Рекомбинантная плазмидная днк ptrx-tevrs-ртн, кодирующая гибридный белок, способный к протеолитическому расщеплению с образованием фрагмента эндогенного человеческого паратиреоидного гормона (1-34), штамм escherichia coli bl21(de3)/ptrx-tevrs-ртн - продуцент указанного белка и способ получения рекомбинантного pth (1-34)



Рекомбинантная плазмидная днк ptrx-tevrs-ртн, кодирующая гибридный белок, способный к протеолитическому расщеплению с образованием фрагмента эндогенного человеческого паратиреоидного гормона (1-34), штамм escherichia coli bl21(de3)/ptrx-tevrs-ртн - продуцент указанного белка и способ получения рекомбинантного pth (1-34)
Рекомбинантная плазмидная днк ptrx-tevrs-ртн, кодирующая гибридный белок, способный к протеолитическому расщеплению с образованием фрагмента эндогенного человеческого паратиреоидного гормона (1-34), штамм escherichia coli bl21(de3)/ptrx-tevrs-ртн - продуцент указанного белка и способ получения рекомбинантного pth (1-34)
Рекомбинантная плазмидная днк ptrx-tevrs-ртн, кодирующая гибридный белок, способный к протеолитическому расщеплению с образованием фрагмента эндогенного человеческого паратиреоидного гормона (1-34), штамм escherichia coli bl21(de3)/ptrx-tevrs-ртн - продуцент указанного белка и способ получения рекомбинантного pth (1-34)
Рекомбинантная плазмидная днк ptrx-tevrs-ртн, кодирующая гибридный белок, способный к протеолитическому расщеплению с образованием фрагмента эндогенного человеческого паратиреоидного гормона (1-34), штамм escherichia coli bl21(de3)/ptrx-tevrs-ртн - продуцент указанного белка и способ получения рекомбинантного pth (1-34)
C12N2330/51 - Микроорганизмы или ферменты; их композиции (биоциды, репелленты или аттрактанты или регуляторы роста растений, содержащие микроорганизмы, вирусы, микробные грибки, ферменты, агенты брожения или вещества, получаемые или экстрагируемые из микроорганизмов или из материала животного происхождения A01N 63/00; пищевые составы A21,A23; лекарственные препараты A61K; химические аспекты или использование материалов для бандажей, перевязочных средств, впитывающих подкладок или хирургических приспособлений A61L; удобрения C05); размножение, консервирование или сохранение микроорганизмов (консервирование живых тканей или органов людей или животных A01N 1/02); мутации или генная инженерия; питательные среды (среды для микробиологических испытаний C12Q)
C07K2319/35 - Пептиды (пептиды в пищевых составах A23, например получение белковых композиций для пищевых составов A23J, препараты для медицинских целей A61K; пептиды, содержащие бета-лактамовые кольца, C07D; циклические дипептиды, не содержащие в молекуле любого другого пептидного звена, кроме образующего их кольцо, например пиперазин-2,5-дионы, C07D; алкалоиды спорыньи циклического пептидного типа C07D519/02; высокомолекулярные соединения, содержащие статистически распределенные аминокислотные единицы в молекулах, т.е. при получении предусматривается не специфическая, а случайная последовательность аминокислотных единиц, гомополиамиды и блоксополиамиды, полученные из аминокислот, C08G 69/00; высокомолекулярные продукты, полученные из протеинов, C08H 1/00; получение

Владельцы патента RU 2700452:

Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова Российской академии наук (ИБХ РАН) (RU)

Изобретение относится к области биотехнологии, конкретно к рекомбинантному получению терапевтических белков и может быть использовано для получения активного фрагмента (1-34) эндогенного человеческого паратиреоидного гормона. Сконструирована рекомбинантная плазмидная ДНК pTrx-TEVrs-РТН, которая обеспечивает синтез гибридного белка, содержащего последовательность тиоредоксина и терипаратида в клетках Escherichia coli. Путём трансформации штамма E.coli BL 21(DE3) плазмидой pTrx-TEVrs-РТН получают штамм- продуцент гибридного белка Trx-TEVrs-РТН. Разработан способ получения рекомбинантного терипаратида, предусматривающий получение и культивирование продуцента гибридного белка, содержащего терипаратид, с последующим выделением и расщеплением указанного гибридного белка. Изобретение позволяет получить рекомбинантный терипаратид с высоким выходом и по упрощённой технологии. 4 н. и 3 з.п. ф-лы, 4 ил., 3 пр.

 

Изобретение относится к биотехнологии, в частности к генной и белковой инженерии. Оно может быть использовано для получения рекомбинантного фрагмента эндогенного человеческого паратиреоидного гормона PTH (1-34).

Активный фрагмент эндогенного человеческого паратиреоидного гормона PTH (1-34), так же известный как терипаратид, способен индуцировать образование костной ткани, что делает его эффективным при лечении остеопороза.

Фрагмент эндогенного человеческого паратиреоидного гормона РТН (1-34) представляет собой 34-членный пептид, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO 1.

Известен метод выделения РТН (1-34) из природного источника (Keutmann, H. T., Aurbach, G. D., Dawson, B. F., Niall, H. D., Deftos, L. J., and Potts, J. T., Jr. (1972) Biochemistry 10, 2779-2787). Недостаток данного метода заключается в небольших выходах продукта и невозможности масштабировать технологический процесс.

Известен химический способ получения PTH (1-34) посредством твердофазного пептидного синтеза /патент US4086196, C07К l4/635, опубл. 25.04.1978/. Недостатком такого метода является наличие продуктов близкородственных примесей, которые возникают в ходе твердофазного синтеза, что значительно усложняет процесс очистки РТН (1-34). Ко всему прочему, химический синтез требует использования сложновоспроизводимых и трудоёмких методов.

Наиболее перспективным, с точки зрения производства PTH(1-34), является применение методов рекомбинантных ДНК. Так, в источнике /патент CN1424325, C07H21/00, опубл.18.06.2003/ описан биотехнологический метод получения РТН(1-34), посредством его слияния с глутатион-S-трансферазой. Протеолитическое расщепление образовавшегося гибридного белка осуществляли тромбином, затем проводили очистку на аффинной колонке с химотрипсином и дальнейшее протеолитическое расщепление с помощью пролинэндопептидазы и дополнительную хроматографическую очистку. Использование аффинной хроматографии и двух протеиназ делает технологию нерентабельной, а также увеличивает трудозатраты.

Известен способ получения РТН (1-34) /патент РФ 2441019, C07K 1/36, опубл. 27.01.2012г./ в составе гибридного белка, который состоит из His-tag, фрагмента белка β-галактозидазы, сайта расщепления энтерокиназы и РТН (1-34). Недостатком данного метода является необходимость использования мочевины, поскольку гибридный белок продуцируется в виде тел включения. Также для очистки гибридного белка была использована аффинная хроматография, что делает процесс очистки нерентабельным.

Аналог, наиболее близкий к заявленному способу получения РТН (1-34), описан в работе (Fu, Xiang-Yang et al, Biotechnology Progress (2005), 21(5), 1429-1435), в котором РТН (1-34) получают в составе гибридного белка, состоящим из тиоредоксина и РТН (1-34). В процессе ферментации используют Тритон-Х 100 и термическую денатурацию, которая приводит к осаждению балластных белков. Нагревание проводят при 80°С в течение 15 минут. В данном способе белок инкубируют при высокой температуре, которая является нежелательной для белков и может привести к окислению метионинов, входящих в состав РТН (1-34).

Таким образом, техническая проблема, существующая при получении PTH (1-34) заключается в трудоемкости и сложности известных способов. Изобретение решает техническую проблему получения высокопродуктивного бактериального штамма-продуцента, позволяющего получать рекомбинантный РТН (1-34) с высоким выходом.

Техническим результатом заявленного изобретения является обеспечение выхода рекомбинантного РТН (1-34) до 5% относительно суммарного белка клетки при чистоте препарата не ниже 98%.

Для решения поставленной технической проблемы и заявленного технического результата предлагается гибридный белок Trx-TEVrs-РТН, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO 2, содержащий тиоредоксин, специфический сайт узнавания TEV-протеиназы, рекомбинантного РТН (1-34), имеющего аминокислотную последовательность SEQ ID NO 1.

Предлагается также рекомбинантная плазмидная ДНК pTrx-TEVrs-РТН для экспрессии гибридного белка Trx-TEVrs-РТН (SEQ ID NO 2), состоящая из HindIII/MscI-фрагмента ДНК плазмиды pET32a, содержащего:

- последовательность промотора T7 и оператора lacO;

- последовательность, кодирующую гибридный белок SEQ ID NO 2;

- ген β-лактамазы в качестве генетического маркера;

- последовательность, кодирующую точку начала репликации;

- ДНК фрагмент, кодирующий последовательность лактозного репрессора LacI.

Предлагается Штамм Escherichia coli BL 21(DE3)/pTrx-TEVrs-РТН, продуцирующий гибридный белок Trx-TEVrs-РТН (SEQ ID NO 2), содержащий рекомбинантую плазмиду ДНК pTrx-TEVrs-РТН. Указанный Штамм Escherichia coli получен путем трансформации клеток штамма Escherichia coli BL 21(DE3) рекомбинантной плазмидной ДНК pTrx-TEVrs-РТН по п.2.

Способ получения рекомбинантного PTH(1-34) (SEQ ID NO 1), включает в себя стадии:

- культивирования полученного штамма-продуцента Escherichia coli BL21(DE3)/ pTrx-TEVrs-РТН с получением биомассы клеток штамма-продуцента;

- выделения РТН(1-34) SEQ ID NO 1 из биомассы клеток штамма-продуцента.

На стадии выделения РТН(1-34) SEQ ID NO 1 осуществляют отделение гибридного белка в виде супернатанта, хроматографическую очистку гибридного белка, расщепление TEV-протеиназой, центрифугиование, отделение супернатанта и хроматографическую очистку РТН(1-34).

1. Конструируют экспрессионную плазмиду pTrx-TEVrs-РТН, содержащую гибридный ген, состоящий из слитых в рамке нуклеотидных последовательностей тиоредоксина, специфического сайта узнавания TEV-протеиназы (SEQ ID NO 3) и N-концевого фрагмента РТН (1-34).

2. Путем трансформации клеток штамма Escherichia coli BL21(DE3) плазмидной ДНК pTrx-TEVrs-РТН, получают штамм-продуцент гибридного белка Trx-TEVrs-PTH(1-34), состоящего из разделенных специфическим сайтом узнавания протеиназы вируса гравировки табака (TEV-протеиназой) тиоредоксина и РТН(1-34), накапливающегося в растворимой форме во время культивирования.

3. Клеточную биомассу разрушают в буферном растворе 50мМ Трис pH 8.5 в присутствии ингибиторов клеточных протеаз и отделяют осветленный клеточный лизат, содержащий гибридный белок Trx-TEVrs-PTH SEQ ID NO 2. Полученный осветлённый клеточный лизат наносят на анионообменную смолу и элюируют белок в градиенте соли.

Протеолитическое расщепление рекомбинантной TEV-протеиназой проводят в течение не менее 18 часов при комнатной температуре при рН 8.0-8.5 в присутствии дитиотреитола при соотношении фермент : белок 1:100.

Дальнейшую очистку целевого продукта проводят с помощью обращённо-фазовой высокоэффективной жидкостной хроматографии в градиенте этанола. Для удаления остаточного спирта проводят упаривание, объединённые фракции лиофилизуют. Идентичность полученного РТН (1-34) подтверждают с помощью масс-спектрометрии.

В связи с отсутствием у РТН (1-34) жёсткой третичной структуры, он является доступной мишенью для клеточных протеаз. Чтобы избежать с этим связанных трудностей, фрагмент эндогенного человеческого паратиреоидного гормона РТН (1-34) (SEQ ID NO 1) получают в составе гибридного белка, содержащего N-концевой тиоредоксин и специфический сайт узнавания протеазы вируса гравировки табака (TEV протеазы, ЕС 3.4.22.4). С этой целью получают рекомбинантную векторную плазмиду pTrx-TEVrs-РТН, содержащую гибридный ген, состоящий из слитых в рамке нуклеотидных последовательностей тиоредоксина и терипаратида, разделенных специфическим сайтом узнавания TEV-протеинаы (SEQ ID NO 3), при этом целевой ген РТН (1-34) амплифицировали с помощью ПЦР, используя плазмиду с искусственным геном РТН (1-34) в качестве матрицы. Полученным экспрессионным вектором трансформируют штамм Е. coli BL21(DE3) (New England Biolabs), получая штамм-продуцент гибридного белка Е. coli BL21(DE3)/pTrx-TEVrs-РТН. Выход РТН (1-34) высокой степени чистоты (98%) после обращённо-фазовой хроматографии достигает 5% относительно суммарного белка клетки.

В предлагаемом техническом решении используют штамм-продуцент Escherichia coli BL21 (DE3), содержащий плазмидную ДНК pTrx-TEVrs-PTH для суперпродукции гибридного белка Trx-TEVrs-PTH, содержащего последовательность тиоредоксина и РТН (1-34) человека.

Используют рекомбинантную плазмидную ДНК pTrx-TEVrs-PTH:

- кодирующую аминокислотную последовательность рекомбинантного

человеческого РТН (1-34);

- состоящую из SgrAI/XbaI-фрагмента ДНК плазмиды pET32a, содержащего последовательность промотора T7 и оператора lacO;

- содержащую последовательность, кодирующую гибридный белок SEQ ID NO 2, включающего в себя последовательность тиоредоксина, специфического сайта узнавания TEV-протеиназы и адаптированную к этим сайтам последовательность гена рекомбинантного человеческого терипаратида;

- содержащая в качестве генетического маркера ген β-лактамазы, детерминирующий устойчивость трансформированных плазмидой pTrx-TEVrs-РТН клеток Е.coli к пенициллиновым антибиотикам; последовательность, кодирующую точку начала репликации; ДНК фрагмент, кодирующий последовательность лактозного репрессора LacI.

Конструкция рекомбинантной плазмидной ДНК pTrx-TEVrs-РТН обеспечивает высокий уровень экспрессии клонированного в ней гена гибридного белка Trx-TEVrs-РТН, содержащего на 5'-конце ген тиоредоксина, соединенного с геном сайта узнавания TEV-протеиназы и РТН (1-34). Для конструирования плазмиды используют химический подход, позволяющий использовать для экспрессии клонированного структурного гена оптимальные регуляторные элементы, контролирующие его экспрессию.

Последовательность TEVrs-PTH получают химическим синтезом.

Концевые его участки, содержащие соответствующие вектору сайты узнавания эндонуклеаз рестрикции вводят с помощью ПЦР с синтетическими олигонуклеотидными праймерами А1 и В1 (SEQ ID NO 4), и затем последовательность клонируют в векторную плазмиду pET32a.

Предлагаемый штамм-продуцент Escherichia coli BL21 (DE3)/pTrx-TEVrs-РТН характеризуется следующими признаками:

Морфологические признаки. Клетки палочковидной формы, грамотрицательные, неспороносные.

Культуральные признаки. Клетки хорошо растут на простых питательных средах. При росте на агаризованной среде "Дифко" – колонии круглые, гладкие, мутные, блестящие, серые, край ровный.

Физико-биологические признаки. Клетки растут при температуре от 4°С до 40°С при оптимальном значении рН от 6,8 до 7,5. В качестве источника азота используют как минеральные соли в аммонийной форме, так и органические соединения в виде пептона, триптона, дрожжевого экстракта, аминокислот и т.д. В качестве источника углерода используют аминокислоты, глицерин, углеводы.

Устойчивость к антибиотикам. Клетки проявляют устойчивость к пенициллиновым антибиотикам (до 500 мкг/мл).

Штамм-продуцент Е.coli BL21 (DE3)/pTrx-TEVrs-РТН отличается от штамма-реципиента Е.coli BL21 (DE3) только наличием рекомбинантной плазмидной ДНК pTrx-TEVrs-РТН, которая и придаёт ему устойчивость к пенициллиновым антибиотикам.

Штаммы-продуценты получают путем трансформации компетентных клеток Е.coli BL21 (DE3) соответствующей рекомбинантной плазмидной ДНК.

Клетки Е.coli BL21 (DE3)/pTrx-TEVrs-РТН являются суперпродуцентом. При индукции изопропил-β-D-1-тиогалактоприанозидом происходит эффективный биосинтез гибридного белка Trx-TEVrs-РТН, который накапливается в клетках в растворимой форме в количестве не менее 35% от суммарного белка клетки.

Изобретение осуществляют следующим образом. Конструируют рекомбинантную плазмидную ДНК pTrx-TEVrs-РТН, для чего нуклеотидную последовательность TEVrs-PTH (SEQ ID NO 5) амплифицируют с помощью ПЦР с синтетическими олигонуклеотидными праймерами (SEQ ID NO 4), содержащими сайты узнавания эндонуклеаз рестрикции MscI (N-конец гена, праймер А1) и HindIII (С - конец гена, праймер В1), полученную ДНК расщепляют соответствующими рестриктазами и затем лигируют с обработанной по тем же сайтам векторной плазмидой pET32a. Лигазной смесью трансформируют компетентные клетки Е.coli BL21(DE3) и высевают на LB-агар, содержащий 50 мкг/мл ампициллина или другого пенициллинового антибиотика. Полученные клоны анализируют с помощью секвенирования.

Штамм-продуцент Е.coli BL21 (DE3)/pTrx-TEVrs-РТН выращивают в богатой среде (YT-, LB-бульон и др.) до достижения максимальной плотности культуры.

На (SEQ ID NO 1) изображена аминокислотная последовательность фрагмента эндогенного человеческого паратиреоидного гормона РТН (1-34).

На (SEQ ID NO 2) изображена аминокислотная последовательность гибридного белка Trx-TEVrs-PTH.

На (SEQ ID NO 3) изображена аминокислотная последовательность специфического сайта узнавания TEV-протеиназы.

На (SEQ ID NO 4) изображена нуклеотидная последовательность праймеров, использованных для амплификации гена синтетического фрагмента TEVrs-PTH.

На (SEQ ID NO 5) изображенаи нуклеотидная последовательность синтетического фрагмента TEVrs-PTH

Изобретение иллюстрируется следующими рисунками.

Фиг. 1.Физическая карта плазмиды pTrx-TEVrs-РТН.

Фиг. 2. Электрофореграмма лизата клеток штамма-продуцента E.coli BL21 (DE3) / pTrx-TEVrs-РТН. М — стандарт молекулярных масс, Pierce Unstained Protein MW Marker, Thermo, cat # 26610; С — лизат клеток.

Фиг. 3. Профиль аналитической ОФ ВЭЖХ полученного РТН (1-34). Образец — раствор РТН (1-34) в виде объединённых фракциях после конечной очистки, в объёме 20 мкл.

Фиг. 4. Масс-спектр полученного РТН (1-34). Образец — раствор РТН (1-34) в виде объединённых фракциях после конечной очистки, в объёме 20 мкл.

Изобретение иллюстрируется нижеследующими примерами.

Пример 1. Конструирование рекомбинантной плазмидной ДНК.

Химический синтез олигонуклеотидов выполняют твердофазным фосфоамидитным методом на ДНК-синтезаторе ASM-102U (БИОССЕТ, Новосибирск) с наращиванием олигонуклеотидной цепи в направлении от 3'-конца к 5'-концу с помощью защищенных фосфамидитов – 5'-диметокситритил-N-ацил-2'-дезоксинуклеозид-3'-O-(β-цианэтил-диизопропиламино)-фосфитов, активированных тетразолом. Синтез проводят в масштабе 0,5-0,7 мкмоль, используя в качестве носителя пористое стекло (размер пор 500 Å), к которому через 3'-сукцинатную связь присоединяют первое нуклеозидное звено (нагрузка 20-30 мкмоль/г). Используют синтетический цикл стандартного фосфоамидитного метода.

Для приготовления вектора ДНК плазмиды pET32a (3 мкг, 1 пмоль) обрабатывают в 40 мкл буфера 50 мМ ацетатат калия, 20 мМ Трис-ацетат, 10 мМ ацетат магния, 100 мкг/мл БСА рестриктазой MscI (10 ед. акт.), а затем - в 40 мкл буфера 50 мМ NaCl, 10 мМ Трис-HCl, 10 мМ MgCl2, 100 мкг/мл БСА рестриктазой HindIII (10 ед.акт.) в течение 1 ч при 37°С. Векторный фрагмент после электрофореза в 15% агарозном геле вырезают из геля и переносят в 200 мкл буфера NT , растворяют при 50°С в течении 5-10 мин и наносят на колонку NucleoSpinExtractII. Промывают буфером NT 3 и элюируют 50 мкл буфера NE.

Для приготовления гена TEVrs-PTH проводят амплификацию с помощью ПЦР, используя в качестве матрицы искусственный ген TEVrs-PTH (0,01 мкг в образце), а в качестве праймеров - синтетические олигонуклеотиды А1 (SEQ ID NO 4) и В1 (SEQ ID NO 4), по 60 пмоль каждого. ПЦР проводят в ДНК-амплификаторе, в буферном растворе, состоящем из четырех dNTP в концентрации 0,5 мМ и 5 ед. акт. Taq-ДНК-полимеразы, в следующем режиме: денатурация - 1 мин при 94°С, отжиг - 30 сек при 60°С, элонгация - 40 сек при 72°С, 30 циклов ПЦР. Ген после электрофореза в 15% агарозном геле вырезают из геля и переносят в 200 мкл буфера NT, растворяют при 50°С в течении 5-10 мин и наносят на колонку NucleoSpinExtractII. Промывают буфером NT 3 и элюируют 50 мкл буфера NE, затем обрабатывают теми же рестриктазами, которые используют при приготовлении вектора, и выделяют целевой фрагмент из агарозного геля.

Полученный синтетический фрагмент с геном рекомбинантного PTH (1-34) в количестве 2 пмоль прибавляют к раствору 1 мкг, полученного из ДНК лазмиды pET32a, описанного выше векторного фрагмента в 10 мкл буфера (20 мМ трис-HCl, рН 7,56, 10 мМ MgCl2, 0,2 мМ rATP, 10 мМ дитиотреитол) и лигируют с помощью 10 ед.акт. Т4-ДНК-лигазы в течение 12 ч при 10°С.

Аликвоту реакционной смеси используют для трансформации компетентных клеток Е.coli BL21 (DE3). Трансформанты высевают на чашки с LB-агаром, содержащим 50 мкг/мл ампициллина. Из клонов выделяют ДНК плазмиды pTrx-TEVrs-РТН. Скрининг рекомбинантов проводят с помощью секвенирования. Физическая карта плазмиды pTrx-TEVrs-РТН представлена на фиг.1. Указаны сайты эндонуклеаз рестрикции. Ori – участок инициации репликации плазмиды. ApR – ген устойчисовсти к ампицилину. LacI – ген репрессора лактозного оперона. Trx-TEVrs-РТН – ген рекомбинантного белка, кодирующий тиоредоксин, сайт узнавания TEV-протеиназы и терипаратид.

Пример 2. Получение штамма-продуцента Е.coli BL21 (DE3)/ pTrx-TEVrs-РТН и определение его продуктивности.

Штамм-продуцент Е.coli BL21 (DE3)/ pTrx-TEVrs-РТН получают трансформацией компетентных клеток Е.coli BL21 (DE3) плазмидой pTrx-TEVrs-РТН, получение которой как описано в примере 1.

Штамм продуцента Е.coli BL21 (DE3)/ p Trx-TEVrs-РТН культивируют при 37°С в 100 мл LB-бульона (рН 7,0) с 50 мкг/мл ампициллина в течение 2 ч в орбитальном шейкере-инкубаторе в колбах Ерленмейера со скоростью вращения 190 об/мин до оптической плотности А550 0,7-0,8. Затем прибавляют изопропил-β-D-1-тиогалактоприанозид до концентрации 0,2 мМ и инкубируют в течение 6 ч, или продолжают выращивание в отсутствие индуктора в течение 6 ч. Каждый час отбирают пробу по 2 мл, определяют А550 и количество культуры, соответствующее 1 мл с А550 1,0, центрифугируют 5 мин при 6000 об/мин. Осаждённые клетки в 100 мкл лизирующего буферного раствора с красителем бромфеноловым синим обрабатывают ультразвуком в течение 20 сек, инкубируют 3 мин при 100°С, аликвоты по 4 мкл используют для электрофореза в 15% SDS-ПААГ. Гель окрашивают кумасси R-250 по стандартной методике и сканируют с помощью денситометра Shimadzu CS-930. Приводили оценку содержания гибридного белка Trx-TEVrs-РТН в клеточном лизате путём анализа насыщенности полос в программном обеспечении ImageJ. Определяют На фиг 2. представлена электрофореграмма лизата клеток штамма-продуцента E.coli BL21 (DE3)/ pTrx-TEVrs-РТН, содержание гибридного белка от общего клеточного не менее 30%.

Пример 3. Получение гибридного белка Trx-TEVrs-РТН, его расщепление и выделение рекомбинантного PTH (1-34).

После окончания ферментации клетки продуцента гибридного белка (биомассу) отделяют центрифугированием (5000 g, 20 мин, 4°С), разрушают на ультразвуковом дезинтеграторе в буфере (50 мМ Tрис/HCl, 10 мМ ЭДТА, 1 мМ ПМСФ, рН 8) и отделяют супернатант центрифугированием (15000 g, 45 мин). Осветленный клеточный лизат наносят на анионообменную смолу уравновешенную буфером для нанесения (50 мМ Трис/HCl, 10 рН 8,5). Гибридный белок элюируют градиентом концентрации соли в буфере для нанесения. В элюат добавляют TEV-протеиназу, тем самым инициируя расщепление гибридного белка, и инкубируют при 22°С в течении 18 ч. Из полученной смеси отбирают пробу в количестве 30 мкл и с красителем бромфеноловым синим инкубируют 3 мин при 100°С. Пробы по 4 мкл используют для электрофореза в 15% SDS-ПААГ. Гель прокрашивают кумасси R-250 по стандартной методике и сканируют с помощью денситометра Shimadzu CS-930. После инкубирования при 22°С в течении 18 ч. доводят рН раствора соляной кислотой до 3.0 и центрифугируют. Дальнейшую очистку и анализ рекомбинантного РТН проводят посредством обращенно-фазовой хроматографии. На фиг. 3 представлен профиль аналитической ОФ ВЭЖХ РТН (1-34), которая свидетельствует о чистоте конечного препарата более 99%.

Идентификацию образующегося рекомбинантного РТН (1-34) проводят с помощью TOF-ESI-масс-спектрометрии на масс-спектрометре Agilent technologies 6224, результирующий масс-спектр представлен на Фиг. 4. Полученный сигнал рекомбинантного РТН соответствует расчётному значению массы 4117 Да. Элюат упаривают на роторном испарителе и лиофилизуют.

1. Гибридный белок Trx-TEVrs-РТН, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO 2, содержащий тиоредоксин, специфический сайт узнавания TEV-протеиназы, рекомбинантный РТН (1-34), имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO 1.

2. Рекомбинантная плазмидная ДНК pTrx-TEVrs-РТН для экспрессии гибридного белка Trx-TEVrs-РТН по п. 1, состоящая из HindHIII/MscI-фрагмента ДНК плазмиды pET32a, содержащая:

- последовательность промотора T7 и оператора lacO;

- последовательность, кодирующую гибридный белок по п. 1;

- ген β-лактамазы в качестве генетического маркера, детерминирующего устойчивость трансформированных плазмидой pTrx-TEVrs-РТН клеток Е.coli к пенициллиновым антибиотикам;

- последовательность, кодирующую точку начала репликации;

- ДНК фрагмент, кодирующий последовательность лактозного репрессора LacI.

3. Штамм Escherichia coli BL 21(DE3)/pTrx-TEVrs-РТН, продуцирующий гибридный белок по п. 1, содержащий рекомбинантную плазмидную ДНК pTrx-TEVrs-РТН по п. 2.

4. Штамм Escherichia coli по п. 3, отличающийся тем, что получен путём трансформации клеток штамма Escherichia coli BL 21(DE3) рекомбинантной плазмидной ДНК pTrx-TEVrs-РТН по п. 2.

5. Способ получения рекомбинантного PTH(1-34), включающий в себя стадии:

(1) культивирование полученного штамма-продуцента Escherichia coli BL21(DE3)/ pTrx-TEVrs-РТН по п. 3 с получением биомассы клеток штамма-продуцента;

(2) выделение рекомбинантного РТН(1-34) SEQ ID NO 1 из биомассы клеток штамма-продуцента.

6. Способ получения рекомбинантного PTH(1-34) по п. 5, отличающийся тем, что выделение РТН(1-34) SEQ ID NO 1 осуществляют за счёт отделения гибридного белка в виде супернатанта, хроматографическую очистку гибридного белка, расщепление TEV-протеиназой, центрифугиование, отделение супернатанта и хроматографическую очистку рекомбинантного РТН(1-34).

7. Способ получения рекомбинантного PTH(1-34) по п. 5, отличающийся тем, что хроматографическую очистку гибридного белка осуществляют на анионообменном сорбенте.



 

Похожие патенты:
Изобретение относится к биотехнологии, микробиологии. Предложен штамм Yarrowia lipolytica ARC 49, обладающий способностью к деструкции нефти и нефтепродуктов.
Изобретение относится к биотехнологии, микробиологии. Предложен штамм бактерий Arthrobacter psychrochitiniphilus ARC 42, обладающий способностью к деструкции нефти и нефтепродуктов и депонированный во Всероссийской Коллекции Промышленных Микроорганизмов под регистрационным номером ВКПМ Ac-2076.
Изобретение относится к области биотехнологии, микробиологии. Предложен штамм бактерий Marinomonas rhizoma ARC 45, обладающий способностью к деструкции нефти и нефтепродуктов, депонированный во Всероссийской Коллекции Промышленных Микроорганизмов под регистрационным номером ВКПМ В-13091.
Изобретение относится к биотехнологии, микробиологии. Предложен штамм бактерий Pseudoalteromonas prydzensis ARC 46, обладающий способностью к деструкции нефти и нефтепродуктов.
Изобретение относится к биотехнологии, микробиологии. Предложен штамм Yarrowia lipolytica ARC 48, обладающий способностью к деструкции нефти и нефтепродуктов.
Изобретение относится к биотехнологии, микробиологии. Предложен штамм бактерий Psychrobacter cibarius ARC 35, обладающий способностью к деструкции нефти и нефтепродуктов.
Изобретение относится к биотехнологии, микробиологии. Предложен штамм бактерий Psychrobacter cryohalolentis ARC 36, обладающий способностью к деструкции нефти и нефтепродуктов.

Изобретение относится к штамму Glomus iranicum var. tenuihypharum var.

Изобретение относится к биотехнологии и представляет собой рекомбинантную плазмидную ДНК pET31b-2хUBI18-35, кодирующую аминокислотную последовательность рекомбинантного антимикробного пептида UBI18-35, кодируемого нуклеотидной последовательностью: 5’-AAAGTGGCGAAACAGGAAAAGAAAAAGAA AAAGACCGGTCGTGCGAAACGTCGT-3’, имеющая молярную массу 1,8 МДа.
Изобретение относится к биотехнологии. Штамм лактобактерий Streptococcus salivarius Т.С.

Настоящее изобретение относится к области биотехнологии, конкретно к получению противомикробных пептидов, и может быть использовано в медицине для антимикробной терапии.

Настоящее изобретение относится к области биотехнологии, конкретно к белкам-агонистам рецептора TRAIL, и может быть использовано в медицине для противоопухолевого лечения.

Изобретение относится к области биотехнологии, конкретно к рекомбинантному получению терапевтических белков, и может быть использовано для получения рекомбинантного фолликулостимулирующего гормона человека (рчФСГ).

Настоящее изобретение относится к области биотехнологии, конкретно к получению противомикробных пептидов, и может быть использовано в медицине для лечения или предотвращения бактериальной и грибковой инфекции.

Изобретение относится к клеточным технологиям и может быть использовано для рекомбинантного получения фолликулостимулирующего гормона (ФСГ) человека. Клеточную линию huFSHKKc6 получают путем трансформации клеток huFSHIK экспрессионной плазмидой длиной 7719 п.о., состоящей из гена устойчивости PuroR с SV40 polyA, укороченного 3'LTR HIV-1, гена устойчивости AmpR, промотора AmpR, ориджина репликации SV40 и pBR322, промотора NP гена р53 человека, pgk - конститутивного промотора гена фосфоглицераткиназы, синтетической нуклеотидной последовательности, кодирующей полноразмерную альфа-субъединицу ФСГ человека, сигнала терминации трансляции, состоящего из 3 пар оснований и консенсусной сигнальной последовательности Козак.

Изобретение относится к области биотехнологии и молекулярной генетики. Представлена генетическая конструкция для гетерологической экспрессии тиазол-оксазол модифицированного пептида клебсазолицина в клетках бактерий Е.

Изобретение относится к области биотехнологии, конкретно к получению слитых белков, связывающихся с PDGF и VEGF, и рекомбинантных вирусных частиц, кодирующих слитые белки, и может быть использовано в медицине.

Изобретение относится к области биохимии, в частности к антителу к TSLP-рецептору. Также раскрыты экспрессионный вектор, клетка-хозяин для получения указанного антитела.

Изобретение относится к области биотехнологии, конкретно к рекомбинантному получению терапевтических белков, и может быть использовано для получения антагониста фактора некроза опухолей.

Изобретение относится к области биотехнологии, конкретно к рекомбинантному получению терапевтических белков, и может быть использовано для получения рекомбинантного противоопухолевого белка DR5-B в Е.

Группа изобретений относится к биотехнологии и медицине, а именно к соединениям и композиции для ингибирования экспрессии рецептора гормона роста (GHR). Соединение содержит модифицированный олигонуклеотид длиной 18-30 связанных нуклеозидов, который имеет последовательность нуклеотидных оснований, содержащую часть из по меньшей мере 18 непрерывных нуклеотидных оснований, на 100% комплементарную относительно равной по длине части нуклеотидных оснований 153921-153940 нуклеиновой кислоты рецептора гормона роста SEQ ID NO: 2.

Изобретение относится к области биотехнологии, конкретно к рекомбинантному получению терапевтических белков и может быть использовано для получения активного фрагмента эндогенного человеческого паратиреоидного гормона. Сконструирована рекомбинантная плазмидная ДНК pTrx-TEVrs-РТН, которая обеспечивает синтез гибридного белка, содержащего последовательность тиоредоксина и терипаратида в клетках Escherichia coli. Путём трансформации штамма E.coli BL 21 плазмидой pTrx-TEVrs-РТН получают штамм- продуцент гибридного белка Trx-TEVrs-РТН. Разработан способ получения рекомбинантного терипаратида, предусматривающий получение и культивирование продуцента гибридного белка, содержащего терипаратид, с последующим выделением и расщеплением указанного гибридного белка. Изобретение позволяет получить рекомбинантный терипаратид с высоким выходом и по упрощённой технологии. 4 н. и 3 з.п. ф-лы, 4 ил., 3 пр.

Наверх