Комбинированная терапия для лечения рака

Группа изобретений относится к лечению рака. Предложены: терапевтическая композиция для ингибирования метилтрансферазы гистона человека EZH2, содержащая N-(4,6-диметил-2-оксо-1,2-дигидропиридин-3-ил)метил)-5-(этил(тетрагидро-2H-пиран-4-ил)амино)-4-метил-4’-(морфолинометил)-[1,1’-дифенил]-3-карбоксамид или его соль и один или более других терапевтических агентов, выбранных из противораковых агентов или глюкокортикоидов (предпочтительно дексаметазон или преднизон); способ лечения с её использованием; способ лечения рака; способ ингибирования пролиферации раковой клетки (варианты). Технический результат состоит в синергетическом действии по снижению жизнеспособности раковых клеток и задержке роста опухоли. 6 н. и 28 з.п. ф-лы, 10 ил., 4 табл.

 

РОДСТВЕННЫЕ ЗАЯВКИ

[001] Настоящая заявка предусматривает собой международную заявку № PCT/US2013/036452, зарегистрированную 12 апреля 2013 года, переведенную на национальную фазу, которая испрашивает приоритет и преимущество предварительной заявки США № 61/624194, зарегистрированной 13 апреля 2012 года, и предварительной заявки США № 61/785169, зарегистрированной 14 марта 2013 года, содержание каждой из которых включено полностью посредством ссылки.

ВКЛЮЧЕНИЕ В ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ ПУТЕМ ССЫЛКИ НА СПИСОК ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ

[002] Содержание текстового файла "EPIZ009001WO_ST25.txt", который был создан 14 октября 2014 года и занимает 45 кБ, включено ссылкой в описание во всей его полноте.

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ

[003] Настоящее изобретение относится к композициям, содержащим ингибиторы метилтрансферазы гистона человека EZH2, каталитической субъединицы комплекса PRC2, которая катализирует от моно- до три-метилирования лизина 27 на гистоне H3 (H3-K27), и один или более других терапевтических агентов, в частности, противораковых агентов, и способам комбинированной терапии для лечения рака.

УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

[004] Лечения рака комбинированной терапией стали более распространены, частично, благодаря воспринимаемому преимуществу воздействия на заболевание через множество путей. Несмотря на то, что много эффективных лечений комбинированной терапией обнаружено за прошедшие несколько десятилетий; ввиду продолжающейся высокой ежегодной смертности по причине рака, есть непрерывная потребность в нахождении эффективных терапевтических режимов для применения в лечении против рака.

СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

[005] В одном аспекте настоящее изобретение описывает композицию, включающую соединение формулы (IIa), которая изображена ниже, и один или более других терапевтических агентов или их фармацевтически приемлемую соль или их сложный эфир.

[006] Соединения формулы (IIa) могут включать одну или более из следующих особенностей:

[007] Каждый из R_a и R_b, независимо друг от друга, представляет собой H или С₁-С₆ алкил.

[008] R_a и R_b вместе с атомом N, к которому они присоединены, представляют собой 4-7-членное гетероциклоалкильное кольцо, содержащее 0 или 1 дополнительный гетероатом, при этом С₁-С₆ алкил и 4-12-членное (например, 4-7-членное) гетероциклоалкильное кольцо являются необязательно замещенными одним или более -Q₃-T₃.

[009] Q₃ представляет собой связь или незамещенный или замещенный С₁-С₃ алкильный линкер.

[010] T₃ представляет собой H, галоген, 4-7-членный гетероциклоалкил, С₁-С₃ алкил, OR_d, COOR_d, -S(O)₂R_d или -NR_dR_e, каждый R_d и R_e, независимо друг от друга, представляет собой H или С₁-С₆ алкил.

[011] R₇ представляет собой С₁-С₆ алкил, С₃-С₈ циклоалкил или 4-12-членный (например, 4-7-членный) гетероциклоалкил, каждый необязательно представляет собой замещенный одним или более -Q₅-T₅. Например, R₇ не представляет собой H.

[012] R₇ представляет собой 4-7-членный гетероциклоалкил, необязательно замещенный одним или более -Q₅-T₅.

[013] R₇ представляет собой пиперидинил, тетрагидропиран, циклопентил или циклогексил, каждый необязательно является замещенным одним-Q₅-T₅.

[014] T₅ представляет собой H, галоген, С₁-С₆ алкил, С₁-С₆ алкоксил, С₃-С₈ циклоалкил, С₆-С₁₀ арил или 4-12-членный (например, 4-7-членный) гетероциклоалкил.

[015] Q₅ представляет собой связь, и T₅ представляет собой С₁-С₆ алкил, С₃-С₈ циклоалкил или 4-12-членный (например, 4-7-членный) гетероциклоалкил.

[016] Q₅ представляет собой CO, S(O)₂ или NHC(O); и T₅ представляет собой С₁-С₆ алкил, С₁-С₆ алкоксил, С₃-С₈ циклоалкил или 4-12-членный (например, 4-7-членный) гетероциклоалкил.

[017] Q₅ представляет собой С₁-С₃ алкильный линкер, и T₅ представляет собой H или С₆-С₁₀ арил.

[018] Q₅ представляет собой С₁-С₃ алкильный линкер, и T₅ представляет собой С₃-С₈ циклоалкил, 4-7-членный гетероциклоалкил или S(O)_qR_q.

[019] R₇ представляет собой циклопентил или циклогексил, каждый необязательно является замещенным одним -Q₅-T₅.

[020] Q₅ представляет собой NHC(O), и T₅ представляет собой С₁-С₆ алкил или С₁-С₆ алкоксил.

[021] R₇ представляет собой изопропил.

[022] Каждый из R₂ и R₄, независимо друг от друга, представляет собой H или С₁-С₆ алкил, необязательно замещенный амино, моно-С₁-С₆ алкиламино, ди-С₁-С₆ алкиламино или С₆-С₁₀ арилом.

[023] R₈ представляет собой H, метил или этил.

[024] R₈ представляет собой метил.

[025] R₈ представляет собой этил.

[026] R₈ представляет собой 4-7-гетероциклоалкил, например, тетрагидропиран.

[027] Настоящее изобретение описывает композицию, содержащую соединение, выбранное из таблицы 1, или его фармацевтически приемлемую соль или сложный эфир и один или более других терапевтических агентов.

[028] Настоящее изобретение описывает композицию, содержащую соединение 44

или его фармацевтически приемлемую соль или сложный эфир и один или более других терапевтических агентов.

[029] В этом и других аспектах настоящего изобретения, в одном варианте осуществления настоящего изобретения другие терапевтические агенты представляют собой противораковые агенты.

[030] В этом и других аспектах настоящего изобретения, в одном варианте осуществления настоящего изобретения другие терапевтические агенты представляют собой глюкокортикоиды.

[031] В этом и других аспектах настоящего изобретения, в одном варианте осуществления настоящего изобретения другие терапевтические агенты выбраны из преднизона, преднизолона, циклофосфамида, винкристина, доксорубицина, мафосфамида, цисплатина, AraC, эверолимуса, децитабина, дексаметазона и их аналогов, производных или комбинаций.

[032] В этом и других аспектах настоящего изобретения, в одном варианте осуществления настоящего изобретения другой терапевтический агент представляет собой преднизон или его аналог или производное.

[033] Настоящее изобретение также описывает фармацевтические композиции, содержащие соединение, выбранное из соединений формулы (IIa), раскрытые в настоящем описании, или их фармацевтически приемлемые соли и один или более терапевтических агентов и фармацевтически приемлемый носитель.

[034] Настоящее изобретение также описывает фармацевтические композиции, содержащие соединение, выбранное из таблицы I, один или более других терапевтических агентов или их фармацевтически приемлемых солей и фармацевтически приемлемый носитель.

[035] Настоящее изобретение также описывает фармацевтические композиции, содержащие соединение, выбранное из соединений формулы (IIa), раскрытые в настоящем описании, или их фармацевтически приемлемые соли или один или более других терапевтических агентов и фармацевтически приемлемый носитель.

[036] Другим аспектом настоящего изобретения является способ лечения или предотвращения заболевания путем введения нуждающемуся в этом пациенту терапевтически эффективного количества композиции, содержащей соединение формулы (IIa), или его фармацевтически приемлемой соли и один или более дополнительных терапевтических агентов. На заболевание по настоящему изобретению можно воздействовать, лечить его или предотвращать путем изменения статуса метилирования гистонов или других белков. Например, заболевание представляет собой рак, предраковое состояние или неврологическое заболевание. Предпочтительно, лимфома представляет собой неходжкинскую лимфому, фолликулярную лимфому или диффузную B-крупноклеточную лимфому. Альтернативно, лейкоз представляет собой хронический миелогенный лейкоз (CML). Предраковое состояние представляет собой, например, миелодиспластический синдром (MDS, прежде известный как предлейкоз).

[037] Пациент по настоящему изобретению включает любого пациента-человека, у которого диагностирован рак, который имеет симптомы рака или подвергается риску развития рака или предракового состояния. Пациент по настоящему изобретению включает любого пациента-человека, у которого экспрессируется мутант EZH2. Например, мутант EZH2 содержит одну или более мутаций, где мутация представляет собой замещение, точечную мутацию, нонсенс-мутацию, миссенс-мутацию, удаление или вставку. Мутант EZH2 по настоящему изобретению может содержать мутацию в домене субстрат-связывающего кармана, как определено в SEQ ID NO:6. Мутант EZH2 может иметь замещение в аминокислоте Y641. Предпочтительно, мутант EZH2 имеет одну из следующих мутаций: замещение фенилаланина (F) на остаток тирозина дикого типа (Y) в положении аминокислоты 641 SEQ ID NO:1 (Y641F); замещение гистидина (H) на остаток тирозина дикого типа (Y) в положении аминокислоты 641 SEQ ID NO:1 (Y641H); замещение аспарагина (N) на остаток тирозина дикого типа (Y) в положении аминокислоты 641 SEQ ID NO:1 (Y641N); замещение серина (S) на остаток тирозина дикого типа (Y) в положении аминокислоты 641 SEQ ID NO:1 (Y641S); и замещение цистеина (С) на остаток тирозина дикого типа (Y) в положении аминокислоты 641 SEQ ID NO:1 (Y641C).

[038] Другие мутации EZH2 могут включать, но не ограничены ими: замещение глицина (G) на остаток аланина дикого типа (A) в положении аминокислоты 677 SEQ ID NO:1 (A677G); замещение валина (V) на остаток аланина дикого типа (A) в положении аминокислоты 687 SEQ ID NO:1 (A687V); замещение метионина (M) на остаток валина дикого типа (V) в положении аминокислоты 674 SEQ ID NO:1 (V674M); замещение гистидина (H) на остаток аргинина дикого типа (R) в положении аминокислоты 685 SEQ ID NO:1 (R685H); замещение цистеина (С) на остаток аргинина дикого типа (R) в положении аминокислоты 685 SEQ ID NO:1 (R685C); замещение серина (S) на остаток аспарагина дикого типа (N) в положении аминокислоты 322 SEQ ID NO:3 (N322S), замещение глутамина (Q) на остаток аргинина дикого типа (R) в положении аминокислоты 288 SEQ ID NO:3 (R288Q), замещение изолейцина (I) на остаток треонина дикого типа (T) в положении аминокислоты 573 SEQ ID NO:3 (T573I), замещение глутаминовой кислоты (E) на остаток аспарагиновой кислоты дикого типа (D) в положении аминокислоты 664 SEQ ID NO:3 (D664E), замещение глутамина (Q) на остаток аргинина дикого типа (R) в положении аминокислоты 458 SEQ ID NO:5 (R458Q), замещение лизина (K) на остаток глутаминовой кислоты дикого типа (E) в положении аминокислоты 249 SEQ ID NO:3 (E249K), замещение цистеина (С) на остаток аргинина дикого типа (R) в положении аминокислоты 684 SEQ ID NO:3 (R684C), замещение гистидина (H) на остаток аргинина дикого типа (R) в положении аминокислоты 628 SEQ ID NO:11 (R628H), замещение гистидина (H) на остаток глутамина дикого типа (Q) в положении аминокислоты 501 SEQ ID NO:5 (Q501H), замещение аспарагина (N) на остаток аспарагиновой кислоты дикого типа (D) в положении аминокислоты 192 SEQ ID NO:3 (D192N), замещение валина (V) на остаток аспарагиновой кислоты дикого типа (D) в положении аминокислоты 664 SEQ ID NO:3 (D664V), замещение лейцина (L) на остаток валина дикого типа (V) в положении аминокислоты 704 SEQ ID NO:3 (V704L), замещение серина (S) на остаток пролина дикого типа (P) в положении аминокислоты 132 SEQ ID NO:3 (P132S), замещение лизина (K) на остаток глутаминовой кислоты дикого типа (E) в положении аминокислоты 669 SEQ ID NO:11 (E669K), замещение треонина (T) на остаток аланина дикого типа (A) в положении аминокислоты 255 SEQ ID NO:3 (A255T), замещение валина (V) на остаток глутаминовой кислоты дикого типа (E) в положении аминокислоты 726 SEQ ID NO:3 (E726V), замещение тирозина (Y) на остаток цистеина дикого типа (С) в положении аминокислоты 571 SEQ ID NO:3 (C571Y), замещение цистеина (С) на остаток фенилаланина дикого типа (F) в положении аминокислоты 145 SEQ ID NO:3 (F145C), замещение треонина (T) на остаток аспарагина дикого типа (N) в положении аминокислоты 693 SEQ ID NO:3 (N693T), замещение серина (S) на остаток фенилаланина дикого типа (F) в положении аминокислоты 145 SEQ ID NO:3 (F145S), замещение гистидина (H) на остаток глутамина дикого типа (Q) в положении аминокислоты 109 SEQ ID NO:11 (Q109H), замещение цистеина (С) на остаток фенилаланина дикого типа (F) в положении аминокислоты 622 SEQ ID NO:11 (F622C), замещение аргинина (R) на остаток глицина дикого типа (G) в положении аминокислоты 135 SEQ ID NO:3 (G135R), замещение глутамина (Q) на остаток аргинина дикого типа (R) в положении аминокислоты 168 SEQ ID NO:5 (R168Q), замещение аргинина (R) на остаток глицина дикого типа (G) в положении аминокислоты 159 SEQ ID NO:3 (G159R), замещение цистеина (С) на остаток аргинина дикого типа (R) в положении аминокислоты 310 SEQ ID NO:5 (R310C), замещение гистидина (H) на остаток аргинина дикого типа (R) в положении аминокислоты 561 SEQ ID NO:3 (R561H), замещение гистидина (H) на остаток аргинина дикого типа (R) в положении аминокислоты 634 SEQ ID NO:11 (R634H), замещение аргинина (R) на остаток глицина дикого типа (G) в положении аминокислоты 660 SEQ ID NO:3 (G660R), замещение цистеина (С) на остаток тирозина дикого типа (Y) в положении аминокислоты 181 SEQ ID NO:3 (Y181C), замещение аргинина (R) на остаток гистидина дикого типа (H) в положении аминокислоты 297 SEQ ID NO:3 (H297R), замещение серина (S) на остаток цистеина дикого типа (С) в положении аминокислоты 612 SEQ ID NO:11 (C612S), замещение тирозина (Y) на остаток гистидина дикого типа (H) в положении аминокислоты 694 SEQ ID NO:3 (H694Y), замещение аланина (A) на остаток аспарагиновой кислоты дикого типа (D) в положении аминокислоты 664 SEQ ID NO:3 (D664A), замещение треонина (T) на остаток изолейцина дикого типа (I) в положении аминокислоты 150 SEQ ID NO:3 (I150T), замещение аргинина (R) на остаток изолейцина дикого типа (I) в положении аминокислоты 264 SEQ ID NO:3 (I264R), замещение лейцина (L) на остаток пролина дикого типа (P) в положении аминокислоты 636 SEQ ID NO:3 (P636L), замещение треонина (T) на остаток изолейцина дикого типа (I) в положении аминокислоты 713 SEQ ID NO:3 (I713T), замещение пирролидин-альфа-карбоновой кислоты (P) на остаток глутамина дикого типа (Q) в положении аминокислоты 501 SEQ ID NO:5 (Q501P), замещение глутамина (Q) на остаток лизина дикого типа (K) в положении аминокислоты 243 SEQ ID NO:3 (K243Q), замещение аспарагиновой кислоты (D) на остаток глутаминовой кислоты дикого типа (E) в положении аминокислоты 130 SEQ ID NO:5 (E130D), замещение глицина (G) на остаток аргинина дикого типа (R) в положении аминокислоты 509 SEQ ID NO:3 (R509G), замещение гистидина (H) на остаток аргинина дикого типа (R) в положении аминокислоты 566 SEQ ID NO:3 (R566H), замещение гистидина (H) на остаток аспарагиновой кислоты дикого типа (D) в положении аминокислоты 677 SEQ ID NO:3 (D677H), замещение аспарагина (N) на остаток лизина дикого типа (K) в положении аминокислоты 466 SEQ ID NO:5 (K466N), замещение гистидина (H) на остаток аргинина дикого типа (R) в положении аминокислоты 78 SEQ ID NO:3 (R78H), замещение метионина (M) на остаток лизина дикого типа (K) в положении аминокислоты 1 SEQ ID NO:6 (K6M), замещение лейцина (L) на остаток серина дикого типа (S) в положении аминокислоты 538 SEQ ID NO:3 (S538L), замещение глутамина (Q) на остаток лейцина дикого типа (L) в положении аминокислоты 149 SEQ ID NO:3 (L149Q), замещение валина (V) на остаток лейцина дикого типа (L) в положении аминокислоты 252 SEQ ID NO:3 (L252V), замещение валина (V) на остаток лейцина дикого типа (L) в положении аминокислоты 674 SEQ ID NO:3 (L674V), замещение валина (V) на остаток аланина дикого типа (A) в положении аминокислоты 656 SEQ ID NO:3 (A656V), замещение аспарагиновой кислоты (D) на остаток аланина дикого типа (A) в положении аминокислоты 731 SEQ ID NO:3 (Y731D), замещение треонина (T) на остаток аланина дикого типа (A) в положении аминокислоты 345 SEQ ID NO:3 (A345T), замещение аспарагиновой кислоты (D) на остаток аланина дикого типа (A) в положении аминокислоты 244 SEQ ID NO:3 (Y244D), замещение триптофана (W) на остаток цистеина дикого типа (С) в положении аминокислоты 576 SEQ ID NO:3 (C576W), замещение лизина (K) на остаток аспарагина дикого типа (N) в положении аминокислоты 640 SEQ ID NO:3 (N640K), замещение лизина (K) на остаток аспарагина дикого типа (N) в положении аминокислоты 675 SEQ ID NO:3 (N675K), замещение тирозина (Y) на остаток аспарагиновой кислоты дикого типа (D) в положении аминокислоты 579 SEQ ID NO:11 (D579Y), замещение изолейцина (I) на остаток аспарагина дикого типа (N) в положении аминокислоты 693 SEQ ID NO:3 (N693I) и замена лизина (K) на остаток аспарагина дикого типа (N) в положении аминокислоты 693 SEQ ID NO:3 (N693K).

[039] Другие мутации EZH2 могут включать: сдвиг рамки считывания в положении аминокислоты 730, 391, 461, 441, 235, 254, 564, 662, 715, 405, 685, 64, 73, 656, 718, 374, 592, 505, 730 или 363 SEQ ID NO:3, 5 или 11 или соответствующем положении нуклеотида последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей SEQ ID NO:3, 5 или 11; удаление глутаминовой кислоты (E) и лейцина (L) в положениях аминокислоты 148 и 149 SEQ ID NO:3, 5 или 11, или нонсенс-мутацию в положении аминокислоты 733, 25, 317, 62, 553, 328, 58, 207, 123, 63, 137 или 60 SEQ ID NO:3, 5 или 11.

[040] Пациент по настоящему изобретению может обладать устойчивостью к любому одному или более другим терапевтическим агентам или любому из соединений, приведенных в настоящем описании. Например, пациент может обладать устойчивостью к ингибиторам EZH или преднизону.

[041] Настоящее изобретение описывает способ ингибирования пролиферации раковой клетки, включающий приведение в контакт указанных раковых клеток с композицией, включающей любое соединение формулы (IIa) или его фармацевтически приемлемую соль и один или более дополнительных терапевтических агентов. Ингибирование пролиферации раковой клетки включает задержку роста раковой клетки, вызов отмирания клеток, снижение жизнеспособности раковой клетки, ингибирование или задержку роста опухоли или уменьшение размера опухоли.

[042] Настоящее изобретение описывает способы комбинированной терапии, в которых любое соединение формулы (IIa) или его фармацевтически приемлемая соль и один или более других терапевтических агентов применяют одновременно или последовательно. Например, любое соединение формулы (IIa) или его фармацевтически приемлемая соль может быть введена до введения одного или более других терапевтических агентов. Например, любое соединение формулы (IIa) или его фармацевтически приемлемая соль может быть введена до введения композиции, включающей любое соединение формулы (IIa) или его фармацевтически приемлемую соль и один или более других терапевтических агентов. Параллельное или последовательное введение любого соединения формулы (IIa) и/или каждого из терапевтических агентов может быть осуществлено любым подходящим путем, включая, но не ограничивая ими, пероральные пути, внутривенные пути, внутримышечные пути и прямое поглощение через ткани слизистой оболочки. Терапевтические агенты могут быть введены одинаковым путем или различными путями.

[043] Способы комбинированной терапии, описанные в настоящем изобретении, могут давать синергический эффект, в котором эффект от комбинации соединений или других терапевтических агентов больше суммы эффектов в результате введения любого из соединений или других терапевтических агентов в качестве одиночных агентов. Синергический эффект также может быть эффектом, который не может быть достигнут путем введения ни одного из соединений или других терапевтических агентов в качестве одиночных агентов. Синергический эффект может включать, но не ограничен ими, эффект лечения рака уменьшением размера опухоли, ингибирования роста опухоли или увеличения выживаемости пациентов. Синергический эффект может также включать снижение жизнеспособности раковой клетки, вызывание отмирания раковой клетки и задержку роста раковой клетки.

[044] Композиции по настоящему изобретению могут быть введены в дозировке от 0,01 мг/кг в сутки до приблизительно 1000 мг/кг в сутки. Любое соединение формулы (IIa) или его фармацевтически приемлемая соль может быть введена в дозировке от 0,01 мг/кг в сутки до приблизительно 1000 мг/кг в сутки. Любой другой терапевтический агент может быть введен в дозировке от 0,01 мг/кг в сутки до приблизительно 1000 мг/кг в сутки.

[045] Если иначе не определено, все технические и научные термины, примененные в настоящем описании, имеют то же самое значение, как обычно понимается специалистами в области техники, к которой принадлежит настоящее изобретение. В спецификации формы единственного числа также включают множественное число, если контекст ясно не указывает иначе. Несмотря на то, что способы и материалы, подобные или эквивалентные приведенным в настоящем описании, могут быть введены на практике или при тестировании настоящего изобретения, подходящие способы и материалы описаны ниже. Все публикации, патентные заявки, патенты и другие ссылки, указанные в настоящем описании, включены посредством ссылки. Ссылки, процитированные в настоящем описании, не считаются предшествующей областью техники по отношению к патентуемому изобретению. В случае конфликта настоящая спецификация, включая определения, имеет приоритет. Кроме того, материалы, способы и примеры являются только иллюстративными и не предназначены для ограничения.

[046] Другие особенности и преимущества настоящего изобретения будут очевидны из следующего подробного описания и формулы изобретения.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ

[047] Фиг. 1 является схематической детализацией in vitro планов лечения для определения эффекта комбинированной терапии на жизнеспособность клетки. (A) Введение соединения 44 до введения соединения 44 и компонент CHOP (циклофосфамид, доксорубицин, винкристин и преднизолон). (B) Введение соединения 44 до компонент CHOP. (С) Введение компонент CHOP до введения соединения 44 и компонент CHOP. Через 4 дня определяли жизнеспособность клетки.

[048] Фиг. 2 представляет четыре графика с измерениями жизнеспособности раковой клетки in vitro после лечения соединением 44 и одними только компонентами CHOP или в комбинации. Клетки WSU-DLCL2 обрабатывали как показано на Фиг. 1A. Клетки сначала обрабатывали различными концентрациями соединения 44. Через четыре дня клетки обрабатывали комбинацией различных концентраций соединения 44 и (A) мафосфамида (метаболит циклофосфамида), (B) доксорубицина, (С) винкристина или (D) преднизолона (метаболит преднизона). Контрольные клетки обрабатывали ДМСО. Жизнеспособность клеток нормализовали по проценту жизнеспособности клетки при обработке ДМСО для каждой концентрации соединения 44.

[049] Фиг. 3 представляет три графика с измерениями жизнеспособности раковой клетки после различных планов обработки. Клетки WSU-DCLC2 обрабатывали увеличивающимися концентрациями преднизолона и соединения 44. Клетки обрабатывали соединением 44 и преднизолоном согласно плану обработки в (A) Фиг. 1А, (B) Фиг. 1В или (С) Фиг. 1С. Жизнеспособность клетки нормализовали по ДМСО/ДМСО-обработанному образцу.

[050] Фиг. 4 представляет три графика с измерениями жизнеспособности раковой клетки после лечения преднизолоном и соединением 44 в клеточных линиях с различными мутациями EZH2. Клетки обрабатывали так, как изображено на Фиг. 1A и увеличивающимися концентрациями преднизолона и соединения 44. Жизнеспособность клетки нормализовали по ДМСО/ДМСО-обработанному образцу. (A) WSU-DLCL2 клетки экспрессируют мутацию Y641F и являются чувствительными к ингибиторам EZH2. (B) RL клетки экспрессируют мутацию Y641N и являются устойчивыми к ингибиторам EZH2 и преднизолону. (С) OCI-LY19 являются клетками дикого типа в Y641 и проявляют чувствительность к преднизолону, но не проявляют чувствительность к соединению 44 или повышенную чувствительность к комбинациям соединения 44 плюс преднизолон.

[051] Фиг. 5 представляет пять графиков, показывающих панель фармакокинетических профилей для совместного введения соединения 44 и компонент CHOP in vivo. Мышам BALB/c вводили один раз пероральным путем соединение 44 и компоненты CHOP. Концентрацию соединения 44 (нг/мл) в плазме измеряли в различные моменты времени через 0-24 часа после введения. Циклофосфамид вводили интраперитонеальной инъекцией в дозе 30 мг/кг. Винкристин вводили внутривенной инъекцией в дозе 0,375 мг/кг. Доксорубицин вводили внутривенной инъекцией в дозе 2,475 мг/кг. Преднизолон вводили пероральным путем в дозе 0,15 мг/кг. Соединение 44 вводили пероральным путем в дозе 225 мг/кг.

[052] Фиг. 6 представляет два графика, демонстрирующих эффект введения соединения 44 и CHOP в модели ксенотрансплантата SUDHL6 на рост опухоли и выживание. Бестимусным мышам подкожно вводили инъекцией 1×10⁷ клеток лимфомы человека SUDHL6. После того, как опухоли достигали размера приблизительно 120 мм³, соединение 44 вводили в течение 28 дней в указанных дозировках либо три раза в день (TID), либо два раза в день (BID). CHOP (циклофосфамид, винкристин, доксорубицин и преднизон) вводили на 1 и 8 день мышам, получающим 225 мг/кг дважды в сутки (225 мг/кг BID и CHOP). Контрольные мыши не получали соединение 44 (носитель) или только CHOP (CHOP). Два раза в неделю измеряли объем опухоли. Животным делали эвтаназию тогда, когда объем опухоли достигал 2000 мм³ или через 60 дней после первой дозы. (A) Для анализа задержки роста опухоли средний объем опухоли вычисляли для каждой группы обработки путем измерения опухоли два раза в неделю в течение 60 дней или до тех пор, пока опухоль не достигала 2000 мм³. (B) Кривая Каплана-Мейера изображает выживаемость мышей.

[053] Фиг. 7 представляет три графика, демонстрирующие эффект от введения соединения 44 и CHOP в модели ксенотрансплантата WSU-DLCL2 на рост опухоли и выживание. Мышам SCID подкожно вводили 1×10⁷ клеток лимфомы человека WSU-DLCL2. После того, как опухоли достигали размера приблизительно 120 мм³, соединение 44 вводили в течение 28 дней в указанных дозировках три раза в день (TID), два раза в день (BID) или один раз в день (QD). CHOP (циклофосфамид, винкристин, доксорубицин и преднизон) вводили в 1 и 22 дни мышам, получающим 225 мг/кг два раза в день (225 мг/кг BID и CHOP). Контрольные мыши либо не получали соединение 44 (носитель), либо получали только CHOP (CHOP). Два раза в неделю измеряли объем опухоли. Животным делали эвтаназию через 28 дней после первой дозы. (A) Эффективность обработки определяли путем измерения среднего объема опухоли в течение лечения. (B) Концентрацию (нг/мл) соединения 44 измеряли в плазме мышей на 28 день перед введением (trough) и через три часа после введения (post). (С) Концентрацию (нг/г) соединения 44 измеряли в ткани опухоли из мышей на 28 день через три часа после введения.

[054] Фиг. 8 представляет вестерн-блот-анализ и график, показывающий статус метилирования гистона в образцах опухолевых тканей из модели ксенотрансплантата WSU-DLCL2. Опухоли собирали через 28 дней после инъекции и экстрагировали гистоны. (A) Вестерн-блоттинг анализ проводили с антителами, специфически распознающими три-метилированный лизин 27 из гистона H3 (H3K27me3) и общих гистонных белков H3. (B) Статус метилирования опухолей определяли посредством ELISA. Определяли три-метилирование H3K27 и нормализовали по общим гистонным H3 уровням.

[055] Фиг. 9 представляет четыре графика, демонстрирующие эффект от введения соединения 44 и COP в модели ксенотрансплантата SUDHL10 на рост опухоли и выживание. Мышам SCID подкожно вводили 1×10⁷ клеток лимфомы человека SUDHL10. После того, как опухоли достигли размера приблизительно 120 мм³, соединение 44 вводили в течение 28 дней в указанных дозировках два раза в день (BID). COP (циклофосфамид, винкристин и преднизон) вводили в 1 и 22 дни мышам, получающим 250 мг/кг два раза в день (250 мг/кг BID и COP). Контрольные мыши не получали соединение 44 (носитель) или только COP (COP). Два раза в неделю измеряли объем опухоли. (A) Эффективность обработки определяли путем измерения среднего объема опухоли на протяжении лечения. (B) Средний вес опухоли определяли после того, как мышей подвергали эвтаназии на 28 день после первого введения дозы. (С) Для анализа задержки роста опухоли вычисляли средний объем опухоли и SEM для каждой группы лечения путем измерения опухоли два раза в неделю в течение 60 дней или до тех пор, пока опухоль не достигала 2000 мм³. (D) Кривая Каплана-Мейера изображает выживаемость мышей, проходящих лечение.

[056] Фиг. 10 представляет четыре графика, показывающие фармакокинетику и фармакодинамические профили после введения COP и соединения 44 введения в модели ксенотрансплантата SUDHL10. Онкологическим мышам делали эвтаназию через 28 дней лечения и собирали ткани. (A) Концентрацию (нг/мл) соединения 44 измеряли в плазме мышей на 28 день перед введением (trough) и после введения (post) при помощи ЖХ-МС/МС. Статус метилирования различных тканей из онкологических мышей определяли посредством ELISA: (B) опухоль, (С) селезенка и (D) костный мозг. Триметилирование H3K27 обнаруживали и нормализовали по общим гистонным H3 уровням.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ НАСТОЯЩЕГО ИЗОБРЕТЕНИЯ

[057] Настоящее изобретение основано на открытии того, что ингибиторы метилтрансферазы гистона EZH2 и другие противораковые агенты могут быть применены в комбинации для лечения определенных опухолей с лучшими результатами, чем результаты, достигаемые лечением опухолей ингибиторами метилтрансферазы гистона EZH2 и только противораковыми агентами отдельно. Соответственно, настоящее изобретение обеспечивает композицию, включающую ингибитор метилтрансферазы гистона EZH2 и один или более других терапевтических агентов, и способы их применения для лечения заболеваний, на течение которых можно воздействовать путем изменения статуса метилирования гистонов или других белков, например, рака. В определенном варианте осуществления настоящего изобретения настоящее изобретение описывает композицию, включающую соединение формулы (IIa) и преднизон. Настоящее изобретение также включает способы комбинированной терапии, включающей ингибитор метилтрансферазы гистона EZH2 и один или более терапевтических агентов, таких как соединение формулы (IIa) и преднизон, для лечения рака, например, фолликулярной лимфомы (FL) и диффузной В-крупноклеточной лимфоцитарной лимфомы (DCLBL). Специфически, способы по настоящему изобретению являются полезными для лечения или предотвращения рака или ингибирования пролиферации раковых клеток.

[058] EZH2 представляет собой метилтрансферазу гистона, которая является каталитической субъединицей комплекса PRC2, которая катализирует от моно- до три-метилирования лизина 27 на гистоне H3 (H3-K27). Триметилирование гистона H3-K27 является механизмом для подавления транскрипции специфических генов, которые находятся в непосредственной близи от участка модификации гистона. Известно, что это триметилирование является маркерным геном рака с измененной экспрессией в раковых клетках, таких как клетки рака простаты (см., например, публикация патентной заявки США № 2003/0175736; включенная в настоящее описание полностью посредством ссылки). Другие исследования предоставляли свидетельства функциональной связи между неуправляемой экспрессией EZH2, репрессией транскрипции и малигнизацией. Varambally et al. (2002) Nature 419(6907):624-9 Kleer et al. (2003) Proc Natl Acad Sci USA 100(20):11606-11.

[059] Один аспект настоящего изобретения относится к способам лечения или облегчения симптомов рака или предзлокачественного состояния у пациента путем введения пациенту, у которого экспрессируется мутант EZH2, терапевтически эффективного количества ингибитора EZH2 и одного или более других терапевтических агентов. Мутант EZH2 по настоящему изобретению относится к мутантному EZH2 полипептиду или последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей мутантный EZH2 полипептид. В определенных вариантах осуществления мутант EZH2 содержит одну или более мутаций в своем домене субстрат-связывающего кармана, как определено в SEQ ID NO:6. Например, мутация может представлять собой замещение, точечную мутацию, нонсенс-мутацию, миссенс-мутацию, удаление или вставку.

[060] Нуклеиновые кислоты EZH2 человека и полипептиды ранее были описаны. См., например, Chen et al. (1996) Genomics 38:30-7 [746 аминокислот]; по каталогу Swiss-Prot № Q15910 [746 аминокислот]; по каталогу GenBank №№ NM_004456 и NP_004447 (изоформа a [751 аминокислот]); и по каталогу GenBank №№ NM_152998 и NP_694543 (изоформа b [707 аминокислот]), все из которых включены в настоящее описание полностью посредством ссылки.

Последовательность аминокислот EZH2 человека (по каталогу Swiss-Prot № Q15910) (SEQ ID NO:1)

Последовательность нуклеотидов EZH2 человека, вариант транскрипта 1 (по каталогу GenBank № NM_004456) (SEQ ID NO:2)

Полная аминокислота EZH2, изоформа а (по каталогу GenBank № NP_004447) (SEQ ID NO:3)

Последовательность нуклеотидов EZH2 человека, вариант транскрипта 2 (по каталогу GenBank № NM_152998) (SEQ ID NO:4)

Полная аминокислота EZH2, изоформа b (по каталогу GenBank № NP_694543) (SEQ ID NO:5)

Полная аминокислота EZH2, изоформа e (по каталогу GenBank № NP_001190178.1) (SEQ ID NO:11)

Ген-усилитель zeste гомолога 2 Homo sapiens (Дрозофила) (EZH2), вариант транскрипта 5, последовательность нуклеотидов (по каталогу GenBank № NM_001203249.1) (SEQ ID NO:12)

[061] Модель структуры неполноценного белка EZH2 на основе цепи А ядерного рецептора, связывающего домен SET белка 1 (NSD1), предоставлена ниже. Эта модель соответствует остаткам аминокислот 533-732 последовательности EZH2 SEQ ID NO:1.

[062] Соответствующая последовательность аминокислот этой модели структуры предоставлена ниже. Остатки в домене субстрат-связывающего кармана подчеркнуты. Остатки в домене SET показаны курсивом.

[063] Считается, что каталитический участок EZH2 расположен в консервативном домене белка, известном как домен SET. Последовательность аминокислот домена SET у EZH2 предоставлена следующей частичной последовательностью, охватывающей остатки аминокислот 613-726 по каталогу Swiss-Prot № Q15910 (SEQ ID NO:1):

Остаток тирозина (Y), показанный подчеркнутым, в SEQ ID NO:7 представляет собой Tyr641 (Y641) в каталоге Swiss-Prot № Q15910 (SEQ ID NO:1).

[064] Домен SET в каталоге GenBank № NP_004447 (SEQ ID NO:3) охватывает остатки аминокислот 618-731 и идентичен с SEQ ID NO:6. Остаток тирозина, соответствующий Y641 в каталоге Swiss-Prot № Q15910, показанный подчеркнутым, в SEQ ID NO:7 представляет собой Tyr646 (Y646) в каталоге GenBank № NP_004447 (SEQ ID NO:3).

[065] Домен SET в каталоге GenBank № NP_694543 (SEQ ID NO:5) охватывает остатки аминокислот 574-687 и идентичен с SEQ ID NO:7. Остаток тирозина, соответствующий Y641 в каталоге Swiss-Prot № Q15910, показанный подчеркнутым, в SEQ ID NO:7 представляет собой Tyr602 (Y602) в каталоге GenBank № NP_694543 (SEQ ID NO:5).

[066] Нуклеотидная последовательность, кодирующая домен SET в каталоге GenBank № NP_004447, представляет собой

где кодон, кодирующий Y641, показан подчеркнутым.

[067] В целях настоящей заявки остаток аминокислоты Y641 EZH2 человека необходимо понимать как относящийся к остатку тирозина, который представляет собой или соответствует Y641 в каталоге Swiss-Prot № Q15910.

Полная последовательность аминокислот Y641 мутанта EZH2 (SEQ ID NO:9)

Где x может быть любым остатком аминокислоты, отличным от тирозина (Y)

[068] Также в целях настоящей заявки мутант Y641 EZH2 человека, и, эквивалентно, мутант Y641 EZH2, необходимо понимать как относящийся к EZH2 человека, в котором остаток аминокислоты, соответствующий Y641 для дикого типа EZH2 человека, замещен остатком аминокислоты, отличным от тирозина.

[069] В одном варианте осуществления настоящего изобретения последовательность аминокислот мутанта Y641 у EZH2 отличается от последовательности аминокислот для дикого типа EZH2 человека только замещением одного остатка аминокислоты, соответствующего Y641 для дикого типа EZH2 человека, остатком аминокислоты, отличным от тирозина.

[070] В одном варианте осуществления настоящего изобретения последовательность аминокислот у мутанта Y641 в EZH2 отличается от последовательности аминокислот для дикого типа EZH2 человека только замещением фенилаланина (F) на один остаток аминокислоты, соответствующий Y641 у дикого типа EZH2 человека. Мутант Y641 в EZH2 согласно этому варианту осуществления называют в настоящем описании мутантом Y641F или, эквивалентно, Y641F.

[071] В одном варианте осуществления настоящего изобретения последовательность аминокислот у мутанта Y641 в EZH2 отличается от последовательности аминокислот для дикого типа EZH2 человека только замещением гистидина (H) на один остаток аминокислоты, соответствующий Y641 для дикого типа EZH2 человека. Мутант Y641 в EZH2 согласно этому варианту осуществления называют в настоящем описании мутантом Y641H или, эквивалентно, Y641H.

[072] В одном варианте осуществления настоящего изобретения последовательность аминокислот у мутанта Y641 в EZH2 отличается от последовательности аминокислот для дикого типа EZH2 человека только замещением аспарагина (N) на один остаток аминокислоты, соответствующий Y641 для дикого типа EZH2 человека. Мутант Y641 в EZH2 согласно этому варианту осуществления называют в настоящем описании мутантом Y641N или, эквивалентно, Y641N.

[073] В одном варианте осуществления настоящего изобретения последовательность аминокислот у мутанта Y641 в EZH2 отличается от последовательности аминокислот для дикого типа EZH2 человека только замещением серина (S) на один остаток аминокислоты, соответствующий Y641 для дикого типа EZH2 человека. Мутант Y641 в EZH2 согласно этому варианту осуществления называют в настоящем описании мутантом Y641S или, эквивалентно, Y641S.

[074] В одном варианте осуществления настоящего изобретения последовательность аминокислот у мутанта Y641 в EZH2 отличается от последовательности аминокислот для дикого типа EZH2 человека только замещением цистеина (С) на один остаток аминокислоты, соответствующий Y641 для дикого типа EZH2 человека. Мутант Y641 в EZH2 согласно этому варианту осуществления называют в настоящем описании мутантом Y641C или, эквивалентно, Y641C.

[075] В одном варианте осуществления настоящего изобретения последовательность аминокислот у мутанта A677 EZH2 отличается от последовательности аминокислот для дикого типа EZH2 человека только замещением неаланиновой аминокислоты, предпочтительно, глицина (G), на один остаток аминокислоты, соответствующий A677 для дикого типа EZH2 человека. Мутант A677 EZH2 согласно этому варианту осуществления называют в настоящем описании мутантом A677 и, предпочтительно, мутантом A677G или, эквивалентно, A677G.

[076] В одном варианте осуществления настоящего изобретения последовательность аминокислот у мутанта A687 в EZH2 отличается от последовательности аминокислот для дикого типа EZH2 человека только замещением неаланиновой аминокислоты, предпочтительно, валина (V), на один остаток аминокислоты, соответствующий A687 для дикого типа EZH2 человека. Мутант A687 EZH2 согласно этому варианту осуществления называют в настоящем описании мутантом A687 и предпочтительно мутантом A687V или, эквивалентно, A687V.

[077] В одном варианте осуществления настоящего изобретения последовательность аминокислот у мутанта R685 в EZH2 отличается от последовательности аминокислот для дикого типа EZH2 человека только замещением неаргининовой аминокислоты, предпочтительно, гистидина (H) или цистеина (С), на один остаток аминокислоты, соответствующий R685 для дикого типа EZH2 человека. Мутант R685 EZH2 согласно этому варианту осуществления называют в настоящем описании мутантом R685 и, предпочтительно, мутантом R685C или мутантом R685H или, эквивалентно, R685H или R685C.

[078] В одном варианте осуществления настоящего изобретения последовательность аминокислот у мутанта в EZH2 отличается от последовательности аминокислот для дикого типа EZH2 человека одним или более остатками аминокислот в его домене субстрат-связывающего кармана, как определено в SEQ ID NO:6. Мутант EZH2 согласно этому варианту осуществления называют в настоящем описании мутантом EZH2.

[079] Другая иллюстрационная мутация замещения аминокислоты включает замещение в положении аминокислоты 677, 687, 674, 685 или 641 SEQ ID NO:1, такое как, но не ограничено им, замещение глицина (G) на остаток аланина дикого типа (A) в положении аминокислоты 677 SEQ ID NO:1 (A677G); замещение валина (V) на остаток аланина дикого типа (A) в положении аминокислоты 687 SEQ ID NO:1 (A687V); замещение метионина (M) на остаток валина дикого типа (V) в положении аминокислоты 674 SEQ ID NO:1 (V674M); замещение гистидина (H) на остаток аргинина дикого типа (R) в положении аминокислоты 685 SEQ ID NO:1 (R685H); замещение цистеина (С) на остаток аргинина дикого типа (R) в положении аминокислоты 685 SEQ ID NO:1 (R685C); замещение фенилаланина (F) на остаток тирозина дикого типа (Y) в положении аминокислоты 641 SEQ ID NO:1 (Y641F); замещение гистидина (H) на остаток тирозина дикого типа (Y) в положении аминокислоты 641 SEQ ID NO:1 (Y641H); замещение аспарагина (N) на остаток тирозина дикого типа (Y) в положении аминокислоты 641 SEQ ID NO:1 (Y641N); замещение серина (S) на остаток тирозина дикого типа (Y) в положении аминокислоты 641 SEQ ID NO:1 (Y641S); или замена цистеина (С) на остаток тирозина дикого типа (Y) в положении аминокислоты 641 SEQ ID NO:1 (Y641C).

[080] Мутация по настоящему изобретению может также включать замещение серина (S) на остаток аспарагина дикого типа (N) в положении аминокислоты 322 SEQ ID NO:3 (N322S), замещение глутамина (Q) на остаток аргинина дикого типа (R) в положении аминокислоты 288 SEQ ID NO:3 (R288Q), замещение изолейцина (I) на остаток треонина дикого типа (T) в положении аминокислоты 573 SEQ ID NO:3 (T573I), замещение глутаминовой кислоты (E) на остаток аспарагиновой кислоты дикого типа (D) в положении аминокислоты 664 SEQ ID NO:3 (D664E), замещение глутамина (Q) на остаток аргинина дикого типа (R) в положении аминокислоты 458 SEQ ID NO:5 (R458Q), замещение лизина (K) на остаток глутаминовой кислоты дикого типа (E) в положении аминокислоты 249 SEQ ID NO:3 (E249K), замещение цистеина (С) на остаток аргинина дикого типа (R) в положении аминокислоты 684 SEQ ID NO:3 (R684C), замещение гистидина (H) на остаток аргинина дикого типа (R) в положении аминокислоты 628 SEQ ID NO:11 (R628H), замещение гистидина (H) на остаток глутамина дикого типа (Q) в положении аминокислоты 501 SEQ ID NO:5 (Q501H), замещение аспарагина (N) на остаток аспарагиновой кислоты дикого типа (D) в положении аминокислоты 192 SEQ ID NO:3 (D192N), замещение валина (V) на остаток аспарагиновой кислоты дикого типа (D) в положении аминокислоты 664 SEQ ID NO:3 (D664V), замещение лейцина (L) на остаток валина дикого типа (V) в положении аминокислоты 704 SEQ ID NO:3 (V704L), замещение серина (S) на остаток пролина дикого типа (P) в положении аминокислоты 132 SEQ ID NO:3 (P132S), замещение лизина (K) на остаток глутаминовой кислоты дикого типа (E) в положении аминокислоты 669 SEQ ID NO:11 (E669K), замещение треонина (T) на остаток аланина дикого типа (A) в положении аминокислоты 255 SEQ ID NO:3 (A255T), замещение валина (V) на остаток глутаминовой кислоты дикого типа (E) в положении аминокислоты 726 SEQ ID NO:3 (E726V), замещение тирозина (Y) на остаток цистеина дикого типа (С) в положении аминокислоты 571 SEQ ID NO:3 (C571Y), замещение цистеина (С) на остаток фенилаланина дикого типа (F) в положении аминокислоты 145 SEQ ID NO:3 (F145C), замещение треонина (T) на остаток аспарагина дикого типа (N) в положении аминокислоты 693 SEQ ID NO:3 (N693T), замещение серина (S) на остаток фенилаланина дикого типа (F) в положении аминокислоты 145 SEQ ID NO:3 (F145S), замещение гистидина (H) на остаток глутамина дикого типа (Q) в положении аминокислоты 109 SEQ ID NO:11 (Q109H), замещение цистеина (С) на остаток фенилаланина дикого типа (F) в положении аминокислоты 622 SEQ ID NO:11 (F622C), замещение аргинина (R) на остаток глицина дикого типа (G) в положении аминокислоты 135 SEQ ID NO:3 (G135R), замещение глутамина (Q) на остаток аргинина дикого типа (R) в положении аминокислоты 168 SEQ ID NO:5 (R168Q), замещение аргинина (R) на остаток глицина дикого типа (G) в положении аминокислоты 159 SEQ ID NO:3 (G159R), замещение цистеина (С) на остаток аргинина дикого типа (R) в положении аминокислоты 310 SEQ ID NO:5 (R310C), замещение гистидина (H) на остаток аргинина дикого типа (R) в положении аминокислоты 561 SEQ ID NO:3 (R561H), замещение гистидина (H) на остаток аргинина дикого типа (R) в положении аминокислоты 634 SEQ ID NO:11 (R634H), замещение аргинина (R) на остаток глицина дикого типа (G) в положении аминокислоты 660 SEQ ID NO:3 (G660R), замещение цистеина (С) на остаток тирозина дикого типа (Y) в положении аминокислоты 181 SEQ ID NO:3 (Y181C), замещение аргинина (R) на остаток гистидина дикого типа (H) в положении аминокислоты 297 SEQ ID NO:3 (H297R), замещение серина (S) на остаток цистеина дикого типа (С) в положении аминокислоты 612 SEQ ID NO:11 (C612S), замещение тирозина (Y) на остаток гистидина дикого типа (H) в положении аминокислоты 694 SEQ ID NO:3 (H694Y), замещение аланина (A) на остаток аспарагиновой кислоты дикого типа (D) в положении аминокислоты 664 SEQ ID NO:3 (D664A), замещение треонина (T) на остаток изолейцина дикого типа (I) в положении аминокислоты 150 SEQ ID NO:3 (I150T), замещение аргинина (R) на остаток изолейцина дикого типа (I) в положении аминокислоты 264 SEQ ID NO:3 (I264R), замещение лейцина (L) на остаток пролина дикого типа (P) в положении аминокислоты 636 SEQ ID NO:3 (P636L), замещение треонина (T) на остаток изолейцина дикого типа (I) в положении аминокислоты 713 SEQ ID NO:3 (I713T), замещение пролина (P) на остаток глутамина дикого типа (Q) в положении аминокислоты 501 SEQ ID NO:5 (Q501P), замещение глутамина (Q) на остаток лизина дикого типа (K) в положении аминокислоты 243 SEQ ID NO:3 (K243Q), замещение аспарагиновой кислоты (D) на остаток глутаминовой кислоты дикого типа (E) в положении аминокислоты 130 SEQ ID NO:5 (E130D), замещение глицина (G) на остаток аргинина дикого типа (R) в положении аминокислоты 509 SEQ ID NO:3 (R509G), замещение гистидина (H) на остаток аргинина дикого типа (R) в положении аминокислоты 566 SEQ ID NO:3 (R566H), замещение гистидина (H) на остаток аспарагиновой кислоты дикого типа (D) в положении аминокислоты 677 SEQ ID NO:3 (D677H), замещение аспарагина (N) на остаток лизина дикого типа (K) в положении аминокислоты 466 SEQ ID NO:5 (K466N), замещение гистидина (H) на остаток аргинина дикого типа (R) в положении аминокислоты 78 SEQ ID NO:3 (R78H), замещение метионина (M) на остаток лизина дикого типа (K) в положении аминокислоты 1 SEQ ID NO:6 (K6M), замещение лейцина (L) на остаток серина дикого типа (S) в положении аминокислоты 538 SEQ ID NO:3 (S538L), замещение глутамина (Q) на остаток лейцина дикого типа (L) в положении аминокислоты 149 SEQ ID NO:3 (L149Q), замещение валина (V) на остаток лейцина дикого типа (L) в положении аминокислоты 252 SEQ ID NO:3 (L252V), замещение валина (V) на остаток лейцина дикого типа (L) в положении аминокислоты 674 SEQ ID NO:3 (L674V), замещение валина (V) на остаток аланина дикого типа (A) в положении аминокислоты 656 SEQ ID NO:3 (A656V), замещение аспарагиновой кислоты (D) на остаток аланина дикого типа (A) в положении аминокислоты 731 SEQ ID NO:3 (Y731D), замещение треонина (T) на остаток аланина дикого типа (A) в положении аминокислоты 345 SEQ ID NO:3 (A345T), замещение аспарагиновой кислоты (D) на остаток аланина дикого типа (A) в положении аминокислоты 244 SEQ ID NO:3 (Y244D), замещение триптофана (W) на остаток цистеина дикого типа (С) в положении аминокислоты 576 SEQ ID NO:3 (C576W), замещение лизина (K) на остаток аспарагина дикого типа (N) в положении аминокислоты 640 SEQ ID NO:3 (N640K), замещение лизина (K) на остаток аспарагина дикого типа (N) в положении аминокислоты 675 SEQ ID NO:3 (N675K), замещение тирозина (Y) на остаток аспарагиновой кислоты дикого типа (D) в положении аминокислоты 579 SEQ ID NO:11 (D579Y), замещение изолейцина (I) на остаток аспарагина дикого типа (N) в положении аминокислоты 693 SEQ ID NO:3 (N693I) и замещение лизина (K) на остаток аспарагина дикого типа (N) в положении аминокислоты 693 SEQ ID NO:3 (N693K).

[081] Мутация по настоящему изобретению может быть сдвигом рамки считывания в положении аминокислоты 730, 391, 461, 441, 235, 254, 564, 662, 715, 405, 685, 64, 73, 656, 718, 374, 592, 505, 730 или 363 SEQ ID NO:3, 5 или 11 или соответствующем положении нуклеотида последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей SEQ ID NO:3, 5 или 11. Мутация EZH2 может также быть вставкой глутаминовой кислоты (E) между положениями аминокислоты 148 и 149 SEQ ID NO:3, 5 или 11. Другим примером мутации EZH2 является удаление глутаминовой кислоты (E) и лейцина (L) в положениях аминокислоты 148 и 149 SEQ ID NO:3, 5 или 11. Мутант EZH2 может дополнительно включать нонсенс-мутацию в положении аминокислоты 733, 25, 317, 62, 553, 328, 58, 207, 123, 63, 137 или 60 SEQ ID NO:3, 5 или 11.

[082] Ожидается, что клетки, гетерозиготные для EZH2, проявляют злокачественный фенотип из-за эффективного образования H3-K27me1 ферментом дикого типа и эффективным последующим превращением этих видов-предшественников в H3-K27me2, и, особенно, H3-K27me3, мутантной формой(ами) фермента.

[083] Предыдущие результаты указывают на зависимость от ферментативного связывания между ферментами, которые осуществляют моно-метилирование H3-K27 и определенных мутантных форм EZH2, патогенеза в фолликулярной лимфоме и диффузной В-крупноклеточной лимфоцитарной лимфоме. Например, клетки, экспрессирующие мутант Y641 в EZH2, могут быть более чувствительными к ингибиторам EZH2 с небольшим размером молекулы, чем клетки, экспрессирующие дикий тип EZH2. Специфически, клетки, экспрессирующие мутант Y641 в EZH2, показывают сниженный рост, деление или пролиферацию, или даже переносят апоптоз или отмирание после воздействия ингибиторов EZH2. Напротив, клетки, экспрессирующие дикий тип EZH2, не чувствительны к антипролиферативному действию ингибиторов EZH2 (патентная заявка США № 61/381684; включенная в настоящее описание полностью посредством ссылки).

[084] Аспектом настоящего изобретения является способ лечения или облегчения симптома рака или предзлокачественного состояния у пациента путем введения пациенту, у которого экспрессируется мутант EZH2, включающий мутацию в домене субстрат-связывающего кармана, как определено в SEQ ID NO:6, терапевтически эффективного количества ингибитора EZH2, как приведено в настоящем описании, например, соединения формулы (IIa) в комбинации с другим агентом, подходящим для одновременного, последовательного введения или чередованием.

[085] Другим аспектом изобретения является способ ингибирования у пациента превращения H3-K27 в триметилированный H3-K27. Ингибирование может включать ингибирование у пациента превращения неметилированного H3-K27 в монометилированный H3-K27, превращения монометилированного H3-K27 в диметилированный H3-K27, превращения диметилированного H3-K27 в триметилированный H3-K27 или любой комбинации из них, включая, например, превращения монометилированного H3-K27 в диметилированный H3-K27 и превращения диметилированного H3-K27 в триметилированный H3-K27. Как применено в настоящем описании, неметилированный H3-K27 относится к гистону H3 без метильной группы, соединенной ковалентной связью с аминогруппой лизина 27. Как применено в настоящем описании, монометилированный H3-K27 относится к гистону H3 с единственной метильной группой, соединенной ковалентной связью с аминогруппой лизина 27. Монометилированный H3-K27 также называют в настоящем описании H3-K27me1. Как применено в настоящем описании, диметилированный H3-K27 относится к гистону H3 с двумя метильными группами, соединенными ковалентной связью с аминогруппой лизина 27. Диметилированный H3-K27 также называют в настоящем описании H3-K27me2. Как применено в настоящем описании, триметилированный H3-K27 относится к гистону H3 с тремя метильными группами, соединенными ковалентной связью с аминогруппой лизина 27. Триметилированный H3-K27 также называют в настоящем описании H3-K27me3.

[086] H3 гистона представляет собой белок длиной 136 аминокислот, последовательность которого известна. См., например, по каталогу GenBank № CAB02546, содержание которого включено в настоящее описание посредством ссылки. Как далее раскрыто в настоящем описании, в дополнение к непроцессированному гистону H3, пептидные фрагменты гистона H3, включающие остаток лизина, соответствующий K27 непроцессированного гистона H3, могут быть применены в качестве субстрата для EZH2 (и аналогично для мутантных форм EZH2), чтобы оценить превращение H3-K27m1 в H3-K27m2 и превращение H3-K27m2 в H3-K27m3. В одном варианте осуществления настоящего изобретения такой пептидный фрагмент соответствует остаткам аминокислоты 21-44 в гистоне H3. Такой пептидный фрагмент имеет последовательность аминокислот LATKAARKSAPATGGVKKPHRYRP (SEQ ID NO:10).

[087] Композиция по настоящему изобретению включает соединение формулы (IIa) и один или более других терапевтических агентов или их фармацевтически приемлемую соль. Соединения формулы (IIa) являются подходящими для введения как часть комбинированной терапии с одним или более других терапевтических агентов или способов лечения, подходящих для применения вместе, последовательно или в чередовании. Другие соединения формулы (IIa), подходящие для способов по настоящему изобретению, описаны в публикации США 20120264734, содержание которой тем самым включено полностью посредством ссылки.

[088] Настоящее изобретение описывает соединения формулы (IIa):

или его фармацевтически приемлемые соли или сложные эфиры, для которых R₇, R₈, R_a и R_b определены в настоящем описании.

[089] Соединения формулы (IIa) могут иметь одну или более из следующих особенностей:

[090] Например, каждый из R_a и R_b независимо друг от друга представляет собой H или С₁-С₆ алкил, необязательно замещенный одним или более -Q₃-T_3.

[091] Например, один из R_a и R_b представляет собой H.

[092] Например, R_a и R_b вместе с атомом N, к которому они присоединены, образуют 4-7-членное гетероциклоалкильное кольцо, содержащее 0 или 1 дополнительный гетероатом при атоме N (например, азетидинил, пирролидинил, имидазолидинил, пиразолидинил, оксазолидинил, изоксазолидинил, триазолидинил, пиперидинил, 1,2,3,6-тетрагидропиридинил, пиперазинил, морфолинил, 1,4-диазепанил, 1,4-оксазепанил, 2-окса-5-азабицикло[2.2.1]гептанил, 2,5-диазабицикло[2.2.1]гептанил и т.п.), и кольцо, необязательно замещенное одним или более -Q₃-T_3.

[093] Например, R_a и R_b вместе с атомом N, к которому они присоединены, образуют азетидинил, пирролидинил, имидазолидинил, пиразолидинил, оксазолидинил, изоксазолидинил, триазолидинил, тетрагидрофуранил, пиперидинил, 1,2,3,6-тетрагидропиридинил, пиперазинил или морфолинил, и кольцо, необязательно замещенное одним или более -Q₃-T₃.

[094] Например, один или несколько -Q₃-T₃ представляют собой оксо.

[095] Например, Q₃ представляет собой связь или незамещенный или замещенный С₁-С₃ алкильный линкер.

[096] Например, T₃ представляет собой H, галоген, 4-7-членный гетероциклоалкил, С₁-С₃ алкил, OR_d, COOR_d, -S(O)₂R_d или -NR_dR_e.

[097] Например, каждый R_d и R_e, независимо друг от друга представляет собой H или С₁-С₆ алкил.

[098] Например, R₇ представляет собой С₃-С₈ циклоалкил или 4-7-членный гетероциклоалкил, каждый необязательно замещен одним или более -Q₅-T₅.

[099] Например, R₇ представляет собой пиперидинил, тетрагидропиран, тетрагидро-2H-тиопиранил, циклопентил, циклогексил, пирролидинил или циклогептил, каждый необязательно замещен одним или более -Q₅-T₅.

[100] Например, R₇ представляет собой циклопентил, циклогексил или тетрагидро-2H-тиопиранил, каждый из которых необязательно замещен одним или более -Q₅-T₅.

[101] Например, Q₅ представляет собой NHC(O), и T₅ представляет собой С₁-С₆ алкил или С₁-С₆ алкокси, каждый

[102] Например, один или несколько -Q₅-T₅ представляют собой оксо.

[103] Например, R₇ представляет собой 1-оксид-тетрагидро-2H-тиопиранил или 1,1-диоксид-тетрагидро-2H-тиопиранил.

[104] Например, Q₅ представляет собой связь, и T₅ представляет собой амино, моно-С₁-С₆ алкиламино, ди-С₁-С₆ алкиламино.

[105] Например, Q₅ представляет собой CO, S(O)₂ или NHC(O); и T₅ представляет собой С₁-С₆ алкил, С₁-С₆ алкокси, С₃-С₈ циклоалкил или 4-7-членный гетероциклоалкил.

[106] Например, R₈ представляет собой H или С₁-С₆ алкил, который необязательно замещен одним или более заместителями, выбранными из группы, состоящей из галогена, гидроксила, COOH, С(O)O-С₁-С₆ алкила, циано, С₁-С₆ алкоксила, амино, моно-С₁-С₆ алкиламино и ди-С₁-С₆ алкиламино.

[107] Например, R₈ представляет собой H, метил или этил.

[108] В одном варианте осуществления настоящего изобретения соединением по настоящему изобретению является соединение 44

или его фармацевтически приемлемая соль.

[109] В одном варианте осуществления настоящего изобретения соединение по настоящему изобретению является соединением самим по себе, т.е. свободным основанием или «голой» молекулой. В другом варианте осуществления настоящего изобретения соединение является его солью, например, моно-HCl или три-HCl солью, моно-HBr или три-HBr солью голой молекулы.

[110] Представительные соединения по настоящему изобретению включают соединения, перечисленные в таблице 1.

В таблице ниже, каждое встречаемое следует рассматривать как .

[111] Как применено в настоящем описании, «алкил», «С₁, С₂, С₃, С₄, С₅ или С₆ алкил» или «С₁-С₆ алкил» предполагает включение насыщенных алифатических углеводородных групп с С₁, С₂, С₃, С₄, С₅ или С₆ прямой цепью (линейной) и насыщенных алифатических углеводородных групп с С₃, С₄, С₅ или С₆ разветвленной цепью. Например, С₁-С₆ алкил предполагает включение С₁, С₂, С₃, С₄, С₅ и С₆ алкильных групп. Примеры алкилов включают фрагменты, содержащие от одного до шести углеродных атомов, такие как, но не ограничены ими, метил, этил, н-пропил, изопропил, н-бутил, втор-бутил, трет-бутил, н-пентил, втор-пентил или н-гексил.

[112] В определенных вариантах осуществления алкил с прямой или разветвленной цепью содержит шесть или менее углеродных атомов (например, С₁-С₆ для прямой цепи, С₃-С₆ для разветвленной цепи), и в другом варианте осуществления настоящего изобретения прямой или разветвленный алкил содержит четыре или менее углеродных атомов.

[113] Как применено в настоящем описании, термин «циклоалкил» относится к насыщенной или ненасыщенной неароматической моно- или полициклической углеводородной (например, сплавленные, соединенные или спиро-кольца) системе, содержащей 3-30 углеродных атомов (например, С₃-С₁₀). Примеры циклоалкила включают, но не ограничены ими, циклопропил, циклобутил, циклопентил, циклогексил, циклогептил, циклооктил, циклопентенил, циклогексенил, циклогептенил и адамантантил. Термин «гетероциклоалкил» относится к насыщенной или ненасыщенной неароматической 3-8-членной моноциклической, 7-12-членной бициклической (сплавленные, соединенные или спиро-кольца) или 11-14-членной трициклической кольцевой системе (сплавленные, соединенные или спиро-кольца), содержащей один или более гетероатомов (таких как O, N, S или Se), если специально не указано иначе. Примеры гетероциклоалкильных групп включают, но не ограничены ими, пиперидинил, пиперазинил, пирролидинил, диоксанил, тетрагидрофуранил, изоиндолинил, индолинил, имидазолидинил, пиразолидинил, оксазолидинил, изоксазолидинил, триазолидинил, тетрагидрофуранил, оксиранил, азетидинил, оксетанил, тиетанил, 1,2,3,6-тетрагидропиридинил, тетрагидропиранил, дигидропиранил, пиранил, морфолинил, 1,4-диазепанил, 1,4-оксазепанил, 2-окса-5-азабицикло[2.2.1]гептанил, 2,5-диазабицикло[2.2.1]гептанил, 2-окса-6-азаспиро[3.3]гептанил, 2,6-диазаспиро[3.3]гептанил, 1,4-диокса-8-азаспиро[4.5]деканил и т.п.

[114] Термин «необязательно замещенный алкил» относится к незамещенному алкилу или алкилу, содержащему обозначенные заместители, заменяющие один или более атомов водорода при одном или более атомов углерода углеводородного скелета. Такие заместители могут включать, например, алкил, алкенил, алкинил, галоген, гидроксил, алкилкарбонилокси, арилкарбонилокси, алкоксикарбонилокси, арилоксикарбонилокси, карбоксилат, алкилкарбонил, арилкарбонил, алкоксикарбонил, аминокарбонил, алкиламинокарбонил, диалкиламинокарбонил, алкилтиокарбонил, алкоксил, фосфат, фосфонат, фосфинат, амино (включая алкиламино, диалкиламино, ариламино, диариламинои алкилариламино), ациламино (включая алкилкарбониламино, арилкарбониламино, карбомоил и уреидо), амидино, имино, сульфгидрил, алкилтио, арилтио, тиокарбоксилат, сульфаты, алкилсульфинил, сульфонато, сульфамоил, сульфонамидо, нитро, трифторметил, циано, азидо, гетероциклил, алкиларил или ароматический или гетероароматический фрагмент.

[115] «Арилалкильный» или «аралкильный» фрагмент представляет собой алкил, замещенный арилом (например, фенилметил (бензил)). «Алкиларильный» фрагмент представляет собой арил, замещенный алкилом (например, метилфенил).

[116] Как применено в настоящем описании, «алкильный линкер» предполагает включение насыщенных двухвалентных алифатических углеводородных групп с С₁, С₂, С₃, С₄, С₅ или С₆ прямой цепью (линейные) и насыщенных алифатических углеводородных групп с С₃, С₄, С₅ или С₆ разветвленной цепью. Например, С₁-С₂ алкильный линкер предполагает включение групп С₁, С₂, С₃, С₄, С₅ или С₆ алкильного линкера. Примеры алкильного линкера включают фрагменты, содержащие от одного до шести углеродных атомов, такие как, но не ограниченны ими, метил (-CH₂-), этил (-CH₂CH₂-), н-пропил (-CH₂ CH₂CH₂-), изопропил (-CHCH₃CH₂-), н-бутил (-CH₂CH₂CH₂CH₂-), втор-бутил (-CHCH₃CH₂CH₂-), изобутил (-С(CH₃)₂CH₂-), н-пентил (-CH₂CH₂CH₂CH₂CH₂-), втор-пентил (-CHCH₃CH₂CH₂CH₂-) или н-гексил (-CH₂CH₂CH₂CH₂CH₂CH₂-).

[117] «Алкенил» включает ненасыщенные алифатические группы, аналогичные по длине и возможным замещениям алкилам, описанным выше, но которые содержат по меньшей мере одну двойную связь. Например, термин «алкенил» включает алкенильные группы с прямой цепью (например, винил, пропенил, бутенил, пентенил, гексенил, гептенил, октенил, ноненил, деценил) и разветвленные алкенильные группы. В определенных вариантах осуществления настоящего изобретения алкенильная группа с прямой или разветвленной цепью содержит шесть или менее углеродных атомов в своей углеродной основе (например, С₂-С₆ для прямой цепи, С₃-С₆ для разветвленной цепи). Термин «С₂-С₆» включает алкенильные группы, содержащие от двух до шести углеродных атомов. Термин «С₃-С₆» включает алкенильные группы, содержащие от трех до шести углеродных атомов.

[118] Термин «необязательно замещенный алкенил» относится к незамещенному алкенилу или алкенилу, содержащему обозначенные заместители, заменяющие один или более водородных атомов при одном или более углеродных атомах углеводородной основы. Такие заместители могут включать, например, алкил, алкенил, алкинил, галоген, гидроксил, алкилкарбонилокси, арилкарбонилокси, алкоксикарбонилокси, арилоксикарбонилокси, карбоксилат, алкилкарбонил, арилкарбонил, алкоксикарбонил, аминокарбонил, алкиламинокарбонил, диалкиламинокарбонил, алкилтиокарбонил, алкокси, фосфат, фосфонат, фосфинат, амино (включая алкиламино, диалкиламино, ариламино, диариламино и алкилариламино), ациламино (включая алкилкарбониламино, арилкарбониламино, карбомоил и уреидо), амидино, имино, сульфгидрил, алкилтио, арилтио, тиокарбоксилат, сульфаты, алкилсульфинил, сульфонато, сульфамоил, сульфонамидо, нитро, трифторметил, циано, гетероциклил, алкиларил или ароматический или гетероароматический фрагмент.

[119] «Алкинил» включает ненасыщенные алифатические группы, аналогичные по длине и возможным замещениям алкилам, описанным выше, но которые содержат по меньшей мере одну тройную связь. Например, «алкинил» включает алкинильные группы с прямой цепью (например, этинил, пропинил, бутинил, пентинил, гексинил, гептинил, октинил, нонинил, децинил) и разветвленные алкинильные группы. В определенных вариантах осуществления настоящего изобретения алкинильная группа с прямой или разветвленной цепью содержит шесть или менее углеродных атомов в своей углеродной основе (например, С₂-С₆ для прямой цепи, С₃-С₆ для разветвленной цепи). Термин «С₂-С₆» включает алкинильные группы, содержащие от двух до шести углеродных атомов. Термин «С₃-С₆» включает алкинильные группы, содержащие от трех до шести углеродных атомов.

[120] Термин «необязательно замещенный алкинил», относится к незамещенному алкинилу или алкинилу, содержащему обозначенные заместители, заменяющие один или более водородных атомов при одном или более углеродных атомах углеводородной основы. Такие заместители могут включать, например, алкил, алкенил, алкинил, галоген, гидроксил, алкилкарбонилокси, арилкарбонилокси, алкоксикарбонилокси, арилоксикарбонилокси, карбоксилат, алкилкарбонил, арилкарбонил, алкоксикарбонил, аминокарбонил, алкиламинокарбонил, диалкиламинокарбонил, алкилтиокарбонил, алкоксил, фосфат, фосфонат, фосфинат, амино (включая алкиламино, диалкиламино, ариламино, диариламино и алкилариламино), ациламино (включая алкилкарбониламино, арилкарбониламино, карбомоил и уреидо), амидино, имино, сульфгидрил, алкилтио, арилтио, тиокарбоксилат, сульфаты, алкилсульфинил, сульфонато, сульфамоил, сульфонамидо, нитро, трифторметил, циано, азидо, гетероциклил, алкиларил или ароматический или гетероароматический фрагмент.

[121] Другие, необязательно замещенные фрагменты (такие как необязательно замещенный циклоалкил, гетероциклоалкил, арил или гетероарил) включают и незамещенные фрагменты и фрагменты, содержащие один или несколько обозначенных заместителей. Например, замещенный гетероциклоалкил включает фрагменты, замещенные одной или более алкильными группами, такие как 2,2,6,6-тетраметил-пиперидинил и 2,2,6,6-тетраметил-1,2,3,6-тетрагидропиридинил.

[122] «Арил» включает группы с ароматичностью, включая «сопряженные» или мультициклические системы по меньшей мере с одним ароматическим кольцом, и не содержащие гетероатом в кольцевой структуре. Примеры включают фенил, бензил, 1,2,3,4-тетрагидронафталенил и т.д.

[123] «Гетероарильные» группы представляют собой арильные группы, как определено выше, за исключением того, что они содержат от одного до четырех гетероатомов в кольцевой структуре, и могут также быть указаны как «арильные гетероциклы» или «гетероароматические соединения». Как применено в настоящем описании, термин «гетероарил» предполагает включение устойчивого 5-, 6- или 7-членного моноциклического или 7-, 8-, 9-, 10-, 11- или 12-членного бициклического ароматического гетероциклического кольца, которое состоит из углеродных атомов и одного или нескольких гетероатомов, например, 1 или 1-2, или 1-3, или 1-4, или 1-5, или 1-6 гетероатомов, или, например, 1, 2, 3, 4, 5 или 6 гетероатомов, независимо выбранных из группы, состоящей из азота, кислорода и серы. Атом азота может быть замещенным или незамещенным (т.е. N или NR, где R представляет собой H или другие заместители, как определено). Гетероатомы азота и серы могут необязательно быть окисленными (т.е. N→O и S(O)_p, где p=1 или 2). Нужно указать, что общее количество атомов S и O в ароматическом гетероцикле составляет не больше 1.

[124] Примеры гетероарильных групп включают пиррол, фуран, тиофен, тиазол, изотиазол, имидазол, триазол, тетразол, пиразол, оксазол, изоксазол, пиридин, пиразин, пиридазин, пиримидин и т.п.

[125] Кроме того, термины «арил» и «гетероарил» включают мультициклические арильные и гетероарильные группы, например, трициклические, бициклические, например, нафталин, бензоксазол, бензодиоксазол, бензотиазол, бензоимидазол, бензотиофен, метилендиоксифенил, хинолин, изохинолин, нафтридин, индол, бензофуран, пурин, бензофуран, деазапурин, индолизин.

[126] В случае мультициклических ароматических колец только одно из колец должно быть ароматическим (например, 2,3-дигидроиндол), несмотря на то, что все кольца могут быть ароматическими (например, хинолин). Второе кольцо может также быть сплавлено или соединено.

[127] Циклоалкильное, гетероциклоалкильное, арильное или гетероарильное кольцо может быть замещенным в одном или более кольцевых положениях (например, кольцеобразующий углерод или гетероатом, такой как N) заместителями, как описано выше, например, такими как алкил, алкенил, алкинил, галоген, гидроксил, алкоксил, алкилкарбонилокси, арилкарбонилокси, алкоксикарбонилокси, арилоксикарбонилокси, карбоксилат, алкилкарбонил, алкиламинокарбонил, аралкиламинокарбонил, алкениламинокарбонил, алкилкарбонил, арилкарбонил, аралкилкарбонил, алкенилкарбонил, алкоксикарбонил, аминокарбонил, алкилтиокарбонил, фосфат, фосфонат, фосфинат, амино (включая алкиламино, диалкиламино, ариламино, диариламино и алкилариламино), ациламино (включая алкилкарбониламино, арилкарбониламино, карбомоил и уреидо), амидино, имино, сульфгидрил, алкилтио, арилтио, тиокарбоксилат, сульфаты, алкилсульфинил, сульфонато, сульфамоил, сульфонамидо, нитро, трифторметил, циано, азидо, гетероциклил, алкиларил или ароматический или гетероароматический фрагмент. Арильная и гетероарильная группы также могут быть сплавлены или соединены с алициклическим или гетероциклическими кольцами, которые не являются ароматическими, чтобы образовать мультициклическую систему (например, тетралин, метилендиоксифенил).

[128] Как применено в настоящем описании, «карбоцикл» или «карбоциклическое кольцо» предполагает включение любого устойчивого моноциклического, бициклического или трициклического кольца, содержащего конкретное количество атомов углерода, любое из которых может быть насыщенным, ненасыщенным или ароматическим. Карбоцикл включает циклоалкил и арил. Например, С₃-С₁₄ карбоцикл предполагает включение моноциклического, бициклического или трициклического кольца, содержащего 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13 или 14 углеродных атомов. Примеры карбоциклов включают, но не ограничены ими, циклопропил, циклобутил, циклобутенил, циклопентил, циклопентенил, циклогексил, циклогептенил, циклогептил, циклогептенил, адамантантил, циклооктил, циклооктенил, циклооктадиенил, флуорофенил, фенил, нафтил, инданил, адамантантил и тетрагидронафтил. Кольца с внутренним мостиком также включены в определение карбоцикла, включая, например, [3.3.0]бициклооктан, [4.3.0]бициклононан, [4.4.0]бициклодекан и [2.2.2]бициклооктан. Кольцо с внутренним мостиком встречается тогда, когда одно или более углеродных атомов связывают два несмежных углеродных атома. В одном варианте осуществления настоящего изобретения внутренние мостики в кольцах представлены одним или двумя углеродными атомами. Указано, что мостик всегда превращает моноциклическое кольцо в трициклическое кольцо. Когда кольцо имеет внутренний мостик, заместители, указанные для кольца, также могут присутствовать на мостике. Сплавленные (например, нафтил, тетрагидронафтил) и спиро-кольца также включены.

[129] Как применено в настоящем описании, «гетероцикл» или «гетероциклическая группа» включает любую кольцевую структуру (насыщенную, ненасыщенную или ароматическую), которая содержит по меньшей мере один кольцевой гетероатом (например, N, O или S). Гетероцикл включает гетероциклоалкил и гетероарил. Примеры гетероциклов включают, но не ограничены ими, морфолин, пирролидин, тетрагидротиофен, пиперидин, пиперазин, оксетан, пиран, тетрагидропиран, азетидин и тетрагидрофуран.

[130] Примеры гетероциклических групп включают, но не ограничены ими, акридинил, азоцинил, бензимидазолил, бензофуранил, бензотиофуранил, бензотиофенил, бензоксазолил, бензоксазолинил, бензтиазолил, бензтриазолил, бензтетразолил, бензизоксазолил, бензизотиазолил, бензимидазолинил, карбазолил, 4aH-карбазолил, карболинил, хроманил, хроменил, циннолинил, декагидрохинолинил, 2H,6H-1,5,2-дитиазинил, дигидрофуро[2,3-b]тетрагидрофуран, фуранил, фуразанил, имидазолидинил, имидазолинил, имидазолил, 1H-индазолил, индоленил, индолинил, индолизинил, индолил, 3H-индолил, изатиноил, изобензофуранил, изохроманил, изоиндазолил, изоиндолинил, изоиндолил, изохинолинил, изотиазолил, изоксазолил, метилендиоксифенил, морфолинил, нафтиридиниил, октагидроизохинолинил, оксадиазолил, 1,2,3-оксадиазолил, 1,2,4-оксадиазолил, 1,2,5-оксадиазолил, 1,3,4-оксадиазолил, 1,2,4-оксадиазол5(4Н)-он, оксазолидинил, оксазолил, оксиндолил, пиримидинил, фенантридинил, фенантролинил, феназинил, фенотиазинил, феноксатинил, феноксазинил, фталазинил, пиперазинил, пиперидинил, пиперидонил, 4-пиперидонил, пиперонил, птеридинил, путирнил, пиранил, пиразинил, пиразолидинил, пиразолинил, пиразолил, пиридазинил, пиридооксазол, пиридоимидазол, пиридотиазол, пиридинил, пиридил, пиримидинил, пирролидинил, пирролинил, 2H-пирролил, пирролил, хиназолинил, хинолинил, 4Н-хинолизинил, хиноксалинил, хинуклидинил, тетрагидрофуранил, тетрагидроизохинолинил, тетрагидрохинолинил, тетразолил, 6H-1,2,5-муадиазинил, 1,2,3-тиадиазолил, 1,2,4-тиадиаазолил, 1,2,5-тиадиазолил, 1,3,4-тиадиазолил, тиаантренил, тиазолил, тиенил, тиенотиазолил, тиенооксазолил, тиеноимидазолил, тиофенил, триазинил, 1,2,3-триазолил, 1,2,4-триазолил, 1,2,5-триазолил, 1,3,4-триазолил и ксантенил.

[131] Термин «замещенный», как применено в настоящем описании, обозначает, что любой один или более из водородных атомов при обозначенном атоме замещены выборкой из указанной группы при условии, что нормальная валентность обозначенного атома не превышена, и что замещение приводит к образованию устойчивого соединения. Когда заместитель представляет собой оксогруппу или кетогруппу (т.е. =O), тогда 2 атома водорода при атоме замещены. Заместители в кетогруппе не присутствуют на ароматических фрагментах. Двойные связи в кольце, как применено в настоящем описании, являются двойными связями, которые образованы между двумя смежными кольцевыми атомами (например, С=С, С=N или N=N). «Устойчивое соединение» и «устойчивая структура» предназначены для указания на соединение, которое является достаточно устойчивым, чтобы перенести выделение до полезной степени чистоты из реакционной смеси и составление в композицию эффективного терапевтического агента.

[132] Когда показано, что связь с заместителем пересекает связь, соединяющую два атома в кольце, то такой заместитель может быть связан с любым атомом в кольце. Когда заместитель перечислен без указания на атом, через который такой заместитель связан с остальной частью соединения по данной формуле, то такой заместитель может быть связан через любой атом в такой формуле. Комбинации заместителей и/или переменных допустимы, но только если такие комбинации приводят к образованию устойчивых соединений.

[133] Когда какая-либо переменная (например, R₁) встречается более одного раза в любой составляющей или формуле соединения, ее определение в каждом местоположении не зависит от ее определения в любом другом местоположении. Таким образом, например, если показано, что группа замещена 0-2 фрагментами R₁, то группа может быть необязательно замещена максимум двумя фрагментами R₁, и R₁ в каждом местоположении выбран независимо по определению R₁. Кроме того, комбинации заместителей и/или переменных допустимы, но только если такие комбинации приводят к образованию устойчивых соединений.

[134] Термин «гидрокси» или «гидроксил» включает группы -OH или -O-.

[135] Как применено в настоящем описании, «гало» или «галоген» относится к фтору, хлору, брому и йоду. Термин «пергалогенированный», в целом, относится к фрагменту, в котором все водородные атомы замещены атомами галогена. Термин «галогеналкил» или «галогеналкоксил» относится к алкильной или алкоксильной группе, замещенной одним или более атомами галогена.

[136] Термин «карбонил» включает соединения и фрагменты, которые содержат углерод, связанный двойной связью с кислородным атомом. Примеры фрагментов, содержащих карбонил, включают, но не ограничены ими, альдегиды, кетоны, карбоновые кислоты, амиды, сложные эфиры, ангидриды и т.д.

[137] Термин «карбоксил» относится к -COOH или его алкильному сложному эфиру С₁-С₆.

[138] «Ацил» включает фрагменты, которые содержат ацильный радикал (R-С(O)-) или карбонил. «Замещенный ацил» включает ацил, где один или несколько водородных атомов замещены, например, на алкил, алкинил, галоген, гидроксил, алкилкарбонилокси, арилкарбонилокси, алкоксикарбонилокси, арилоксикарбонилокси, карбоксилат, алкилкарбонил, арилкарбонил, алкоксикарбонил, аминокарбонил, алкиламинокарбонил, диалкиламинокарбонил, алкилтиокарбонил, алкоксил, фосфат, фосфонат, фосфинат, амино (включая алкиламино, диалкиламино, ариламино, диариламино и алкилариламино), ациламино (включая алкилкарбониламино, арилкарбониламино, карбомоил и уреидо), амидино, имино, сульфгидрил, алкилтио, арилтио, тиокарбоксилат, сульфаты, алкилсульфинил, сульфонато, сульфамоил, сульфонамидо, нитро, трифторметил, циано, азидо, гетероциклил, алкиларил или ароматический или гетероароматический фрагмент.

[139] «Ароил» включает фрагменты с арилом или гетероароматический фрагмент, связанный с карбонилом. Примеры ароила включают фенилкарбокси, нафтилкарбокси и т.д.

[140] «Алкоксиалкил», «алкиламиноалкил» и «тиоалкоксиалкил» включают алкильные группы, как описано выше, в которых кислород, азот или атомы серы замещают один или более углеродных атомов в углеводородной основе.

[141] Термин «алкокси» или «алкоксил» включает замещенные и незамещенные алкильные, алкенильные и алкинильные группы, соединенные ковалентной связью с атомом кислорода. Примеры алкоксигрупп или алкоксильных радикалов включают, но не ограничены ими, метокси, этокси, изопропилокси, пропокси, бутокси и пентокси. Примеры замещенных алкокси включают галогенированные алкокси. Алкокси могут быть замещены группами, такими как алкенил, алкинил, галоген, гидроксил, алкилкарбонилокси, арилкарбонилокси, алкоксикарбонилокси, арилоксикарбонилокси, карбоксилат, алкилкарбонил, арилкарбонил, алкоксикарбонил, аминокарбонил, алкиламинокарбонил, диалкиламинокарбонил, алкилтиокарбонил, алкоксил, фосфат, фосфонат, фосфинат, амино (включая алкиламино, диалкиламино, ариламино, диариламино и алкилариламино), ациламино (включая алкилкарбониламино, арилкарбониламино, карбомоил и уреидо), амидино, имино, сульфгидрил, алкилтио, арилтио, тиокарбоксилат, сульфаты, алкилсульфинил, сульфонато, сульфамоил, сульфонамидо, нитро, трифторметил, циано, азидо, гетероциклил, алкиларил или ароматические или гетероароматический фрагменты. Примеры галогензамещенных алкокси включают, но не ограничены ими, фторметокси, дифторметокси, трифторметокси, хлорметокси, дихлорметокси и трихлорметокси.

[142] Термин «простой эфир» или «алкокси» включает соединения или фрагменты, которые содержат кислород, связанный с двум углеродными атомами или гетероатомами. Например, термин включает «алкоксиалкил», который относится к алкильной, алкенильной или алкинильной группе, ковалентно связанной с кислородным атомом, который является ковалентно связанным с алкильной группой.

[143] Термин «сложный эфир» включает соединения или фрагменты, которые содержат углерод или гетероатом, связанный с кислородным атомом, который связан с углеродом карбонильной группы. Термин «сложный эфир» включает алкоксикарбокси, такие как метоксикарбонил, этоксикарбонил, пропоксикарбонил, бутоксикарбонил, пентоксикарбонил и т.д.

[144] Термин «тиоалкил» включает соединения или фрагменты, которые содержат алкильную группу, связанную с атомом серы. Тиоалкильные группы могут быть замещенными группами, такими как алкил, алкенил, алкинил, галоген, гидроксил, алкилкарбонилокси, арилкарбонилокси, алкоксикарбонилокси, арилоксикарбонилокси, карбоксилат, карбоксикислота, алкилкарбонил, арилкарбонил, алкоксикарбонил, аминокарбонил, алкиламинокарбонил, диалкиламинокарбонил, алкилтиокарбонил, алкоксил, амино (включая алкиламино, диалкиламино, ариламино, диариламино и алкилариламино), ациламино (включая алкилкарбониламино, арилкарбониламино, карбомоил и уреидо), амидино, имино, сульфгидрил, алкилтио, арилтио, тиокарбоксилат, сульфаты, алкилсульфинил, сульфонато, сульфамоил, сульфонамидо, нитро, трифторметил, циано, азидо, гетероциклил, алкиларил или ароматические или гетероароматические фрагменты.

[145] Термин «тиокарбонил» или «тиокарбокси» включает соединения и фрагменты, которые содержат углерод, связанный с двойной связью с атомом серы.

[146] Термин «тиоэфир» включает фрагменты, которые содержат атом серы, связанный с двумя углеродными атомами или гетероатомами. Примеры тиоэфиров включают, но не ограничены ими, алктиоалкилы, алктиоалкенилы и алктиоалкинилы. Термин «алктиоалкилы» включает фрагменты с алкильной, алкенильной или алкинильной группой, связанной с атомом серы, который связан с алкилом. Точно также термин «алктиоалкенилы» относится к фрагментам, в которых алкильная, алкенильная или алкинильная группа связана с атомом серы, который является ковалентно связанным с алкенилом; и алктиоалкинилы» относится к фрагментам, в которых алкильная, алкенильная или алкинильная группа связана с атомом серы, который является ковалентно связанным с алкинильной группой.

[147] Как применено в настоящем описании, «амин» или «аминогруппа» относится к незамещенному или замещенному -NH₂. «Алкиламино» включает группы соединений, в которых азот из -NH₂ связан по меньшей мере с одним алкилом. Примеры алкиламино включают бензиламино, метиламино, этиламино, фенэтиламино и т.д. «Диалкиламино» включает группы, в которых азот из -NH₂ связан по меньшей мере с двумя дополнительными алкилами. Примеры диалкиламино включают, но не ограничены ими, диметиламино и диэтиламино. «Ариламино» и «диариламино» включают группы, в которых азот связан по меньшей мере с одной или двумя арильными группами, соответственно. «Аминоарил» и «аминоарилокси» относятся к арилу и арилокси, замещенным амино. «Алкилариламино», «алкиламиноарил» или «ариламиноалкил» относится к аминогруппе, которая связана по меньшей мере с одной алкильной группой и по меньшей мере с одной арильной группой. «Алкаминоалкил» относится к алкильной, алкенильной или алкинильной группе, связанной с атомом азота, который также связан с алкилом. «Ациламино» включает группы, в которых азот связан с ацилом. Примеры ациламино включают, но не ограничены ими, алкилкарбониламино, арилкарбониламино, карбомоил и уреидо.

[148] Термин «амид» или «аминокарбокси» включает соединения или фрагменты, которые содержат атом азота, который связан с углеродом карбонила или тиокарбонилом. Термин включает группы «алкаминокарбокси», которые включают алкильные, алкенильные или алкинильные группы, связанные с амино, которая связана с углеродом тиокарбонила или карбонила. Это также включает группы «ариламинокарбокси», которые включают арильные или гетероарильные фрагменты, связанные с аминогруппой, которая связана с углеродом тиокарбонильной или карбонильной группы. Термины «алкиламинокарбокси», «алкениламинокарбокси», «алкиниламинокарбокси» и «ариламинокарбокси» включают фрагменты, в которых алкильные, алкенильные, алкинильные и арильные фрагменты, соответственно, связаны с атомом азота, который в свою очередь связан с углеродом карбонильной группы. Амиды могут быть замещены заместителями, такими как алкил с прямой цепью, разветвленный алкил, циклоалкил, арил, гетероарил или гетероцикл. Заместители в амидах могут быть дополнительно замещенными.

[149] Соединения по настоящему изобретению, которые содержат атомы азота, могут быть превращены в N-оксиды путем обработки окислительным агентом (например, 3-хлорпероксибензойная кислота (mCPBA) и/или пероксиды водорода), чтобы получить другие соединения по настоящему изобретению. Таким образом, предполагается, что все показанные и патентуемые азотсодержащие соединения, когда это позволяет валентность и структура, включают и соединение, как показано, и его N-оксидное производное соединение (которое может быть обозначен как N→O или N⁺-O^-). Кроме того, в других случаях атомы азота в соединениях по настоящему изобретению могут быть превращены в N-гидрокси или N-алкокси. Например, N-гидрокси могут быть получены окислением материнского амина окислительным агентом, таким как m-CPBA. Также подразумевается, что все показанные и патентуемые азотсодержащие соединения, когда позволяет валентность и структура, охватывают и соединение, как показано, и производные N-гидрокси (т.е. N-OH) и N-алкокси (т.е. NOR, где R представляет собой замещенный или незамещенный С₁-С₆ алкил, С₁-С₆ алкенил, С₁-С₆ алкинил, 3-14-членный карбоцикл или 3-14-членный гетероцикл).

[150] В настоящей спецификации структурная формула соединения представляет определенный изомер для удобства в некоторых случаях, но настоящее изобретение включает все изомеры, такие как геометрические изомеры, оптические изомеры на основе асимметричного атома углерода, стереоизомеры, таутомеры и т.п. Кроме того, может иметь место кристаллический полиморфизм для соединений, представленных формулой. Указано, что любая кристаллическая форма, смесь кристаллических форм или ее ангидрид или гидрат включены в объем настоящего изобретения. Кроме того, так называемый метаболит, который получается разложением настоящего соединения in vivo, включен в объем настоящего изобретения.

[151] «Изомерия» обозначает соединения, которые имеют идентичные молекулярные формулы, но отличаются последовательностью соединения их атомов или в расположении их атомов в пространстве. Изомеры, которые отличаются расположением их атомов в пространстве, называют «стереоизомерами». Стереоизомеры, которые не являются зеркальными отображениями друг друга, называют «диастереоизомерами», а стереоизомеры, которые являются неналагающимися зеркальными изображениями друг друга, называют «энантиомерами» или иногда оптическими изомерами. Смесь, содержащую равное количество индивидуальных энантиоерных форм противоположной хиральности, называют «рацемической смесью».

[152] Углеродный атом, связанный с четырьмя неидентичными заместителями, называют «хиральным центром».

[153] «Хиральный изомер» обозначает соединение по меньшей мере с одним хиральным центром. Соединения с более, чем одним хиральным центром могут существовать или в виде индивидуального диастереоизомера, или в виде смеси диастереоизомеров, которую называют «диастереоизомерной смесью». Когда присутствует один хиральный центр, стереоизомер может быть охарактеризован абсолютной конфигурацией (R или S) этого хирального центра. Абсолютная конфигурация относится к расположению в пространстве заместителей, присоединенных к хиральному центру. Заместители, присоединенные к рассматриваемому хиральному центру, оцениваются в соответствии с правилом Sequence Rule авторов Кан, Ингольд и Прелог (Cahn et al., Angew. Chem. Inter. Edit. 1966, 5, 385; errata 511; Cahn et al., Angew. Chem. 1966, 78, 413; Cahn and Ingold, J. Chem. Soc. 1951 (Лондон), 612; Cahn et al., Experientia 1956, 12, 81; Cahn, J. Chem. Educ. 1964, 41, 116).

[154] «Геометрический изомер» обозначает диастереоизомеры, которые обязаны своим существованием затрудненному вращению вокруг двойных связей или циклоалкильному линкеру (например, 1,3-циклобутил). Эти конфигурации различаются в своем названии по приставке цис и транс, или Z и E, которые указывают на то, что группы находятся на одной и той же или противоположных сторонах от двойной связи в молекуле согласно правилам Кана-Тнгольда-Прелога.

[155] Необходимо понимать, что соединения по настоящему изобретению могут быть изображены как различные хиральные изомеры или геометрические изомеры. Нужно также понимать, что, когда соединения имеют хиральные изомерные или геометрические изомерные формы, предполагается, что все изомерные формы включены в объем настоящего изобретения, и обозначение соединений не исключает какие-либо изомерные формы.

[156] Кроме того, структуры и другие соединения, обсужденные в настоящем изобретении, включают все их атропные изомеры. «Атропные изомеры» представляют собой тип стереоизомеров, в которых атомы двух изомеров по разному расположены в пространстве. Атропные изомеры обязаны своим существованием затрудненному вращению больших групп вокруг центральной связи. Такие атропные изомеры, как правило, существуют в виде смеси, однако в результате недавних продвижений в хроматографических методах стало возможным разделение смеси двух атропных изомеров в отдельных случаях.

[157] «Таутомер» является одним из двух или более структурных изомеров, которые существуют в равновесии, и легко превращаются из одной изомерной формы в другую. Это превращение приводит к формальной миграции водородного атома, сопровождаемой переключением смежных сопряженных двойных связей. Таутомеры существуют в виде смеси таутомерного набора в растворе. В растворах, где таутомеризация возможная, достигается химическое равновесие таутомеров. Точное соотношение таутомеров зависит от нескольких факторов, включая температуру, растворитель и pH. Процесс взаимопревращения таутомеров, которые образованы путем таутомеризации, называют таутомерией.

[158] Из различных типов таутомерии, которые возможны, как правило, наблюдаются два. В кето-енольной таутомерии происходит одновременный сдвиг электронов и водородного атома. Кольчато-цепная таутомерия возникает в результате реакции альдегидной группы (-CHO) в молекуле с цепью из сахара с одной из гидроксильных групп (-OH) в той же самой молекуле с получением из нее циклической (кольцевой) формы, какая наблюдается у глюкозы.

[159] Общими таутомерными парами являются: кетон-енол, амид-нитрил, лактам-лактим, таутомерия амид-имидной кислоты в гетероциклических кольцах (например, в нуклеиновых основаниях, таких как гуанин, тимин и цитозин), имин-енамин и енамин-енамин. Примером кето-енольного равновесия является таковое между пиридин-2(1H)-оном и соответствующими придин-2-олами, как показано ниже.

[160] Необходимо понимать, что соединения по настоящему изобретению могут быть изображены как различные таутомеры. Нужно также понимать, что, когда соединения имеют таутомерные формы, предполагается, что все таутомерные формы включены в объем настоящего изобретения, и обозначение соединений не исключает какую-либо таутомерную форму.

[161] Термин «кристаллические полиморфы», «полиморфы» или «кристалличекие формы», обозначает кристаллические структуры, в которых соединение (или его соль или сольват) может кристаллизоваться с различной кристаллической пространственной организацией, в любой из которых элементная композиция одинакова. Разные кристаллические формы обычно имеют разные дифракционные картины при рассеянии рентгеновских лучей, инфракрасные спектры, температуру плавления, твердость, плотность, форму кристалла, оптические и электрические свойства, устойчивость и растворимость. Растворитель для перекристаллизации, скорость кристаллизации, температура хранения и другие факторы могут заставить одну из кристаллических форм доминировать. Кристаллические полиморфы соединений могут быть получены кристаллизацией в различных условиях.

[162] Соединения формулы (IIa), раскрытые в настоящем описании, включают сами соединения, а также их соли, их сложные эфиры, их сольваты и их пролекарства, по возможности. Соль, например, может быть образована между анионом и положительно заряженной группой (например, аминогруппой) на арил- или гетероарил-замещенном бензольном соединении. Подходящие анионы включают хлорид, бромид, иодид, сульфат, бисульфат, сульфамат, нитрат, фосфат, цитрат, метансульфонат, трифторацетат, глутамат, глюкуронат, глутарат, малат, малеат, сукцинат, фумарат, тартрат, тозилат, салицилат, лактат, нафталинсульфонат и ацетат (например, трифторацетат). Термин «фармацевтически приемлемый анион» относится к аниону, подходящему для образования фармацевтически приемлемой соли. Аналогично, соль может также быть образована между катионом и отрицательно заряженной группой (например, карбоксилатом) на арил- или гетероарил-замещенном бензольном соединении. Подходящие катионы включают ион натрия, ион калия, ион магния, ион кальция и катион аммония, такой как ион тетраметиламмония. Арил- или гетероарил-замещенные бензольные соединения также включают, такие соли, которые содержат четверичные атомы азота. В солевой форме считается, что соотношение соединения к катиону или аниону соли может составлять 1:1 или любое другое соотношение, кроме 1:1, например, 3:1, 2:1, 1:2 или 1:3.

[163] Примеры пролекарств включают сложные эфиры и другие фармацевтически приемлемые производные соединения, которые при введении пациенту способны обеспечивать активные арил- или гетероарил-замещенные бензольные соединения.

[164] Дополнительно, соединения по настоящему изобретению, например, соли соединений, могут существовать как в гидратированном, так и в негидратированной (безводной) форме или в виде сольватов с другими молекулами растворителя. Неограничивающие примеры гидратов включают моногидраты, дигидраты и т.д. Неограничивающие примеры сольватов включают сольваты этилового спирта, сольваты ацетона и т.д.

[165] «Сольват» обозначает формы присоединения растворителя, которые содержат либо стехиометрическое, либо нестехиометрическое количество растворителя. Некоторые соединения имеют тенденцию захватывать молекулы растворителя в фиксированном мольном отношении в твердом кристаллическом состоянии, таким образом, образуя сольват. Если растворитель является водой, образованный сольват является гидратом; а если растворитель является спиртом, образованный сольват является алкоголятом. Гидраты образованны комбинацией одной или более молекул воды с одной молекулой вещества, в которых вода сохраняет свое молекулярное состояние в виде H₂O.

[166] Как применено в настоящем описании, термин «аналог» относится к химическому соединению, которое является структурно подобным другому, но отличается немного в композиции (также замещением одного атома атомом другого элемента или присутствием специфической функциональной группы или замещением одной функциональной группы другой функциональной группой). Таким образом, аналог является соединением, которое подобно или сопоставимо по функции и виду, но не по структуре или происхождению с референтным соединением.

[167] Как определено в настоящем описании, термин «производное соединение» относится к соединениям, которые имеют общую структуру ядра и являются замещенными различными группами, как приведено в настоящем описании. Например, все соединения, представленные формулой (I), являются арил- или гетероарил-замещенными бензольными соединениями и имеют формулу (I) в качестве общего ядра.

[168] Термин «биоизостер» относится к соединению, образующемуся в результате обмена атомом или группой атомов с другим, подобным в широкой области, атом или группой атомов. Цель биоизостерной замены состоит в том, чтобы получить новое соединение подобное по биологическим свойствам материнскому соединению. Биоизостерная замена может быть на физико-химической или топологической основе. Примеры биоизостеров карбоновой кислоты включают, но не ограничены ими, ацилсульфонамиды, тетразолы, сульфонаты и фосфонаты. См., например, Patani and LaVoie, Chem. Rev. 96, 3147-3176, 1996.

[169] Настоящее изобретение предполагает включение всех изотопных атомов, встречающихся в настоящих соединениях. Изотопы включают те атомы, которые имеют одинаковый атомный номер, но различные массовые числа. Для общего примера и без ограничения изотопы водорода включают тритий и дейтерий, и изотопы углерода включают С-13 и С-14.

[170] Любое соединение формулы (IIa) по настоящему изобретению, как приведено в настоящем описании, может быть ингибитором EZH2.

[171] В определенных аспектах настоящего изобретения ингибитор EZH2 «выборочно ингибирует» активность метилтрансферазы гистона мутанта EZH2, когда он ингибирует активность метилтрансферазы гистона мутанта EZH2 эффективнее, чем он ингибирует активность метилтрансферазы гистона EZH2 дикого типа. Например, в одном варианте осуществления настоящего изобретения селективный ингибитор имеет IC₅₀ для мутанта EZH2, что по меньшей мере на 40 процентов ниже, чем IC₅₀ для EZH2 дикого типа. В одном варианте осуществления настоящего изобретения селективный ингибитор имеет IC₅₀ для мутанта EZH2, что по меньшей мере на 50 процентов ниже, чем IC₅₀ для дикого типа EZH2. В одном варианте осуществления настоящего изобретения селективный ингибитор имеет IC₅₀ для мутанта EZH2, что по меньшей мере на 60 процентов ниже, чем IC₅₀ для дикого типа EZH2. В одном варианте осуществления настоящего изобретения селективный ингибитор имеет IC₅₀ для мутанта EZH2, что по меньшей мере на 70 процентов ниже, чем IC₅₀ для дикого типа EZH2. В одном варианте осуществления настоящего изобретения селективный ингибитор имеет IC₅₀ для мутанта EZH2, что по меньшей мере на 80 процентов ниже, чем IC₅₀ для дикого типа EZH2. В одном варианте осуществления настоящего изобретения селективный ингибитор имеет IC₅₀ для мутанта EZH2, что по меньшей мере на 90 процентов ниже, чем IC₅₀ для дикого типа EZH2.

[172] В одном варианте осуществления настоящего изобретения селективный ингибитор мутанта EZH2 не обнаруживает по существу никакого ингибиторного действия на EZH2 дикого типа.

[173] В определенных аспектах настоящего изобретения ингибитор ингибирует превращение H3-K27me2 в H3-K27me3. В одном варианте осуществления настоящего изобретения ингибитор, как говорят, ингибирует триметилирование H3-K27. Так как превращение H3-K27me1 в H3-K27me2 предшествует превращению H3-K27me2 в H3-K27me3, ингибитор превращения H3-K27me1 в H3-K27me2 естественным образом также ингибирует превращение H3-K27me2 в H3-K27me3, т.е. это ингибирует триметилметилирование H3-K27. Также возможно ингибирование превращения H3-K27me2 в H3-K27me3 без ингибирования превращения H3-K27me1 в H3-K27me2. Ингибирование этого типа также приводило бы к ингибированию триметилметилирования H3-K27, хотя и без ингибирования диметилирования H3-K27.

[174] В одном варианте осуществления настоящего изобретения ингибитор ингибирует превращение H3-K27me1 в H3-K27me2 и превращение H3-K27me2 в H3-K27me3. Такой ингибитор может в отдельности непосредственно ингибировать превращение H3-K27me1 в H3-K27me2. Альтернативно, такой ингибитор может непосредственно ингибировать и превращение H3-K27me1 в H3-K27me2 и превращение H3-K27me2 в H3-K27me3.

[175] В определенных аспектах настоящего изобретения ингибиторное соединение ингибирует активность метилтрансферазы гистона. Ингибирование активности метилтрансферазы гистона может быть обнаружено с применением любого подходящего способа. Ингибирование может быть измерено, например, как в терминах скорости активности метилтрансферазы гистона, так и продукта активности метилтрансферазы гистона.

[176] Ингибирование является измеримым ингибированием по отношению к подходящему контролю. В одном варианте осуществления настоящего изобретения ингибирование является по меньшей мере 10-процентным ингибированием по сравнению с подходящим контролем. Таким образом, скорость ферментативной активности или количество продукта в присутствии ингибитора составляет менее или равно 90 процентам от соответствующей скорости или количества без ингибитора. В различных других вариантах осуществления ингибирование составляет по меньшей мере 20, 25, 30, 40, 50, 60, 70, 75, 80, 90 или 95 процентов от ингибирования в подходящем контроле. В одном варианте осуществления настоящего изобретения ингибирование составляет по меньшей мере 99 процентов ингибирования в подходящем контроле. Таким образом, скорость ферментативной активности или количество продукта с ингибитором составляет менее или равно 1 проценту от соответствующей скорости или количества без ингибитора.

[177] Композиция по настоящему изобретению включает соединение формулы (IIa) или его фармацевтически приемлемую соль и один или более других терапевтических агентов или их фармацевтически приемлемую соль. Настоящее изобретение предусматривает введение соединения формулы (IIa) или его фармацевтически приемлемой соли и одного или более терапевтических агентов или их фармацевтически приемлемой соли в виде совместной композиция или отдельных композиций, где введение композиций происходит одновременно, последовательно или с чередованием. В определенных вариантах осуществления другие терапевтические агенты могут быть агентами, которые являются признанными в области техники как полезные для лечения заболевания или состояния, лечимого композицией по настоящему изобретению. В другом варианте осуществления настоящего изобретения другой терапевтический агент может быть агентом, который не является признанным в области техники как полезный для лечения заболевания или состояния, лечимого композицией по настоящему изобретению. В одном аспекте другие терапевтические агенты могут быть агентами, которые придают полезное свойство композиции по настоящему изобретению (например, агент, который изменяет вязкость композиции). Полезное свойство композиции по настоящему изобретению включает, но не ограничено ими, фармакокинетическое или фармакодинамическое совместное действие, следующее из комбинации соединения формулы (IIa) и одного или более других терапевтических агентов. Например, один или более других терапевтических агентов могут быть противораковыми агентами или химиотерапевтическими агентами. Например, один или более других терапевтических агентов могут быть глюкокортикоидами. Например, один или более других терапевтических агентов могут быть выбраны из преднизона, преднизолона, циклофосфамида, винкристина, доксорубицина, мафосфамида, цисплатина, AraC, эверолимуса, децитабина, дексаметазона или функциональных аналогов, производных соединений, пролекарств и их метаболитов. В другом аспекте другим терапевтическим агентом может быть преднизон или его активный метаболит, преднизолон.

[178] Терапевтические агенты, сформулированы ниже в иллюстративных целях и не предназначены для ограничения общности. Настоящее изобретение включает по меньшей мере один другой терапевтический агент, выбранный из списков ниже. Настоящее изобретение может включать более одного другого терапевтического агента, например, два, три, четыре или пять других терапевтических агентов, таким образом, что композиция по настоящему изобретению может осуществлять свою предполагаемую функцию.

[179] В одном варианте осуществления настоящего изобретения другой терапевтический агент является противораковым агентом. В одном варианте осуществления настоящего изобретения противораковый агент является соединением, которое влияет на модификацию гистона, таким как ингибитор HDAC. В определенных вариантах осуществления противораковый агент выбран из группы, состоящей из химиотерапевтических препаратов (таких как 2CdA, 5-FU, 6-меркаптопурин, 6-TG, Abraxane®, Accutane®, Actinomycin-D, Adriamycin®, Alimta®, полностью транс-ретиноевая кислота, аметоптерин, Ara-C, азацитадин, BCNU, Blenoxane® Camptosar®, CeeNU®, клофарабин, Clolar®, Cytoxan®, даунорубицина гидрохлорид, DaunoXome®, Dacogen®, DIC, Doxil®, Ellence®, Eloxatin®, Emcyt®, этопозида фосфат, Fludara®, FUDR®, Gemzar®, Gleevec®, гексаметилмеламин, Hycamtin®, Hydrea®, Idamycin®, Ifex®, иксабепилон, Ixempra®, L-аспарагиназа, Leukeran®, липосомальный Ara-C, L-PAM, лизодрен, Matulane®, митрацин, митомицин-C, Myleran®, Navelbine®, Neutrexin®, нилотиниб, Nipent®, азотистый иприт, Novantrone®, Oncaspar®, Panretin®, Paraplatin®, Platinol®, пролифепроспан 20 с кармустиновым имплантатом, Sandostatin®, Targretin®, Tasigna®, Taxotere®, Temodar®, TESPA, Trisenox®, Valstar®, Velban®, Vidaza®, винкристина сульфат, VM 26, Xeloda® и Zanosar®); биологических препаратов (таких как альфа-интерферон, бацилла Кальмета-Герена, Bexxar®, Campath®, Ergamisol®, эрлотиниб, Herceptin®, интерлейкин-2, Iressa®, леналидомид, Mylotarg®, Ontak®, Pegasys®, Revlimid®, Rituxan®, Tarceva®, Thalomid®, Tykerb®, Velcade® и Zevalin®); кортикостероидов (таких как натриевый фосфат дексаметазона, DeltaSone® и Delta-Cortef®); гормональных терапий (таких как Arimidex®, Aromasin®, Casodex®, Cytadren®, Eligard®, Eulexin®, Evista®, Faslodex®, Femara®, Halotestin®, Megace®, Nilandron®, Nolvadex®, Plenaxis® и Zoladex®); и радиофармацевтических препаратов (таких как Iodotope®, Metastron®, Phosphocol® и Samarium SM-153).

[180] В другом варианте осуществления настоящего изобретения другой терапевтический агент является химиотерапевтическим агентом (также называемый противоопухолевым агентом или антипролиферативным агентом), выбранным из группы, включающей алкилирующий агент; антибиотик; антиметаболит; детоксифицирующий агент; интерферон; поликлональное или моноклональное антитело; ингибитор EGFR; ингибитор HER2; ингибитор диацетилазы гистона; гормон; митотический ингибитор; ингибитор MTOR; ингибитор мультикиназы; ингибитор киназы серина/треонина; ингибиторы киназы тирозина; ингибитор VEGF/VEGFR; таксан или производное соединение таксана, ингибитор ароматазы, антрациклин, препараты с действием на микротрубочки, лекарственное средство ингибитор топоизомеразы, ингибитор молекулярной мишени или фермента (например, киназы или метилтрансферазы белка), лекарственное средство аналог цидина или любой химиотерапевтический, противоопухолевый или антипролиферативный агент, перечисленный в www.cancer.org/docroot/cdg/cdg_0.asp.

[181] Иллюстрационные алкилирующие агенты включают, но не ограничены ими, циклофосфамид (Cytoxan; Neosar); хлорамбуцил (Leukeran); мелфалан (Alkeran); кармустин (BiCNU); бусульфан (Busulfex); ломустин (CeeNU); дакарбазин (DTIC-Dome); оксалиплатин (Eloxatin); кармустин (Gliadel); ифосфамид (Ifex); мехлоретамин (Mustargen); бусульфан (Myleran); карбоплатин (Paraplatin); цисплатин (CDDP; Platinol); темозоломид (Temodar); тиотепа (Thioplex); бендамустин (Treanda); или стрептоцин (Zanosar).

[182] Иллюстративные антибиотики включают, но не ограничены ими, доксорубицин (Adriamycin); липосомальный доксорубицин (Doxil); митоксантрон (Novantrone); блеомицин (Blenoxane); даунорубицин (Cerubidine); липосомальный даунорубицин (DaunoXome); дактиномицин (Cosmegen); эпирубицин (Ellence); идарубицин (Idamycin); пликамицин (Mithracin); митомицин (Mutamycin); пентостатин (Nipent); или валрубицин (Valstar).

[183] Иллюстративные антиметаболиты включают, но не ограничены ими, фтороурацил (Adrucil); капецитабин (Xeloda); гидроксимочевина (Hydrea); меркаптопурин (Purinethol); пеметрексед (Alimta); флударабин (Fludara); неларабин (Arranon); кладрибин (Кладрибин Novaplus); клофарабин (Clolar); цитарабин (Cytosar-U); децитабин (Dacogen); липосомальный цитарабин (DepoCyt); гидроксимочевина (Droxia); пралатрексат (Folotyn); флоксуридин (FUDR); гемцитабин (Gemzar); кладрибин (Leustatin); флударабин (Oforta); метотрексат (MTX; Rheumatrex); метотрексат (Trexall); тиогуанин (Tabloid); TS-1 или цитарабин (Tarabine PFS).

[184] Иллюстративные детоксифицирующие агенты включают, но не ограничены ими, амифостин (Ethyol) или месна (Mesnex).

[185] Иллюстративные интерфероны включают, но не ограничены ими, интерферон альфа-2b (Интрон A) или интерферон альфа-2a (Roferon-A).

[186] Иллюстративные поликлональные или моноклональные антитела включают, но не ограничены ими, трастузумаб (Герцептин); офатумумаб (Arzerra); бевацизумаб (Avastin); ритуксимаб (Rituxan); цетуксимаб (Erbitux); панитумумаб (Vectibix); тозитумомаб/иодин131 тозитумомаб (Bexxar); алемтузумаб (Campath); ибритумомаб (зевалин; In-111; Y-90 зевалин); гемтузумаб (Mylotarg); экулизумаб (Soliris) орденозумаб.

[187] Иллюстративные ингибиторы EGFR включают, но не ограничены ими, гефитиниб (Iressa); лапатиниб (Tykerb); цетуксимаб (Erbitux); эрлотиниб (Tarceva); панитумумаб (Vectibix); PKI-166; канертиниб (CI-1033); матузумаб (Emd7200) или EKB-569.

[188] Иллюстративные ингибиторы HER2 включают, но не ограничены ими, трастузумаб (Герцептин); лапатиниб (Tykerb) или AC-480.

[189] Ингибиторы деацетилазы гистона включают, но не ограничены им, вориностат (Zolinza).

[190] Иллюстративные гормоны включают, но не ограничены ими, тамоксифен (Soltamox; Nolvadex); ралоксифен (Evista); мегестрол (Megace); леупролид (Lupron; Lupron Depot; Eligard; Viadur); фульвестрант (Faslodex); летрозол (Femara); трипторелин (Trelstar LA; Trelstar Depot); экземестан (Aromasin); гозерелин (Zoladex); бикалютамид (Casodex); анастрозол (Arimidex); флуоксиместерон (Androxy; Halotestin); медроксипрогестерон (Provera; Depo-Provera); эстрамустин (Emcyt); флутамид (Eulexin); торемифен (Fareston); дегареликс (Firmagon); нилутамид (Nilandron); абареликс (Plenaxis); или тестолактон (Teslac).

[191] Иллюстративные митотические ингибиторы включают, но не ограничены ими, паклитаксел (Taxol; Onxol; Abraxane); доцетаксел (Taxotere); винкристин (Онковин; Vincasar PFS); винбластин (Velban); этопозид (Toposar; Etopophos; VePesid); тенипозид (Vumon); иксабепилон (Ixempra); нокодазол; эпотилон; винорелбин (Navelbine); камптотецин (CPT); иринотекан (Camptosar); топотекан (Hycamtin); амсакрин или ламелларин D (LAM-D).

[192] Иллюстративные ингибиторы MTOR включают, но не ограничены ими, эверолимус(Afinitor) или темзиролимус (Torisel); рапамун, радафоролимус; или AP23573.

[193]

[194] Иллюстративные ингибиторы VEGF/VEGFR включают, но не ограничены ими, бевацизумаб (Avastin); сорафениб (Nexavar); сунитиниб (Sutent); раибизумаб; пегаптаниб; или вандетениб.

[195] Иллюстративные препараты с воздействием на микротрубочки включают, но не ограничены ими, паклитаксел, доцетаксел, винкристин, винбластин, нокодазол, эпотилоны и навелбин.

[196] Иллюстративные препараты ингибитора топоизомеразы включают, но не ограничены ими, тенипозид, этопозид, адриамицин, камптотецин, даунорубицин, дактиномицин, митоксантрон, амсакрин, эпирубицин и идарубицин.

[197] Типовые таксаны или производные соединения таксана включают, но не ограничены ими, паклитаксел и доцетаксол.

[198] Иллюстративные общие химиотерапевтические, противоопухолевые, антипролиферативные агенты включают, но не ограничены ими, альтретамин (Hexalen); изотретиноин (Accutane; Amnesteem; Claravis; Sotret); третиноин (Vesanoid); азацитидин (Vidaza); бортезомиб (Velcade) аспарагиназа (Elspar); левамисол (Ergamisol); митотан (Lysodren); прокарбазин (Matulane); пегаспаргаза (Oncaspar); денилейкин дифтитокс (Ontak); порфимер (Photofrin); алдеслейкин (Proleukin); леналидомид (Revlimid); бексаротен (Targretin); талидомид (Thalomid); темзиролимус (Torisel); триоксид мышьяка (Trisenox); вертепорфин (Visudyne); мимозин (Leucenol); (1M тегафур-0,4 М 5-хлор-2,4-дигидроксипиримидин - 1М оксонат калия) или ловастатин.

[199] В другом аспекте другой терапевтический агент является химиотерапевтическим агентом или цитокином, таким как G-CSF (колониестимулирующий фактор гранулоцита).

[200] В еще одном аспекте другие терапевтические агенты могут быть стандартными химиотерапевтическими комбинациями, такими как, но не ограничены ими, CMF (циклофосфамид, метотрексат и 5-фтороурацил), CAF (циклофосфамид, адриамицин и 5-фтороурацил), AC(адриамицинми циклофосфамид), FEC (5-фтороурацил, эпирубицин и циклофосфамид), ACT или ATC(адриамицин, циклофосфамид и паклитаксел), ритуксимаб, кселода (капецитабин), цисплатин (CDDP), карбоплатин, TS-1 (тегафур, гиместат и отастат калия в мольном соотношении 1:0,4:1), камптотецин-11 (CPT-11, иринотекан или Camptosar™), CHOP (циклофосфамид, гидроксидаунорубицин, онковин и преднизон или преднизолон), R-CHOP (ритуксимаб, циклофосфамид, гидроксидаунорубицин, онковин, преднизон или преднизолон) или CMFP (циклофосфамид, метотрексат, 5-фтороурацил и преднизон).

[201] В другом аспекте другие терапевтические агенты могут быть ингибитором фермента, такого как рецепторная или нерецепторная киназа. Рецепторные и нерецепторные киназы являются, например, киназами тирозина или киназами серина/треонина. Ингибиторы киназы, приведенные в настоящем описании, являются небольшими молекулами, полинуклеиновыми кислотами, полипептидами или антителами.

[202] Иллюстративные ингибиторы киназ включают, но не ограничены ими, бевацизумаб (нацелен на VEGF), BIBW 2992 (нацелен на EGFR и Erb2), цетуксимаб/эрбитукс (нацелен на Erb1), иматиниб/глеевек (нацелен на Bcr-Abl), трастузумаб (нацелен на Erb2), гефитиниб/иресса (нацелен на EGFR), ранбизумаб (нацелен на VEGF), пегаптаниб (нацелен на VEGF), эрлотиниб/тарцева (нацелен на Erb1), нилотиниб (нацелен на Bcr-Abl), лапатиниб (нацелен на Erb1 и Erb2/Her2), GW-572016/лапатиниба дитиозилат (нацелен на HER2/Erb2), панитумумаб/вектибикс (нацелен на EGFR), вандетиниб (нацелен на RET/VEGFR), E7080 (множественны цели, включая RET и VEGFR), герцептин (нацелен на HER2/Erb2), PKI-166 (нацелен на EGFR), канертиниб/CI-1033 (нацелен на EGFR), сунитиниб/SU-11464/сутент (нацелен на EGFR и FLT3), матузумаб/Emd7200 (нацелен на EGFR), EKB-569 (нацелен на EGFR), Zd6474 (нацелен на EGFR и VEGFR), PKC-412 (нацелен на VEGR и FLT3), ваталаниб/Ptk787/ZK222584 (нацелен на VEGR), CEP 701 (нацелен на FLT3), SU5614 (нацелен на FLT3), MLN518 (нацелен на FLT3), XL999 (нацелен на FLT3), VX-322 (нацелен на FLT3), Azd0530 (нацелен на SRC), BMS-354825 (нацелен на SRC), SKI 606 (нацелен на SRC), CP 690 (нацелен на JAK), AG-490 (нацелен на JAK), WHI-P154 (нацелен на JAK), WHI-P131 (нацелен на JAK), сорафениб/нексавар (нацелен на киназу RAF, VEGFR-1, VEGFR-2, VEGFR-3, PDGFR-ß, KIT, FLT-3 и RET), дазатиниб/сприцел (BCR/ABL и Src), AC-220 (нацелен на Flt3), AC-480 (нацелен на все белки HER, «panHER»), мотесаниба дифосфат (нацелен на VEGF1-3, PDGFR и c-kit), денозумаб (нацелен на RANKL, ингибирует SRC), AMG888 (нацелен на HER3) и AP24534 (множественные цели, включая Flt3).

[203] Иллюстративные ингибиторы киназы серина/треонина включают, но не ограничены ими, рапамун (нацелен на mTOR/FRAP1), дефоролимус (нацелен на mTOR), сертикан/эверолимус (нацелен на mTOR/FRAP1), AP23573 (нацелен на mTOR/FRAP1), эрила/фасудила гидрохлорид (нацелен на RHO), флавопиридол (нацелен на CDK), селициклиб/CYC202/росковитрин (нацелен на CDK), SNS-032/BMS-387032 (нацелен на CDK), рубоксистаурин (нацелен на PKC), Pkc412 (нацелен на PKC), бриостатин (нацелен на PKC), KAI-9803 (нацелен на PKC), SF1126 (нацелен на PI3K), VX-680 (нацелен на киназу Aurora), Azd1152 (нацелен на киназу Аврора), Arry-142886/AZD-6244 (нацелен на MAP/MEK), SCIO-469 (нацелен на MAP/MEK), GW681323 (нацелен на MAP/MEK), СС-401 (нацелен на JNK), CEP 1347 (нацелен на JNK) и PD 332991 (нацелен на CDK).

[204] Иллюстративные ингибиторы киназы тирозина включают, но не ограничены ими, эрлотиниб (Тарцева); гефитиниб (Иресса); иматиниб (Гливек); сорафениб (Нексавар); сунитиниб (Сутент); трастузумаб (Герцептин); бевацизумаб (Авастин); ритуксимаб (Ритуксан); лапатиниб (Тикерб); цетуксимаб (Эрбитукс); панитумумаб (Вектибикс); эверолимус (Афинитор); алемтузумаб (Кампат); гемтузумаб (Милотарг); темзиролимус (Торисел); пазопаниб (Вотриент); дасатиниб (Сприцел); нилотиниб (Тасигна); ваталаниб (Ptk787; ZK222584); CEP 701; SU5614; MLN518; XL999; VX-322; Azd0530; BMS-354825; SKI 606 CP 690; AG-490; WHI-P154; WHI-P131; AC-220; или AMG888.

[205] Настоящее изобретение описывает способы комбинированной терапии, в которой композицию, включающую соединение формулы (IIa) или его фармацевтически приемлемую соль и один или более других терапевтических агентов, применяют к нуждающемуся в этом пациенту для лечения заболевания или рака. Комбинированная терапия может также быть применена к раковым клеткам, чтобы ингибировать пролиферацию или вызвать отмирание клеток. В одном аспекте соединение формулы (IIa) или его фармацевтически приемлемую соль вводят до введения композиции по настоящему изобретению, включающей соединение формулы (IIa) или его фармацевтически приемлемую соль и один или более других терапевтических агентов. В одном аспекте соединение формулы (IIa) или его фармацевтически приемлемую соль вводят до введения одного или более терапевтических агентов, так, что другие терапевтические агенты вводят по отдельности или в единой композиции или в двух или больше композициях, например, вводят одновременно, последовательно или с чередованием.

[206] В одном варианте осуществления настоящего изобретения композиция по настоящему изобретению включает соединение формулы (IIa) или его фармацевтически приемлемую соль и один или несколько противораковых агентов, например, CHOP (циклофосфамид, гидроксидаунорубицин, онковин и преднизон или преднизолон) или R-CHOP (ритуксимаб, циклофосфамид, гидроксидаунорубицин, онковин, преднизон или преднизолон). В одном варианте осуществления настоящего изобретения композиция по настоящему изобретению включает соединение формулы (IIa) или его фармацевтически приемлемую соль и преднизона или преднизолон. Способы по настоящему изобретению включают комбинированную терапию применения соединения формулы (IIa) или его фармацевтически приемлемой соли и противораковых агентов, где противораковыми агентами является CHOP, R-CHOP, преднизон или преднизолон.

[207] В определенных вариантах осуществления предполагается, что «комбинированная терапия» охватывает введение этих терапевтических агентов последовательным образом, когда каждый терапевтический агент вводят в различное время, так же как введение этих терапевтических агентов или, по меньшей мере, двух из терапевтических агентов одновременно или существенно одновременно. Одновременное введение может быть достигнуто, например, введение пациенту единой капсулы, содержащей фиксированное соотношение каждого из терапевтических агентов, или множества отдельных капсул для каждого из терапевтических агентов. Последовательное или существенно одновременное введение каждого из терапевтических агентов может быть осуществлено любым подходящим путем включая, но не ограничивая ими, пероральные пути, внутривенные пути, внутримышечные пути и прямое поглощение через ткани слизистой оболочки. Терапевтические агенты могут быть введены одинаковыми путями или различными путями. Например, первый терапевтический агент выбранной комбинации может быть введен внутривенной инъекцией, в то время как другие терапевтические агенты комбинации могут быть введены перорально. Альтернативно, например, все терапевтические агенты могут быть введены перорально, или все терапевтические агенты могут быть введены внутривенной инъекцией. Терапевтические агенты могут также быть введены с чередованием.

[208] В определенных аспектах настоящего изобретения комбинированная терапия, показанная в настоящем изобретении, может иметь синергический эффект при лечении заболевания или рака. «Синергический эффект» определен как то, когда действие комбинации терапевтических агентов оказывается больше суммы эффектов каждого из агентов, примененных по отдельности. Синергический эффект может также быть эффектом, который не может быть достигнут введением ни одного из соединений или других терапевтических агентов в качестве единственного агента. Синергический эффект может включать, но не ограничен ими, эффект лечения рака снижением размера опухоли, остановка роста опухоли или увеличение выживаемости пациентов. Синергический эффект может также включать снижение жизнеспособности раковой клетки, вызывая отмирание раковой клетки, и остановку или задержку роста раковой клетки.

[209] В определенных аспектах настоящего изобретения «комбинированная терапия» также охватывает введение терапевтических агентов как описано выше в дополнительной комбинации с другими биологически активными ингредиентами и немедикаментозными методами лечения (например, хирургия или лучевая терапия). Там где комбинированная терапия дополнительно включает немедикаментозное лечение, немедикаментозное лечение может быть проведено в любое подходящее время, при условии, что достигается благоприятный эффект от совместного действия комбинации терапевтических агентов и немедикаментозного лечения. Например, в соответствующих случаях, благоприятный эффект все еще достигается даже когда немедикаментозное лечение временно устраняют из введения терапевтических агентов, возможно на дни или даже недели.

[210] В другом аспекте композиции по настоящему изобретению или его фармацевтически приемлемая соль, пролекарство, метаболит, аналог или его производное соединение, могут быть применены в комбинации с лучевой терапией. Лучевая терапия может также быть применена в комбинации с композицией по настоящему изобретению и другими химиотерапевтическими агентами, приведенными в настоящем описании в качестве части терапии с множеством агентов.

[211] Настоящее изобретение также описывает фармацевтические композиции, включающие соединение формулы (IIa) или его фармацевтически приемлемые соли и один или более других терапевтических агентов, раскрытых в настоящем описании, в смеси с фармацевтически подходящими носителями или эксципиентом(ами) в дозах для лечения или предотвращения заболевания или состояния, как приведено в настоящем описании. В одном аспекте настоящее изобретение также описывает фармацевтические композиции, включающие любое соединение из таблицы I или их фармацевтически приемлемые соли и один или более терапевтических агентов, в смеси с фармацевтически подходящими носителями или эксципиентом(ами) в дозах для лечения или предотвращения заболевания или состояния, как приведено в настоящем описании. В другом аспекте настоящее изобретение также описывает фармацевтические композиции, включающие соединение 44

или его фармацевтически приемлемые соли и один или более терапевтических агентов в смеси с фармацевтически подходящими носителями или эксципиентом(ами) в дозах для лечения или предотвращения заболевания или состояния, как приведено в настоящем описании. Фармацевтические композиции по настоящему изобретению могут также быть применены в комбинации с другими терапевтическими агентами или лечебными воздействиями одновременно, последовательно или с чередованием.

[212] Смеси композиций по настоящему изобретению могут также быть введены пациенту в виде простой смеси или в соответствующих составленных в композицию фармацевтических композициях. Например, один аспект настоящего изобретения относится к фармацевтической композиции, включающей терапевтически эффективную дозу ингибитора EZH2 по формуле (IIa) или его фармацевтически приемлемую соль, гидрат, энантиомер или стереоизомер; один или более других терапевтических агентов, и фармацевтически приемлемый растворитель или носитель.

[213] «Фармацевтическая композиция» является композицией, содержащей соединения по настоящему изобретению в форме, подходящей для введения пациенту. В одном варианте осуществления настоящего изобретения фармацевтическая композиция находится в насыпной форме или в форме единичной дозировка. Форма единичной дозировки является любой из множества форм, включая, например, капсулу, пакет для внутривенного вливания, таблетку, дозатор на аэрозольном ингаляторе или флакон. Количество активного ингредиента (например, композиция раскрытого соединения или его соли, гидрата, сольвата или изомера) в единичной дозе композиции является эффективным количеством и изменяется в зависимости от конкретного применяемого лечения. Специалист в области техники оценить, что иногда необходимо делать обычные вариации в дозировке в зависимости от возраста и состояния пациента. Дозировка также зависит от пути введения. Подразумевается множество путей, включая пероральный, пульмональный, ректальный, парентеральный, трансдермальный, подкожный, внутривенный, внутримышечный, интраперитонеальный, ингаляционный, щечный, подъязычный, внутриплевральный, интратекальный, внутриназальный и т.п. Формы дозировки для местного или трансдермального введения соединения по настоящему изобретению, включают порошки, спреи, мази, пасты, кремы, лосьоны, гели, растворы, пластыри и вдыхаемые формы. В одном варианте осуществления настоящего изобретения активное соединение смешивают в стерильных условиях с фармацевтически приемлемым носителем и с любыми необходимыми консервантами, буферами или газами-вытеснителями.

[214] Как применено в настоящем описании, фраза «фармацевтически приемлемый» относится к тем соединениям, анионам, катионам, веществам, композициям, носителям, и/или дозировочным формам, которые с медицинской точки зрения являются подходящими для применения в контакте с тканями людей и животных без чрезмерной токсичности, раздражения, аллергической реакции или других проблем или осложнений, соответствуя приемлемому соотношению благоприятный эффект/риск.

[215] «Фармацевтически приемлемый инертный наполнитель» обозначает инертный наполнитель, который является полезным при получении фармацевтической композиции, которая, в целом, безопасна, нетоксична ни биологически, ни иным образом нежелательна и включает инертный наполнитель, который является приемлемым для ветеринарного применения, так же как фармацевтического применения к человеку. «Фармацевтически приемлемый инертный наполнитель», как применено в спецификации и формуле изобретения, включает как один, так и более одного инертного наполнителя.

[216] Фармацевтическая композиция по настоящему изобретению составлена в композицию так, чтобы быть совместимой с предполагаемым путем ее введения. Примеры путей введения включают парентеральный, например, внутривенный, кожный, подкожный, пероральный (например, ингаляция), трансдермальный (местный) и трансмукозальный путь введения. Растворы или суспензии, применяемые для парентерального, кожного или подкожного введения, могут включать следующие компоненты: стерильный разбавитель, такой как вода для инъекции, физиологический раствор, нелетучие масла, полиэтиленгликоли, глицерин, пропиленгликоль или другие синтетические растворители; бактерицидные добавки, такие как бензиловый спирт или метилпарабены; антиоксиданты, такие как аскорбиновая кислота или бисульфит натрия; хелатирующие агенты, такие как этилендиаминтетрауксусная кислота; буферы, такие как ацетаты, цитраты или фосфаты, и агенты для регулирования тоничности, такие как хлорид натрия или декстроза. pH может быть отрегулирован кислотами или основаниями, такими как соляная кислота или гидроксид натрия. Препараты для парентерального введения могут быть заключены в ампулы, шприцы одноразового применения или многодозные флаконы из стекла или пластмассы.

[217] Композиция по настоящему изобретению может быть введена пациенту многими известными способами, применяемыми в настоящее время для химиотерапевтического лечения. Например, для лечения рака, соединение по настоящему изобретению может быть введено непосредственно в опухоли, введено в кровоток или полости тела или перорально или применено к коже посредством пластырей. Выбранная доза должна быть достаточной для обеспечения эффективного лечения, но не настолько высокой, чтобы вызвать недопустимые побочные эффекты. Тяжесть состояния заболевания (например, рак, предрак и т.п.) и здоровье пациента следует, предпочтительно, тщательно проверять во время и в течение обоснованного периода после лечения.

[218] Термин «терапевтически эффективное количество», как применено в настоящем описании, относится к количеству фармацевтического средства для лечения, облегчения или предотвращения идентифицированного заболевания или состояния, или демонстрирующему обнаруживаемое терапевтическое или ингибирующее действие. Эффект может быть обнаружен любым способом анализа, известным в области техники. Точное эффективное количество для пациента будет зависеть от массы, размера тела пациента и здоровья; природы и тяжести состояния; и терапевтического средства или комбинации терапевтических средств, выбранных для введения. Терапевтически эффективные количества для данной ситуации могут быть определены обычным экспериментированием, которое входит в область умений и суждений клинического врача. В предпочтительном аспекте заболеванием или состоянием, требующим лечения, является рак. В другом аспекте заболеванием или состоянием, требующим лечения является нарушение пролиферации клеток.

[219] В определенных вариантах осуществления терапевтически эффективное количество каждого фармацевтического агента, применяемого в комбинации, будет меньше при применении в комбинации по сравнению с монотерапией каждым агентом в отдельности. Такое меньшее терапевтически эффективное количество может обеспечивать более низкую токсичность терапевтического режима.

[220] Для любого соединения терапевтически эффективное количество может быть оценено первоначально либо в испытаниях с клеточными культурами, например, на опухолевых клетках, или в моделях животных, обычно крыс, мышей, кроликов, собак или свиней. Модель животных также может быть применена для определения соответствующего диапазона концентрации и пути введения. Такая информация затем может быть применена для определения полезных доз и путей введения для людей. Терапевтическое/профилактическое действие и токсичность могут быть определены стандартными фармацевтическими способами на клеточных культурах или подопытных животных, например, ED₅₀ (доза, терапевтически эффективная для 50% популяции) и LD₅₀ (доза, смертельная для 50% популяции). Соотношение между токсическим и терапевтическим эффектами для дозы является терапевтическим индексом, и оно может быть выражено как соотношение LD₅₀/ED₅₀. Предпочтительны фармацевтические композиции, которые демонстрируют большие терапевтические индексы. Дозировка может изменяться в пределах этого диапазона в зависимости от дозировки, применяемой дозировочной формы, чувствительности пациента и пути введения.

[221] Дозировку и путь введения подбирают так, чтобы обеспечить достаточные уровни активного компонента(ов) или поддержать желаемый эффект. Факторы, которые могут быть приняты во внимание, включают тяжесть болезненного состояния, общее состояние здоровья пациента, возраст, вес и пол пациента, диету, время и частоту введения, сочетание(я) лекарств, чувствительность к реакции и устойчивость/отклик на терапию. Фармацевтические композиции длительного действия можно вводить каждые 3-4 дня, каждую неделю или один раз каждые две недели в зависимости от периода полураспада и скорости выведения конкретной композиции.

[222] Фармацевтические композиции, содержащие активные соединения по настоящему изобретению, могут быть получены общеизвестным образом, например, способами обычного смешивания, растворения, гранулирования, дражирования, отмучивания, эмульгирования, капсулирования, заключения в оболочку или лиофилизации. Фармацевтические композиции могут быть составлены в композицию обычным способом с применением одного или более фармацевтически приемлемых носителей, включающих инертные наполнители и/или эксципиенты, которые способствуют обработке активных соединений в препараты, которые могут быть применены фармацевтически. Конечно, соответствующая композиция зависит от выбранного пути введения.

[223] Фармацевтические композиции, подходящие для введения путем инъекции, включают стерильные водные растворы (при растворимости в воде) или дисперсии и стерильные порошки для быстрого приготовления стерильных впрыскиваемых растворов или дисперсий. Для внутривенного введения подходящие носители включают физиологический солевой раствор, бактериостатическую воду, Cremophor EL™ (BASF, Парсиппани, Нью-Джерси) или солевой раствор с фосфатным буфером (PBS). Во всех случаях композиция должна быть стерильной и должна быть жидкой до такой степени, чтобы легко проходить через иглу шприца. Эта должна быть устойчивой в условиях получения и хранения и должна сохраняться без загрязнения микроорганизмами, такими как бактерии и грибы. Носитель может быть растворителем или дисперсионной средой, содержащей, например, воду, этанол, полиол (например, глицерин, пропиленгликоль и жидкий полиэтиленгликоль и т.п.) и их подходящие смеси. Надлежащую текучесть можно поддерживать, например, при помощи нанесения покрытия, такого как лецитин, поддержанием необходимого размера частиц в случае дисперсии и при помощи поверхностно-активных веществ. Предотвращение воздействия микроорганизмов может быть достигнуто различными противобактериальными и противогрибковыми агентами, например, парабенами, хлорбутанолом, фенолом, аскорбиновой кислотой, тимерозалом и т.п. Во многих случаях предпочтительно включение изотонических агентов, например, сахаров, многоатомных спиртов, таких как манитол и сорбитол, и хлорида натрия в композиции. Продолжительная абсорбция впрыскиваемых композиций может быть вызвана включением в композицию агента, который задерживает абсорбцию, например, моностеарат алюминия и желатин.

[224] Стерильные впрыскиваемые растворы могут быть получены путем включения активного соединения в необходимом количестве в соответствующем растворителе с одним или комбинацией ингредиентов, перечисленных выше, при необходимости, с последующей стерилизацией фильтрованием. В целом, дисперсии получают путем включения активного соединения в стерильный носитель, которое содержит основную дисперсионную среду и другие необходимые ингредиенты из перечисленных выше. В случае стерильных порошков для получения стерильных впрыскиваемых растворов способами получения являются вакуумная сушка и сушение сублимацией, которые дают порошок активного ингредиента плюс любой дополнительный желаемый ингредиент из его предварительно стерилизованного фильтрованием раствора.

[225] Композиции для перорального введения, в целом, включают инертный растворитель или пищевой фармацевтически приемлемый носитель. Они могут быть заключены в капсулы из желатина или спрессованы в таблетки. С целью перорального терапевтического введения активное соединение может быть включено в эксципиенты и применено в форме таблеток, пастилок или капсул. Композиции для перорального введения также могут быть получены с применением жидкого носителя для применения в качестве жидкости для полоскания рта, в которой соединение в жидком носителе вводится перорально и полощется и откашливается или глотается. Фармацевтически совместимые связующие агенты и/или вспомогательные вещества могут быть включены как часть композиции. Таблетки, пилюли, капсулы, пастилки и т.п. могут содержать любые ингредиенты из следующих или соединения аналогичного характера: связующий агент, такой как микрокристаллическая целлюлоза, трагакант или желатин; эксципиент, такой как крахмал или лактоза, разрыхлитель, такой как альгиновая кислота, Primogel или кукурузный крахмал; смазка, такая как стеарат магния или Sterotes; глидант, такой как коллоидный диоксид кремния; подслащивающий агент, такой как сахароза или сахарин; или ароматизирующий агент, такой как мята, метилсалицилат или апельсиновый ароматизатор.

[226] Для введения путем ингаляции соединения делают в форме аэрозольного спрея в емкости под давлением или диспенсере, который содержит подходящего газ-вытеснитель, например, газ, такой как диоксид углерода, или распылителе.

[227] Системное введение также может быть осуществлено трансмукозальными или трансдермальными путями. Для трансмукозального или трансдермального введения в композиции вводят смачивающие агенты, подходящие для пропитывания через барьер. Такие смачивающие реагенты общеизвестны в области техники и включают, например, для транмукозального введения детергены, желчные соли и производные соединения фусидовой кислоты. Трансмукозальное введение может быть осуществлено с помощью назальных спреев или свечей. Для трансдермального введения активные соединения составляют в композицию в форме мази, бальзама, гелей или кремов, как общеизвестно в области техники.

[228] Активные соединения могут быть получены с фармацевтически приемлемыми носителями, которые защищают соединение от быстрого выпадения из тела, в таких формах как композиция с замедленным выпуском, включая имплантаты и системы доставки с микрокапсулированием. Могут быть применены разлагаемые микроорганизмами, биологически совместимые полимеры, такие как этиленвинилацетат, полиангидриды, полигликолевая кислота, коллаген, сложные полиортоэфиры и полимолочная кислота. Способы получения таких композиций будут очевидны специалистам в области техники. Материалы также могут быть получены коммерчески от Alza Corporation и Nova Pharmaceuticals, Inc. Липосомальные суспензии (включая липосомы, нацеленные на инфицированные клетки, с моноклональными антителами к вирусным антигенам) также могут быть применены в качестве фармацевтически приемлемых носителей. Они могут быть получены способами, известными специалистам в области техники, например, как описано в патенте СШ № 4522811.

[229] В частности, выгодно составлять пероральные или парентеральные композиции в форме единичной дозировки для простоты введения и однородности дозировки. Единичная форма дозировки, как применено в настоящем описании, относится к физически дискретным единицам, применяемым в качестве единичной дозы для пациента, который проходит лечение; каждая единица, содержит предопределенное количество активного соединения, вычисленного так, чтобы оказать желаемое терапевтическое влияние в сочетании с требуемым фармацевтическим носителем. Спецификация для форм единичной дозировки по настоящему изобретению диктуется и непосредственно зависит от уникальных характеристик активного соединения и специфического терапевтического эффекта, который предполагается достигнуть.

[230] В терапевтических применениях дозировки соединений ингибитора EZH2, приведенных в настоящем описании, других терапевтических агентов, приведенных в настоящем описании, композиций, включающих соединение формулы (IIa) и один или более других терапевтических агентов, или фармацевтических композиций, применяемых в соответствии с настоящим изобретением изменяются в зависимости от агента, возраста, веса, и клинического состояния пациента реципиента, и опыта и мнения клинического врача или практика, применяющего терапию, среди прочих факторов, влияющих на выбор дозировки. В целом, доза должна быть достаточной, чтобы приводить к замедлению, и предпочтительно, регрессии роста опухолей и также, предпочтительно, вызову полной регрессии рака. Дозировки могут варьировать приблизительно от 0,01 мг/кг в сутки до приблизительно 5000 мг/кг в сутки. В предпочтительных аспектах нстоящего изобретения дозировки могут варьировать приблизительно от 1 мг/кг в сутки до приблизительно 1000 мг/кг в сутки. В одном аспекте доза находится в диапазоне приблизительно от 0,1 мг/день до приблизительно 50 г/день; от приблизительно 0,1 мг/день до приблизительно 25 г/день; от приблизительно 0,1 мг/день до приблизительно 10 г/день; от приблизительно 0,1 мг до приблизительно 3 г/день; или от приблизительно 0,1 мг до приблизительно 1 г/день в единичных, разделенных или непрерывных дозах (доза, которая может быть отрегулирована на основе веса пациента в кг, площади поверхности в м² и возраста в годах). Эффективным количеством фармацевтического агента является такое, которое обеспечивает объективно идентифицируемое выздоровление, отмечаемое клиническим врачом или другим компетентным наблюдателем. Например, регрессия опухоли у пациента может быть измерена по диаметру опухоли. Уменьшение в диаметре опухоли указывает на регрессию. На регрессию также указывает отсутствие повторного появления опухолей после остановки лечения. Как применено в настоящем описании, термин «путем эффективной дозировки» относится к количеству активного соединения для получения желаемого биологического эффекта у пациента или клетки.

[231] Фармацевтические композиции могут быть включены в емкость, пакет или распылитель вместе с инструкциями для введения.

[232] Композиция по настоящему изобретению способна дополнительно образовывать соли. Композиция по настоящему изобретению способна образовывать более одной соли на молекулу, например, моно-, ди-, три-. Все эти формы также подразумеваются в объеме патентуемого изобретения.

[233] Как применено в настоящем описании, «фармацевтически приемлемые соли» относятся к производным соединениям соединений по настоящему изобретению, в которых материнское соединение модифицировано превращением в кислую или основную соль. Примеры фармацевтически приемлемых солей включают, но не ограничены ими, соли неорганической или органической кислоты и основных остатков, такие как амины, щелочные или органические соли кислых остатков, таких как карбоновые кислоты и т.п. Фармацевтически приемлемые соли включают обычные нетоксичные соли или соли четвертичного аммониевого основания материнского соединения, образованного, например, из нетоксичных минеральных или органических кислот. Например, такие обычные нетоксичные соли включают, но не ограничены ими, получаемые из минеральных и органических кислот, выбранных из 2-ацетооксибензойной, 2-гидроксиэтансульфоновой, уксусной, аскорбиновой, бензолсульфоновой, бензойной, бикарбоновой, угольной, лимонной, этилендиаминтетрауксусной, этандисульфоновой, 1,2-диметансульфоновой, фумаровой, глюкогептоновой, глюконовой, глутаминовой, гликолевой, гликолиларсаниловой, гексилрезорциновой, гидрабамовой, бромводородной, хлорводородной, иодоводородной, гидроксималеиновой, гидроксинафтойной, изэтиновой, молочной, лактабионовой, лаурилсульфоновой, малеиновой, оксиянтарной, миндальной, метан сульфоновой, напсиловой, азотной, щавелевой, памовой, пантотеновой, фенилуксусной, фосфорной, полигалактуроновой, пропионовой, салициловой, стеариновой, субуксусной, янтарной, сульфаминовой, сульфаниловой, серной, дубильной, винной, толуолсульфоновой, и обычно встречающихся аминовых кислот, например, глицина, аланина, фенилаланина, аргинина и т.д.

[234] Другие примеры фармацевтически приемлемых солей включают капроновую кислоту, циклопентанпропионовую кислоту, пировиноградную кислоту, малоновую кислоту, 3-(4-гидроксибензоил)бензойную кислоту, коричную кислоту, 4-хлорбензолсульфоновую кислоту, 2-нафталинсульфоновую кислоту, 4-толуолсульфоновую кислоту, камфорсульфоновую кислоту, 4-этилбицикло-[2.2.2]-окт-2-ен-1-карбоксильную кислота, 3-фенилпропионовую кислота, триметилуксусную кислоту, третичную бутилуксусную кислоту, муконовую кислоту и т.п. Настоящее изобретение также охватывает соли, образующиеся, когда кислотный протон, присутствующий в материнском соединении замещается либо ионом металла, например, ионом щелочного металла, ионом щелочноземельного металла, либо ионом алюминия; или координируется с органическим основанием, таким как этаноламин, диэтаноламин, триэтаноламин, трометамин, N-метилглюкамин и т.п.

[235] Нужно понимать, что все ссылки на фармацевтически приемлемые соли включают формы присоединения растворителя (сольваты) или кристаллические формы (полиморфы), как определено в настоящем описании, той же самой соли.

[236] Композиция по настоящему изобретению также может быть получена в виде сложных эфиров, например, фармацевтически приемлемых сложных эфиров. Например, функциональная группа карбоновой кислоты в соединении может быть превращена в соответствующий ему сложный эфир, например, метиловый, этиловый или другой сложный эфир. Кроме того, спиртовая группа в соединении может быть превращена в соответствующий ему сложный эфир, например, ацетат, пропионат или другой сложный эфир.

[237] Композиция по настоящему изобретению также может быть получена в виде пролекарств, например, фармацевтически приемлемых пролекарств. Термины «про-лекарство» и «пролекарство» применяются в настоящем описании взаимозаменяемо и относятся к любому соединению, которое высвобождает активное лекарственное средство-предшественник in vivo. Так как пролекарства, как известно, усиливают многочисленные желательные качества фармацевтических препаратов (например, растворимость, биодоступность, промышленное получение и т.д.), соединения по настоящему изобретению могут быть доставлены в форме пролекарств. Таким образом, настоящее изобретение предполагает охват пролекарств патентуемых в настоящем описании соединений, способов их доставки и содержащих их композиций. Подразумевается, что «пролекарства» включают любые ковалентно связанные носители, которые выпускают активное лекарственное средство-предшественник по настоящему изобретению in vivo, когда такое пролекарство вводят пациенту. Пролекарства в настоящем изобретении получают путем модификации присутствующих функциональных групп в соединении таким образом, что модифицированные соединения расщепляются либо при рутинной обработке, либо in vivo до материнского соединения. Пролекарства включают соединения по настоящему изобретению, в которых гидроксильная группа, аминогруппа, сульфгидрильная, карбоксильная или карбонильная группа связана с любой группой, которая может быть расщеплена in vivo с образованием свободного гидроксила, свободной аминогруппы, свободного сульфгидрила, свободной карбоксигруппы или свободной карбонильной группы, соответственно.

[238] Примеры пролекарств включают, но не ограничены ими, сложные эфиры (например, ацетат, диалкиламиноацетаты, формиаты, фосфаты, сульфаты и производные соединения бензоата) и карбаминаты (например, N,N-диметиламинокарбонил) гидроксильных функциональных групп, сложные эфиры (например, сложные этиловые эфиры, морфолиноэтанольные сложные эфиры) карбоксильных функциональных групп, N-ацильные производные соединения (например, N-ацетил) основания N-Манниха, Шиффовы основания и енаминоны функциональных аминогрупп, оксимов, ацеталей, кеталей и енольных сложных эфиров кетона и алдегидные функциональные группы в соединениях по настоящему изобретению и т.п., см. Bundegaard, H., Design of Prodrugs, p1-92, Elesevier, New York-Oxford (1985).

[239] Композицию или фармацевтически приемлемые соли, сложные эфиры или их пролекарства вводят перорально, назально, трансдермально, пульмонально, ингаляционным путем, буккально, подъязычно, интраперинтонеально, подкожно, внутримышечно, внутривенно, ректально, интраплеврально, интратекально и парентерально. В одном варианте осуществления настоящего изобретения соединение вводят перорально. Специалист в области техники сможет определить преимущества специфических путей введения.

[240] Режим дозировки для введения соединения выбирают в соответствии со множеством факторов включая тип, вид, возраст, вес, пол и заболевание пациента; тяжесть состояния, которое требует лечения; путь введения; почечную и печеночную функции пациента; и конкретное применяемое соединение или его соль. Врач-специалист или ветеринар могут с легкостью определить и предписать эффективное количество лекарственного средства, требуемое для предотвращения, противодействия или остановки прогрессирования состояния.

[241] Техники составления в композиции и введения раскрытых соединений по настоящему изобретению могут быть найдены в Remington: the Science and Practice of Pharmacy, 19^е издание, Mack Publishing Co., Истон, Пенсильвания (1995). В одном варианте осуществления настоящего изобретения соединения, приведенные в настоящем описании и их фармацевтически приемлемые соли применяют в фармацевтических препаратах в комбинации с фармацевтически приемлемым носителем или растворителем. Подходящие фармацевтически приемлемые носители включают инертные твердые наполнители или разбавители и стерильные водные или органические растворы. Соединения в таких фармацевтических композициях присутствуют в количестве, достаточном, чтобы обеспечить желаемое количество дозировки в диапазоне, описанном здесь.

[242] Все проценты и соотношения, примененные в настоящем описании, если иначе не указано, взяты по массе. Другие особенности и преимущества настоящего изобретения очевидны из различных примеров. Предоставленные примеры иллюстрируют различные компоненты и методологию, полезную в осуществлении настоящего изобретения. Примеры не ограничивают патентуемое изобретение. На основе настоящего раскрытия специалист может идентифицировать и применять другие компоненты и методологию, полезные для осуществления настоящего изобретения.

[243]

[244] Настоящее изобретение описывает композиции и способы лечения состояний и заболеваний, на течение которых можно повлиять изменением статуса метилирования гистонов или других белков, где указанный статус метилирования опосредован, по меньшей мере, частично активностью EZH2. Изменение статуса метилирования гистонов может в свою очередь влиять на уровень экспрессии целевых генов, активизированных метилированием, и/или иметь целевые гены, подавленные метилированием. Способ включает введение нуждающемуся в таком лечении пациенту терапевтически эффективного количества композиции по настоящему изобретению или его фармацевтически приемлемой соли, пролекарства, метаболита, полиморфа или сольвата нуждающемуся в таком лечении пациенту.

[245] На основе по меньшей мере того факта, что патологическое метилирование гистона, как обнаружено, связано с определенными видами рака и предзлокачественными состояниями, способ лечения рака или предракового состояния с мутантом EZH2 у пациента включает введение нуждающемуся в этом пациенту терапевтически эффективного количества соединения, которое ингибирует метилирование. В одном варианте осуществления настоящего изобретения способ лечения рака или предракового состояния у пациента включает введение нуждающемуся в этом пациенту терапевтически эффективного количества соединения, которое ингибирует превращение неметилированного H3-K27 в монометилированный H3-K27 (H3-K27me1). В одном варианте осуществления настоящего изобретения способ лечения рака или предракового состояния у пациента включает введение нуждающемуся в этом пациенту терапевтически эффективного количества соединения, которое ингибирует превращение монометилированного H3-K27 (H3-K27me1) в диметилированный H3-K27 (H3-K27me2). В одном варианте осуществления настоящего изобретения способ лечения рака или предракового состояния у пациента включает введение нуждающемуся в этом пациенту терапевтически эффективного количества соединения, которое ингибирует превращение H3-K27me2 в триметилированный H3-K27 (H3-K27me3). В одном варианте осуществления настоящего изобретения способ лечения рака или предракового состояния у пациента включает введение нуждающемуся в этом пациенту терапевтически эффективного количества соединения, которое ингибирует и превращение H3-K27me1 в H3-K27me2 и превращение H3-K27me2 в H3-K27me3. Важно указать, что специфическое для заболевания увеличение в метилировании может происходить в хроматине в ключевых геномных локусах в отсутствие общего увеличения клеточных уровней метилирования белка или гистона. Например, возможно возникновение аберрантного гиперметилирования в ключевых генах, имеющих отношение к заболеванию, на фоне общего гипометилирования гистона или белка.

[246] Модуляторы метилирования могут быть применены для модулирования пролиферации клеток, в целом. Например, в некоторых случаях чрезмерная пролиферация может быть снижена агентами, которые снижают метилирование, тогда как недостаточная пролиферация может стимулироваться агентами, которые увеличивают метилирование. Соответственно, заболевания, которые могут быть вылечены, включают гиперпролиферативные заболевания, такие как доброкачественный рост клеток и злокачественный рост клеток (рак).

[247] Нарушение, в котором EZH2-опосредованное метилирование белка играет роль, может быть раком, нарушением пролиферации клеток или предраковым состоянием. Настоящее изобретение дополнительно описывает применение композиции по настоящему изобретению или его фармацевтически приемлемую соли, пролекарства, метаболита, полиморфа или сольвата к нуждающемуся в таком лечении пациенту для получения медикамента, полезного для лечения рака. Иллюстративные виды рака, которые можно лечить, включает лимфомы, включая неходжкинскую лимфому, фолликулярную лимфому (FL) и диффузную В-крупноклеточную лимфоцитарную лимфому (DLBCL); меланому; и лейкоз, включая CML. Иллюстративное предраковое состояние включает миелодиспластический синдром (MDS; прежде известный как предлейкоз).

[248] В целом, соединения, которые являются модуляторами метилирования, могут быть применены для модулирования пролиферации клеток, в целом. Например, в некоторых случаях чрезмерная пролиферация может быть снижена агентами, которые уменьшают метилирование, тогда как недостаточная пролиферация может стимулироваться агентами, которые увеличивают метилирование. Соответственно, заболевания, которые могут быть вылечены соединениями по настоящему изобретению, включают гиперпролиферативные заболевания, такие как доброкачественный рост клеток и злокачественный рост клеток.

[249] Как применено в настоящем описании, «нуждающийся пациент» является пациентом с нарушением, в котором играет роль EZH2-опосредованное метилирование белка, или пациентом с повышенным риском развития такого нарушения относительно популяции в целом. Нуждающийся пациент может быть в предраковом состоянии. Предпочтительно, у нуждающегося пациента обнаружен рак. «Пациент» включает млекопитающее. Млекопитающее может быть, например, любым млекопитающим, например, человеком, приматом, птицей, мышью, крысой, домашней птицей, собакой, кошкой, коровой, лошадью, козой, верблюдом, овцой или свиньей. Предпочтительно, млекопитающее является человеком.

[250] Пациент по настоящему изобретению включает любого пациента-человека, у которого диагностирован, который имеет симптомы или подвергается риску развития рака или предракового состояния. Пациент по настоящему изобретению включает любого пациента-человека, у которого экспрессируется мутант EZH2. Например, мутант EZH2 содержит одну или более мутаций, где мутация, является замещением, точковой мутацией, нонсенс-мутацией, миссенс-мутацией, удалением или вставкой или любой другой мутацией EZH2, приведенной в настоящем описании.

[251] Нуждающийся пациент может иметь резистентный или устойчивый рак. «Резистентный или устойчивый рак» обозначает рак, который не поддается лечению. Рак может быть устойчивым в начале лечения, или он может стать устойчивым во время лечения. В некоторых вариантах осуществления у нуждающегося пациента происходит рецидив рака после ремиссии при самой последней терапии. В некоторых вариантах осуществления, нуждающийся пациент получал без улучшения все известные эффективные терапии для лечения рака. В некоторых вариантах осуществления нуждающийся пациент ранее проходил, по меньшей мере, одну терапию. В определенных вариантах осуществления предшествующая терапия является монотерапией. В определенных вариантах осуществления предшествующая терапия является комбинированной терапией.

[252] В некоторых вариантах осуществления у нуждающегося пациента может быть вторичный рак в результате предыдущей терапии. «Вторичный рак» обозначает рак, который возникает из-за или в результате предыдущих канцерогенных терапий, таких как химиотерапия.

[253] Пациент также может демонстрировать резистентность к ингибиторам метилтрансферазы гистона EZH2 или любому другому терапевтическому агенту.

[254] Настоящее изобретение также показывает способ выбора комбинированной терапии для пациента с раком. Способ включает стадии: обнаружение одной или более мутаций EZH2, приведенных в настоящем описании, в образце из пациента; и выбор на основе наличие одной или более мутаций EZH2 комбинированной терапии для лечения рака. В одном варианте осуществления настоящего изобретения терапия включает введение пациенту композиции по настоящему изобретению. В одном варианте осуществления настоящего изобретения способ дополнительно включает введение пациенту терапевтически эффективного количества композиции по настоящему изобретению. Мутация EZH2 может быть обнаружена с применением любого подходящего способа, известного в области техники. Больше способов описано в патентной публикации США 20130040906, которая включена в настоящее описание полностью посредством ссылки.

[255] Способы и применения, приведенные в настоящем описании, могут включать стадии обнаружения одной или более мутаций EZH2, приведенных в настоящем описании, в образце из нуждающегося пациента до и/или после введения композиции по настоящему изобретению (например, композиция, включающая соединение формулы (IIa) или его фармацевтически приемлемые соли и один или более терапевтических агентов) пациенту. Наличие одной или более мутаций EZH2, приведенных в настоящем описании, в тестируемом образце указывает на то, что пациент является чувствительным к комбинированной терапии по настоящему изобретению.

[256] Настоящее изобретение обеспечивает персонифицированную медицину, лечение и/или управление раком у пациента посредством генетического скрининга одной или более мутаций EZH2, приведенных в настоящем описании, у пациента. Например, настоящее изобретение описывает способы лечения или облегчения симптома рака или предзлокачественного состояния у нуждающегося в этом пациента путем определения чувствительности пациента к комбинированной терапии, и когда пациент является чувствительным к комбинированной терапии путем введения пациенту композиции по настоящему изобретению. Чувствительность определяют, получая образца из пациента и обнаруживая одну или несколько мутаций EZH2, приведенных в настоящем описании, и наличие такой одной или более мутаций EZH2, приведенных в настоящем описании, указывает на то, что пациент является чувствительным к композиции по настоящему изобретению. Как только чувствительность пациента определена, терапевтически эффективное количество композиции, например, композиции, включающей соединение формулы (IIa) или его фармацевтически приемлемые соли и один или более терапевтических агентов, может быть введено. Терапевтически эффективное количество композиции может быть определено специалистом в области техники.

[257] Как применено в настоящем описании, термин «откликаемость» является взаимозаменяемым с терминами «откликающийся», «чувствительный» и «чувствительность», и это предполагает, что пациент проявляет терапевтические отклики при введении композиции по настоящему изобретению, например, опухолевые клетки или опухолевые ткани пациента подвергаются апоптозу и/или отмиранию и/или показывают снижение роста, деления или пролиферации. Этот термин также обозначает, что пациент будет иметь или имеет более высокую вероятность, относительно популяции в целом, проявления терапевтических откликов при введении композиции по настоящему изобретению, например, опухолевые клетки или опухолевые ткани пациента подвергаются апоптозу и/или отмиранию и/или проявляют снижение роста, деления или пролиферации.

[258] Под «образцом» понимается любой биологический образец, полученный из пациента, который включает, но без ограничения, клетки, образцы тканей, жидкости организма (включая, но не ограничивая ими, слизь, кровь, плазму, сыворотку, мочу, слюну и сперму), опухолевые клетки и опухолевые ткани. Предпочтительно, образец выбирают из костного мозга, клеток периферических кровяных клеток, крови, плазмы и сыворотки. Образцы могут быть предоставлены пациентом, проходящим лечение или тестировании. Альтернативно образцы могут быть получены врачом согласно обычной практике в области техники.

[259] Как применено в настоящем описании, термин «нарушение пролиферации клетки» относится к состояниям, в которых нерегулируемый или аномальный рост клеток или и то и другое могут привести к развитию нежелательного состояния или заболевания, которое может быть или может не быть злокачественным. Иллюстративные нарушения пролиферации клеток по настоящему изобретению охватывают множество состояний, в которых клеточное деление разрегулирована. Иллюстративное нарушение пролиферации клеток включает, но не ограничено ими, опухоли, доброкачественные опухоли, злокачественные опухоли, предзлокачественные состояния, in situ опухоли, капсульные опухоли, метастатические опухоли, жидкие опухоли, твердые опухоли, иммунологические опухоли, гематологические опухоли, раки, карциномы, лейкозы, лимфомы, саркомы и быстро делящиеся клетки. Термин «быстро делящаяся клетка», как применено в настоящем описании, определен как любая клетка, которая делится со скоростью, превышающей или большей, чем ожидаемая или наблюдаемая у соседних или расположенных рядом клеток в пределах той же самой ткани. Нарушение пролиферации клеток включает предрак или предраковое состояние. Нарушение пролиферации клеток включает рак. Предпочтительно, описанные здесь способы применяют для лечения или облегчения симптомов рака. Термин «рак» включает твердые опухоли, а также гематологические опухоли и/или злокачественные образования. «Предраковая клетка» является клеткой, проявляющей нарушение пролиферации клетки, которое является предраком или предраковым состоянием. «Раковая клетка» является клеткой, проявляющей нарушение пролиферации клетки, которое является раком. Любые воспроизводимые средства измерения могут быть применены для идентификации раковых клеток или предраковых клеток. Раковые клетки или предраковые клетки могут быть идентифицированы гистологическим типированием или оценкой образца ткани (например, биопсийного образца). Раковые клетки или предраковые клетки могут быть идентифицированы с помощью соответствующих молекулярных маркерных генов.

[260] Иллюстративные незлокачественные состояния или нарушения включают следующие, но не ограничены ими, ревматоидный артрит; воспаление; аутоиммунное заболевание; лимфопролиферативные состояния; акромегалия; ревматоидный спондилит; остеоартрит; подагра, другие артритические состояния; сепсис; септический шок; эндотоксиновый шок; грам-отрицательный сепсис; синдром токсического шока; астма; синдром расстройства дыхания у взрослых; хроническое обструктивное заболевание легких; хроническое легочное воспаление; воспалительное заболевание кишечника; болезнь Крона; псориаз; экзема; неспецифический язвенный колит; панкреатический фиброз; печеночный фиброз; острая и хроническая почечная недостаточность; синдром раздраженной толстой кишки; парез; рестеноз; мозговая малярия; инсульт и ишемическое повреждение; невральная травма; болезнь Альцгеймера; болезнь Хантингтона; болезнь Паркинсона; острая и хроническая боль; аллергический ринит; аллергический конъюнктивит; хроническая сердечная недостаточность; острый коронарный синдром; кахексия; малярия; лепра; лейшманиоз; болезнь Лайма; синдром Рейтера; острый синовит; дегенерация мышцы, бурсит; тендинит; тендовагинит; межпозвоночный дисковый синдром с грыжей, разрывом или выпадением; остеопетроз; тромбоз; рестеноз; силикоз; патологическое разрастание мягких тканей в легких; заболевание резорбции кости, такие как остеопороз; реакция трансплантат против хозяина; рассеянный склероз; волчанка; фибромиалгия; СПИД и другие вирусные заболевания, такие как опоясывающий герпес, простой герпес I или II, вирус гриппа и вирус цитомегалии; и сахарный диабет.

[261] Иллюстративный рак включает следующие, но не ограничен ими, адренокортикальная карцинома, СПИД-ассоциированные раки, СПИД-ассоциированная лимфома, анальный рак, аноректальный рак, рак анального канала, рак аппендикса, мозжечковая астроцитома у детей, мозговая астроцитома у детей, базально-клеточный рак, рак кожи (немеланома), желчный рак, внепеченочный рак желчного протока, внутрипеченочный рак желчного протока, рак мочевого пузыря, рак почки и мочевого пузыря, рак кости и суставов, остеогенная саркома и злокачественная фиброзная гистиоцитома, рак мозга, опухоль головного мозга, глиома стволовой части мозга, мозжечковая астроцитома, мозговая астроцитома/злокачественная глиома, эпендимома, медуллоблатома, супратенториальные примитивные нейроэктодермальные опухоли, глиома зрительного пути и гипоталамическая глиома, рак молочной железы, бронхиальные аденомы/карциноиды, карциноидная опухоль, желудочно-кишечный рак, рак нервной системы, лимфома нервной системы, рак центральной нервной системы, лимфома центральной нервной системы, рак шейки матки, детский рак, хронический лимфоцитарный лейкоз, хронический миелогенным лейкоз, хронические миелопролиферативные нарушения, рак толстой кишки, рак ободочной и прямой кишки, кожная Т-лимфоцитарная лимфома, лимфоидная опухоль, фунгоидный микоз, синдром Сезари, внутриматочный рак, желудочный рак, внечерепная опухоль зародышевой клетки, внегонадная опухоль зародышевой клетки, внепеченочный рак желчного протока, рак ушка, внутриглазная меланома, ретинобластома, рак желчного пузыря, желудочный рак (желудка), плоскоклеточная карцинома желудочно-кишечного тракта, желудочно-кишечная стромальная опухоль (GIST), опухоль зародышевой клетки, овариальная опухоль зародышевой клетки, гестационная трофобластическая глиома, рак головы и шеи, гепатоцеллюлярный рак (печени), лимфома Ходжкина, подглоточный рак, внутриглазная меланома, глазной рак, инсуломы (эндокринная часть поджелудочной железы), саркома Капоши, рак почек, почечный рак, рак почек, гортанный рак, острый лимфообластный лейкоз, острый миелоидный лейкоз, хронический лимфоцитарный лейкоз, хронический миелогенным лейкоз, волосатоклеточный лейкоз, рак губ и ротовой полости, рак печени, рак легких, немелкоклеточный рак легких, мелкоклеточный рак легких, СПИД-ассоциированная лимфома, неходжкинская лимфома, первичная лимфома центральной нервной системы, макроглобулинемия Вальденстрема, медуллобластома, меланома, внутриглазная меланома (глаза), карцинома из клеток Меркеля, злокачественная мезотелиома, мезотелиома, метастатический сквамозный рак шеи, рак рта, рак языка, синдрома множественной эндокринной неоплазии, фунгоидный микоз, миелодиспластические синдромы, миелодиспластическое/миелопролиферативное заболевания, хронический миелогенный лейкоз, острый миелоидный лейкоз, множественная миелома, хронические миелопролиферативные нарушения, носоглоточный рак, нейробластома, рак полости рта, рак ротовой полости, ротоглоточный рак, овариальный рак, овариальный эпителиальный рак, овариальная пограничная опухоль яичника, рак поджелудочной железы, инсулоцитный рак поджелудочной железы, рак параназальной пазухи и носовой полости, рак паращитовидной железы, рак полового члена, фарингеальный рак, феохромоцитома, пинеобластома и супратенториальные примитивные нейроэктодермальные опухоли, гипофизарная опухоль, опухоли плазматических клеток/множественная миелома, легочная бластома, рак простаты, ректальный рак, рак почечной лоханки и мочеточника, переходноклеточный рак, ретинобластома, рабдомиосаркома, рак слюнной железы, опухоли саркома семейства юинга, саркома Капоши, саркома мягких тканей, утробный рак, утробная саркома, рака кожи (немеланома), рак кожи (меланома), рак клетки Меркеля кожи, рак тонкой кишки, саркома мягкой ткани, плоскоклеточный рак, (желудочный) рак желудка, супратенториальные примитивные нейроэктодермальные опухоли, тестикулярный рак, рак горловины, тимома, тимома и тимусный рак, рак щитовидной железы, переходноклеточный рак почечной лоханки и мочеточника и других мочевых органов, гестационные трофобластические опухоли, уретральный рак, внутриматочный утробный рак, утробная саркома, утробный рак тела, влагалищный рак, вульварный рак и опухоль Вильма.

[262] «Нарушение пролиферации клеток гематологической системы» является нарушением пролиферации клеток, вовлекающим клетки гематологической системы. Нарушение пролиферации клеток гематологической системы может включать лимфому, лейкоз, миелоидные опухоли, тучноклеточные опухоли, миелодисплазию, доброкачественную моноклональную гаммопатию, лимфоматоидный гранулематоз, лимфоматоидный папулез, истинную полицитемию, хронический миелоцитарный лейкоз, идиопатическая миелоцитарная метаплазия и эссенциальная тромбоцитемия. Нарушение пролиферации клеток гематологической системы может включать гиперплазию, дисплазию и метаплазию клеток гематологической системы. Предпочтительно, композиции по настоящему изобретению могут быть применены для лечения рака, выбранного из группы, состоящей из гематологического рака по настоящему изобретению или гематологического нарушения пролиферации клеток по настоящему изобретению. Гематологический рак по настоящему изобретению может включать множественную миелому, лимфому (включая лимфому Ходжкина, неходжкинскую лимфому, детские лимфомы и лимфомы лимфоцитарного и кожного происхождения), лейкоз (включая лейкоз у детей, волосатоклеточный лейкоз, острый лимфоцитарный лейкоз, острый миелоцитарный лейкоз, хронический лимфоцитарный лейкоз, хронический миелоцитарный лейкоз, хронический миелогенный лейкоз и тучноклеточный лейкоз), миелоидные опухоли и тучноклеточные опухоли.

[263] «Нарушение пролиферации клеток легкого» является нарушением пролиферации клеток, включающим клетки легкого. Нарушения пролиферации клеток легкого могут включать все формы нарушений пролиферации клеток, затрагивающие клетки легкого. Нарушения пролиферации клеток легкого может включать рак легких, раковое или предраковое состояние легкого, доброкачественный роста или очаги поражения легкого, и злокачественный рост или очаги поражения легкого, и метастатические поражения в тканях и органах тела, отличных от легкого. Предпочтительно, композиции по настоящему изобретению могут быть применены для лечения рака легких или нарушения пролиферации клеток легкого. Рак легких может включать все формы рака легкого. Рак легких может включать злокачественные опухоли легкого, рак in situ, типичные карциноидные опухоли и нетипичные карциноидные опухоли. Рак легких может включать мелкоклеточный рак легких («SCLC»), немелкоклеточный рак легких («NSCLC»), плоскоклеточный рак, аденокарциному, мелкоклеточную карциному, крупноклеточную карциному, аденосквамозную карциному и мезотелиому. Рак легких может включать «рубцовую карциному», бронхоальвеолярную карциному, гигантоклеточную карциному, веретеноклеточную карциному и крупноклеточную нейроэндокринную карциному. Рак легких может включать опухоли легкого гистологической и ультраструктурной гетерогенностью (например, смешанные типы клетки).

[264] Нарушения пролиферации клеток легкого могут включать все формы нарушений пролиферации клеток, затрагивающие клетки легкого. Нарушения пролиферации клеток легкого могут включать рак легких, предзлокачественные состояния легкого. Нарушения пролиферации клеток легкого могут включать гиперплазию, метаплазию и дисплазию легкого. Нарушения пролиферации клеток легкого могут включать вызываемую асбестом гиперплазию, сквамозную метаплазию и доброкачественную реактивную мезотелиальную метаплазию. Нарушения пролиферации клеток легкого могут включать замену столбчатого эпителия слоистым сквамозным эпителием, и мукозальную дисплазию. Люди, подвергающиеся вдыхаемым вредным агентам окружающей среды, таким как сигаретный дым и асбест, могут иметь повышенный риск развития нарушения пролиферации клеток легкого. Предшествующие заболевания легких, которые могут предрасположить людей к развитию нарушений пролиферации клеток легкого, могут включать хроническое интерстициальное заболевание легких, некротическое заболевание легких, склеродермию, ревматоидное заболевание, саркоидоз, интерстициальный пневмонит, туберкулез, повторные пневмонии, идиопатический легочный фиброз, гранулематоз, асбестоз, фиброзирующий альвеолит и болезнь Ходжкина.

[265] «Нарушение пролиферации клеток толстой кишки» является нарушением пролиферации клеток, включающим клетки толстой кишки. Предпочтительно, нарушение пролиферации клеток толстой кишки является раком толстой кишки. Предпочтительно, композиции по настоящему изобретению могут быть применены для лечения рака толстой кишки или нарушения пролиферации клеток толстой кишки. Рак толстой кишки может включать все формы рака толстой кишки. Рак толстой кишки может включать спорадические и наследственные случаи рака толстой кишки. Рак толстой кишки может включать злокачественные опухоли толстой кишки, рак in situ, типичные карциноидные опухоли и нетипичные карциноидные опухоли. Рак толстой кишки может включать аденокарциному, плоскоклеточную карциному и аденосквамозную карциному. Рак толстой кишки может быть связан с наследственным синдромом, выбранным из группы, состоящей из наследственного неполипозного рака ободочной и прямой кишки, семейного аденоматозного полипоза, синдрома Гарднера, синдрома Пейтца-Егерса, синдрома Туркота и ювенильного полипоза. Рак толстой кишки может быть вызван наследственным синдромом, выбранным из группы, состоящей из наследственного неполипозного рака ободочной и прямой кишки, семейного аденоматозного полипоза, синдрома Гарднера, синдрома Пейтца-Егерса, синдрома Туркота и ювенильного полипоза.

[266] Нарушения пролиферации клеток толстой кишки могут включать все формы нарушений пролиферации клеток, затрагивающие клетки толстой кишки. Нарушения пролиферации клеток толстой кишки могут включать рак толстой кишки, предзлокачественные состояния толстой кишки, аденоматозные полипы толстой кишки и метахронные поражения толстой кишки. Нарушение пролиферации клеток толстой кишки может включать аденому. Нарушения пролиферации клеток толстой кишки могут быть характеризованы гиперплазией, метаплазией и дисплазией толстой кишки. Предшествующие заболевания толстой кишки, которые могут предрасположить людей к развитию нарушений пролиферации клеток толстой кишки, могут включать предшествующий рак толстой кишки. Текущее заболевание, которая может предрасположить людей к развитию нарушений пролиферации клеток толстой кишки, может включать болезнь Крона и неспецифический язвенный колит. Нарушение пролиферации клеток толстой кишки может быть связано с мутацией в гене, выбранном из группы, состоящей из p53, ras, FAP и DCC. Человек может иметь повышенный риск развития нарушения пролиферации клеток толстой кишки из-за наличия мутации в гене, выбранном из группы, состоящей из p53, ras, FAP и DCC.

[267] «Нарушение пролиферации клеток поджелудочной железы» является нарушением пролиферации клеток, включающим клетки поджелудочной железы. Нарушения пролиферации клеток поджелудочной железы могут включать все формы нарушений пролиферации клеток, затрагивающие панкреатические клетки. Нарушения пролиферации клеток поджелудочной железы может включать рак поджелудочной железы, раковое или предраковое состояние поджелудочной железы, гиперплазию поджелудочной железы и дисплазию поджелудочной железы, доброкачественный рост или очаги поражения поджелудочной железы, и злокачественный рост или очаги поражения поджелудочной железы, и метастатические поражения в тканях и органах тела, отличных от поджелудочной железы. Рак поджелудочной железы включает все формы рака поджелудочной железы. Рак поджелудочной железы может включать протоковую аденокарциному, аденосквамозную карциному, плеоморфную гигантоклеточную карциному, муцинозную аденокарциному, остеокласт-подобную гигантоклеточную карциному, муцинозную цистаденокарциному, ацинарную карциному, недифференцированную крупноклеточную карциному, мелкоклеточную карциному, панкреатобластому, папиллярную неоплазму, муцинозную кистозную аденому, папиллярную кистозную неоплазму и серозная кистозную аденому. Рак поджелудочной железы также может включать панкреатические неоплазмы с гистологической и ультраструктурной гетерогенностью (например, смешанные типы клетки).

[268] «Нарушение пролиферации клеток простаты» является нарушением пролиферации клеток, включающим клетки простаты. Нарушения пролиферации клеток простаты могут включать все формы нарушений пролиферации клеток, затрагивающие клетки простаты. Нарушения пролиферации клеток простаты может включать рака простаты, раковое или предраковое состояние простаты, доброкачественный рост или очаги поражения простаты, и злокачественный рост или очаги поражения простаты, и метастатические поражения в тканях и органах тела, отличных от простаты. Нарушения пролиферации клеток простаты могут включать гиперплазию, метаплазию и дисплазию простаты.

[269] «Нарушение пролиферации клеток кожи» является нарушением пролиферации клеток, включающим клетки кожи. Нарушения пролиферации клеток кожи могут включать все формы нарушений пролиферации клеток, воздействующие на клетки кожи. Нарушения пролиферации клеток кожи может включать раковое или предраковое состояние кожи, доброкачественный рост или очаги поражения кожи, меланомы, злокачественной меланомы и другоие злокачественные росты или очаги поражения кожи, и метастатические поражения в тканях и органах тела, отличных от кожи. Нарушения пролиферации клеток кожи может включать гиперплазию, метаплазию и дисплазию кожи.

[270] «Нарушение пролиферации клеток яичника» является нарушением пролиферации клеток, включающим клетки яичника. Нарушения пролиферации клеток яичника могут включать все формы нарушений пролиферации клеток, затрагивающие клетки яичника. Нарушения пролиферации клеток яичника может включать раковое или предраковое состояние яичника, доброкачественный рост или очаги поражения яичника, овариальный рака, злокачественный рост или очаги поражения яичника и метастатические поражения в тканях и органах тела, отличных от яичника. Нарушения пролиферации клеток кожи может включать гиперплазию, метаплазию и дисплазию клеток яичника.

[271] «Нарушение пролиферации клеток молочной железы» является нарушением пролиферации клеток, включающим клетки молочной железы. Нарушения пролиферации клеток молочной железы могут включать все формы нарушений пролиферации клеток, воздействующие на клетки молочной железы. Нарушения пролиферации клеток молочной железы могут включать рак молочной железы, раковое или предраковое состояние молочной железы, доброкачественный рост или очаги поражения молочной железы, и злокачественный рост или очаги поражения молочной железы, и метастатические поражения в тканях и органах тела, отличных от молочной железы. Нарушения пролиферации клеток молочной железы могут включать гиперплазию, метаплазию и дисплазию молочной железы.

[272] Нарушение пролиферации клеток молочной железы может быть предраковым состоянием молочной железы. Композиции по настоящему изобретению могут быть применены для лечения предракового состояния молочной железы. Предраковое состояние молочной железы может включать нетипичную гиперплазию молочной железы, протоковую карциному in situ (DCIS), интрадуктальный рак, лобулярную карциному in situ (LCIS), лобулярную неоплазию и рост или очаг поражения молочной железы на стадии 0 или со степенью 0 (например, стадия 0 или степень 0 рака молочной железы или карцинома in situ). Предраковому состоянию молочной железы может быть присвоена стадия согласно системе классификации TNM, как принято американским совместным комитетом по раку (AJCC), где первичной опухоли (T) присваивается стадия T0 или Tis; и где региональным лимфатическим узлам (N) присваивается стадия N0; и где отдаленному метастазу (M) присваивается стадия M0.

[273] Нарушение пролиферации клеток молочной железы может быть раком молочной железы. Предпочтительно, композиции по настоящему изобретению могут быть применены для лечения рака молочной железы. Рак молочной железы включает все формы рака молочной железы. Рак молочной железы может включать первичный эпителиальный рак молочной железы. Рак молочной железы может включать рак, в котором молочная железа охвачена другими опухолями, такими как лимфома, саркома или меланома. Рак молочной железы может включать карциному молочной железы, протоковую карциному молочной железы, лобулярную карциному молочной железы, недифференцированную карциному молочной железы, филлодную цистосаркому молочной железы, ангиосаркому молочной железы и первичную лимфому молочной железы. Рак молочной железы может включать рак молочной железы на стадиях I, II, IIIA, IIIB, IIIC и IV. Протоковый рак молочной железы может включать инвазивную карциному, инвазивную карциному in situ с преобладающим внутрипротоковым компонентом, воспалительный рак молочной железы и протоковую карциному молочной железы с гистологическим типом, выбранным из группы, состоящей из угревого, муцинозного (коллоид), медуллярного, медуллярного с лимфоцитарным инфильтратом, папиллярного, скиррозного и трубчатого. Лобулярная карцинома молочной железы может включать инвазивную лобулярную карциному с преобладающим in situ компонентом, инвазивную лобулярную карциному и инфильтративную лобулярную карциному. Рак молочной железы может включать заболевание Пэджета, заболевание Пэджета с внутрипротоковой карциномой и заболевание Пэджета с инвазивной протоковой карциномой. Рак молочной железы может включать неоплазмы молочной железы с гистологической и ультраструктурной гетерогенностью (например, смешанные типы клетки).

[274] Предпочтительно, соединение по настоящему изобретению или его фармацевтически приемлемая соль, пролекарство, метаболит, полиморф или сольват могут быть применены для лечения рака молочной железы. Рак молочной железы, который требует лечения, может включать семейный рак молочной железы. Рак молочной железы, который требует лечения, может включать спорадический рак молочной железы. Рак молочной железы, который требует лечения, может возникнуть у пациента мужского пола. Рак молочной железы, который требует лечения, может возникнуть у пациента женского пола. Рак молочной железы, который требует лечения, может возникнуть у пациента женского пола в пременопаузе или у пациента женского пола в постменопаузе. Рак молочной железы, который требует лечения, может возникнуть у пациента в возрасте равном или старше 30 лет или у пациента моложе 30 лет. Рак молочной железы, который требует лечения, возникает у пациента в возрасте равном или старше 50 лет или пациента моложе 50 лет. Рак молочной железы, который требует лечения, может возникать у пациента в возрасте равном или старше 70 лет или у пациента моложе 70 лет.

[275] Рак молочной железы, который требует лечения, может быть типирован для идентификации семейной или спонтанной мутации в BRCA1, BRCA2 или p53. Рак молочной железы, который требует лечения, может быть типирован как характеризующийся амплификацией гена HER2/neu, как со сверхэкспрессией HER2/neu или как с низким, промежуточным или высоким уровнем экспрессии HER2/neu. Рак молочной железы, который требует лечения, может быть типирован по маркерному гену, выбранному из группы, состоящей из рецептора эстрогена (ER), рецептора прогестерона (PR), человеческого рецептора эпидермального фактора роста 2, Ki-67, CA15-3, СА 27-29 и c-Met. Рак молочной железы, который требует лечения, может быть типирован как ER-неизвестный, ER-обогащенный или ER-обедненный. Рак молочной железы, который требует лечения, может быть типирован как ER-негативный или ER-позитивный. ER-типирование рака молочной железы может быть выполнено любыми воспроизводимыми средствами. ER-типирование рака молочной железы может быть выполнено как указано в Onkologie 27: 175-179 (2004). Рак молочной железы, который требует лечения, может быть типирован как PR-неизвестный, PR-обогащенный или PR-обедненный. Рак молочной железы, который требует лечения, может быть типирован как PR-негативный или PR-позитивный. Рак молочной железы, который требует лечения, может быть типирован как рецептор-положительный или рецептор-негативный. Рак молочной железы, который требует лечения, может быть типирован как ассоциированный с повышенными уровнями в крови CA 15-3 или CA 27-29 или обоих.

[276] Рак молочной железы, который требует лечения, может включать локализованную опухоль молочной железы. Рак молочной железы, который требует лечения, может включать опухоль молочной железы, которая ассоциирована с отрицательной биопсией сигнального лимфатического узла (SLN). Рак молочной железы, который требует лечения, может включать опухоль молочной железы, которая ассоциирована с положительной биопсией сигнального лимфатического узла (SLN). Рак молочной железы, который требует лечения, может включать опухоль молочной железы, которая ассоциирована с одним или более положительными подмышечными лимфатическими узлами, где подмышечным лимфатическим узлам присвоена стадия любым применимым способом. Рак молочной железы, который требует лечения, может включать опухоль молочной железы, которая типирована как имеющая статус отрицательный по поражению лимфатических узлов (например, негативный по лимфатическим узлам) или положительный статус по поражению лимфатических узлов (например, положительный по лимфатическим узлам). Рак молочной железы, который требует лечения, может включать опухоль молочной железы, которая метастазировала в другие места тела. Рак молочной железы, который требует лечения, может быть классифицирован как метастазировавший в место, выбранное из группы, состоящей из кости, легкого, печени или мозга. Рак молочной железы, который требует лечения, может быть классифицирован по характеристике, выбранной из группы, состоящей из метастатической, локализованной, региональной, местно-региональной, местнораспространенной, дистанцированной, многоочаговой, билатеральной, ипсилатеральной, контралатеральной, новодиагностированной, рецидивной и неоперабельной.

[277] Соединение по настоящему изобретению или его фармацевтически приемлемая соль, сложный эфир, пролекарство, метаболит, полиморф или сольват могу быть применены для лечения или предотвращения нарушения пролиферации клеток молочной железы или лечения или предотвращения рак молочной железы у пациента с повышенным риском развития рака молочной железы относительно популяции в целом. Пациент с повышенным риском развития рака молочной железы относительно популяции в целом является пациентом женского пола с семейной историей или персональной историей рака молочной железы. Пациент с повышенным риском развития рака молочной железы относительно популяции в целом является пациентом женского пола с генеративной или спонтанной мутацией в BRCA1 или BRCA2 или в обоих. Пациент с повышенным риском развития рака молочной железы относительно популяции в целом является пациентом женского пола с семейной историей рака молочной железы и генеративной или спонтанной мутацией в BRCA1 или BRCA2 или в обоих. Пациент с повышенным риском развития рака молочной железы относительно популяции в целом является пациентом женского пола в возрасте более 30 лет, более 40 лет, более 50 лет, более 60 лет, более 70 лет, более 80 лет или более 90 лет. Пациент с повышенным риском развития рака молочной железы относительно популяции в целом является пациентом с нетипичной гиперплазией молочной железы, протоковой карциномой in situ (DCIS), внутрипротоковой карциномой, лобулярной карциномой in situ (LCIS), лобулярной неоплазией или с 0 стадией или с очагом поражения молочной железы (например, стадия 0 или степень 0 рака молочной железы или карциномы in situ).

[278] Рак молочной железы, который требует лечения, может иметь гистологически градацию согласно системе Скарффа-Блума-Ричардсона, в которой опухолям молочной железы присвоены баллы числа митозов 1, 2 или 3; балл ядерного плейоморфизма 1, 2 или 3; балл трубочкообразования 1, 2 или 3; и общий балл Скарффа-Блума-Ричардсона между 3 и 9. Раку молочной железы, который требует лечения, может быть присвоена степень опухоли согласно International Consensus Panel on the Treatment of Breast Cancer, выбранная из группы, состоящей из степени 1, степени 1-2, степени 2, степени 2-3 или степени 3.

[279] Рак, который требует лечения, может быть классифицирован согласно системе классификации TNM Американского объединенного комитета по раку American Joint Committee on Cancer (AJCC), где опухоли (T) присваивается стадия TX, T1, T1mic, T1a, T1b, T1c, T2, T3, T4, T4a, T4b, T4c или T4d; и где региональным лимфатическим узлам (N) присваивается стадия NX, N0, N1, N2, N2a, N2b, N3, N3a, N3b или N3c; и где отдаленному метастазу (M) может быть присвоена стадия MX, M0 или M1. Раку, который требует лечения, может быть присвоена стадия согласно классификации Американского объединенного комитета по раку (AJCC), такая как стадия I, стадия IIA, стадия IIB, стадия IIIA, стадия IIIB, стадия IIIC или стадия IV. Раку, который требует лечения, может быть присвоена степень согласно классификации AJCC, такая как степень GX (например, степень не может быть оценена), степень 1, степень 2, степень 3 или степень 4. Рак, который требует лечения, может быть классифицирован согласно классификации патологий AJCC(pN) pNX, pN0, PN0 (I-), PN0 (I+), PN0 (mol-), PN0 (mol+), PN1, PN1 (mi), PN1a, PN1b, PN1c, pN2, pN2a, pN2b, pN3, pN3a, pN3b или pN3c.

[280] Рак, который требует лечения, может включать опухоль, диаметр которой определен меньшим или равным приблизительно 2 сантиметрам. Рак, который требует лечения, может включать опухоль, диаметр которой определен равным приблизительно от 2 до приблизительно 5 сантиметрам. Рак, который требует лечения, может включать опухоль, диаметр которой определен большим или равным приблизительно 3 сантиметрам. Рак, который требует лечения, может включать опухоль, диаметр которой определен большим 5 сантиметров. Рак, который требует лечения, может быть классифицирован по микроскопическому виду как хорошо дифференцированный, умеренно дифференцированный, плохо дифференцированный или недифференцированный. Рак, который требует лечения, может быть классифицирован по микроскопическому виду относительно индекса митоза (например, количество клеточных делений) или ядерному плейоморфизму (например, изменение в клетках). Рак, который требует лечения, может быть классифицирован по микроскопическому виду как ассоциированный с областями отмирания (например, областями отмирающих или деградирующих клеток). Рак, который требует лечения, может быть классифицирован как рак с патологическим кариотипов, с содержанием аномального количества хромосом или с содержанием одной или более хромосом, которые являются аномальными по внешности. Рак, который требует лечения, может быть классифицирован как анэуплоидный, триплоидный, тетраплоидный или как рак с измененной плоидностью. Рак, который требует лечения, может быть классифицирован как рак с хромосомной транслокацией или удалением или дублированием всей хромосомы или с областью удаления, дублирования или амплификацией участка хромосомы.

[281] Рак, который требует лечения, может быть оценен ДНК цитометрией, поточной цитометрией или отображающей цитометрией. Рак, который требует лечения, может быть типирован как рак с 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80% или 90% клеток в фазе синтеза клеточного деления (например, в S-фазе клеточного деления). Рак, который требует лечения, может быть типирован как рак с низкой долей S-фазы или с высокой долей S-фазы.

[282] Как применено в настоящем описании, «нормальная клетка» является клеткой, которая не может быть классифицирована как часть «нарушения пролиферации клеток». У нормальной клетки низкий уровень нерегулируемого или аномального роста или обоих, которые могут приводить к развитию нежелательного состояния или заболевания. Предпочтительно, нормальная клетка обладает нормально функционирующими контрольными механизмами контрольных точек клеточного цикла.

[283] Как применено в настоящем описании, «вхождение в контакт с клеткой» относится к состоянию, в котором соединение или другая композиция вещества находится в прямом контакте с клеткой или находится достаточно близко, чтобы вызвать желаемое биологическое действие в клетке.

[284] Как применено в настоящем описании, «соединение-кандидат» относится к соединению по настоящему изобретению или его фармацевтически приемлемой соли, сложному эфиру, пролекарству, метаболиту, полиморфу или сольвату, который был или будет протестирован в одном или более биологических испытаниях in vitro или in vivo для определения того, вероятно ли, что это соединение вызовет желаемую биологическую или медицинскую реакцию в клетке, ткани, системе, животном или человеке, которую ищет исследователь или клинический врач. Соединение-кандидат является соединением по настоящему изобретению или его фармацевтически приемлемой солью, сложным эфиром, пролекарством, метаболитом, полиморфом или сольватом. Биологическим или медицинским ответом может быть лечение от рака. Биологический или медицинский ответ может быть лечением или профилактикой нарушения пролиферации клеток. Биологические испытания in vitro или in vivo могут включать, но не ограничены ими, анализы ферментативной активности, анализы сдвига электрофорезной подвижности, анализы репортерного гена, in vitro анализы жизнеспособности клетки и анализы, приведенные в настоящем описании.

[285] Как применено в настоящем описании, «лечение» или «лечить» описывает действия и заботу о пациенте с целью борбы с заболеванием, состоянием или нарушением и включает введение соединения по настоящему изобретению или его фармацевтически приемлемой соли, пролекарства, метаболита, полиморфа или сольвата для облегчения симптомов или осложнений заболевания, состояния или нарушения или избавления от заболевания, состояния или нарушения.

[286] Композиция по настоящему изобретению или его фармацевтически приемлемая соль, пролекарство, метаболит, полиморф или сольват также могут быть применены для предотвращения заболевания, состояния или нарушения. Как применено в настоящем описании, «предотвращение» или «предотвратить» описывает сокращение или исчезновение появления симптомов или осложнений заболевания, состояния или нарушения.

[287] Как применено в настоящем описании, термин «облегчить» предназначен для описания способа, которым тяжесть признака или симптома нарушения уменьшается. Важно, что признак или симптом может быть облегчен без исчезновения. В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения введение фармацевтических композиций по настоящему изобретению приводит к устранению признака или симптома, однако, устранение не требуется. Ожидается, что эффективные дозировки снижают тяжесть признака или симптома. Например, признак или симптом нарушения, такого как рак, которые могут встретиться во множестве мест, облегчаются, если тяжесть рака снижена, по меньшей мере, в одном из множества мест.

[288] Как применено в настоящем описании, термин «тяжесть» предназначен для описания потенциала перехода опухоли из предзлокачественного или доброкачественного состояния в злокачественное состояние. Альтернативно, или в дополнение, тяжесть предназначена для обозначения стадии рака, например, согласно системе TNM (принятой Международным союзом против пака (UICC) и Американским объединенным комитетом по раку (AJCC)) или другими признанными в области техники способами. Стадия рака относится к степени или тяжести рака на основе факторов, таких как место первичной опухоли, размер опухоли, количество опухолей и участие лимфатических узлов (распространение рака в лимфатические узлы). Альтернативно или в дополнение, тяжесть предназначена для описания степени опухоли признанными области техники способами (см. Национальный онкологический институт, www.cancer.gov). Степень опухоли является системой, применяемой для классифицирования раковых клеток с точки зрения того, насколько патологическими они выглядят под микроскопом и как быстро опухоль, вероятно, будет расти и распространяться. Учитывается много факторов при определении степени опухоли, включая структуру и паттерн роста клеток. Специфические факторы, применяемые для определения степени опухоли, изменяются с каждым типом рака. Тяжесть также описывает гистологическую степень, также называемую дифференцированием, которая относится к тому, насколько опухолевые клетки напоминают нормальные клетки того же самого типа ткани (см. Национальный Онкологический институт, www.cancer.gov). Кроме того тяжесть описывает степень полиморфизма ядер, которая относится к размеру и форме ядра в опухолевых клетках и проценту делящихся опухолевых клеток (см. Национальный Онкологический институт, www.cancer.gov).

[289] В другом аспекте настоящего изобретения тяжесть описывает степень, до которой опухоль секретировала факторы роста, разложила внеклеточную матрицу, стала васкуляризированной, потеряла адгезию к прилегающим тканям или метастазировала. Кроме того, тяжесть описывает количество мест, в которые метастазировала первичная опухоль. Наконец, тяжесть включает трудность лечения опухолей различных типов и расположений. Например, неоперабельные опухоли, такие виды рака, который характеризуются большим доступом ко многим системам организма (гематологические и иммунологические опухоли), и такие, которые являются наиболее устойчивыми к традиционным видам лечения, считаются самыми тяжелыми. В этих ситуациях, увеличение ожидаемой продолжительности жизни пациента и/или снижение боли, уменьшение пропорции раковых клеток или ограничение раковых клеток одной системой и улучшение стадии/степени опухоли/гистологической степени/степени полиморфизма ядер считаются облегчением признака или симптома рака.

[290] Как применено в настоящем описании, термин «симптом» определен как индикация заболевания, болезни, повреждения или того, что что-то в организме не правильно. Симптомы чувствуются или замечаются человеком, имеющим симптом, но могут не сразу замечены другими. Другие определены как не имеющие отношения к работе в здравоохранении.

[291] Как применено в настоящем описании термин «признак» также определен как индикация того, что что-то неправильно в организме. Но признаки определены как нечто, что может быть замечено доктором, медсестрой или другим специалистом в области здравоохранения.

[292] Рак представляет группу заболеваний, которые могут вызывать почти любой признак или симптом. Признаки и симптомы зависят от того, где локализуется рак, размера рака и насколько это влияет на соседние органы или структуры. Если рак распространяется (метастазирует), то симптомы могут появляться в различных частях тела.

[293] Нарушением, в котором EZH2-опосредованное метилирование белка играет роль, может быть неврологическим заболеванием. Соединение по настоящему изобретению может, таким образом, также быть применено для лечения неврологических заболеваний, таких как эпилепсия, шизофрения, биполярное расстройство или другие психологические и/или психиатрические расстройства, невропатии, атрофия скелетных мышц и нейродегенеративные заболевания, например, нейродегенеративное заболевание. Иллюстративные нейродегенеративные заболевания включают: болезнь Альцгеймера, амиотрофический латеральный склероз (ALS) и болезнь Паркинсона. Другой класс нейродегенеративных заболеваний включает заболевания, вызываемые, по меньшей мере, частично агрегация полиглутамина. Заболевания этого класса включают: болезни Хантингтона, спинально-бульбарную мышечную атрофию (SBMA или болезнь Кеннеди) дентаторубропаллидолюисову атрофию (DRPLA), спинально-церебеллярную атаксию 1 (SCA1), спинально-церебеллярную атаксию 2 (SCA2), болезнь Мачадо-Джозефа (MJD; SCA3), спинально-церебеллярную атаксию 6 (SCA6), спинально-церебеллярную атаксию 7 (SCA7) и спинально-церебеллярную атаксию 12 (SCA12).

[294] Любое другое заболевание, в котором играет роль эпигенетическое метилирование, которое опосредовано EZH2, может быть излечимо или предотвратимо с применением композиций и способов, приведенных в настоящем описании.

[295] Лечение рака может приводить к сокращению размера опухоли. Сокращение размера опухоли также может быть указано как «регрессия опухоли». Предпочтительно, после лечения, размер опухоли уменьшается на 5% или более относительно его размера до лечения; более предпочтительно, размер опухоли уменьшается на 10% или более; более предпочтительно, уменьшается на 20% или более; более предпочтительно, уменьшается на 30% или более; более предпочтительно, уменьшается на 40% или более; еще более предпочтительно, уменьшается на 50% или более; и наиболее предпочтительно, уменьшается более чем на 75% или более. Размер опухоли может быть измерен любыми воспроизводимыми средствами измерения. Размер опухоли может быть измерен как диаметр опухоли.

[296] Лечение рака может приводить к сокращению объема опухоли. Предпочтительно, после лечения объем опухоли уменьшается на 5% или более относительно ее размера до лечения; более предпочтительно, объем опухоли уменьшается на 10% или более; более предпочтительно, уменьшается на 20% или более; более предпочтительно, уменьшается на 30% или более; более предпочтительно, уменьшается на 40% или более; еще более предпочтительно, уменьшается на 50% или более; и наиболее предпочтительно, уменьшается более чем на 75% или более. Объем опухоли может быть измерен любыми воспроизводимыми средствами измерения.

[297] Лечение рака приводит к уменьшению количества опухолей. Предпочтительно, после лечения, количество опухолей уменьшается на 5% или более относительно количества до лечения; более предпочтительно, количество опухолей уменьшается на 10% или более; более предпочтительно, уменьшается на 20% или более; более предпочтительно, уменьшается на 30% или более; более предпочтительно, уменьшается на 40% или более; еще более предпочтительно, уменьшается на 50% или более; и наиболее предпочтительно, уменьшается более чем на 75%. Количество опухолей может быть измерено любыми воспроизводимыми средствами измерения. Количество опухолей может быть измерено путем подсчета опухолей видимых невооруженным глазом или при специфическом увеличении. Предпочтительно, специфическое увеличение составляет 2×, 3×, 4×, 5×, 10× или 50×.

[298] Лечение рака может приводить к уменьшению количества метастатических поражений в других тканях или органах, отдаленных от основного участка опухоли. Предпочтительно, после лечения количество метастатических поражений уменьшается на 5% или более относительно количества до лечения; более предпочтительно, количество метастатических поражений уменьшается на 10% или более; более предпочтительно, уменьшается на 20% или более; более предпочтительно, уменьшается на 30% или более; более предпочтительно, уменьшается на 40% или более; еще более предпочтительно, уменьшается на 50% или более; и наиболее предпочтительно, уменьшается более чем на 75%. Количество метастатических поражений может быть измерено любыми воспроизводимыми средствами измерения. Количество метастатических поражений может быть измерено путем подсчета метастатических поражений, видимых невооруженным глазом или при специфическом увеличении. Предпочтительно, специфическое увеличение составляет 2×, 3×, 4×, 5×, 10× или 50×.

[299] Лечение рака может приводить к увеличению средней продолжительности выживания популяции пациентов, проходящих лечение, по сравнению с популяцией, получающей один только носитель. Предпочтительно, средняя продолжительность выживания увеличивается более чем на 30 дней; более предпочтительно, более чем на 60 дней; более предпочтительно, более чем на 90 дней; и наиболее предпочтительно, более чем на 120 дней. Увеличение средней продолжительности выживания в популяции может быть измерено любыми воспроизводимыми средствами. Увеличение в средней продолжительности выживания в популяции может быть измерено, например, вычислением для популяции средней продолжительности выживания после начала лечения активным соединением. Увеличение в средней продолжительности выживания в популяции также может быть измерено, например, вычислением для популяции средней продолжительности выживания после завершения первого раунда лечения активным соединением.

[300] Лечение рака может приводить к увеличению средней продолжительности выживания в популяции проходящих лечение по сравнению с популяцией не проходящих лечение пациентов. Предпочтительно, средняя продолжительность выживания увеличивается более чем на 30 дней; более предпочтительно, более чем на 60 дней; более предпочтительно, более чем на 90 дней; и наиболее предпочтительно, более чем на 120 дней. Увеличение средней продолжительности выживания популяции может быть измерено любыми воспроизводимыми средствами. Увеличение средней продолжительности выживания популяции может быть измерено, например, вычислением для популяции средней продолжительности выживания после начала лечения активным соединением. Увеличение средней продолжительности выживания в популяции также может быть измерено, например, вычислением для популяции средней продолжительности выживания после завершения первого раунда лечения активным соединением.

[301] Лечение рака может приводить к увеличению средней продолжительности выживания популяции пациентов проходящих лечение по сравнению с популяцией, получающей монотерапию с лекарственным агентом, который не является соединением по настоящему изобретению или его фармацевтически приемлемой солью, пролекарством, метаболитом, аналогом или производным соединением. Предпочтительно, средняя продолжительность выживания увеличивается более чем на 30 дней; более предпочтительно, более чем на 60 дней; более предпочтительно, более чем на 90 дней; и наиболее предпочтительно, более чем на 120 дней. Увеличение средней продолжительности выживания популяции может быть измерено любыми воспроизводимыми средствами. Увеличение средней продолжительности выживания популяции может быть измерено, например, вычислением для популяции средней продолжительности выживания после начала лечения активным соединением. Увеличение средней продолжительности выживания популяции также может быть измерено, например, вычислением для популяции средней продолжительности выживания после завершения первого раунда лечения активным соединением.

[302] Лечение рака может приводить уменьшению смертности в популяции пациентов проходящих лечение по сравнению с популяцией, получающей один только носитель. Лечение рака может приводить к уменьшению смертности в популяции пациентов проходящих лечение по сравнению с популяцией пациентов, не проходящих лечение. Лечение рака может приводить к уменьшению смертности в популяции пациентов проходящих лечение по сравнению с популяцией, получающей монотерапию с лекарственным агентом, которое не является соединением по настоящему изобретению или его фармацевтически приемлемой солью, пролекарством, метаболитом, аналогом или производным соединением. Предпочтительно, смертность уменьшается более чем на 2%; более предпочтительно, более чем на 5%; более предпочтительно, более чем на 10%; и наиболее предпочтительно, более чем на 25%. Снижение смертности в популяции пациентов проходящих лечение может быть измерено любыми воспроизводимыми средствами. Снижение смертности в популяции может быть измерено, например, вычислением для популяции среднего количества связанных с заболеванием смертельных случаев в единицу времени после начала лечения активным соединением. Снижение смертности в популяции также может быть измерено, например, вычислением для популяции среднего количества связанных с заболеванием смертельных случаев в единицу времени после завершения первого раунда лечения активным соединением.

[303] Лечение рака может приводить к снижению скорости роста опухоли. Предпочтительно, после лечения, скорость роста опухоли уменьшается, по меньшей мере, на 5% относительно величины до лечения; более предпочтительно, скорость роста опухоли уменьшается по меньшей мере на 10%; более предпочтительно, уменьшается по меньшей мере на 20%; более предпочтительно, уменьшается по меньшей мере на 30%; более предпочтительно, уменьшается по меньшей мере на 40%; более предпочтительно, уменьшается по меньшей мере на 50%; еще более предпочтительно, уменьшается по меньшей мере на 50%; и наиболее предпочтительно, уменьшается по меньшей мере на 75%. Скорость роста опухоли может быть измерена любыми воспроизводимыми средствами измерения. Скорость роста опухоли может быть измерена по изменению диаметра опухоли в единицу времени.

[304] Лечение рака может приводить к уменьшению возобновления роста опухоли. Предпочтительно, после лечения, возобновление роста опухоли составляет менее 5%; более предпочтительно, возобновление роста опухоли составляет менее 10%; более предпочтительно, менее 20%; более предпочтительно, менее 30%; более предпочтительно, менее 40%; более предпочтительно, менее 50%; еще более предпочтительно, менее 50%; и наиболее предпочтительно, менее 75%. Возобновление роста опухоли может быть измерено любыми воспроизводимыми средствами измерения. Возобновление роста опухоли измеряют, например, путем измерения увеличения диаметра опухоли после предшествующего сокращения опухоли, последовавшего за лечением. На уменьшение в возобновлении роста опухоли указывает отсутствие повторного появления опухолей после прекращения лечения.

[305] Лечение или предотвращение нарушения пролиферации клеток может приводить к уменьшению скорости пролиферации клеток. Предпочтительно, после лечения, скорость пролиферации клеток уменьшается по меньшей мере на 5%; более предпочтительно, по меньшей мере на 10%; более предпочтительно, по меньшей мере на 20%; более предпочтительно, по меньшей мере на 30%; более предпочтительно, по меньшей мере на 40%; более предпочтительно, по меньшей мере на 50%; еще более предпочтительно, по меньшей мере на 50%; и наиболее предпочтительно, по меньшей мере на 75%. Скорость пролиферации клеток может быть измерена любыми воспроизводимыми средствами измерения. Скорость пролиферации клеток измеряют, например, путем измерения количества делений клетки в образце ткани в единицу времени.

[306] Лечение или предотвращение нарушения пролиферации клеток может приводить к снижению доли пролиферирующих клеток. Предпочтительно, после лечения, доля пролиферирующих клеток уменьшается по меньшей мере на 5%; более предпочтительно, по меньшей мере на 10%; более предпочтительно, по меньшей мере на 20%; более предпочтительно, по меньшей мере на 30%; более предпочтительно, по меньшей мере на 40%; более предпочтительно, по меньшей мере на 50%; еще более предпочтительно, по меньшей мере на 50%; и наиболее предпочтительно, по меньшей мере на 75%. Доля пролиферирующих клеток может быть измерена любыми воспроизводимыми средствами измерения. Предпочтительно, долю пролиферирующих клеток измеряют, например, определением количества делящихся клеток по отношению к количеству неделящихся клеток в образце ткани. Доля пролиферирующих клеток может быть эквивалентна митотическому индексу.

[307] Лечение или предотвращение нарушения пролиферации клеток может приводить к уменьшению размера области или зоны пролиферации клеток. Предпочтительно, после лечения размер области или зоны пролиферации клеток уменьшается по меньшей мере на 5% относительно ее размера до лечения; более предпочтительно, уменьшается по меньшей мере на 10%; более предпочтительно, уменьшается по меньшей мере на 20%; более предпочтительно, уменьшается по меньшей мере на 30%; более предпочтительно, уменьшается по меньшей мере на 40%; более предпочтительно, уменьшается по меньшей мере на 50%; еще более предпочтительно, уменьшается по меньшей мере на 50%; и наиболее предпочтительно, уменьшается по меньшей мере на 75%. Размер области или зоны пролиферации клеток может быть измерен любыми воспроизводимыми средствами измерения. Размер области или зоны пролиферации клеток может быть измерен как диаметр или ширина области или зоны пролиферации клеток.

[308] Лечение или предотвращение нарушения пролиферации клеток может приводить к уменьшению количества или доли клеток, имеющих патологический вид или морфологию. Предпочтительно, после лечения, количество клеток, имеющих патологическую морфологию, уменьшается по меньшей мере на 5% относительно их числа до лечения; более предпочтительно, уменьшается по меньшей мере на 10%; более предпочтительно, уменьшается по меньшей мере на 20%; более предпочтительно, уменьшается по меньшей мере на 30%; более предпочтительно, уменьшается по меньшей мере на 40%; более предпочтительно, уменьшается по меньшей мере на 50%; еще более предпочтительно, уменьшается по меньшей мере на 50%; и наиболее предпочтительно, уменьшается по меньшей мере на 75%. Патологический вид клеток или морфология могут быть измерены любыми воспроизводимыми средствами измерения. Патологическая клеточная морфология может быть измерена при помощи микроскопии, например, с применением инвертационного микроскопа для культуры тканей. Патологическая клеточная морфология может принимать форму ядерного плейоморфизма.

[309] Как применено в настоящем описании, термин «селективно» обозначает тенденцию встречаться с большей частотой в одной популяции, чем в другой популяции. Сравниваемые популяции могут быть популяциями клеток. Предпочтительно, соединение по настоящему изобретению или его фармацевтически приемлемая соль, пролекарство, метаболит, полиморф или сольват действует селективно на раковые или предраковые клетки, но не на нормальные клетки. Предпочтительно, соединение по настоящему изобретению или его фармацевтически приемлемая соль, пролекарство, метаболит, полиморф или сольват, действует селективно так, что модулирует одну молекулярную мишень (например, целевую метилтрансферазу белка), но не значительно модулирует другую молекулярную мишень (например, нецелевая метилтрансфераза белка). Настоящее изобретение также описывает способ селективного ингибирования активности фермента, такого как метилтрансфераза белка. Предпочтительно, событие происходит селективно в популяции А относительно популяции B, если оно происходит более чем в два раза чаще в популяции А по сравнению с популяцией B. Событие происходит селективно, если оно происходит более чем в пять раз чаще в популяции A. Событие происходит селективно, если оно встречается более чем в десять раз чаще в популяции A; более предпочтительно, более чем в пятьдесят раз; еще более предпочтительно, более чем в 100 раз; и наиболее предпочтительно, более чем в 1000 раз чаще в популяции А по сравнению с популяцией B. Например, будет считаться, что отмирание клеток происходит селективно в раковых клетках, если он происходит более чем в два раза чаще в раковых клетках по сравнению с нормальными клетками.

[310] Композиция по настоящему изобретению, например, композиция, включающая любое соединение формулы (IIa) или его фармацевтически приемлемую соль и один или более других терапевтических агентов, таких как преднизон, может модулировать активность молекулярной мишени (например, целевой метилтрансферазы белка). Модуляция относится к стимулированию или ингибированию активности молекулярной мишени. Предпочтительно, соединение по настоящему изобретению или его фармацевтически приемлемая соль, пролекарство, метаболит, полиморф или сольват модулирует активность молекулярной мишени, если оно стимулирует или ингибирует активность молекулярной мишени по меньшей мере 2-кратно относительно активности молекулярной мишени в тех же условиях, но только в отсутствие указанного соединения. Более предпочтительно, соединение по настоящему изобретению или его фармацевтически приемлемая соль, пролекарство, метаболит, полиморф или сольват модулирует активность молекулярной мишени, если оно стимулирует или ингибирует активность молекулярной мишени по меньшей мере 5-кратно, по меньшей мере 10-кратно, по меньшей мере 20-кратно, по меньшей мере 50-кратно, по меньшей мере 100-кратно относительно активности молекулярной мишени в тех же условиях, но только в отсутствие указанного соединения. Активность молекулярной мишени может быть измерена любыми воспроизводимыми средствами. Активность молекулярной мишени может быть измерена in vitro или in vivo. Например, активность молекулярной мишени может быть измерена in vitro анализом ферментативной активности или анализом связывания ДНК, или активность молекулярной мишени может быть измерена in vivo путем оценки экспрессии репортерного гена.

[311] Композиция по настоящему изобретению не значительно модулирует активность молекулярной мишени, если добавление соединения не стимулирует или ингибирует активность молекулярной мишени больше чем на 10% относительно активности молекулярной мишени в тех же условиях, но в отсутствии указанного соединения.

[312] Как применено в настоящем описании, термин «избирательный в отношении изоферментов» обозначает предпочтительное ингибирование или стимулирование первой изоформы фермента по сравнению со второй изоформой фермента (например, предпочтительное ингибирование или стимулирование изофермента альфа метилтрансферазы белка по сравнению с изоферментом бета-метилтрансферазы белка). Предпочтительно, соединение по настоящему изобретению или его фармацевтически приемлемая соль, пролекарство, метаболит, полиморф или сольват демонстрирует минимум четырехкратную разницу, предпочтительно, десятикратную разницу, более предпочтительно, пятидесятикратную разницу в дозировке, необходимой для достижения биологического эффекта. Предпочтительно, соединение по настоящему изобретению или его фармацевтически приемлемая соль, пролекарство, метаболит, полиморф или сольват демонстрирует эту разницу в диапазоне ингибирования, и разница иллюстрируется при IC₅₀, т.е. 50%-ом ингибировании для представляющей интерес молекулярной мишени.

[313] Применение композиции по настоящему изобретению к клетке или нуждающемуся в этом пациенту может приводить к модуляции (т.е. стимулированию или ингибированию) активности метилтрансферазы интересующего белка.

[314] Применение соединения по настоящему изобретению, например, композиции, включающей любое соединение формулы (IIa) или его фармацевтически приемлемую соль и один или более других терапевтических агентов, таких как преднизон, к клетке или нуждающемуся в этом пациенту приводит к модуляции (т.е. стимулированию или ингибированию) активности внутриклеточной мишени (например, субстрата). Несколько внутриклеточных мишеней могут модулироваться соединениями по настоящему изобретению, включая без ограничения метилтрансферазу белка.

[315] Активирование относится к приведению композиции вещества (например, белка или нуклеиновой кислоты) в состояние, подходящее для выполнения желаемой биологической функции. Композиция вещества, способного к активизации, также имеет неактивизированное состояние. Активизированная композиция вещества может иметь ингибирующую или стимулирующую биологическую функцию или обе.

[316] Повышение относится к увеличению в желаемой биологической активности композиции вещества (например, белка или нуклеиновой кислоты). Повышение может происходить через увеличение концентрации композиции вещества.

[317] Как применено в настоящем описании, «путь контрольных точек клеточного цикла» относится к биохимическому пути, который вовлечен в модуляцию контрольных точек клеточного цикла. Путь контрольных точек клеточного цикла может обладать стимулирующим или ингибирующим эффектом или обоими на одну или более функций, включая путь контрольных точек клеточного цикла. Путь контрольных точек клеточного цикла состоит по меньшей мере из двух композиций вещества, предпочтительно, белков, обе из которых способствуют модуляции контрольных точек клеточного цикла. Путь контрольных точек клеточного цикла может быть активизирован посредством активации одного или более участников пути контрольных точек клеточного цикла. Предпочтительно, путь контрольных точек клеточного цикла является биохимическим сигнальным путем.

[318] Как применено в настоящем описании, «регулятор контрольных точек клеточного цикла» относится к композиции вещества, которая может функционировать, по меньшей мере, частично, в модуляции контрольных точек клеточного цикла. Регулятор контрольных точек клеточного цикла может иметь стимулирующий или ингибиторный эффекты или оба на один или более функций, включая контрольные точки клеточного цикла. Регулятор контрольных точек клеточного цикла может быть белком или не белком.

[319] Лечение рака или нарушения пролиферации клеток может приводить к отмиранию клеток и, предпочтительно, отмирание клеток приводит к уменьшению количества клеток в популяции, по меньшей мере, на 10%. Более предпочтительно, отмирание клеток обозначает уменьшение по меньшей мере на 20%; более предпочтительно, уменьшение по меньшей мере на 30%; более предпочтительно, уменьшение по меньшей мере на 40%; более предпочтительно, уменьшение по меньшей мере на 50%; наиболее предпочтительно, уменьшение по меньшей мере на 75%. Количество клеток в популяции может быть измерено любыми воспроизводимыми средствами. Число клеток в популяции может быть измерено активируемой флюоресценцией сортировкой клеток (FACS), иммунофлуоресцентной микроскопией и световой микроскопией. Способы измерения отмирания клеток показаны в Li et al., Proc Natl Acad Sci USA. 100(5): 2674-8, 2003. В одном аспекте тмирание клеток происходит путем апоптоза.

[320] Предпочтительно, эффективное количество композиции по настоящему изобретению или его фармацевтически приемлемой соли, пролекарства, метаболита, полиморфа или сольвата не является значимо цитотоксическим для нормальных клеток. Терапевтически эффективное количество соединения не является значимо цитотоксическим для нормальных клеток, если введение соединения в терапевтически эффективном количестве не вызывает отмирание клеток в количестве более 10% нормальных клеток. Терапевтически эффективное количество соединения не значительно влияет на жизнеспособность нормальных клеток, если введение соединения в терапевтически эффективном количестве не вызывает отмирание клеток в количестве более, чем 10% нормальных клеток. В одном аспекте отмирание клеток происходит путем апоптоза.

[321] Приведение композиции по настоящему изобретению или его фармацевтически приемлемой соли, пролекарства, метаболита, полиморфа или сольвата в контакт с клеткой может вызвать или активизировать отмирание клеток селективно для раковых клеток. Введение нуждающемуся в этом пациенту соединения по настоящему изобретению или его фармацевтически приемлемой соли, пролекарства, метаболита, полиморфа или сольвата может вызывать или активизировать отмирание клеток выборочно для раковых клеток. Приведение композиции по настоящему изобретению или фармацевтически приемлемой соли, пролекарства, метаболита, полиморфа или сольвата в контакт с клеткой может вызвать отмирание клеток селективно для одной или более клеток, подверженных нарушению пролиферации клеток. Предпочтительно, введение нуждающемуся в этом пациенту композиции по настоящему изобретению или его фармацевтически приемлемой соли, пролекарства, метаболита, полиморфа или сольвата вызывает отмирание клеток селективно для одной или более клеток, подверженных нарушению пролиферации клеток.

[322] Настоящее изобретение относится к способу лечения или предотвращения рака путем введения композиции по настоящему изобретению или его фармацевтически приемлемой соли, пролекарства, метаболита, полиморфа или сольвата нуждающемуся в этом пациенту, где введение композиции по настоящему изобретению или его фармацевтически приемлемой соли, пролекарства, метаболита, полиморфа или сольвата приводит к одному или более из следующих: профилактика пролиферации раковых клеток путем накопления клеток в одной или более фаз клеточного цикла (например, G1, G1/S, G2/M) или инициация старения клеток или ускорение дифференцирования опухолевой клетки; ускорение отмирания раковых клеток через цитотоксичность, некроз или апоптоз, без существенного количества отмирающих нормальных клеток, противоопухолевая активность у животных с терапевтическим индексом по меньшей мере 2. Как применено в настоящем описании «терапевтический индекс» равен максимальной переносимой дозой, деленной на эффективную дозу.

[323] Специалист в области техники может обратиться к текстам справочного характера за подробным описанием известных способов, рассмотренных в настоящем описании или эквивалентных способов. Эти тексты включают Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley and Sons, Inc. (2005); Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual (3^е издание), Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, Нью-Йорк (2000); Coligan et al., Current Protocols in Immunology, John Wiley & Sons, N.Y.; Enna et al., Current Protocols in Pharmacology, John Wiley & Sons, Нью-Йорк; Fingl et al., The Pharmacological Basis of Therapeutics (1975), Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co., Easton, PA, 18е издание (1990). К этим текстам можно, конечно, также обращаться при получении или применении аспекта настоящего изобретения.

Пример 1: Синтез N-(4,6-диметил-2-oxo-1,2-дигидропиридин-3-ил)метил)-5-(этил(тетрагидро-2H-пиран-4-ил)амино)-4-метил-4’-(морфолинометил)-[1,1’-дифенил]-3-карбоксамид

Соединение 44

[324] Стадия 1: Синтез 5-бром-2-метил-3-нитробензойной кислоты

[325] К перемешиваемому раствору 2-метил-3-нитробензойной кислоты (100 г, 552 ммоль) в концентрированной H₂SO₄ (400 мл) 1,3-дибром-5,5-диметил-2,4-имидазолидиндион (88 г, 308 ммоль) добавляли по частям при комнатной температуре, и затем реакционную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 5 ч. Реакционную смесь выливали на ледяную воду, образующийся твердый осадок отфильтровывали, промывали водой и высушивали в вакууме, чтобы получить желаемое соединение в виде твердого вещества (140 г, 98%). Выделенное соединение переносили непосредственно на следующую стадию. ¹H-ЯМР (ДМСО-d₆, 400 МГц) δ 8,31 (c, 1H), 8,17 (c, 1H), 2,43 (c, 3H).

[326] Стадия 2: Синтез метил 5-бром-2-метил-3-нитробензоата

[327] К перемешиваемому раствору 5-бром-2-метил-3-нитробензойной кислоты (285 г, 1105 ммоль) в ДМФА (2,8 л) при комнатной температуре добавляли карбонат натрия (468 г, 4415 ммоль) с последующим добавлением метилйодида (626,6 г, 4415 ммоль). Полученную реакционную смесь нагревали при 60°С в течение 8 ч. После завершения (проверяли посредством ТСХ) реакционную смесь фильтровали (чтобы удалить карбонат натрия) и промывали этилацетатом (1 л ×3). Объединенный фильтрат промывали водой (3 л ×5), и водную фазу извлекали обратно этилацетатом (1 л ×3). Объединенные органические слои высушивали над безводным сульфатом натрия, фильтровали и концентрировали под пониженным давлением, чтобы получить приведенное в названии соединение в виде твердого вещества (290 г, выход 97%). Выделенное соединение переносили непосредственно на следующую стадию. ¹H-ЯМР (CDCl₃, 400 МГц) δ 8,17 (c, 1H), 7,91 (c, 1H), 3,96 (c, 3H), 2,59 (c, 3H).

[328] Стадия 3: Синтез метил 3-амино-5-бром-2-метилбензоата

[329] К перемешиваемому раствору метил 5-бром-2-метил-3-нитробензоата (290 г, 1058 ммоль) в этиловом спирте (1,5 л) добавляли водный хлорид аммония (283 г, 5290 ммоль, растворенный в 1,5 л воды). Полученную смесь перемешивали при 80°С, к ней добавляли по частям железный порошок (472 г, 8451 ммоль). Полученную реакционную смесь нагревали при 80°С в течение 12 ч. После завершения, как определено по ТСХ, реакционную смесь в горячем состоянии фильтровали через celite®, и слой целита промывали метанолом (5 л) с последующим промыванием 30% MeOH в ДХМ (5 л). Объединенный фильтрат концентрировали в вакууме, полученный остаток разбавляли водным раствором (2 л) бикарбоната натрия и экстрагировали этилацетатом (5 л ×3). Объединенные органические слои высушивали над безводным сульфатом натрия, фильтровали и концентрировали при пониженном давлении, чтобы получить соединение, приведенное в названии, в виде твердого вещества (220 г, 85%). Соединение переносили непосредственно на следующую стадию. ¹H-ЯМР (CDCl₃, 400 МГц) δ 7,37 (c, 1H), 6,92 (c, 1H), 3,94 (c, 3H), 3,80 (шир.c, 2H), 2,31 (c, 3H).

[330] Стадия 4: Синтез метил 5-бром-2-метил-3-(тетрагидро- 2H-пиран-4-ил)амино)бензоата

[331] К перемешиваемому раствору метил 3-амино-5-бром-2-метилбензоата (15 г, 61,5 ммоль) и дигидро-2H-пиран-4(3)-она (9,2 г, 92 ммоль) в дихлорэтане (300 мл) добавляли уксусную кислоту (22 г, 369 ммоль), и реакционную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 15 минут, затем реакционную смесь охлаждали до 0°С, и добавляли натрия триацетоксиборгидрид (39 г, 184 ммоль). Реакционную смесь перемешивали в течение ночи при комнатной температуре. После завершения реакции, как определено по ТСХ, водный раствор бикарбоната натрия добавляли в реакционную смесь до получения pH 7-8. Органическую фазу отделяли, и водную фазу экстрагировали этилацетатом. Объединенные органические слои высушивали над безводным сульфатом натрия, фильтровали и концентрировали при пониженном давлении. Сырьевое соединение очищали колоночной хроматографией (силикагель с отверстиями 100-200 меш), элюируя смесью этилацетат:гексан, чтобы получить желаемое соединение в виде твердого вещества (14 г, 69%). ¹H-ЯМР (ДМСО-d₆, 400 МГц) δ 7,01 (c, 1H), 6,98 (c, 1H), 5,00 (д, 1H, J=7,6 Гц), 3,84-3,87 (м, 2H), 3,79 (c, 3H), 3,54-3,56 (м, 1H), 3,43 (т, 2H, J=12 Гц), 2,14 (c, 3H), 1,81-1,84 (м, 2H), 1,47-1,55 (м, 2H).

[332] Стадия 5: Синтез метил 5-бром-3-(этил(тетрагидро-2H-пиран-4-ил)амино)-2-метилбензоата

[333] К перемешиваемому раствору метил 5-бром-2-метил-3-(тетрагидро-2H-пиран-4-ил)амино)бензоата (14 г, 42,7 ммоль) в дихлорэтане (150 мл) добавляли уксусный альдегид (3,75 г, 85,2 ммоль) и уксусную кислоту (15,3 г, 256 ммоль). Полученную реакционную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 15 минут. Смесь охлаждали до 0°С и добавляли триацетоксиборгидрид натрия (27 г, 128 ммоль). Реакционную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 3 часов. После завершения реакции, как определено по ТСХ, водный раствор бикарбоната натрия добавляли в реакционную смесь до достижения pH 7-8. Органическую фазу отделяли, и водную фазу экстрагировали этилацетатом. Объединенные органические слои высушивали над безводным сульфатом натрия, фильтровали и концентрировали при пониженном давлении. Сырьевое соединение очищали колоночной хроматографией (силикагель с отверстиями 100-200 меш), элюируя смесью этилацетат:гексан, чтобы получить желаемое соединение в виде вязкой жидкости (14 г, 93%). ¹H-ЯМР (ДМСО-d₆, 400 МГц) δ 7,62 (c, 1H), 7,52 (c, 1H), 3,80 (шир.c, 5Н), 3,31 (т, 2H), 2,97-3,05 (м, 2H), 2,87-2,96 (м, 1H), 2,38 (c, 3H), 1,52-1,61 (м, 2H), 1,37-1,50 (м, 2H), 0,87 (т, 3H, Гц J=6,8).

[334] Стадия 6: Синтез 5-бром-N-((4,6-диметил-2-оксо-1,2-дигидропиридин-3-ил)метил)-3-(этил(тетрагидро-2H-пиран-4-ил)амино)-2-метилбензамида

[335] К перемешиваемому раствору 5-бром-3-(этил(тетрагидро-2H-пиран-4-ил)амино)-2-метилбензоата (14 г, 39,4 ммоль) в этиловом спирте (100 мл) добавляли водный NaOH (2,36 г, 59,2 ммоль в воде на 25 мл), и полученную смесь перемешивали при 60°С в течение 1 ч. После завершения реакции, как определено по ТСХ, растворитель удаляли при пониженном давлении, и полученный остаток подкисляли 1 н. HCl до достижения pH 7, и затем добавляли водный раствор лимонной кислоты до достижения pH 5-6. Водный слой экстрагировали 10% MeOH в ДХМ (200 мл ×3), объединенные органические слои высушивали над безводным сульфатом натрия, фильтровали и концентрировали при пониженном давлении, чтобы получить соответствующую кислоту (14 г, 100%).

[336] Вышеуказанную кислоту (14 г, 40,9 ммоль) затем растворяли в ДМСО (70 мл) и добавляли к ней 3-(аминометил)-4,6-диметилпиридин-2(1H)-он (12,4 г, 81,9 ммоль). Реакционную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 15 минут, затем добавляли PYBOP (31,9 г, 61,4 ммоль), и перемешивание продолжали в течение ночи при комнатной температуре. После завершения реакции, как определено по ТСХ, реакционную смесь выливали на ледяную воду (700 мл), перемешивали в течение 30 минут, и образующийся твердый осадок собирали путем фильтрации, промывали водой (500 мл) и высушивали на воздухе. Полученное твердое вещество перемешивали с ацетонитрилом (75 мл ×2), фильтровали и высушивали на воздухе. Полученное твердое вещество снова перемешивали с 5% MeOH в ДХМ (100 мл), фильтровали и высушивали полностью в вакууме, чтобы получить приведенное в названии соединение в виде твердого вещества (14 г, 74%). ¹H-ЯМР (ДМСО-d₆, 400 МГц) δ 11,47 (c, 1H), 8,23 (т, 1H), 7,30 (c, 1H), 7,08 (c, 1H), 5,85 (c, 1H), 4,23 (д, 2H, J=4,4 Гц), 3,81 (д, 2H, J=10,4 Гц), 3,20-3,26 (м, 2H), 3,00-3,07 (м, 1H), 2,91-2,96 (м, 2H), 2,18 (c, 3H), 2,14 (c, 3H), 2,10 (c, 3H), 1,58-1,60 (м, 2H), 1,45-1,50 (м, 2H), 0,78 (т, 3H, J=6,8 Гц),

[337] Стадия 7: Синтез N-((4,6-диметил-2-оксо-1,2-дигидропиридин-3-ил)метил)-5-(этил(тетрагидро-2H-пиран-4-ил)амино)-4-метил-4’-(морфолинометил)-[1,1’-дифенил]-3-карбоксамида

[338] К перемешиваемому раствору 5-бром-N-((4,6-диметил-2-оксо-1,2-дигидропиридин-3-ил)метил)-3-(этил(тетрагидро-2H-пиран- 4-ил)амино)-2-метилбензамида (14 г, 29,5 ммоль) в смеси диоксан/вода (70 мл/14 мл) добавляли 4-(4-(4,4,5,5-тетраметил-1,3,2-диоксоборолан-2-ил)бензил)морфолин (13,4 г, 44,2 ммоль) с последующим добавлением Na₂CO₃ (11,2 г, 106,1 ммоль). Раствор продували аргоном в течение 15 минут, и затем добавляли Pd(PPh3)₄ (3,40 г, 2,94 ммоль), и раствор снова продували аргоном в течение дополнительных 10 минут. Реакционную смесь нагревали при 100°С в течение 4 ч. После завершения (проверяли посредством ТСХ), реакционную смесь разбавляли водой и экстрагировали 10%-ым MeOH/ДХМ. Объединенные органические слои высушивали над безводным сульфатом натрия, фильтровали и концентрировали под пониженным давлением. Сырьевое соединение очищали колоночной хроматографией (силикагель с отверстиями 100-200 меш), элюируя смесью метанол:ДХМ с получением приведенного в названии соединения в виде твердого вещества (12 г, 71%). Аналитические данные: ЖХМС: 573,35 (m+1)⁺; ВЭЖХ: 99,5% (254 нм) (R_t; 3,999; Способ: Колонка: ODS-A YMC 150 мм × 4,6 мм × 5 мкм; Мобильная фаза: A; 0,05% ТФА в воде/B; 0,05% ТФА в ацетонитриле; Вводимый объем: 10 мкл, температура колонки: 30°С; Объемная скорость потока: 1,4 мл/мин; Градиент: от 5% B до 95% B за 8 мин, задержка в течение 1,5 минут, 9,51-12 мин 5% B); ^lH-ЯМР (ДМСО-d₆, 400 МГц) δ 11,46 (c, 1H), 8,19 (т, 1H), 7,57 (д, 2H, J=7,2 Гц), 7,36-7,39 (м, 3H), 7,21 (c, 1H), 5,85 (c, 1H), 4,28 (д, 2H, J=2,8 Гц), 3,82 (д, 2H, J=9,6 Гц), 3,57 (шир.c, 4H), 3,48 (c, 2H), 3,24 (т, 2H, J=10,8 Гц), 3,07-3,09 (м, 2H), 3,01 (м, 1H), 2,36 (м, 4H), 2,24 (c, 3H), 2,20 (c, 3H), 2,10 (c, 3H), 1,64-1,67 (м, 2H), 1,51-1,53 (м, 2H), 0,83 (т, 3H, J=6,4 Гц).

[339] Стадия 8: Синтез N-(4,6-диметил-2-оксо-1,2-дигидропиридин-3-ил)метил)-5-(этил(тетрагидро-2H-пиран-4-ил)амино)-4-метил-4’-(морфолинометил)-[1,1’-дифенил]-3-карбоксамида трихлоргидрата

[340] N-((4,6-диметил-2-оксо-1,2-дигидропиридин-3-ил)метил)-5-(этил(тетрагидро-2H-пиран-4-ил)амино)-4-метил-4’-(морфолинометил)-[1,1’-дифенил]-3-карбоксамид (12 г, 21,0 ммоль) растворяли в метаноловом растворе HCl (200 мл) и перемешивали при комнатной температуре в течение 3 ч. Через три часа перемешивания реакционную смесь концентрировали при пониженном давлении. Полученное твердое вещество перемешивали с эфиром (100 мл × 2), чтобы получить желаемую соль в виде твердого вещества (11 г, 77%). Аналитические данные три-HCl соли: ЖХМС: 573,40 (m+1)⁺; ВЭЖХ: 99,1% (254 нм) (R_t; 3,961; Способ: Колонка: ODS-A YMC 150 мм × 4,6 мм × 5 мкм; Мобильная фаза: A; 0,05% ТФА в воде/B; 0,05% ТФА в ацетонитриле; Вводимый объем: 10 мкл, температура колонки: 30°С; Объемная скорость потока: 1,4 мл/мин; Градиент: от 5% B до 95% B за 8 минут, задержка в течение 1,5 минуты, 9,51-12 минут 5% B); ^lH-ЯМР (D₂O, 400 МГц) δ 7,92 (шир.c, 1H,) 7,80 (c, 1H), 7,77 (д, 2H, J=8 Гц), 7,63 (c, 1H), 7,61 (c, 1H), 6,30 (c, 1H), 4,48 (c, 2H), 4,42 (c, 2H), 4,09-4,11 (м, 4H), 3,95-3,97 (м, 2H), 3,77 (т, 3H, J=10,4 Гц), 3,44-3,47 (м, 3H), 3,24-3,32 (м, 3H), 2,42 (c, 3H), 2,35 (c, 3H), 2,26 (c, 3H), 2,01 (м, 2H), 1,76 (м, 2H), 1,04 (т, 3H, J=6,8 Гц).

Пример 2: Комбинированная терапия с соединением 44 и компонентами CHOP

[341] Клеточные линии лимфомы человека WSU-DLCL2 (DSMZ; ACC 575), OCI-Ly19 (DSMZ; ACC 528), RL (ATCC; CRL-2261) получали из указанных источников и поддерживали в питательной среде RPMI-1640, обогащенной 10%-ой фетальной бычьей сыворотки и 2 мМ глутамином. Клетки культивировали в колбах для выращивания культуры тканей в увлажненном термостате при 37°С в атмосфере 5% CO₂ и 95% воздуха.

[342] Эффект комбинированной терапии соединением 44 с каждым из компонентов CHOP (циклофосфамид, винкристин, доксорубицин и преднизолон) по отдельности на жизнеспособность раковой клетки исследовали in vitro. План дозировки изображен на Фиг. 1A. Клетки лимфомы человека WSU-DLCL2 обрабатывали увеличивающимися концентрациями соединения 44. Через 4 дня комбинацию увеличивающихся концентраций соединения 44 и каждого из компонентов CHOP вводили к клеткам. Через 4 дня жизнеспособность клеток определяли с применением реагента от Guava ViaCount от Millipore и анализа проточной цитометрией. Процент жизнеспособных клеток для каждого образца нормализовали по проценту жизнеспособных клеток для ДМСО-обработанных образцов внутри каждой группы концентраций соединения 44.

[343] Клетки, обработанные соединением 44 и компонентами CHOP в отдельности показывали снижение в жизнеспособности клеток. Клетки, обработанные соединением 44 с мафосфамидом (метаболит циклофосфамида) (Фиг. 2A) и доксорубицином (Фиг. 2B) не демонстрировали снижения жизнеспособности клеток при увеличивающихся концентрациях мафосфамида или доксорубицина. Комбинированная терапия с соединением 44 с винкристином (Фиг. 2С) показывала снижение жизнеспособности клеток при самой высокой концентрации соединения 44. Важно, что комбинированная терапия с применением соединения 44 и преднизолона (метаболит преднизона) (Фиг. 2D) показывала синергическое снижение жизнеспособности клеток при 2 самых высоких дозах соединения 44 и при всех дозах преднизолона.

Пример 3: Синергические эффекты комбинированной терапии соединением 44 и преднизолоном зависят от режима дозировки

[344] Чтобы исследовать роль выбора времени для введения соединения 44 и преднизолона на жизнеспособность клеток, клетки WSU-DLCL2 обрабатывали при различных режимах дозирования, как изображено на Фиг. 1. Жизнеспособность клеток определяли по окрашиванию реагентом Guava ViaCount от Millipore и затем анализировали проточной цитометрией.

[345] Введение соединения 44 до совместного введения соединения 44 и преднизолона приводило к снижению жизнеспособностью клеток (Фиг. 3A). Клетки обрабатывали так, как изображено на Фиг. 1A. Жизнеспособность клеток нормализовали по образцу ДМСО/ДМСО, таким образом выявляя эффект обработки соединением 44 в отдельности. Увеличение концентраций соединения 44 приводило к уменьшению роста клеток. Важно, что увеличение концентраций преднизолона в комбинации с соединением 44 приводило к дополнительному уменьшению роста клеток по сравнению с обработкой клеток соединением 44 или преднизолоном независимым образом в качестве единственных агентов. Поэтому комбинированная терапия с соединением 44 и преднизолоном, в которой соединение 44 вводят первым, вызывает синергический эффект снижения жизнеспособности раковых клеток.

[346] Введение соединения 44 до введения преднизолона приводило с снижению жизнеспособности клеток (Фиг. 3B). Клетки обрабатывали так, как изображено на Фиг. 1B. Жизнеспособность клеток нормализовали по ДМСО-обработанному образцу для каждой группы концентрации соединения 44. Обработка увеличивающимися концентрациями преднизолона в качестве единственного агента после предшествующего введения соединения 44 также приводила к дополнительному снижению жизнеспособности клеток по сравнению с клетками, обработанными одним только преднизолоном, таким образом демонстрируя синергический эффект комбинированной терапии соединением 44 и преднизолоном.

[347] Введение преднизона до совместного введения соединения 44 и преднизолона не снижало жизнеспособность клеток (Фиг. 3С). Клетки обрабатывали так, как изображено на Фиг. 1С. Жизнеспособность клеток нормализовали по ДМСО-обработанному образцу для каждой группы концентрации соединения 44. Эти результаты продемонстрировали, что введение преднизолона до обработки композицией, включающей соединение 44 и преднизолон, не вызывало синергический эффект на жизнеспособность клеток.

[348] Эти данные ясно показывают, что комбинированная терапия с соединением 44 и преднизолоном снижает жизнеспособность раковых клеток или вызывает отмирание раковых клеток. Специфически, комбинированная терапия, в которой клетки обрабатывают соединением 44 до обработки преднизолоном или комбинацией преднизолона и соединения 44, приводит в результате к синергическому эффекту на жизнеспособность клеток, где снижение жизнеспособности клеток больше, чем снижение, вызываемое обработкой или преднизолоном, или соединением 44 в качестве единственных агентов.

Пример 4: Синергия соединения 44 и преднизолона зависит от мутации EZH2

[349] Различные линии раковых клеток лимфомы человека, содержащие различные мутации EZH2, анализировали на их чувствительность к соединению 44 и преднизолону. Клетки обрабатывали с такими режимами дозирования, которые продемонстрированы на Фиг. 1A, где клетки сначала обрабатывают соединением 44, а затем через 4 дня обрабатывают комбинацией соединения 44 и преднизолона. Жизнеспособность клеток определяли через 4 дня с применением реагента Guava ViaCount от Millipore и анализа проточной цитометрии. Процент жизнеспособности клеток нормализовали по проценту ДМСО-обработанного образца.

[350] Клетки лимфомы, экспрессирующие дикий тип (WT) EZH2, клеточная линия OCI-LY19 устойчивы к обработке ингибиторами EZH2. Соответственно, обработка увеличивающимися концентрациями соединения 44 не влияет на жизнеспособность клеток. Увеличение концентраций преднизолона не имеет дополнительного или синергического эффекта на жизнеспособность клеток (Фиг. 4A).

[351] Клетки WSU-DLCL2, содержащие мутацию Y641F, чувствительны к обработке ингибиторами EZH2, что доказано снижением жизнеспособности клеток при увеличивающихся концентрациях соединения 44 при его применении в качестве единственного агента. Кроме того, при обработке в комбинации с преднизолоном, клетки демонстрируют сниженную жизнеспособность клеток (Фиг. 4B).

[352] Клетки RL содержат мутацию Y641N и устойчивы к обработке ингибитором EZH2. Введение увеличивающихся концентраций соединения 44 в отдельности не приводит к снижению жизнеспособности клеток. Однако, совместное введение соединения 44 с преднизолоном приводило к синергическому эффекту, где снижение жизнеспособности клеток было больше, чем снижение, наблюдаемое при введении соединения 44 и преднизолона в качестве единственных агентов (Фиг. 4С).

[353] Взятые вместе, эти результаты указывают на то, что комбинированная терапия с соединением 44 и преднизолоном может давать синергический эффект в снижении жизнеспособности раковых клеток и увеличении отмирания раковых клеток, которые экспрессируют мутант EZH2. Кроме того, клетки, которые устойчивы к обоим лекарственным агентам, соединению 44 и преднизолону, при их применении в качестве единственных агентов, становятся чувствительными к обработке комбинацией, и жизнеспособность клеток снижается.

Пример 5: Фармакокинетический анализ совместного введения соединения 44 и компонентов CHOP in vivo

[354] Фармакокинетический анализ соединения 44 в комбинации с каждыми из компонент CHOP (циклофосфамид, винкристин, доксорубицин и преднизолон) проводили, чтобы определить поглощение или распределение соединения 44 in vivo. Мужские особи BALB/c в возрасте между 8-12 неделями и весящие 20-40 г получали из In vivo, Бенгалуру, Индия. Животным вводили один из компонент CHOP в качестве единственного агента или в комбинации с соединением 44. Циклофосфамид вводили интраперитонеальной инъекцией в дозе 30 мг/кг. Винкристин вводили внутривенной инъекцией в дозе 0,375 мг/кг. Доксорубицин вводили внутривенной инъекцией в дозе 2,475 мг/кг. Преднизолон вводили пероральным путем в дозе 0,15 мг/кг. Соединение 44 вводили в дозе 225 мг/кг пероральным путем. Образцы плазмы крови отбирали в различные моменты времени в течение 24-часового периода после введения.

[355] Процедура экстракции для плазмы исследуемых образцов или стандартных образцов с добавлением плазмы для калибровки была одинаковой: 25 мкл образца либо исследуемого образца, либо меченого стандартного образца для калибровки добавляли в отдельные предварительно меченные микроцентрифужные стаканы. Затем, объем 100 мкл IS (Glipizide, 500 нг/мл), полученный в ACN добавляли в микроцентрифужные стаканы, кроме контрольных образцов, в которые добавляли ацетонитрил, и перемешивали на вортексе в течение 5 минут. Образцы центрифугировали в течение 10 минут при скорости 15000 оборотов в минуту (20600 g) при 4°С. После центрифугирования, 100 мкл надосадочного раствора отбирали из каждого центрифужного стакана и переносили во вставочные флаконы. Эти флаконы загружали в автоматической дозатор для анализа ЖХ/МС/МС. Калибровочные стандарты получали путем добавления 10 мкл анализируемого вещества (соединение 44, циклофосфамид, доксорубицин, винкристин и преднизолон) в 190 мкл чистой плазмы мыши.

[356] Модуль анализа без учета компартментов в WinNonlin® (версия 5.2) применяли для оценки фармакокинетических параметров. Области под кривой зависимости концентрации от времени (AUC) вычисляли по линейному правилу трапеций. Отношение (AUC_combo/AUC_single) для AUC в комбинированной терапии соединением 44 с каждым компонентом CHOP (AUC_combo) к AUC каждого компонента CHOP в отдельности (AUC_single) и указанная схожая биодоступность при введении компонентов CHOP по отдельности или с соединением 44.

Пример 6: Анализ комбинированной терапии соединения 44 и CHOP в моделях ксенотрансплантата мыши

Мыши

[357] Женские особи мышей Fox Chase SCID^® (CB17/Icr-Prkdcscid/IcrIcoCrl, Charles River Laboratories) или бестимусные мыши (Crl:NU(Ncr)-Foxn1nu, Charles River Laboratories) были в возрасте 8 недель и имели диапазон веса тел (BW) 16,0-21,1 г в день 1 исследования. Животным давали ad libitum воду (обратный осмос 1 промилле Cl) и корм NIH 31 Modified and Irradiated Lab Diet^®, состоящий на 18,0% из неочищенного белка, 5,0% неочищенного жира и 5,0% неочищенного волокна. Мышей размещали на подложке Enrich-o’cobs^TM в статических микроизоляторах с 12-часовым световым циклом при 20-22°С (68-72°F) и влажности 40-60%. Все процедуры соответствуют рекомендациям Guide for Care and Use of Laboratory Animals относительно принуждения, бережливости, операций, регулирования корма и жидкостей и ветеринарной заботы.

Культура опухолевых клеток

[358] Клеточные линии лимфомы человека получали из различных источников (ATCC, DSMZ) и поддерживали в Пьемонте в виде суспензионных культур в питательной среде RPMI-1640, содержащей 100 единиц/мл натриевой соли пенициллина G, 100 г/мл стрептомицина и 25 г/мл гентамицина. Питательную среду обогащали 10%-ой фетальной бычьей сыворотки и 2 мМ глутамином. Клетки культивировали в колбах для выращивания культуры тканей в увлажненном термостате при 37°С в атмосфере 5% CO₂ и 95% воздуха.

In vivo имплантация опухоли

[359] Клеточные линии лимфомы человека собирали во время середины фазы логарифмического роста и повторно суспендировали в PBS с 50% Matrigel™ (BD Biosciences). Каждая мышь получала 1×10⁷ клеток (0,2 мл клеточной суспензии) подкожно в правый бок. Опухоли измеряли циркулем в двух направлениях, чтобы наблюдать рост, когда средний объем приближался к желаемому диапазону 80-120 мм³. Размер опухоли в мм³ вычисляли по:

где w = ширина и l = длина опухоли в мм. Масса опухоли может быть оценена, учитывая то, что 1 мг эквивалентен 1 мм³ объема опухоли. Через 10-30 дней (в зависимости от примененной клеточной линии) мышей с опухолями 108-126 мм³ сортировали в группы лечения со средними объемами опухоли 117-119 мм³.

Испытательные продукты

[360] Соединения формулы (IIa) хранили при комнатной температуре и защищали от света. В каждый день обработки получали свежие композиции соединения путем суспендирования порошков в 0,5% карбоксиметилцеллюлозе натрия (NaCMC) и 0,1% Tween® 80 в деминерализованной воде. Носитель соединения 44, 0,5% NaCMC и 0,1% Tween® 80 в деминерализованной воде применяли для лечения контрольных групп с теми же самыми режимами. Композиции хранили в темноте при 4°С до введения.

[361] Несколько химиотерапевтических агентов вводили параллельно с соединениями Epizyme. Циклофосфамид (Baxter, партия № 016591) разбавляли до 20 мг/мл стерильным солевым раствором и хранили при 4°С. Свежий раствор для дозирования получали для каждой дозы разведением солевым раствором. Доксорубицин (Doxorubicin Meiji®, Meiji Pharmaceutical Co. Ltd., 1 мг/мл) хранили при 4°С и разбавляли солевым раствором в каждый день введения. Винкристин (Hospira, Inc., 1 мг/мл) разбавляли солевым раствором в каждый день введения. Преднизон (Boehringer Ingelheim GmbH, 1 мг/мл) разбавляли PBS в начале каждого 5-дневного цикла дозирования.

Режим введения

[362] Мышей обрабатывали дозами соединений в пределах от 75 до 600 мг/кг и с режимами TID (3 раза в день каждые 8 ч), BID (два раза в день каждые 12 ч) или QD (один раз в день) для различного количества дней перорально с искуственным питанием или путем внутривенных, интраперитонеальных или подкожных инъекций. Каждую дозу вводили в объеме 0,2 мл/20 г мыши (10 мл/кг) и регулировали по последней зарегистрированной массе индивидуального животного. Максимальная длительность обработки составляла 28 дней.

Медианный объем опухоли (MTV) и анализ ингибирования роста опухоли (TGI)

[363] Эффективность лечения обработки определяли в последний день лечения. MTV (n), медианный объем опухоли для количества животных, n, оцениваемый в последний день, определяли для каждой группы. Ингибирование роста опухоли в процентах (% TGI) может быть определено несколькими путями. Во-первых, различие между MTV (n) обозначенной контрольной группой и MTV (n) группы с лечением лекарственным агентом выражено в виде процентной доли MTV (n) контрольной группы:

[364] Другим способом вычислить % TGI является взятие в расчет изменения размера опухоли со дня 1 до дня n, где n является последним днем лечения.

Анализ задержки роста опухолей

[365] Альтернативно, мышей оставляли в живых после последнего дня лечения для анализа задержки роста опухоли. Опухоли измеряли циркулем два раза в неделю, и каждое подопытное животное подвергали эвтаназии, когда его опухоль достигла конечного объема 2000 мм³ или в предварительно установленный последний день исследования, что наступало раньше. Время до конца исследования (TTE) для каждой мыши вычисляли из следующего уравнения:

где b представляет собой точку пересечения, и m - угол наклона прямой, полученной линейной регрессией log-трансформированных данных роста опухоли. Наборы данных были составлены из первого наблюдения, которое превышало конечный объем и три последовательных наблюдения, которые непосредственно предшествовали достижению конечного объема. Животным, у которых не достигался конечный объем, присваивали значение TTE, равное последнему дню (предварительно определенному) исследования. Любому животному, смерть которого классифицировалась как асоциированная с лечением (TR), присваивали значение TTE, равное дню смерти. Любое животное, смерть которого классифицировалась как неассоциированная с лечением (NTR), исключали из вычислений TTE и всех последующих исследований.

[366] Способ лечения определяли из задержки роста опухоли (TGD), определяемой как увеличение в медианном TTE в группе лечения по сравнению с контрольной группой:

выраженное в днях или в виде процентной доли от среднего TTE контрольной группы:

где:

T = медианное TTE для группы лечения

С = медианное TTE для контрольной группы

Токсичность

[367] Животных ежедневно взвешивали в течение дней 1-5, и затем дважды еженедельно до завершения исследования. Мышей часто обследовали на явные признаки любого неблагоприятного побочного эффекта лечения, которые регистрировали. Приемлемую токсичность для максимальной переносимой дозы (MTD) определяли как среднюю в группе потерю BW менее 20% во время теста, и не более 10% летальности в результате TR смертельных случаев. Смерть классифицировали как TR, если она имела отношение к побочным эффектам лечения, о чем свидетельствовали клинические признаки и/или вскрытие, или по неизвестным причинам во время периода дозирования. Смерть классифицировали как NTR, если были свидетельства того, что смерть не была связана с побочными эффектами лечения. Смертельные случаи NTR во время интервала дозирования, как правило, категоризировались как NTRa (из-за случайности или ошибки человека) или NTRm (из-за подтвержденного вскрытием распространения опухоли инвазией и/или метастазом). Животные, принимавшие лечение пероральным путем, которые умирают по неизвестным причинам во время периода дозирования, могут быть классифицированы как NTRu, когда общая картина в группе и вскрытие не поддерживают по классификации вариант TR, а выявить ошибку в дозировании невозможно.

Осуществление отбора образцов

[368] В некоторые дни во время исследования у мышей отбирали образцы предопределенным способом. Осуществление отбора образцов включало нетерминальный выпуск крови (0,25 мл) и челюстной вены без анестезии и полнообъемный забор крови через терминальную кардиальную пункцию под анестезией CO₂. Образцы крови перерабатывали с получением плазмы с K2-ЭДТА в качестве антикоагулянта. Образцы плазмы замораживали при -80°С и хранили до биоанализа уровней соединений.

[369] Опухоли собирали у указанных мышей в условиях без РНКазы и делили пополам. Слой толщиной 2 мм из одной половины каждой опухоли фиксировали в формалине на 24 часа и переносили в 70%-ый этанол. Фиксированные опухолевые ткани заливали парафином. Оставшиеся опухолевые ткани из каждого животного быстро замораживали в жидком N₂ и измельчали в ступке с пестиком.

[370] У указанных мышей отбирали образцы суррогатных тканей, включая селезенку, кожу, костный мозг и усы. Каждую ткань отделяли фиксировали и/или быстро замораживали.

Статистические и графические исследования

[371] Все статистические и графические исследования проводили при помощи Prism 3.03 (GraphPad) для Windows. Применяли несколько способов анализа. Медианные объемы опухолей D29 сравнивали тестом Краскела-Уоллиса и апостериорным критерием множественного сравнения Данна. Эти тесты проводили три раза.

[372] Двусторонние статистические анализы проводили при P=0,05. Prism выдает результаты как незначимые (ns) при P>0,05, значимые (символизируется «*») при 0,01<P<0,05, сильно значимые («**») при 0,001<P<0,01 и весьма значимые («***») при P>0,001.

[373] Чтобы протестировать статистическую значимость различий между контрольной группой и группой с лечением по всему периоду лечения применяли либо тест повторных измерений ANOVA с последующим апостериорным критерием множественных сравнений Даннета, либо двухфакторный дисперсионный анализ.

[374] Для графический представлений создавали диаграмму «коробки с усами», чтобы показать распределение индивидуальных объемов опухолей в каждой группе. Коробка представляет наблюдения в диапазоне квантилей 25-75, горизонтальная линия соответствует значению медианы, и «усы» показывают максимальные и минимальные значения. Медиана или среднее значение (±SEM) объема опухолей изображали в виде графика полулогарифмических или прямоугольных координатах как функцию от времени. Среднее значение изменения BW в группе во время исследования откладывали на графике как процентное изменение ±SEM от D1.

[375] Точечный график создавали, чтобы показать значения TTE по группам. TTE график включает смертельные случаи NTR, которые исключены из всех других графических результатов анализов. Когда животное выходило из исследования из-за размера опухоли, итоговый объем опухоли, зарегистрированный для животного, включали вместе с данными, примененными для вычисления среднего объема в последующие моменты времени. Процент животных в каждой группе, остававшихся в исследовании со временем, представляли на графике выживания Каплана-Мейера.

Экстракция гистона

[376] Для выделения гистонов 60-90 мг опухолевой ткани гомогенизировали в 1,5 мл буфера для экстракции ядер (10 мм Трис-HCl, 10 мМ MgCl₂, 25 мМ KCl, 1% Triton X-100, 8,6% сахарозы, плюс планшет ингибитора протеазы 1836145 Roche) и инкубировали на льду в течение 5 минут. Ядра собирали центрифугированием при 600 g в течение 5 минут при 4°С и промывали один раз PBS. Надосадочный раствор удаляли, и гистоны экстрагировали в течение одного часа с интенсивным перемешиванием на вортексе каждые 15 минут 0,4 н. холодной серной кислотой. Экстракты очищали центрифугированием при 10000 g в течение 10 минут при 4°С и переносили в свежий микроцентрифужный стакан, содержащий 10-кратный объем ледяного ацетона. Гистоны осаждали при -20°С в течение 2 часов - в течение ночи, таблетировали центрифугированием при 10000 g в течение 10 минут и повторно суспендировали в воде.

ELISA

[377] Гистоны экстрагировали из образцов опухолей как описано выше. Гистоны получали в эквивалентных концентрациях в буфере для иммобилизации (PBS+0,05%BSA), с выходом 0,5 нг/мкл образца, и 100 мкл образца или стандарта добавляли в двухкратной повторности в два 96-луночных планшета ELISA (Thermo Labsystems, Immulon 4HBX #3885). Планшеты герметично закрывали и инкубировали в течение ночи при 4°С. На следующий день планшеты промывали 3×300 мкл/лунка PBST (PBS+0,5% твин 20; 10×PBST, KPL № 51-14-02) на устройстве для мойки планшетов Bio Tek. Планшеты заливали 300 мкл/лунка растворителя (PBS+2%BSA+0,05% твин 20), инкубировали при комнатной температуре в течение 2 часов и промывали 3-кратным объемом PBST. Все антитела разбавляли разбавителем. 100 мкл/лунка анти-H3K27me3 (CST № 9733, 50% маточный раствор глицерина 1:1000) или анти-total H3 (Abcam ab1791, 50% глицерин 1:10000) добавляли в каждый планшет. Планшеты инкубировали в течение 90 минут при комнатной температуре и промывали 3-кратным объемом PBST. 100 мкл/лунка анти-Rb-IgG-HRP (Cell Signaling Technology, 7074) добавляли 1:2000 в планшет H3K27Me3 и 1:6000 в планшет H3 и инкубировали в течение 90 минут при комнатной температуре. Тарелки промывали 4-кратным объемом PBST. Для обнаружения добавляли 100 мкл/лунка TMB субстрата (BioFx Laboratories, № TMBS) и тарелки, инкубированные в темноте при комнатной температуре в течение 5 мин. Реакцию останавливали добавлением 100 мкл/лунка 1 н. H₂SO₄. Поглощение света при 450 нм считывали на микропланшетном ридере SpectaMax M5.

Исследование эффективности действия в модели ксенотрансплантата SUDHL6

[378] Эффект лечения соединением 44 и в комбинации с CHOP на ингибирование роста опухоли in vivo определяли в модели ксенотрансплантата SUDHL6. Сравнением роста опухоли и уровня выживаемости установлено, что введение соединения 44 и CHOP ингибирует или задерживает рост опухоли и увеличивает выживаемость онкологических мышей. Бестимусным мышам подкожно вводили 1×10⁷ клеток лимфомы человека SUDHL6. Соединение 44 вводили один раз в день (QD), два раза в день (BID) или три раза в день (TID) в указанных концентрациях (75 мг/кг, 150 мг/кг или 225 мг/кг). Мыши получали CHOP в дни 1 и 8. Объем опухоли измеряли два раза в неделю до конечно результата на 60 день или когда объем опухоли достигал 2000 мм³, что бы ни наступало первым.

[379] Комбинированная терапия соединением 44 и CHOP показала ингибирование роста опухоли в течение лечения (28 дней) по сравнению с мышами получавшими только CHOP или соединение 44 в отдельности (Фиг. 6A). Важно что, мыши, проходившие лечение комбинированной терапией соединением 44 и CHOP, демонстрировали устойчивую регрессию размера опухоли; 7 из 12 мышей продемонстрировали полный ответ в день 60 при 225 мг/кг BID и группе комбинации CHOP (Фиг. 6A). Строили кривую Каплана-Мейера, чтобы показать выживаемость мышей в исследовании. 57% мышей, которые получали комбинированную терапию соединением 44 и CHOP, остались в живых через 60 дней после инъекции (Фиг. 6B). Эффективность действия одиночного агента в виде соединения 44 не наблюдалась в течение 28-дневного лечения, однако высокая внутригрупповая вариабельность могла скрыть эффект лечения соединением 44 в качестве единственного агента.

Исследование эффективности действия в модели ксенотрансплантата WSU-DLCL2

[380] Эффект лечения соединением 44 и в комбинации с CHOP на ингибирование роста опухоли in vivo определяли в модели ксенотрансплантата WSU-DLCL2. Сравнением роста опухолей установлено, что введение соединения 44 и CHOP ингибирует или задерживает рост опухоли у онкологических мышей. Мышам SCID подкожно вводили 1×10⁷ клеток лимфомы человека WSU-DLCL2. Соединение 44 вводили один раз в день (QD), два раза в день (BID) или три раза в день (TID) в указанных концентрациях (150 мг/кг, 225 мг/кг, 300 мг/кг или 600 мг/кг). Мыши получали CHOP в дни 1 и 22 (CHOP в дни 1 и 8 не были перенесены мышами SCID). Объем опухоли измеряли два раза в неделю до конечного объема до 28 дня.

[381] Терапия соединением 44 в отдельности и в комбинации с CHOP приводила к ингибированию роста опухоли (Фиг. 7A). Введение 150 мг/кг три раза в день (TID) и 225 мг/кг два раза в день (BID) соединения 44 в качестве единственного агента приводило к значимо меньшими опухолями по объему по сравнению с контрольными мышами, получавшими только носитель (p<0,05). Кроме того, комбинированная терапия соединением 44 и CHOP показала статистически значимое ингибирование роста опухоли по сравнению с контрольными мышами, получавшими только носитель (p<0,001). Статистические критерии вычисляли с применением анализа повторных измерений ANOVA с последующими апостериорным тестом Даннетта. Вычисляли ингибирование роста опухоли, проявляя то, что лечение опухолей соединением 44 приводило к большему ингибированию роста опухоли при всех дозировках (таблица 2). Важно, лечение комбинацией соединения 44 с CHOP, приводило к самому большому ингибированию роста опухоли.

Таблица 2
Ингибирование роста опухоли (TGI) в модели ксенотрансплантата WSU-DLCL2
Группа	% TGI в день 1	% TGI в день 7
150 мг/кг TID	73	86
225 мг/кг BID	71	80
300 мг/кг BID	57	67
600 мг/кг QD	58	70
CHOP комбо	93	100
CHOP	45	51

[382] Чтобы исследовать поглощение и распределение введенных агентов проводили фармакокинетический анализ для определения концентрации соединения 44 (нг/мл) в плазме онкологических мышей (Фиг. 7B). Образцы плазмы отбирали на 28 день за 5 минут до введения последней дозы («trough») и через 3 часа после последней дозы («post»). Образцы плазмы анализировали при помощи ЖХ-МС/МС, чтобы определить концентрации соединения 44 (нг/мл). Уровни соединения 44 не были достоверно различными между мышами, которые получали 225 мг/кг соединения 44 два раза в день (BID) в качестве единственного агента и 225 мг/кг соединения 44 (BID) с CHOP в момент времени за 5 минут до введения последней дозы. Однако, через 3 часа после введения последней дозы уровни соединения 44 были значительно увеличены у мышей, которые получали 225 мг/кг соединения 44 два раза в день (BID) с CHOP по сравнению с соединением 44 в качестве единственного агента.

[383] Также проводили фармакокинетический анализ, чтобы определить концентрации соединения 44 (нг/г) в опухолевых тканях, собранных у мышей на 28 день через 3 часа после последнего введения лекарственного средства (Фиг. 7С).

[384] Эффективность целевого ингибирования in vivo определяли анализом статуса метилирования гистона в опухолях после 28 дней лечения. Вестерн-блот-анализ (Фиг. 8A) продемонстрировал, что метилирование H3K27 ингибировалось соединением 44 при всех дозировках и режимах дозирования в опухолях WSU-DLCL2. Гистоны экстрагировали так, как описано выше. Концентрации белка в экстрагированных кислотой гистонах определяли анализом BCA (Pierce). 400-800 нг каждого лизата фракционировали на 10-20% геле Трис-глицина (Biorad), переносили с применением iBlot (7 минут на программе 3, с применением нитроцеллюлозных стеков для переноса), и отбирали образцы со следующими антителами в блокирующем буфере Odyssey: анти-H3K27me3 кролика (CST 9733; разведение 1:20000) и анти-Total H3 мыши (CST 3638; разведение 1:20000). После инкубации первичного Ab образцы мембраны отбирали с IRDye 800CW Donkey-anti-mouse IgG (LiCOR № 926-32212) и Alexa Fluor 680 goat-anti-rabbit IgG (Invitrogen № A-21076), вторичный Ab и получали изображения с применением системы LiCOR Odyssey. Сигнал от общего белка гистона H3 служил контролем.

[385] Анализ метилирования гистона в опухолях WSU-DLCL2 при помощи ELISA подтвердил, что метилирование гистонов ингибировалось соединением 44 при всех дозировках и режимах дозирования (Фиг. 8B). Опухоли из мышей, которые получали носитель или CHOP, не проявляли ингибирования метилирования в H3K27. Гистоны экстрагировали из опухолей через 28 дней лечения и анализировали при помощи ELISA как описано выше.

Исследование эффективности действия в модели ксенотрансплантата SUDHL10

[386] Эффект лечения соединением 44 и в комбинации с COP (циклосфосфамид, онковин [винкристин] и преднизон) на ингибирование роста опухоли in vivo определяли в модели ксенотрансплантата SUDHL10. Сравнением роста опухолей установили, что введение соединения 44 и COP ингибирует или задерживает рост опухолей у онкологических мышей. Мышам SCID подкожно вводили 1×10⁷ клеток лимфомы человека SUDHL10. Соединение 44 вводили два раза в день (BID) или три раза в день (TID) в указанных концентрациях (125 мг/кг, 250 мг/кг или 500 мг/кг). Мыши получали COP в дни 1 и 22 (CHOP в дни 1 и 8 не были перенесены мышами SCID). Объем опухоли измеряли два раза в неделю до конечного результата до 28 дней. Половину когорты подвергали эвтаназии через 28 дней лечения, в то время как другую половину анализировали до конечного объема до 60 дней для анализа задержки роста опухоли.

[387] Фиг. 9A показывает, что введение соединения 44 в отдельности в качестве единственного агента показало статистически значимое ингибирование роста опухоли при 250 мг/кг и 500 мг/кг при введении два раза в день (BID) по сравнению с контрольными мышами, получавшими только носитель в качестве лечения (p<0,001). Кроме того, комбинированная терапия соединением 44 при 250 мг/кг два раза в день (BID) и COP показала статистически значимое ингибирование роста опухоли по сравнению с контрольными мышами, получавшими только носитель в качестве лечения (p<0,001). Статистические критерии вычисляли с применением анализа повторных измерений ANOVA с последующим апостериорным тестом Дaннeтa. Одну мышь в группе BID с дозой 500 мг/кг подвергли эвтаназии в день 15 из-за плохого состояния тела. Мыши, получавшие комбинированную терапию соединением 44 и COP, демонстрировали 8%-ую потерю массы тела в день 25, когда дозирование останавливали, но возобновили в день 27. В день 29, 1/16 мышь и 2/15 мыши были без опухоли в группах с дозами 500 мг/кг и 250 мг/кг. Поразительно, 10/14 мышей, получавших комбинированную терапию соединением 44 и СOP, были без опухолей в день 29.

[388] Ингибирование роста опухолей также вычисляли, выявляя то, что лечение опухолей ксенотрансплантата SUDHL10 соединением 44 с или без COP приводило к эффективному ингибированию роста опухоли при всех дозировках (таблица 3).

Таблица 3
Ингибирование роста опухоли (TGI) в модели ксенотрансплантата SUDHL10
Группа	% TGI в день 1	% TGI в день 7
125 мг/кг BID	54	57
250 мг/кBID	101	113
500 мг/кBID	104	115
COP	42	43
COP комбо	107	108

[389] Опухоли взвешивали после эвтаназии мышей на 28 день (Фиг. 9B). Опухоли из мышей, принимавших в качестве единственного агента соединение 44 в дозе 125 мг/кг или COP, были значительно меньше по сравнению с контрольными мышами (носитель). Опухоли из мышей, получавших комбинированную терапию соединением 44 и COP, были значительно меньше, чем опухоли из мышей, получавших соединение 44 в качестве единственного агента в дозах 500 мг/кг и 250 мг/кг.

[390] Половину когорты сохраняли до дня 60 для определения эффективности лечения путем определения задержки роста опухолей (Фиг. 9С). Рост опухолей в мышах, получавших дозы 500 мг/кг и 250 мг/кг соединения 44 в качестве единственного агента, показал небольшие опухоли на 28 день, в то время как контрольные мыши и мыши, которые получали COP, продемонстрировали большие опухоли, где опухоли продолжали расти после дня 28. Поразительно, мыши, получавшие комбинированную терапию, не только имели меньшие опухоли, чем все другие группы лечения, но также и показали значительную и устойчивую задержку роста опухолей.

[391] Фиг. 9D показывает кривую Каплана-Мейера, изображающую выживаемость мышей, получавших соединением 44 в отдельности или в комбинации с COP. Введение соединения 44 в качестве единственного агента в дозе 125 мг/кг, 250 мг/кг и 500 мг/кг, увеличивало выживаемость мышей по сравнению с контрольными мышами или мышами, получавшими только COP. Важно, объединенное введение соединения 44 с COP повышало выживаемость мышей по сравнению с введением единственного агента.

[392] Фармакокинетика и фармакодинамические исследования проводили на модели ксенотрансплантата SUDHL10. Фиг. 10A показывает фармакокинетический анализ уровней концентраций соединения 44 в плазме (нг/мл). Образцы плазмы получали из онкологических мышей на 28 день или за 5 минут до введения последней дозы («trough») или через 3 часа после введения последней дозы («post»). Уровни содержания соединения 44 определяли при помощи ЖХМС. Фармакодинамический анализ проводили при помощи ELISA и путем определения соотношения триметилированного H3K27 в образцах опухолей. Фармакодинамический анализ также проводили в других тканях, специфически, в селезенке и костном мозге онкологических мышей, чтобы показать эффективность ингибирования метилирования гистона соединением 44 в нормальных тканях суррогатной мыши (Фиг. 10B и 10С).

[393] Пример 7: Синергические эффекты комбинированной терапии с соединением 44 и противораковыми агентами

[394] Способы

[395] Клеточные линии лимфомы человека WSU-DLCL2 (DSMZ; ACC 575), SU-DHL-10 (DSMZ; ACC 576) и Toledo (ATCC; CRL-2631) получали из указанных источников и поддерживали в среде RPMI-1640, обогащенной добавлением 10%-20% термоинактивированной фетальной бычьей сыворотки и 2 мМ глутамина. Клетки культивировали в колбах для выращивания культуры тканей в увлажненном термостате при 37°С в атмосфере 5% CO₂ и 95% воздуха. WSU-DLCL2 и SU-DHL-10 содержат мутацию Y641 EZH2, и клеточная линия Toledo содержит EZH2 дикого типа.

[396] Исследовали in vitro антипролиферативные эффекты комбинации соединения 44 со следующими лекарственными препаратами: AraC, цисплатин, децитабин, дексаметазон, эверолимус, преднизолон и доксорубицин. WSU-DLCL2, SU-DHL-10 или клетки лимфомы человека Toledo обрабатывали увеличивающимися концентрациями соединения 44 в колбах. Через 4 дня обработки клетки WSU-DLCL2 или SU-DHL-10 дробили до исходной посевной плотности и высевали в 96-луночный планшет для клеточной культуры с каждой концентрацией соединения 44 в одном ряду планшета. Через 6 дней клетки Toledo дробили до исходной посевной плотности и высевали в 96-луночный планшет для клеточной культуры с каждой концентрацией соединения 44 в одном ряду планшета. Затем в планшет добавляли увеличивающиеся дозы лекарственных препаратов. Одна доза на столбец, образуя матрицу доз соединения 44 и дозы лекарственного препарата. После инкубирования в течение дополнительных 3 дней измеряли жизнеспособность клеток WSU-DLCL2 или SU-DHL-10 с применением реагент Promega Cell Titer-Glo с последующим хемолюминесцентным обнаружением. После инкубирования в течение дополнительных 5 дней измеряли жизнеспособность клеток Toledo с применением реагента Promega Cell Titer-Glo с последующим хемолюминесцентным обнаружением.

[397] Анализ данных

[398] Синергию определяли с применением пакета программ Сalcusyn от Biosoft на основе метода Chou-Talalay для комбинаций лекарств, в котором применяется уравнение среднего эффекта (Сhou 2006). Во-первых, исходные значения люминесценции преобразовывали в процентное ингибирование, или подверженную фракцию (Fa) вычисляли с применением контролей для максимального ингибирования и ДМСО-обработанных клеток в качестве контроля для минимального ингибирования, расположенных на каждом планшете. Значения процентного ингибирования для каждого постоянного соотношения соединений в комбинациях вводили в Сalcusyn для определения значений индекса комбинаций. Значения индекса комбинации менее 1 указывают на синергию.

[399] Для испытательных соединений, которые не ингибировали жизнеспособность клеток на 50%, синергия не может быть определена с применением Сalcusyn. Вместо этого данные представляли в виде порядка сдвига IC₅₀ для IC₅₀ соединения 44. Альтернативно, если соединение 44 не имело эффекта, также как с клетками Toledo, приводили порядок сдвига IC₅₀ для лекарственного препарата вместо соединения 44.

[400] Результаты

[401] Обработка клеток WSU-DLCL2 и SU-DHL-10 соединением 44 и как с AraC, цисплатином, доксорубицином, децитабином, так и с эверолимусом продемонстрировала синергическое снижение жизнеспособности клеток. Значения индекса комбинации для комбинаций с соединением 44 и децитабином в клетках WSU-DLCL2 и SU-DHL-10 были ниже 0,1, что обозначает очень сильный синергизм согласно характеристике Chou-Talalay (Сhou 2006). Значения индекса комбинации для комбинаций с соединением 44 и эверолимусом в клетках WSU-DLCL2 были ниже 0,1 и в клетках SU-DHL-10 они составляли между 0,1-0,3, что обозначает очень сильный синергизм и сильный синергизм, соответственно. Комбинации с соединением 44 и или AraC, цисплатином или доксорубицином в клетках WSU-DLCL2 и SU-DHL-10 имели значения индекса комбинации между 0,3-0,7, что обозначает синергизм (Сhou 2006). Комбинация соединения 44 с преднизолоном усиливала потенциал действия соединения 44 7-кратно для клеток WSU-DLCL2 и 3-кратно для SU-DHL-10 при максимально дозе преднизолона. Дополнительно, комбинация с соединением 44 и дексаметазоном усиливала потенциал действия соединения 44 17-кратно для клеток WSU-DLCL2 и 3-кратно для клеток SU-DHL-10 при максимально дозе дексаметазона.

[402] Клеточная линия Toledo не показала чувствительности к соединению 44, и никакой выгоды от комбинации не было замечено, когда соединение 44 объединяли как с AraC, цисплатином, доксорубицин, децитабином, эверолимусом, преднизолоном, так и с дексаметазоном. Таким образом, похоже, что благоприятный эффект от комбинации, видимый в этих экспериментах, зависит от мутации EZH2.

[403]

Таблица 4
Список соединений и клеточных линий
	WSU	SUDHL10	Toledo
Преднизолон	7-кратное увеличение	3-кратное увеличение	Отсутствие усиления
Доксорубицин	Синергизм CI 0,3-0,7	Синергизм CI 0,3-0,7	Отсутствие усиления
Цисплатин	Синергизм CI 0,3-0,7	н.о.	Отсутствие усиления
AraC	Синергизм CI 0,3-0,7	Синергизм CI 0,3-0,7	Отсутствие усиления
Эверолимус	Очень сильный синергизм CI<0,1	Сильный синергизм CI 0,1-0,3	Отсутствие усиления
Децитабин	Очень сильный синергизм CI<0,1	Очень сильный синергизм CI<0,1	Отсутствие усиления
Дексаметазон	17-кратное увеличение	3-кратное увеличение	Отсутствие усиления

ВКЛЮЧЕНИЕ ПОСРЕДСТВОМ ССЫЛКИ

[404] Все публикации и патентные документы, приведенные в настоящем описании, включены в настоящее описание посредством ссылки, как если бы было указано, что каждая такая публикация или документ специфически и индивидуально включен в настоящее описание посредством ссылки. Цитата публикаций и патентных документов не подразумевает допущение того, что любое из них является предшествующей областью техники, и при этом не составляет какого-либо допущения относительно их содержания или даты. Настоящее изобретение описано сейчас посредством письменного описания. Специалисты в области техники признают, что изобретение может быть применено на практике во множестве вариантов осуществления и что предшествующее описание и примеры, описанные выше, приведены только с целью иллюстрации, а не ограничения формулы изобретения, которая следует далее.

ЭКВИВАЛЕНТЫ

[405] Настоящее изобретение может быть осуществлено в других специфических формах, не отступая от его сущности или существенных характеристик. Поэтому предшествующие варианты осуществления нужно считать во всех отношениях иллюстративными, а не ограничивающими изобретение, приведенное в настоящем описании. Охват настоящего изобретения, таким образом, указан в приложенной формуле изобретения, а не в предшествующем описании, и предполагается, что все изменения, которые происходят в пределах значений и диапазона эквивалентности формулы изобретения, им охвачены.

1. Терапевтическая композиция для ингибирования метилтрансферазы гистона человека EZH2, содержащая N-(4,6-диметил-2-оксо-1,2-дигидропиридин-3-ил)метил)-5-(этил(тетрагидро-2H-пиран-4-ил)амино)-4-метил-4’-(морфолинометил)-[1,1’-дифенил]-3-карбоксамид или его фармацевтически приемлемую соль и один или более других терапевтических агентов, выбранных из противораковых агентов или глюкокортикоидов.

2. Композиция по п.1, в которой указанные один или более другие терапевтические агенты выбирают из преднизона, преднизолона, циклофосфамида, винкристина, доксорубицина, мафосфамида, цисплатина, AraС, эверолимуса, децитабина и дексаметазона или их комбинаций.

3. Композиция по п.1, в которой указанные один или более другие терапевтические агенты представляют собой преднизон.

4. Композиция по п.1, в которой указанные один или более другие терапевтические агенты представляют собой дексаметазон.

5. Фармацевтическая композиция для ингибирования метилтрансферазы гистона человека EZH2, содержащая терапевтически эффективное количество композиции по п.1 и фармацевтически приемлемый носитель.

6. Способ лечения или предотвращения рака или предракового состояния, включающий введение нуждающемуся в этом пациенту терапевтически эффективного количества композиции для ингибирования метилтрансферазы гистона человека EZH2 по п.1.

7. Способ по п.6, в котором на рак или предраковое состояние можно воздействовать изменением статуса метилирования гистонов, опосредованного по меньшей мере частично активностью EZH2.

8. Способ лечения или предотвращения рака, включающий введение пациенту терапевтически эффективной дозы ингибитора метилтрансферазы гистона человека EZH2 N-(4,6-диметил-2-оксо-1,2-дигидропиридин-3-ил)метил)-5-(этил(тетрагидро-2H-пиран-4-ил)амино)-4-метил-4’-(морфолинометил)-[1,1’-дифенил]-3-карбоксамида или его фармацевтически приемлемой соли одновременно или последовательно с одним или более другими терапевтическими агентами, выбранными из противораковых агентов и глюкокортикоидов.

9. Способ по п.8, в котором N-(4,6-диметил-2-оксо-1,2-дигидропиридин-3-ил)метил)-5-(этил(тетрагидро-2H-пиран-4-ил)амино)-4-метил-4’-(морфолинометил)-[1,1’-дифенил]-3-карбоксамид вводят до введения указанных одного или более других терапевтических агентов.

10. Способ по п.6, в котором композицию по п.1 вводят нуждающемуся в этом пациенту в дозировке от 0,01 мг/кг в сутки до приблизительно 1000 мг/кг в сутки.

11. Способ по п.8, в котором N-(4,6-диметил-2-оксо-1,2-дигидропиридин-3-ил)метил)-5-(этил(тетрагидро-2H-пиран-4-ил)амино)-4-метил-4’-(морфолинометил)-[1,1’-дифенил]-3-карбоксамид вводят в дозировке от 0,01 мг/кг в сутки до приблизительно 1000 мг/кг в сутки.

12. Способ по п.8, где каждый из указанных одного или более других терапевтических агентов вводят в дозировке от 0,01 мг/кг в сутки до приблизительно 1000 мг/кг в сутки.

13. Способ по п.6, в котором у указанного пациента экспрессируется мутант EZH2.

14. Способ по п.13, в котором указанный мутант EZH2 содержит одну или более мутаций, где мутация представляет собой замещение, точечную мутацию, нонсенс-мутацию, миссенс-мутацию, удаление или вставку.

15. Способ по п.13, в котором указанный мутант EZH2 содержит одну или более мутаций в своем домене субстрат-связывающего кармана, как определено в SEQ ID NO:6.

16. Способ по п.13, в котором указанный мутант EZH2 представляет собой мутант Y641.

17. Способ по п.16, в котором указанный мутант Y641 выбран из Y641F, Y641H, Y641N и Y641S.

18. Способ по п.13, в котором мутант EZH2 имеет мутацию в положении аминокислоты 677, 687, 674, 685 или 641 SEQ ID NO:1.

19. Способ по п.13, в котором указанный мутант EZH2 содержит одну или более мутаций, выбранных из группы, состоящей из замещения глицина (G) на остаток аланина дикого типа (A) в положении аминокислоты 677 SEQ ID NO:1 (A677G); замещения валина (V) на остаток аланина дикого типа (A) в положении аминокислоты 687 SEQ ID NO:1 (A687V); замещения метионина (M) на остаток валина дикого типа (V) в положении аминокислоты 674 SEQ ID NO:1 (V674M); замещения гистидина (H) на остаток аргинина дикого типа (R) в положении аминокислоты 685 SEQ ID NO:1 (R685H); замещения цистеина (С) на остаток аргинина дикого типа (R) в положении аминокислоты 685 SEQ ID NO:1 (R685С); замещения серина (S) на остаток аспарагина дикого типа (N) в положении аминокислоты 322 SEQ ID NO:3 (N322S), замещения глутамина (Q) на остаток аргинина дикого типа (R) в положении аминокислоты 288 SEQ ID NO:3 (R288Q), замещения изолейцина (I) на остаток треонина дикого типа (T) в положении аминокислоты 573 SEQ ID NO:3 (T573I), замещения глутаминовой кислоты (E) на остаток аспарагиновой кислоты дикого типа (D) в положении аминокислоты 664 SEQ ID NO:3 (D664E), замещения глутамина (Q) на остаток аргинина дикого типа (R) в положении аминокислоты 458 SEQ ID NO:5 (R458Q), замещения лизина (K) на остаток глутаминовой кислоты дикого типа (E) в положении аминокислоты 249 SEQ ID NO:3 (E249K), замещения цистеина (С) на остаток аргинина дикого типа (R) в положении аминокислоты 684 SEQ ID NO:3 (R684С), замещения гистидина (H) на остаток аргинина дикого типа (R) в положении аминокислоты 628 SEQ ID NO:21 (R628H), замещения гистидина (H) на остаток глутамина дикого типа (Q) в положении аминокислоты 501 SEQ ID NO:5 (Q501H), замещения аспарагина (N) на остаток аспарагиновой кислоты дикого типа (D) в положении аминокислоты 192 SEQ ID NO:3 (D192N), замещения валина (V) на остаток аспарагиновой кислоты дикого типа (D) в положении аминокислоты 664 SEQ ID NO:3 (D664V), замещения лейцина (L) на остаток валина дикого типа (V) в положении аминокислоты 704 SEQ ID NO:3 (V704L), замещения серина (S) на остаток пролина дикого типа (P) в положении аминокислоты 132 SEQ ID NO:3 (P132S), замещения лизина (K) на остаток глутаминовой кислоты дикого типа (E) в положении аминокислоты 669 SEQ ID NO:21 (E669K), замещения треонина (T) на остаток аланина дикого типа (A) в положении аминокислоты 255 SEQ ID NO:3 (A255T), замещения валина (V) на остаток глутаминовой кислоты дикого типа (E) в положении аминокислоты 726 SEQ ID NO:3 (E726V), замещения тирозина (Y) на остаток цистеина дикого типа (С) в положении аминокислоты 571 SEQ ID NO:3 (С571Y), замещения цистеина (С) на остаток фенилаланина дикого типа (F) в положении аминокислоты 145 SEQ ID NO:3 (F145С), замещения треонина (T) на остаток аспарагина дикого типа (N) в положении аминокислоты 693 SEQ ID NO:3 (N693T), замещения серина (S) на остаток фенилаланина дикого типа (F) в положении аминокислоты 145 SEQ ID NO:3 (F145S), замещения гистидина (H) на остаток глутамина дикого типа (Q) в положении аминокислоты 109 SEQ ID NO:21 (Q109H), замещения цистеина (С) на остаток фенилаланина дикого типа (F) в положении аминокислоты 622 SEQ ID NO:21 (F622С), замещения аргинина (R) на остаток глицина дикого типа (G) в положении аминокислоты 135 SEQ ID NO:3 (G135R), замещения глутамина (Q) на остаток аргинина дикого типа (R) в положении аминокислоты 168 SEQ ID NO:5 (R168Q), замещения аргинина (R) на остаток глицина дикого типа (G) в положении аминокислоты 159 SEQ ID NO:3 (G159R), замещения цистеина (С) на остаток аргинина дикого типа (R) в положении аминокислоты 310 SEQ ID NO:5 (R310С), замещения гистидина (H) на остаток аргинина дикого типа (R) в положении аминокислоты 561 SEQ ID NO:3 (R561H), замещения гистидина (H) на остаток аргинина дикого типа (R) в положении аминокислоты 634 SEQ ID NO:21 (R634H), замещения аргинина (R) на остаток глицина дикого типа (G) в положении аминокислоты 660 SEQ ID NO:3 (G660R), замещения цистеина (С) на остаток тирозина дикого типа (Y) в положении аминокислоты 181 SEQ ID NO:3 (Y181С), замещения аргинина (R) на остаток гистидина дикого типа (H) в положении аминокислоты 297 SEQ ID NO:3 (H297R), замещения серина (S) на остаток цистеина дикого типа (С) в положении аминокислоты 612 SEQ ID NO:21 (С612S), замещения тирозина (Y) на остаток гистидина дикого типа (H) в положении аминокислоты 694 SEQ ID NO:3 (H694Y), замещения аланина (A) на остаток аспарагиновой кислоты дикого типа (D) в положении аминокислоты 664 SEQ ID NO:3 (D664A), замещения треонина (T) на остаток изолейцина дикого типа (I) в положении аминокислоты 150 SEQ ID NO:3 (I150T), замещения аргинина (R) на остаток изолейцина дикого типа (I) в положении аминокислоты 264 SEQ ID NO:3 (I264R), замещения лейцина (L) на остаток пролина дикого типа (P) в положении аминокислоты 636 SEQ ID NO:3 (P636L), замещения треонина (T) на остаток изолейцина дикого типа (I) в положении аминокислоты 713 SEQ ID NO:3 (I713T), замещения пролина (P) на остаток глутамина дикого типа (Q) в положении аминокислоты 501 SEQ ID NO:5 (Q501P), замещения глутамина (Q) на остаток лизина дикого типа (K) в положении аминокислоты 243 SEQ ID NO:3 (K243Q), замещения аспарагиновой кислоты (D) на остаток глутаминовой кислоты дикого типа (E) в положении аминокислоты 130 SEQ ID NO:5 (E130D), замещения глицина (G) на остаток аргинина дикого типа (R) в положении аминокислоты 509 SEQ ID NO:3 (R509G), замещения гистидина (H) на остаток аргинина дикого типа (R) в положении аминокислоты 566 SEQ ID NO:3 (R566H), замещения гистидина (H) на остаток аспарагиновой кислоты дикого типа (D) в положении аминокислоты 677 SEQ ID NO:3 (D677H), замещения аспарагина (N) на остаток лизина дикого типа (K) в положении аминокислоты 466 SEQ ID NO:5 (K466N), замещения гистидина (H) на остаток аргинина дикого типа (R) в положении аминокислоты 78 SEQ ID NO:3 (R78H), замещения метионина (M) на остаток лизина дикого типа (K) в положении аминокислоты 1 SEQ ID NO:6 (K6M), замещения лейцина (L) на остаток серина дикого типа (S) в положении аминокислоты 538 SEQ ID NO:3 (S538L), замещения глутамина (Q) на остаток лейцина дикого типа (L) в положении аминокислоты 149 SEQ ID NO:3 (L149Q), замещения валина (V) на остаток лейцина дикого типа (L) в положении аминокислоты 252 SEQ ID NO:3 (L252V), замещения валина (V) на остаток лейцина дикого типа (L) в положении аминокислоты 674 SEQ ID NO:3 (L674V), замещения валина (V) на остаток аланина дикого типа (A) в положении аминокислоты 656 SEQ ID NO:3 (A656V), замещения аспарагиновой кислоты (D) на остаток аланина дикого типа (A) в положении аминокислоты 731 SEQ ID NO:3 (Y731D), замещения треонина (T) на остаток аланина дикого типа (A) в положении аминокислоты 345 SEQ ID NO:3 (A345T), замещения аспарагиновой кислоты (D) на остаток аланина дикого типа (A) в положении аминокислоты 244 SEQ ID NO:3 (Y244D), замещения триптофана (W) на остаток цистеина дикого типа (С) в положении аминокислоты 576 SEQ ID NO:3 (С576W), замещения лизина (K) на остаток аспарагина дикого типа (N) в положении аминокислоты 640 SEQ ID NO:3 (N640K), замещения лизина (K) на остаток аспарагина дикого типа (N) в положении аминокислоты 675 SEQ ID NO:3 (N675K), замещения тирозина (Y) на остаток аспарагиновой кислоты дикого типа (D) в положении аминокислоты 579 SEQ ID NO:21 (D579Y), замещения изолейцина (I) на остаток аспарагина дикого типа (N) в положении аминокислоты 693 SEQ ID NO:3 (N693I) и замещения лизина (K) на остаток аспарагина дикого типа (N) в положении аминокислоты 693 SEQ ID NO:3 (N693K).

20. Способ по п.13, в котором у указанного мутанта EZH2 сдвиг рамки считывания в положении аминокислоты 730, 391, 461, 441, 235, 254, 564, 662, 715, 405, 685, 64, 73, 656, 718, 374, 592, 505, 730 или 363 SEQ ID NO:3, 5 или 21 или в соответствующем положении нуклеотида последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей SEQ ID NO:3, 5 или 21.

21. Способ по п.13, в котором у указанного мутанта EZH2 удалена глутаминовая кислота (E) и лейцин (L) в положениях аминокислоты 148 и 149 SEQ ID NO:3, 5 или 21.

22. Способ по п.13, в котором у указанного мутанта EZH2 есть нонсенс-мутация в положении аминокислоты 733, 25, 317, 62, 553, 328, 58, 207, 123, 63, 137 или 60 SEQ ID NO:3, 5 или 21.

23. Способ по п.6, в котором указанный пациент продемонстрировал устойчивость к любому из компонентов композиции по п.1 при его применении в качестве единственного агента.

24. Способ по п.8, в котором указанные один или более другие терапевтические агенты представляют собой преднизон или преднизолон.

25. Способ по п.8, в котором указанные один или более другие терапевтические агенты представляют собой дексаметазон.

26. Способ по п.8, в котором рак представляет собой лимфому, лейкоз или меланому.

27. Способ по п.26, в котором лимфома выбрана из группы, состоящей из неходжкинской лимфомы, фолликулярной лимфомы и диффузной В-крупноклеточной лимфомы.

28. Способ по п.26, в котором лейкоз представляет собой хронический миелогенный лейкоз (СML).

29. Способ по п.6, в котором предраковое состояние представляет собой миелодиспластический синдром (MDS, прежде известный как предлейкоз).

30. Способ ингибирования пролиферации раковой клетки, включающий приведение в контакт указанной раковой клетки с композицией по п.1.

31. Способ ингибирования пролиферации раковой клетки, включающий приведение в контакт указанной раковой клетки с N-(4,6-диметил-2-оксо-1,2-дигидропиридин-3-ил)метил)-5-(этил(тетрагидро-2H-пиран-4-ил)амино)-4-метил-4’-(морфолинометил)-[1,1’-дифенил]-3-карбоксамидом и одним или более другими терапевтическими агентами, выбранными из противораковых агентов или глюкокортикоидов, где N-(4,6-диметил-2-оксо-1,2-дигидропиридин-3-ил)метил)-5-(этил(тетрагидро-2H-пиран-4-ил)амино)-4-метил-4’-(морфолинометил)-[1,1’-дифенил]-3-карбоксамид и указанные другие терапевтические агенты вводят одновременно или последовательно.

32. Способ по п.31, в котором N-(4,6-диметил-2-оксо-1,2-дигидропиридин-3-ил)метил)-5-(этил(тетрагидро-2H-пиран-4-ил)амино)-4-метил-4’-(морфолинометил)-[1,1’-дифенил]-3-карбоксамид вводят до введения указанных одного или более других терапевтических агентов.

33. Способ по п.31, где указанные один или более другие терапевтические агенты представляют собой преднизон или преднизолон.

34. Способ по п.31, где указанные один или более другие терапевтические агенты представляют собой дексаметазон.