулятов, используемых в примере 1, что, возможно, обусловлено природой самого вида как высокосимбиотического суперпродуцента внематричного мицелия, гломалина, и сильной внутренней колонизацией, которая, в свою очередь, приводит к надлежащей физиологической активности с низкой устьичной проводимостью, что приводит к эффективному использованию воды и высокой производительности даже при более высоких дозах удобрения.

Другой вариант осуществления изобретения представляет собой композицию изобретения, в которой указанная композиция представлена в форме порошка, эмульгируемого концентрата или гранул.

Другой вариант осуществления изобретения представляет собой композицию изобретения, в которой указанная композиция представляет собой жидкость, твердое вещество или гель.

Другой вариант осуществления изобретения представляет собой композицию изобретения, содержащую по меньшей мере один фунгицид, по меньшей мере один биофунгицид, по меньшей мере один инсектицид, по меньшей мере один биоинсектицид, по меньшей мере один нематоцид и/или по меньшей мере один бионематоцид.

В частности, указанный фунгицид выбран из группы, включающей манеб, манкозеб, металаксил-ридомил, миклобутанил, олпизан, пропамокарб, квинтозин, стрептомицин, серу, тиофанатметил, тирам, трифорин, винклозолин, окись цинка, цинеб, цирам, банрот, связанную медь, хлорталонил, каптан, хлорнеб, ципроконазол, этилен цинка, бисдитиокарбамат, этридиазол, фенаминосульф, фенаримол, флутоланил, фолпет, фосетил алюминия и ипродион.

В частности, указанный биофунгицид выбран из группы, включающей Trichodermas sp, Bacillus subtilis, Bacillus licheniformis, Bacillus pumilus, Bacillus amyloliquefaciens, Streptomyces sp, Coniothyrium minitans и Pythium oligandrum.

В частности, указанный инсектицид выбран из группы, включающей органофосфат, карбамат и неоникотиноид.

В частности, указанный биоинсектицид выбран из группы, включающей Bacillus sp., Chromobacterium sp., Beauveria sp.и Metarhizium sp.

В частности, указанный нематоцид представляет собой органофосфат или карбамат.

В частности, указанный бионематоцид представляет собой Pasteuria sp.

Другой вариант осуществления изобретения представляет собой способ получения композиции изобретения, включающий:

(a) инокуляцию оболочки семени растения-хозяина штаммом Glomus iranicum var. tenuihypharum var. nov., депонированным под депонентным номером 54871 в ВССМ,

(b) выращивание указанного растения с циклами полива от 7 до 10 дней на репродуктивном субстрате, содержащем смектитовые глины, которые в процентном соотношении составляют более 52% от общего веса указанного субстрата,

(c) прекращение указанного полива в течение периода, равного или более 20 дней,

(d) удаление надземной части растения и удаление субстрата, и

(e) измельчение указанного субстрата до менее 80 микрон при температуре от 25 до 30°С для получения указанной композиции.

В примере 1 композиция изобретения показала высокую эффективность в качестве бионематоцида. Было установлено, что обработка с помощью композиции изобретения привела к более интенсивному начальному развитию, которое поддерживалось в течение всего цикла роста.

Наиболее важным фактом является то, что у всех обрабатываемых растений наблюдается резкое снижение продуктивности примерно через 140 дней после пересадки, и растения значительно увядают при естественном старении и повышении температуры, характерной для дней, благоприятных для распространения колоний нематод. Это приводит к получению очень маленьких плодов, не имеющих никакой коммерческой ценности.

Вторая инокуляция препаратов с помощью композиции изобретения и применение препарата для сравнения (Видат) снова активизирует производительность и вегетативный рост растений обычным путем при всех обработках с помощью препаратов Glomus iranicum var. tenuihypharum var. nov. и композиции изобретения, способствуя более быстрому росту и скорейшему восстановлению растения. Это происходит из-за быстрого действия этого вида, вызывающего ускорение корневой активности в растении, и демонстрирующего лучшую эффективность, чем препарат для сравнения, и приводящее к улучшению внешнего вида и производительности в конце испытания, как при лечебной, так и при профилактической обработке. Чтобы избежать резкого снижения продуктивности, рекомендуется проводить вторую инокуляцию композиции изобретения примерно на 120 день, чтобы предотвратить распространение нематод и ускорить развитие корневой системы.

Более высокая производительность наблюдалась для обоих сортов помидоров, взятых из примера 2, которые обрабатывали композицией изобретения в количестве 13 кг/растение для сорта Даниела и 5 кг/растение для сорта Раф. После данной обработки были получены самые большие плоды, что свидетельствует о лучшем поглощении воды и питательных веществ.

Другим вариантом осуществления изобретения является использование композиции изобретения в качестве бионематоцида, далее - использование изобретения.

Другой вариант осуществления изобретения заключается в использовании данного изобретения, в котором композицию изобретения применяют к растению путем обработки семян, корней, погружения корней в эмульсию, добавления в воду для полива, полива, применения порошка в корневой системе или впрыскивания эмульсии в корневую систему.

Краткое описание рисунков

Рисунок 1. На рисунке показаны результаты расчета общего количества бактерий (КОЕ/мл почвы, верхняя часть) или общего количества грибов (КОЕ/мл почвы, нижняя часть) для различных обработок в условиях лечебного воздействия. Результаты приведены для случаев использования Glomus iranicum var. tenuihypharum var. nov. (пунктирная линия), Glomus iranicum var. tenuihypharum var. nov. с ионами металлов и хитина (сплошная линия), применения соединения Видат (пунктирная и точечная линия) и результатов для контрольных растений (точечная линия).

Рисунок 2. На рисунке показаны результаты расчета общего количества бактерий (КОЕ/мл почвы, верхняя часть) или общего количества грибов (КОЕ/мл почвы, нижняя часть) для различных обработок в условиях профилактики. Результаты приведены для случаев использования Glomus iranicum var. tenuihypharum var. nov. (пунктирная линия), Glomus iranicum var. tenuihypharum var. nov. с ионами металлов и хитина (сплошная линия), применения соединения Видат (пунктирная и точечная линия) и результатов для контрольных растений (точечная линия).

Предпочтительные варианты осуществления изобретения

Пример 1

Генетическая идентификация штамма изобретения

Выделение ДНК

Выделенные гифы и споры переносили в пробирки Эппендорфа объемом 1,5 мл со стеклянными шариками массой 0,2 г (2 мм в диаметре) и 100 мкл буферного раствора ЦТАБ (2% ЦТАБ = Цетил-триметил аммония бромид, 1,4 М NaCl, 0,1 М Трис-HCl рН 7,5, 0,2 М Na-ЭДТА).

Данную смесь гармонизировали с помощью шаровой мельницы типа Retsch ММ301 на полной скорости в течение 30 секунд. Добавили еще 400 мкл буферного раствора ЦТАБ, и смесь выдерживали в термостате при температуре 65°С в течение одного часа. Затем добавили 400 мкл смеси хлороформа и изоамилового спирта (24:1) и размешали смесь, перевернув реакционные пробирки, и центрифугировали смесь в течение 5 минут при 10000×г, а верхний слой собрали в чистую пробирку Эппендорфа. Данный этап повторили два раза. В данную суспензию добавили 200 мкл 5 М ацетата аммония, смесь выдержали в термостате при температуре 4°С в течение 30 минут, после чего ее подвергли центрифугованию в течение 20 минут при температуре 4°С и скорости 13000 об/мин. ДНК осаждалась всю ночь с помощью 700 мкл изопропанола при температуре -20°С. Полученную осажденную ДНК выделили с помощью изопропанола и промыли ледяным 70% этиловым спиртом, высушили и повторно растворили в 50 мкл буферного раствора Трис этилендиамина (10 мМ Трис, 10 мМ ЭДТА, рН 8) + 4,5 U РНКаза/мл.

Условия полимеразной цепной реакции

Для ПЦР-амплификации и секвенирования внутренних транскрибируемых участков-спейсеров гена 18S рРНК использовались праймеры Gloml310 и ITS4i (Редекер, 2000). Амплификации проводились в 0,2 мМ смеси dNTP, 1 мМ каждого праймера, 10% рабочем буферном растворе ПЦР и дважды дистиллированной стерильной воде. ДНК-полимеразу GoTaq® (Promega, Мангейм, Германия) добавили в 3,75 и/100 мкл реакционной смеси; 2 мкл матрицы геномной ДНК использовали в каждых 20 мкл/реакционная смесь. Амплификации проводились в усовершенствованном термоблоке Primus 96 (peqLab Biotechnology) в 200 реакционных пробирках (мкл) (изначальная денатурация проводилась при температуре 94°С в течение 120 с, после которой проводились 30 циклов при температуре 94°С в течение 15 с, при температуре 52°С в течение 30 с, при температуре 72°С в течение 45 с, а окончательный скошенный агар выдерживался при 72°С в течение 120 с).

Анализ данных

Выравнивание осуществлялось первоначально с использованием компьютерной программы BioEdit 7.0. Филогенетические анализы методом максимального правдоподобия (МП) были проведены с помощью программы PHYML. Модель замены нуклеотидов семейства GTR использовалась с оценками МП базовых частот. Доля неизменных участков была оценена и оптимизирована. Были разработаны четыре категории нормы замещения, и оценен и оптимизирован параметр гамма-распределения. Был использован бутстрэп-анализ со 100 повторами для проверки статистической поддержки ветвей.

Секвенирование

Избыточные праймеры и dNTP извлекались с помощью колоночной хроматографии (MicroSpin S-300 HR, Amersham Biosciences). Для частичного секвенирования области 18S-ITS1-5.8S использовались праймеры Glom1310 и ITS4i в концентрации 1,6 мМ. Секвенирование проводилось с помощью набора для циклического секвенирования PRISM BigDyeTM Terminator Cycle Sequencing Kit от компании ABI (Applied Biosystems) в соответствии с рекомендациями завода-изготовителя. Параметры для секвенирования: задержка 18 секунд при 96°С, а затем 25 циклов по 18 сек при 96°С, 5 секунд при 50°С и 4 мин при 60°С.Анализ последовательности проводили с использованием автоматического анализатора последовательностей (ABI PRISM 3130, Applied Biosystems) в сочетании с программным обеспечением ABI Prism™ Auto Assembler (версия 140, Applied Biosystems).

Последовательность рибосомной РНК 18S (частичная последовательность), ITS1 (полная последовательность) и ген 5.8S рибосомной РНК (частичная последовательность) были получены из штамма изобретения, последовательность которого обозначается идентификатором SEQ ID №: 1.

Пример 2

Эффективность воздействия композиции изобретения на урожай помидоров

Испытание было разделено на две части: профилактическую и лечебную обработку, разделенные на 5 обработок:

O₁: Обработка контрольных растений

О₂: Обработка микоризным инокулятом Glomus iranicum var. tenuihypharum var. nov.

O₃: Обработка испытуемым препаратом. (Композиция изобретения, Glomus iranicum var. tenuihypharum var. nov. с ионами металлов и хитином)

О₅: Обработка для сравнения с коммерческим препаратом (ВИДАТ, оксамил)

Оценивалось количество грибов Glomus iranicum var. tenuihypharum var. nov. при обработках, в процессе которых осуществлялась инокуляция гриба. В 1 кг почве было образовано от 1 до 5 грамм мицелия и спор данного вида, что составляет от 0,1 и 0,5%. С другой стороны, корневая система, в которой они были образованы, достигла 10% от общего веса (100 г). Вес мелких корней, обработанных грибом данного вида, составил 40 г на 1 килограмм почвы, т.е. 4% от общего веса. На этих мелких корнях имеется только 75% микоризных ростков, поэтому процентное содержание микоризы в одном килограмме почвы составляет 3%.

Композиция изобретения, используемая при Обработке О₃, содержит Glomus iranicum var. tenuihypharum var. nov.; концентрации хитина и ионов металлов в указанной композиции составили: хитин - 5% по весу, Fe - 5% по весу, Ca - 4% по весу и Mg - 1% по весу.

Профилактическая и лечебная обработки были проведены по 4 раза. Каждый экспериментальный блок включал 2 емкости для выращивания растений объемом 30 л с 2 растениями. Растения были выбраны случайным образом для каждой обработки, или были выбраны растения, подверженные воздействию вирусов, испорченные растения или растения с патологическими изменениями. Ряды и емкости, соответствующие всей периферии испытания, не были в него включены, чтобы избежать пограничного эффекта.

Условия полива и внесения удобрений были одинаковыми на всем участке для проведения испытания. Было обеспечено место для слива при поливе 4 л/ч на емкость для выращивания растений. Для всех обработок было оборудовано два места для слива.

Вода для полива, используемая для проведения испытания, подавалась из системы подачи Таджо-Сегара. Вода для полива была щелочной и слегка соленой, с несколько повышенным содержанием ионов натрия и хлора, но это никоим образом не ограничивает объекта испытания.

Используемый инокулят был взят из партии торфа с корнями помидоров, зараженных фитопаразитическими нематодами из теплиц из Масаррона, провинция Мурсия. Инокулят гомогенизировали и размножили, чтобы обеспечить надлежащее распределение популяции нематод и обеспечить их достаточное количество для второй инокуляции.

В предыдущем испытании, целью которого было определение фитопаразитических нематод, было обнаружено большое количество галловых нематодов (Meloidogyne), несколько меньшее количество гетеродер (Heterodera) и почти не было обнаружено особей золотистых картофельных нематод (Globodera).

Первая инокуляция была проведена в день, совпадающий с днем высадки растений, подвергнутых лечебной обработке в ходе испытания. Вторая инокуляция была проведена только в ходе профилактической обработки в процессе испытания за два дня до первого применения препаратов. Период роста составил 9 месяцев.

Проведение инокуляции нематод при лечебной обработке в процессе испытания совпало с пересадкой помидоров. Через один месяц была проведена инокуляция нематод в ходе профилактической обработки испытания. Через два дня было проведено первое применение (инокуляции композиции изобретения и применение Видата), и через 2 месяца второе применение (инокуляции композиции изобретения и применение Видата).

Элементы N, Р, K, Ca и Mg использовались в течение периода роста в следующем соотношении: N - 12,8 мМ; Р - 1,4 мМ; K - 5,5 мМ; Ca - 4,8 мМ; Mg - 2,4 мМ. Для достижения данного соотношения удобрение использовалось в следующих концентрациях: 0,117 см³/л 72% фосфорной кислоты, 0,379 г/л нитрата кальция, 0,547 г/л калиевой селитры, 0,120 г/л аммиачной селитры, 0,020 г/л смеси микроэлементов. Использовались следующие параметры регулятора подачи воды при поливе: окончательный рН 5,5, чтобы получить рН 6 в капельнице, предполагаемый расход - 0,07 л/м³ 59% азотной кислоты, окончательная электропроводимость (ЭП) - 2,1 дСм/м, повышение ЭП - 0,8 дСм/м.

В таблице ниже приведены данные о проведенных фитосанитарных обработках.

Оценка образования галлов

Было проведено два выкорчевывания для каждой обработки: в начале в процессе лечебной обработки, чтобы оценить уровень заражения, и в конце в процессе профилактической обработки с той же целью.

Первое выкорчевывание было проведено через 45 дней после инокуляции нематод и через 7 дней после применения испытуемого препарата. Было проведено сканирование с высоким разрешением, увеличивающее живые корни, погруженные в осмосную воду, с помощью которого наблюдалось большое процентное соотношение галлов при всех обработках, что свидетельствует о большом количестве нематод.

Второе выкорчевывание было проведено через 120 дней после инокуляции и через 83 дня после применения испытуемого препарата. На данном этапе четко наблюдалась значительная разница между обработками. У растений, обработанных композицией изобретения, наблюдалось меньшее количество галлов и большее количество активных маленьких корней.

Третье выкорчевывание было проведено по окончании выращивания растений, которые подлежали профилактической обработке, для оценки степени заражения нематодами при всех обработках.

Разницы в строении и развитии корней в сравнении с результатами, полученными через 120 дней, не было. Испытуемый препарат показал лучшие результаты, что можно было наблюдать с помощью сканирования живых корней, погруженных в осмосную воду.

Анализ корней

Для каждого вида обработки было произведено 9 выемок почвы и 2 выкорчевывания корней, чтобы оценить толщину корней, их колонизацию, внешний мицелий, общую микрофлору и нематодологию.

В таблицах ниже приведены общие значения касательно микоризной колонизации, внематричного мицелия и нематодологии, которые соответствуют данным, полученным при девяти выемках, произведенных на протяжении всего периода роста.

Микоризная колонизация

Были взяты образцы мелких корней, их промыли дионизированной водой и очистили в 10% растворе гидроксида калия в течение 10 минут при температуре 90°С. После этого их выдержали в 2N растворе HCl в течение 10 минут и в конце окрасили 0,05 лакто глицерином - раствором трипанового синего.

На основании данных можно сделать вывод о том, что при обработке композицией изобретения получена большая микоризная колонизация, достигающая 89% как при лечебной, так и при профилактической обработке испытания. Микоризные значения, полученные при обработке Glomus iranicum var. tenuihypharum var. nov., были ниже при наличии ионов металла и хитина. Как лечебная, так и профилактическая обработка повлияла на колонизацию местных древовидных микоризных грибов (ДМГ), при этом она уменьшилась при применении Видата, что, несомненно, повлияло на местную микоризацию.

Внематричный мицелий

После центрифугирования и декантирования 50 г аликвотной части пробы почвы, весь материал, собранный в сито с размером ячеек 40 микрон, собрали, пропустили через лабораторную мешалку при 900 об/мин, отфильтровали под вакуумом, сложили собранный материал в 5 реплик по 40 мг и оценили под препаровальной лупой. Были определены две воображаемые линии - по горизонтали и вертикали, и среднее значение рассчитанного количества мицелия умножили на поправочный коэффициент 0,000745 и экстраполировали до мг мицелия на грамм образца.

Процесс формирования внематричного мицелия был похож на микоризную колонизацию, а также в процентном соотношении колонизации были зарегистрированы более высокие значения в отношении обработки композицией изобретения. Значения для мицелия были выше при наличии ионов металлов и хитина, однако, в растениях, обработанных только Glomus iranicum var. tenuihypharum var. nov., этот параметр также достигает высокой концентрации по сравнению с обработкой контрольных растений Видатом, что дополнительно снизило количество образуемого внематричного мицелия местных грибов. Как и процент колонизации, значения были очень схожи с двумя условиями применения, а при лечебной обработке наблюдалась наибольшая стимуляция роста.

Количество нематод при лечебной обработке

Анализ процесса изменения количества нематод в почве был проведен на основании количества молодых нематод (J2) и процента смертности их популяций. Было обнаружено, что после обработки Видатом и композицией изобретения в процессе проведения испытания у контрольных растений наблюдались очень похожие уровни J2, но не у растений, обработанных Glomus iranicum var. tenuihypharum var. nov., и не у растений абсолютного контроля.

Тем не менее, было установлено, что применение композиции изобретения способствовало появлению самого высокого процента смертности, который также держался на постоянном уровне с 60 дня до окончания испытания, что демонстрирует его силу в качестве бионематоцида, из-за эффекта, вызываемого комбинированным воздействием, с одной стороны, микоризных грибов, а, с другой стороны, ионов металлов и хитина, что спровоцировало разрушение нематод в ризосфере. При обработке контрольных растений химическим средством наибольший процент смертности наблюдался на 60 день, но эффективность химического средства была тесно связана с точными моментами его применения и не была длительной как в предыдущем случае.

Процент смертности после применения одного штамма Glomus iranicum var. tenuihypharum var. nov. достиг более 60%, а через 6 месяцев его активность значительно снизилась. Растения абсолютного контроля имели худший процент смертности в почве.

Количество нематод при профилактической обработке

В случае профилактической обработки Видатом уровни J2 были ниже, чем при обработке композицией изобретения, тем не менее, в обоих случаях можно было контролировать количество нематод по сравнению с остальными видами обработки, при которых наблюдались очень сходные уровни в течение всего испытания.

После анализа процента смертности в этих условиях были получены результаты, которые были очень схожи с результатами, полученными после лечебной обработки, поэтому применение композиции изобретения способствовало получению самого высокого процента смертности, который также держался на постоянном уровне с 60 дня до окончания испытания. При обработке контрольных растений химическим средством наибольший процент смертности наблюдался на 60 и 120 день, но затем он постепенно уменьшался. Кроме того, эффективность химического средства была тесно связана с точными моментами его применения и не была длительной.

Как при лечебной, так и при профилактической обработке композицией изобретения наблюдался высокий процент смертности нематод, который поддерживался на уровне около 70-80% в течение всего периода роста. Тем не менее, обработка Видатом утратила эффективность в течение нескольких дней.

Активность ризосферы при лечебной обработке

Были приготовлены серийные разведения образцов ризосферной почвы. Впоследствии были определены концентрации ризосферных бактерий и грибов, присутствующих при различных обработках, путем определения наиболее вероятного числа микроорганизмов. Для роста бактерий использовался питательный агар, а для роста грибов использовался агар с бенгальским розовым и картофельный агар с декстрозой.

Графики изменения количества микроорганизмов всей микрофлоры (бактерии и грибы) в процессе всего испытания при лечебных обработках (Рисунок 1) показывают стимулирующее воздействие, связанное с обработкой композицией изобретения, на контроль количества нематод, колонизацию, микоризную активность, а также на стимулирование микроорганизмов ризосферы. Незначительное стимулирующее воздействие также наблюдалось при обработке с использованием только гидразидов малеиновой кислоты, указывая, что, несмотря на известную стимуляцию гифосферы, которая происходит в древовидных микоризных сообществах, оно еще больше усиливалось при наличии ионов металлов и хитина.

Активность ризосферы при профилактической обработке

Результаты показаны на Рисунке 2. При профилактических обработках был получен тот же результат, что и при лечебных обработках.

Важно отметить, что при обработке контрольных растений и обработке Видатом была обнаружена низкая микробная активность. Такая низкая активность вызвана по причине сильного воздействия на контрольные растения при воздействии нематод и дезинфицирующего воздействия Видата, в результате чего значительно снизилось количество микроорганизмов.

Производительность и качество

Был собран урожай со всех растений, подвергшихся лечебной и профилактической обработке, а количество плодов было подсчитано, и плоды взвешены. Плоды, имеющие дефект или пораженные заболеванием, отбраковывались.

Браком считались только плоды, имеющие дефект или пораженные заболеванием, и они отбраковывались. Небольшие плоды не отбраковывались. С начала сбора урожай собирали примерно один раз в неделю до конца роста сельскохозяйственных культур.

Полные данные для каждого сорта при профилактической и лечебной обработке приведены ниже:

Данные о градусах плотности Брикса и твердости плодов получили всего за пять раз в разные периоды сбора урожая, чтобы оценить степень влияния на качество плодов.

Полные данные для каждого сорта при профилактической и лечебной обработке приведены ниже:

Значительных изменений градусов плотности Брикса, вызванных популяцией нематод или в результате применения препаратов, выявлено не было. Значения были нормальными для обоих сортов, и был получен максимальный градус плотности Брикса от середины по кругу (8,1° Брикса, измеренный у сорта Раф, и 6,4° Брикса - у сорта Даниэла, оба значения относятся к обработке 03).

Твердость плодов значительно не ухудшилась, поскольку показания пенетрометра были нормальными для каждого сорта. Значения для сорта Раф находятся в диапазоне от 4,5 до 5,5 при всех обработках, и для сорта Даниэла - от 4,8 до 5,6. Поэтому у плодов наблюдалась нормальная консистенция, как при наличии вредителей, так и после применения испытуемых препаратов.

Штамм Glomus iranicum var. tenuihypharum var. nov., депонированный под депонентным номером 54871 в ВССМ и включающий последовательность, обозначаемую идентификатором SEQ ID №: 1, при этом штамм используется для включения в композицию бионематоцида.