Способ тестирования на заражение вирусами посадочного материала картофеля, выращенного in vitro

Авторы патента:

Павловская Нинэль Ефимовна (RU)

Гагарина Ирина Николаевна (RU)

Гаврилова Анна Юрьевна (RU)

Горькова Ирина Вячеславовна (RU)

C12N7/00 - Вирусы, например бактериофаги; их композиции; приготовление или очистка их (лекарственные препараты, содержащие вирусы A61K 35/76; получение лекарственных составов, содержащих вирусные антигены или антитела, например вакцин из вирусов A61K 39/00)

Владельцы патента RU 2701687:

Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования "Орловский государственный аграрный университет имени Н.В. Парахина" (RU)

Изобретение относится к области биотехнологии. Изобретение представляет собой способ тестирования на заражение вирусами посадочного материала картофеля, выращенного in vitro, заключающийся в том, что получают белковый лектинсодержащий экстракт корней подорожника большого Plantago major из гомогенизированной муки размолотых корней растений 0,9%-ным раствором хлористого натрия настаиванием в течение 24 часов в соотношении 1:6, после чего гомогенат центрифугируют и доводят до рН 4,0, вновь центрифугируют и супернотант нейтролизуют до рН 7,0, удаляют осадок центрифугированием, белок высаливают 70% сульфатом аммония, поле чего неочищенный сырой лектин собирают на фильтр и растворяют в дистиллированной воде, затем получают концентрат вирусов с посадочного материала и проводят агглютинацию полученных вирусов белковым лектинсодержащим экстрактом корней подорожника большого Plantago major в концентрации 0,03%, при этом если происходит агглютинация, то посадочный материал не заражен вирусами, а отсутствие агглютинации показывает, что посадочный материал заражен вирусами. Изобретение позволяет ускорить процесс тестирования посевного материала картофеля. 2 табл.

Изобретение предназначено для использования в сельском хозяйстве для контроля при получении безвирусного посадочного материала картофеля и в фитопатологии при тестировании растений на вирусы.

Появляется все больше данных, свидетельствующих об участии лектинов в таких неспецифических иммунных реакциях, как агглютинация, опсонизация и лизис. Взаимодействуя с углеводными структурами на поверхности бактерий, лектины агглютинируют их в сгустки, которые впоследствии лизируются.

В качестве способа тестирования на заражения вирусами известен способ тестирования на древесных индикаторах (Патент РФ N 2016509 кл. А01Н 1/04, A01G 7/00 Способ диагностики заражения черной смородины реверсией // Атрощенко Г.П. - опубл. 1994, Б.И. N 14) [1].

Известен также способ на травянистых индикаторах (Технология производства безвирусного посадочного материала плодовых, ягодных культур и винограда // М.: ГПО "Союзплодопитомник". - 1989. - С. 6-7.) [2].

Недостатком описанных выше методов тестирования на заражение вирусами является их высокая трудоемкость и высокая стоимость расходных материалов, а так же длительность проведения анализа.

Задачей изобретения является снижение трудоемкости и стоимости расходных материалов а также ускорение процесса тестирования при выявлении заражения вирусами в посевном материале картофеля выращенного в условиях in vitro.

Поставленная задача решается благодаря тому, что в способе тестирования растений на вирусы, включающем получение концентрата вирусов с посадочного материала и проводят агглютинацию полученных вирусов белковым лектинсодержащим экстрактом корней подорожника большого Plantago major в концентрации 0,03%, при этом если происходит агглютинация, то исследуемый посадочный материал заражен вирусами, а отсутствие агглютинации показывает, что посадочный материал не заражен вирусами.

Для проведения тестирования на заражение вирусами посадочного материала картофеля применяли белковые лектинсодержащие экстракты в концентрации 0,03%, выделенные из семян сои Glycine max, корней лопуха большого Arctium lappa L., из корней одуванчика лекарственного Taraxacum officinale, полыни горькой Artemisia absinthium L., чистотела Chelidonium majus L и корней подорожника большого Plantago major.

Белковые лектинсодержащие экстракты получали из гомогенизированной муки размолотых семян, корней или зеленой массы растений 0,9%-ным раствором хлористого натрия настаиванием в течение 24 часов в соотношении 1:6. Гомогенаты центрифугировали и доводили до pH 4,0, вновь центрифугировали и супернотант нейтролизовали до pH 7,0. Осадок удаляли центрифугированием. Белок высаливали 70% сульфатом аммония. Неочищенный сырой лектин собирали на фильтр и растворяли в дистиллированной воде. Полученные экстракты хранили в холодильнике при температуре 4°C. Выход белковых лектинсодержащих экстрактов из семян сои составляет 32 мг/100 г, из корней одуванчика составляет 44 мг/100 г., корней лопуха 38 мг/100., корней подорожника 32 мг/100 г., составляет 40 мг/100 г, чистотела 27 мг/100 г.

Для выделения вирусов исследуемый растительный материал гомогенизировали в 0,02 М фосфатном буфере, pH 6,8, содержащем 0,2 М сахарозу, и 2 мМ ЭДТА, при соотношении навески и буфера 1:4 (г/мл). Для разрушения растительных тканей использовали лабораторный блендер или керамические ступку с пестиком. Гомогенат осветляли низкоскоростным центрифугированием 2000 об/мин 15 мин при температуре 4°C и фильтровали. Вирус осаждали центрифугированием при 12000 об/мин 20 мин и получали концентрат.

Концентрат вирусов адсорбировали на планшете для ИФА, затем вносили экстракты лектинов с пероксидазной меткой, т.е. к спиртовому раствору бензидина добавляли перекись водорода в соотношении 1:10.

Для сравнения агглютинирующей активности белковых лектинсодержащих экстрактов использовался контроль из стабилизированных эритроцитов человека. Для дифференцирования реакции агглютинации белковыми лектинсодержащими экстрактами вирусов, а не компонентов среды стабилизатора, в котором они находятся, использовался контроль из пробы этой среды, свободной от штаммов микроорганизмов. Оценку степени агглютинации проводили визуально.

Изучение действия белковых лектинсодержащих экстрактов на вирусы подтвердило их способность к агглютинации некоторых из них. Агглютинация белковыми лектинсодержащими экстрактами компонентов среды контроля отсутствовала (среда свободная от вирусов) (Таблица 1).

Приведенные в таблице 1 данные свидетельствуют о том, что белковые лектинсодержащие экстракты корней лопуха большого Arctium lappa L. и лектины чистотела Chelidonium majus L используемых в эксперименте не комплементарны углеводным детерминантам вирусам.

- - Отрицательный результат;

+ - Малая зараженность;

++ - Средняя зараженность;

+++ - Сильная зараженность.

Тестирование на заражение вирусами посадочного материала картофеля выращенного in vitro по тест- системе с применением белковых лектинсодержащих экстрактов, в частности экстрактов из семян сои Glycine max, выявило сильное заражение у картофеля сортов Удача, Лабадиа и Невский. Среднее у сортов Жуковский ранний, Снегирь, Романо и Голубизна. Малая зараженность у сорта Эффект. У сортов Крепыш, Розара, Красавчик, Эффект - заражение вообще не выявлено.

При использовании белковых лектинсодержащих экстрактов корней лопуха большого Arctium lappa L. малая зараженность выявлена только на сортах картофеля Розара, Красавчик и Эффект при том, что на других сортах заражение не выявлено.

Белковые лектинсодержащие экстракты из корней одуванчика лекарственного Taraxacum officinale выявили сильное проявление зараженности у сорта Жуковский ранний, Удача, Невский. Малая зараженность у сортов Крепыш, Розара, Красавчик и Голубизна, В то время, как у сортов Снегирь, Инноватор, Лабадиа, Романо и Эффект заражения не выявлено.

Применение белковых лектинсодержащих экстрактов полыни горькой Artemisia absinthium L. выявило заражение средней степени у сортов картофеля: Удача, Невский и Романо. У сортов Розара, Снегирь, Красавчик и Лабадиа заражения не обнаружено.

Белковые лектинсодержащие экстракты чистотела Chelidonium majus L обнаружили заражение средней степени на сорте Жукоский ранний и слабая степень заражения у сорта Лабадиа, во всех остальных сортах заражение не выявлено.

Изучение зараженности на белковых лектинсодержащих экстрактов из корней подорожника большого Plantago major идентифицировано сильное заражение у сортов Жуковский ранний, Удача и Невский. Средняя степень заражения у сортов Снегирь, Лабадиа, Эффект и Голубизна. Малая степень у сортов Крепыш, Розара, Инноватор, Красавчик и Романо.

Таким образом, при проведении исследований выявлено, что белковые лектинсодержащие экстракты корней подорожника большого Arctium major в концентрации 0,03% являются универсальными для тестирования на заражение вирусами посевного материала картофеля выращенного in vitro.

Тестирование на наличие вирусов в посадочном материале картофеля, выращенном in vitro проводится в течение 3-х часов, и имеет низкую стоимость расходных материалов. Для тестирования другими способами требуется не менее 8 часов.

Способ тестирования на заражение вирусами посадочного материала картофеля, выращенного in vitro, заключающийся в том, что получают белковый лектинсодержащий экстракт корней подорожника большого Plantago major из гомогенизированной муки размолотых корней растений 0,9%-ным раствором хлористого натрия настаиванием в течение 24 часов в соотношении 1:6, после чего гомогенат центрифугируют и доводят до рН 4,0, вновь центрифугируют и супернотант нейтролизуют до рН 7,0, удаляют осадок центрифугированием, белок высаливают 70% сульфатом аммония, поле чего неочищенный сырой лектин собирают на фильтр и растворяют в дистиллированной воде, затем получают концентрат вирусов с посадочного материала и проводят агглютинацию полученных вирусов белковым лектинсодержащим экстрактом корней подорожника большого Plantago major в концентрации 0,03%, при этом если происходит агглютинация, то посадочный материал не заражен вирусами, а отсутствие агглютинации показывает, что посадочный материал заражен вирусами.

Изобретение относится к генной инженерии. Описано применение патогенного вируса кори (MV) из живого ослабленного штамма вируса кори (MV), в котором нокаутирован ген, кодирующий вирусный акцессорный белок С (MV-deltaC), в лечении агрессивной злокачественной опухоли или агрессивного рака при введении индивидууму, у которого диагностирована такая злокачественная опухоль или раковое заболевание.

Штамм с/2014 вируса мачупо - возбудителя боливийской геморрагической лихорадки, предназначенный для лабораторной оценки эффективности медицинских средств защиты в отношении данного возбудителя // 2699525

Изобретение относится к области биотехнологии. Изобретение представляет собой штамм С/2014 вируса Мачупо - возбудителя Боливийской геморрагической лихорадки (БГЛ), вариант природного штамма Carvallo, адаптированный к морским свинкам и вызывающий у них зависимую от вводимой дозы вируса гибель.

Олигонуклеотидные праймеры и флуоресцентно-меченные зонды, способ и тест-система для дифференциации генома вакцинного штамма и полевого изолята вируса заразного узелкового дерматита крс с дополнительной детекцией генома каприпоксвирусов с помощью полимеразной цепной реакции в режиме реального времени // 2699195

Изобретение относится к биотехнологии, а именно к средствам молекулярной диагностики. Разработаны олигонуклеотидные праймеры и флуоресцентно-меченные зонды для дифференциации генома вакцинного штамма и полевого изолята вируса заразного узелкового дерматита КРС с дополнительной детекцией генома каприпоксвирусов с помощью полимеразной цепной реакции в режиме реального времени:полевой изолят ЗУД КРС:f- 5'- TAGAAAATGGATGTACCACAAATACAG 3',r 5' -TTGTTACAACTCAAATCGTTAGGTG-3',зонд 5' -ACCACCTAATGATAGTGTTTATGATTTACC-3;каприпоксвирусы:f - 5' ATGAAACCAATGGATGGGATA 3',r - 5' CGAAATGAAAAACGGTATATGGA 3',зонд - 5' ATGAGCCATCCATTTTCCAA 3'4;вакцинный штамм ЗУД КРС:f- 5'-TGTTTCCATTCTCCACTGCT-3',r - 5' -TACTTACTAAAAAATGGGCGCА-3',зонд - 5'-TCGCTGACATCGTTAGTCCАСТС-3'.Предложен способ дифференциации генома вакцинного штамма и полевого изолята вируса заразного узелкового дерматита (нодулярного дерматита) КРС с дополнительной детекцией генома каприпоксвирусов с помощью ПЦР в режиме реального времени при одинаковом термическом профиле с использованием этих праймеров и зондов, и тест-система ПЦР в режиме реального времени для его проведения.

Слитые полипептиды и вакцины // 2699006

Изобретение относится к области биохимии. Описана группа изобретений, включающая полипептид, подходящий для индукции иммунного ответа против вируса PCV2, рекомбинантную клетку, содержащую молекулу нуклеиновой кислоты, кодирующую вышеуказанный полипептид, нуклеиновую кислоту, вектор, содержащий нуклеиновую кислоту, рекомбинантный вирус оспы свиней, содержащий в своем геноме нуклеиновую кислоту, композицию, вакцину, применение полипептида, клетки и нуклеиновой кислоты для получения лекарственного средства для лечения или профилактики PCV2-ассоциированного заболевания у свиньи.

Ротавирусные частицы с химерными поверхностными белками // 2698049

Изобретение относится к биотехнологии и представляет собой комплекс химерного поверхностного белка для определения структуры гетерологичного белка, содержащий образующий тример поверхностный белок ротавируса VP7, связанный с гетерологичным белком, где поверхностный белок ротавируса VP7 связан с указанным гетерологичным белком нековалентно состоящей из двух частей адаптерной системой, где одна часть адаптерной системы образована первым адаптерным полипептидом, который слит с поверхностным белком ротавируса VP7, необязательно посредством линкерной последовательности, а другая часть адаптера образована вторым адаптерным полипептидом, который слит с гетерологичным белком, необязательно посредством линкерной последовательности, где первый адаптерный полипептид и второй адаптерный полипептид содержат гептадную повторяющуюся последовательность, где обе части адаптерной системы образуют стабильный комплекс друг с другом, и где указанный комплекс химерного поверхностного белка способен становиться частью внешнего слоя ротавирусной частицы путем рекапсидации in vitro с его помощью двухслойных ротавирусных частиц.

Вспомогательный плазмидный лентивирусный экспрессионный вектор для получения высоких титров vpx-содержащих лентивирусных частиц, обеспечивающий эффективное заражение моноцитов и дендритных клеток человека // 2697781

Изобретение относится к области биотехнологии и может быть использовано в терапии онкологических заболеваний. Описан универсальный вспомогательный плазмидный экспрессионный лентивирусный вектор для получения высоких титров вирусных частиц, содержащих ген Vpx, включающий в качестве базовых элементов, обеспечивающих функционирование вектора, последовательность вирион-ассоциированного белка Vpx, содержащую С-концевой HIV-1 gag/pol мотив и FLAG последовательность и объединенную с последовательностью гена трансактиваторного белка Rev через специфическую последовательность Т2А, обеспечивающую расщепление слитых белков во время процесса трансляции мРНК трансгена; в качестве регуляторных элементов- RSVпромотор/энхансер [rous sarcoma virus) и NES (nuclear export signal)- сигнал экспорта из ядра в цитоплазму.

Иммортализованные фибробласты эмбриона цыпленка // 2694318

Группа изобретений относится к области генетической инженерии, в частности к иммортализованным фибробластам эмбриона цыпленка (ФЭЦ) для размножения вирусов, способам их получения, к культурам клеток, включающим иммортализованные ФЭЦ, к способам репликации вирусов птиц в таких клетках и к способам получения вакцин.

Микровезикула и способ ее получения // 2693088

Изобретение относится к биотехнологии. Описан способ получения микровезикул, содержащих трансгенный продукт и/или лентивирусную РНК, содержащую трансген.

Способ адаптации ротавируса группы а человека к росту на перевиваемых культурах клеток животных // 2692604

Изобретение относится к области биотехнологии. Изобретение представляет собой способ адаптации ротавируса человека группы А к росту на перевиваемых культурах клеток животных, заключающийся в том, что адаптацию и последующее культивирование ротавируса человека группы А проводят путем последовательных пассажей на смешанной культуре, состоящей из эпителиоидного и фибробластного типов клеток в соотношении 1:1; в качестве клеток эпителиоидного ряда используют перевиваемую культуру клеток почки эмбриона свиньи (СПЭВ), фибробластного типа - перевиваемую культуру фибробластов крысы (ФК), выращенные раздельно на среде 199; полученный монослой клеток обоих типов снимают со стекла смесью раствора Версена и 0,25% раствора трипсина в соотношении 5:1, разводят средой 199 в 4 раза, смешивают при соотношении культур клеток 1:1, добавляют 10% прогретой сыворотки крупного рогатого скота, выдерживают в термостате при +37°С в течение 2 суток; отмывают 3-кратно монослой смеси клеток от ростовой среды раствором Хенкса, добавляют 0,5 мл обработанной раствором трипсина (20 мкг/мл) 10% фекальной суспензии, содержащей ротавирус человека, и контактируют в течение 10 мин; добавляют поддерживающую среду 199 без сыворотки до первоначального объема и выдерживают в термостате при +37°С в течение 10 суток; замораживают при -18-20°С в течение 5 ч с последующим оттаиванием при 37°С, повторяя процедуру трижды; последующие пассажи проводят по той же схеме, используя инокулят предыдущего пассажа.

Способы очистки вируса, продуцированного in vitro, и анализ элиминации вируса // 2691026

Изобретение относится к области биотехнологии. Изобретение представляет собой способ очистки вируса без оболочки или с псевдооболочкой, продуцированного in vitro, с использованием композиции с по меньшей мере одним детергентом.