Способ количественного определения n-[3-(4-нитрофениламино)-индол-2-илметилен]аминогуанидина метансульфоната в плазме крови

Изобретение относится к медицине, а именно фармакологии и токсикологии, и может быть использовано для определения N-[3-(4-нитрофениламино)-индол-2-илметилен]аминогуанидина метансульфоната в плазме крови. Для этого образец экстрагируют ацетонитрилом с добавлением натрия хлорида. Затем препарат количественно определяют методом высокоэффективной жидкостной хроматографии на колонке ProntoSIL, 75х2,0 мм, 5 мкм в градиентном режиме элюирования, в качестве подвижной фазы А смеси используют 0,2 М раствор лития перхлората в 0,005 М растворе хлорной кислоты, в качестве подвижной фазы Б - ацетонитрил с последующим УФ-детектированием при длине волны 330 нм. Изобретение обеспечивает количественное определение N-[3-(4-нитрофениламино)-индол-2-илметилен]аминогуанидина метансульфоната в биологических средах. 1 ил., 6 табл., 2 пр.

 

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ

Изобретение относится к области медицины, а именно к фармакологии и токсикологии, и может быть использовано для определения N-[3-(4-нитрофениламино)-индол-2-илметилен]аминогуанидина метансульфоната в плазме крови.

ПРЕДШЕСТВУЮЩИЙ УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

Производное аминогуанидина - N-[3-(4-нитрофениламино)-индол-2-илметилен]аминогуанидина метансульфонат является действующим веществом разрабатываемого противовоспалительного средства для лечения воспалительных и дегенеративных заболеваний опорно-двигательного аппарата.

Одной из актуальных задач при создании нового лекарственного средства является проведение исследований фармакокинетики с целью оценки всасывания, распределения, метаболизма и экскреции. Для проведения исследований фармакокинетики требуется разработать биоаналитическую методику количественного определения действующего вещества в биологических средах, в частности в плазме крови.

В настоящее время не известно способов количественного определения N-[3-(4-нитрофениламино)-индол-2-илметилен]аминогуанидина метансульфоната в плазме крови и других биологических средах организма. Для поиска возможных прототипов проведен анализ сведений о методах определения веществ с подобной химической структурой, в частности - производных аминогуанидина и производных индола, используемых в качестве действующих веществ лекарственных средств.

Известен способ количественного определения аминогуанидина в плазме крови и других биологических образцах с использованием экстракции вещества из образцов трихлоруксусной кислотой, реакции с 6-метил-2-пиридин-карбоксальдегидом при температуре 95-100°С, и определением вещества методом ВЭЖХ с использованием в качестве подвижной фазы смеси ацетонитрил (15%) : метанол (10%) : 0,01 М гептансульфоната в растворе натри фосфорнокислого однозамещенного и УФ-детектированием при длине волны 302 нм [патент US 5108930, МПК G01N 33/00, опубл. 28.04.1992].

В качестве прототипа использован описанный ранее способ количественного определения производного индола-сертиндола (1-[-2-[4-[5-Хлор-1-(4-фторфенил)-1Н-индол-3-ил]-1-пиперидинил]этил]-2-имидазолидинона). Данный способ основан на методе ВЭЖХ с УФ-детектированием при длине волны 230 нм, с использованием в качестве подвижной фазы А-0,1% раствора кислоты трифторуксусной, фазы Б - ацетонитрила с градиентом концентраций 10-90% [Ремезова И.П. и соавт. Разработка методик обнаружения некоторых атипичных нейролептиков для целей химико-токсикологического анализа. Фармация и фармакология. 2014, №6 (7), С. 54-58].

СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Предлагаемое изобретение решает задачу разработки нового способа количественного определения действующего вещества противовоспалительного лекарственного средства - N-[3-(4-нитрофениламино)-индол-2-илметилен] аминогуанидина метансульфоната в плазме крови.

ОСУЩЕСТВЛЕНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Поставленная задача решается способом количественного определения N-[3-(4-нитрофениламино)-индол-2-илметилен]аминогуанидина метансульфоната в плазме крови, включающим экстракцию определяемого вещества ацетонитрилом с добавлением натрия хлорида с последующим определением его методом высокоэффективной жидкостной хроматографии с градиентным режимом элюирования с использованием в качестве подвижной фазы А - смеси 0,2 М раствора лития перхлората в 0,005 М растворе хлорной кислоты, подвижной фазы Б - ацетонитрила, с последующим УФ-детектированием при длине волны 330 нм.

Наиболее оптимальными, но не необходимыми хроматографическими условиями при этом являются:

Общее время анализа - 25 мин;
Колонка - колонка ProntoSIL, 75×2,0 мм, 5 мкм (ООО ИХ «ЭкоНова»);
Температура колонки - 35°С;
Скорость потока - 0,15 мл/мин;
Детектор - спектрофотометрический, 330 нм;
Объем пробы - 20 мкл.

Аналитическую длину волны подбирали по результатам анализа УФ-спектра N-[3-(4-нитрофениламино)-индол-2-илметилен]аминогуанидина метансульфоната (далее по тексту - субстанция LIS-M) в смеси ацетонитрил-ПФ А в соотношении (1:1) (Фиг. 1) и особенностей матрицы, в которой необходимо проводить количественное определение. На УФ-спектре субстанции LIS-M в области от 210 до 400 нм наблюдается 3 максимума поглощения - 230, 255 и 330 нм. 330 нм выбрана основной аналитической длиной волны, так как она является наиболее селективной и характеризуется практически полным отсутствием поглощения другими компонентами матрицы.

Отсутствие источников информации, содержащих ту же совокупность признаков, что и в разработанном способе, сообщает ему соответствие критерию «новизна».

Та же совокупность признаков позволяет получить новый непредсказуемый эффект - разработка высокоэффективного способа количественного определения в плазме крови нового лекарственного средства - N-[3-(4-нитрофениламино)-индол-2-илметилен]аминогуанидина метансульфоната и, таким образом, сообщает ему соответствие критерию «изобретательский уровень».

Проведение количественного определения нового лекарственного средства с использованием известного оборудования с помощью известных препаратов сообщает разработанному способу соответствие критерию «промышленная применимость».

Таким образом, разработанный способ соответствует всем 3 критериям охраноспособности изобретения и может быть квалифицирован как изобретение.

На Фиг. 1 представлен УФ-спектр субстанции LIS-M.

Пример 1. Подбор условий извлечения определяемого вещества

Для извлечения определяемого вещества из плазмы крови используется несколько подходов. Наиболее простой и быстрый способ пробоподготовки - осаждение белков органическими растворителями с последующим центрифугированием. Кратность разбавления образца при этом варьируется от 1 до 5, а степень извлечения определяемого вещества обычно находится в интервале 90-100%. После центрифугирования надосадочную жидкость (супернатант) вводят в хроматографическую систему. После осаждения белка в пробе остается большое количество компонентов, которые могут помешать при определении исследуемого вещества. Также при осаждении белков очень проблематично сконцентрировать образец, что не позволяет снизить предел обнаружения.

Другой метод подготовки проб - жидкостно-жидкостная экстракция. Данный метод удобно применять, если требуется концентрирование исследуемого вещества перед определением. Степень извлечения методом жидкостно-жидкостной экстракции составляет обычно 70-90% и при этом концентрацию определяемого ЛВ в инжектируемом образце можно повысить в 5-10 раз по сравнению с исходной пробой, что позволяет существенно снизить предел обнаружения. Таким образом, для проведения фармакокинетических исследований нового лекарственного средства LIS-M более оптимально использовать метод жидкостно-жидкостной экстракции.

Исходя из физико-химических свойств субстанции LIS-M были использованы два экстрагента: ацетонитрил и этилацетат.

Экстракция LIS-M из раствора этилацетатом

В 3 пластиковых центрифужных микропробирки типа «Эппендорф» вместимостью 2 мл помещали по 500 мкл раствора LIS-M, с содержанием 1 мкг/мл, прибавляли 50 мкл 20% раствора натрия гидроксида и перемешивали на встряхивателе типа «Vortex» при 3000 об/мин в течение 1 мин. Экстрагировали на встряхивателе типа «Vortex» при 3000 об/мин в течение 10 мин. Центрифугировали при 16060 g в течение 10 мин. Органический слой отбирали и упаривали под вакуумом при температуре 50°С до сухого остатка. К сухому остатку прибавили 500 мкл смеси ПФ А - ПФ Б в соотношении (1:1), перемешали на встряхивателе типа «Vortex» при 3000 об/мин в течение 10 мин.

Экстракция LIS-M из раствора ацетонитрилом

В 3 пластиковых центрифужных микропробирки типа «Эппендорф» вместимостью 2 мл помещали по 500 мкл раствора LIS-M, с содержанием 1 мкг/мл. Экстрагировали на встряхивателе типа «Vortex» при 3000 об/мин в течение 10 мин. Центрифугировали при 16060 g в течение 10 мин. Органический слой отбирали и упаривали под вакуумом при температуре 50°С до сухого остатка. К сухому остатку прибавили 500 мкл смеси ПФ А - ПФ Б в соотношении (1:1), перемешали на встряхивателе типа «Vortex» при 3000 об/мин в течение 10 мин.

Для определения степени извлечения полученные результаты сравнивали с аналитическим сигналом, полученным для раствора LIS-M, с содержанием 1 мкг/мл.

Результаты определения степени извлечения представлены в таблице 1.

Как видно из таблицы 1, наибольшая степень извлечения достигается ацетонитрилом. Таким образом, данный экстрагент можно использовать для экстракции LIS-M из биологических сред.

Были проведены валидационные тесты, в ходе которых не обнаружено отклонений от установленных критериев приемлемости.

Пример 2. Подтверждение точности.

Точность биоаналитической методики характеризуется близостью полученных с помощью нее значений к номинальным концентрациям аналита.

Точность внутри цикла.

Был проанализирован один аналитический цикл, состоящий из четырех уровней концентраций, по 5 образцов на каждом уровне. Уровни концентрации: 50 нг/мл (нижний предел количественного определения - НПКО), 150 нг/мл (тройная величина НПКО), 1000 нг/мл (50% диапазона калибровочной кривой - КК) и 1500 нг/мл (75% от верхнего диапазона калибровочной кривой).

Критерий приемлемости:

- отклонение среднего значения каждого уровня концентрации от номинального содержания должно быть в пределах 15% для всех уровней концентрации, кроме НПКО для которой допускается отклонение 20%.

Результаты определения точности представлены в таблице 2.

Отклонение от номинального значения средних значений рассчитанных концентраций находится в диапазоне от -6,11 до 2,82%, что удовлетворяет критерию приемлемости.

Точность между циклами

В течение не менее двух дней были проанализированы три аналитических цикла, состоящий из четырех уровней концентраций, по 5 образцов на каждом уровне. Уровни концентрации: НПКО, тройная величина НПКО, около 50% диапазона калибровочной кривой и не менее 75% от верхнего диапазона калибровочной кривой.

Критерий приемлемости:

Отклонение среднего значения каждого уровня концентрации от номинального содержания должно быть в пределах 15% для всех уровней концентрации, кроме НПКО для которой допускается отклонение 20%.

Результаты определения точности между циклами представлены в таблицах 3-6.

Отклонение от номинального значения средних значений рассчитанных концентраций для всех аналитических циклов находится в диапазоне от -4,13 до 2,82%, что удовлетворяет критерию приемлемости.

Как видно из приведенных примеров, предлагаемое изобретение позволяет получить необходимую и достоверную информацию о способе количественного определения N-[3-(4-нитрофениламино)-индол-2-илметилен]аминогуанидина метан-сульфоната в биологических средах.

Способ количественного определения N-[3-(4-нитрофениламино)-индол-2-илметилен] аминогуанидина метансульфоната в плазме крови, включающий экстракцию определяемого вещества ацетонитрилом с добавлением натрия хлорида с последующим разделением методом высокоэффективной жидкостной хроматографии на колонке ProntoSIL, 75×2,0 мм, 5 мкм с градиентным режимом элюирования с использованием в качестве подвижной фазы А смеси 0,2 М раствора лития перхлората в 0,005 М растворе хлорной кислоты, подвижной фазы Б - ацетонитрила, с последующим УФ-детектированием при длине волны 330 нм.



 

Похожие патенты:

Изобретение относится к диагностике, а именно к способу дифференциальной диагностики воспалительных заболеваний кишечника (ВЗК) у детей. Способ дифференциальной диагностики воспалительных заболеваний кишечника у детей, предусматривает определение уровня aнти-GP2 IgA-антител и уровня секреторных sIgA-антител в копроэкстракте обследуемого методом иммуноферментного анализа, сопоставление полученного значения соотношения GP2 IgA/sIgA с уровнем порогового критерия, равного 0,784, и при значении соотношения GP2 IgA/sIgA ниже 0,784 у обследуемого диагностируют воспалительное заболевание кишечника, а если рассчитанное значение соотношения GP2 IgA/ sIgA выше 0,784, у обследуемого исключают диагноз воспалительного заболевания кишечника.

Группа изобретений относится к биосенсорам для определения концентрации аналита в пробе жидкости. Тестовый сенсор для определения концентрации аналита в биологической жидкости содержит: сенсорную пластинку, включающую в себя зону приема жидкости и область вставки в порт; один или более контактов сенсора, расположенных в области вставки в порт; первый ряд оптически прозрачных и непрозрачных позиций, образующих кодовую комбинацию калибровки, расположенную в первой зоне области вставки в порт; и второй ряд оптически прозрачных и непрозрачных позиций, образующих кодовую комбинацию синхронизации, расположенную во второй зоне области вставки в порт, причем вторая зона отличается от первой зоны, так что один или более контактов сенсора расположены между первой зоной и второй зоной.

Изобретение относится к медицине, а более конкретно к лабораторной диагностике, и может быть использовано в амбулаторной и стационарной стоматологической практике.
Изобретение относится к медицине, а именно к лабораторной диагностике, и может быть использовано для оценки активности инфекционного процесса, вызванного неферментирующими грамотрицательными бактериями (НФГОБ) в бронхолегочной системе у пациентов с муковисцидозом.

Изобретение относится к области биотехнологии. Предложен способ детекции полинуклеотида или полинуклеотидной последовательности в образце.

Изобретение относится к сельскому хозяйству, а именно способу контроля инкубации птичьего эмбриона в яйце для получения выборки яиц путем определения пола, стадии развития и/или жизнеспособности птичьего эмбриона.

Группа изобретений относится к области измерения глюкозы. Система для измерения концентрации глюкозы содержит: биодатчик, включающий по меньшей мере два электрода с ферментом; и измерительный прибор, содержащий: устройство измерения температуры, микроконтроллер, соединенный с источником питания, памятью и множеством электродов биодатчика.

Изобретение относится к области медицины и представляет собой способ раннего обнаружения и диагностирования злокачественной опухоли в биологических образцах внеклеточных текучих веществ у субъектов без диабета, включающий стадии: a) определение уровня образования метилглиоксаля (МГ) в биологическом образце субъекта из внеклеточного текучего вещества; b) сравнение указанного уровня с уровнем МГ у субъектов без злокачественных опухолей (контрольное значение); где, если уровень образования МГ в указанных биологических образцах выше, чем указанное контрольное значение, то указанных субъектов считают страдающими злокачественной опухолью.

Изобретение касается способа контроля концентраций нескольких аналитов в пробе жидкости с использованием тест-элемента, выполненного для анализа пробы в отношении первого и второго аналитов, и портативного измерительного прибора, содержащего дисплей, процессор и запоминающее устройство и взаимодействующего с одним или несколькими тест-элементами для определения концентрации по меньшей мере первого и второго аналитов в пробе жидкости, нанесенной на указанный один или несколько тест-элементов, где первый аналит представляет собой гидроксибутират, а второй аналит представляет собой глюкозу.

Изобретение относится к области гигиены труда и медицины и раскрывает способ проведения радиационного контроля в случае ингаляционного поступления содержащих актиниды радиоактивных аэрозолей в организм персонала.

Настоящее изобретение относится к области иммунологии. Предложены способы очистки слитого белка.

Изобретение относится к соли бензолсульфоновой кислоты и 2-[(4S)-6-(4-хлорфенил)-1-метил-8-(метилокси)-4H-[1,2,4]триазоло[4,3-a][1,4]бензодиазепин-4-ил]-N-этилацетамида в кристаллической твердой форме, характеризующейся картиной дифракции рентгеновских лучей на порошке (XRPD), содержащей по меньшей мере три угла дифракции, выраженных в градусах 2θ, выбранных из группы, состоящей из примерно 5,5, 7,4, 9,1, 10,0, 10,4, 13,3, 13,6, 14,9, 18,7, 20,4, 20,9, 22,8 и 23,1° (±0,1°); и/или 13C спектром ядерного магнитного резонанса твердого тела (ттЯМР), содержащим по меньшей мере десять пиков, выраженных в виде химических сдвигов в млн-1, выбранных из группы, состоящей из пиков при примерно 169,6, 167,5, 165,6, 160,1, 159,4, 157,1, 155,9, 154,3, 152,4, 146,9, 145,8, 140,0, 137,9, 135,9, 133,4, 132,0, 130,6, 129,9, 128,3, 127,1, 125,6, 123,5, 120,6, 119,1, 114,1, 113,7, 58,0, 53,6, 53,1, 40,7, 37,0, 34,9, 15,8, 14,7 и 12,0 (±0,2 млн-1).

Изобретение относится к области органической химии, а именно к гетероциклическому соединению формулы (IIA) или его фармацевтически приемлемой соли, где Е обозначает -СН2-; Q обозначает -СН2-, -CH2O- или -СН2ОСН2-; Z обозначает водород или метил; R1 обозначает -SO2Ra, -CORd или -CO2Rd; или R1 обозначает C1-С6-алкил, эта группа необязательно может содержать один или три заместителя, независимо выбранных из галогена и С2-С6-алкоксикарбонила; R12 обозначает водород; R15 обозначает галоген; R16 обозначает галоген; Ra обозначает C1-С6-алкил и Rd обозначает трифторметил или C1-С6-алкил.

Изобретение относится к соединению, представленному формулой I, его энантиомерам, диастереомерам или фармацевтически приемлемым солям, которые обладают действием модулятора N-формил-пептидного рецептора 2.

Изобретение относится к новому соединению формулы (I) или его фармацевтически приемлемой соли, обладающими свойствами ингибитора LTA-4-гидролазы. Соединения могут найти применение для лечения заболевания и расстройства, которое облегчается посредством ингибирования активности LTA4-h.

Изобретение относится к области органической химии, а именно к производному 3Н-имидазо[4,5-с]пиридина формулы (IIA) или к его фармацевтически приемлемой соли, где Е обозначает -СН2-; Q обозначает -СН2- или -СН2О-; Z обозначает водород; или Z обозначает фенил или пиридинил, любая из этих групп необязательно может содержать один заместитель, выбранный из С1-С6-алкоксигруппы и аминокарбонила; R11 обозначает водород; R15 обозначает галоген или дифторметоксигруппу; и R16 обозначает галоген.

Изобретение относится к области органической химии, а именно к производному 5,6,7,8-тетрагидроимидазо[1,2-а]пиридина формулы (IIA) или к его фармацевтически приемлемой соли, где Е обозначает -СН2-; Q обозначает -СН2О-; Z обозначает (оксо)оксазолидинилфенил; R11 обозначает водород; R12 обозначает водород или галоген; R15 обозначает дифторметоксигруппу; и R16 обозначает водород.

Изобретение относится к области органической химии, а именно к гетероциклическому соединению формулы (IIB) или его фармацевтически приемлемой соли, где Е обозначает -СН2-; Q обозначает -СН2- или -СН2О-; Z обозначает водород или метил; V обозначает C-R22 или N; R15 обозначает галоген или дифторметоксигруппу; R16 обозначает водород или галоген; R21 обозначает гидроксигруппу, метоксигруппу, пиперазинил или морфолинил; R22 обозначает водород и R23 обозначает водород.

Изобретение относится к биотехнологии и решает задачу лечения заболеваний, в частности системной красной волчанки, фрагментом антитела, специфически связывающимся с CD154.

Настоящее изобретение относится к соединению формулы (I) или к его фармацевтически приемлемой соли, или к его энантиомерам, или к его диастереоизомерам, или к их смеси, обладающему способность ингибировать фосфоинозитид-3-киназу (PI3K), а также к фармацевтической композиции, содержащей соединение формулы (I) или его фармацевтически приемлемую соль.

Изобретение относится к медицине и может быть использовано для получения гелеобразной композиции крови человека, обогащенной высвобожденными факторами роста и тромбоцитами.

Изобретение относится к медицине, а именно фармакологии и токсикологии, и может быть использовано для определения N-[3--индол-2-илметилен]аминогуанидина метансульфоната в плазме крови. Для этого образец экстрагируют ацетонитрилом с добавлением натрия хлорида. Затем препарат количественно определяют методом высокоэффективной жидкостной хроматографии на колонке ProntoSIL, 75х2,0 мм, 5 мкм в градиентном режиме элюирования, в качестве подвижной фазы А смеси используют 0,2 М раствор лития перхлората в 0,005 М растворе хлорной кислоты, в качестве подвижной фазы Б - ацетонитрил с последующим УФ-детектированием при длине волны 330 нм. Изобретение обеспечивает количественное определение N-[3--индол-2-илметилен]аминогуанидина метансульфоната в биологических средах. 1 ил., 6 табл., 2 пр.

Наверх