Способ получения парвовируса, характеризующегося высоким титром инфекционности и высокой чистотой

Изобретение относится к биотехнологии, а именно, способу получения парвовируса, происходящего из неконцентрированного супернатанта клеточной культуры. Способ включает (a) стадию предварительного расчета каждые 24 часа зависимого от времени изменения плотности клеток в культуральном субстрате, когда клетки-хозяева инфицируются парвовирусом, для каждой плотности клеток (A) при инфицировании вирусом; (b) стадию определения на основе зависимого от времени изменения клеточной плотности, рассчитанной предварительно на стадии (a), (b1) время (T_max) от инфицирования до времени пика зависимого от времени изменения плотности клеток, (b2) плотность клеток (B_max) при T_max и A1, которая представляет собой A, которая удовлетворяет следующему уравнению (1) B_max/A1>1,2, (b3) максимальную (A_max) плотность клеток A1 при инфицировании вирусом и (b4) A2, которая удовлетворяет следующему уравнению (2) A_max≥A₂≥A_max/10; (c) стадию инокуляции посевного парвовируса в культуральный субстрат, содержащий клетки-хозяева, имеющие плотность клеток A2, где инфицирующий вирус, определенный в (b4) стадии (b), и сывороточная среда дают множественность заражения (MOI) от 0,001 до 0,1; (d) стадию культивирования культивируемого продукта, содержащего клетки-хозяева и парвовирус, полученные на стадии (c), в течение периода времени T_max или более до менее (T_max+48) часов, где T_max определено в (b1) стадии (b); (e) стадию замены культурального супернатанта, полученного на стадии (d), бессывороточной средой и культивирования в течение 12 часов или более; и (f) стадию сбора содержащего парвовирус культурального супернатанта, полученного путем культивирования на стадии (e); где на стадии (b), когда A, удовлетворяющая уравнению (1), отсутствует, стадии (a) и (b) осуществляют повторно путем использования другой плотности клеток A при инфицировании вирусом. Изобретение позволяет получить парвовирус с высоким титром инфекционности для применения при оценке вирусной безопасности фармацевтических или биологических продуктов или при получении вакцин. 8 з.п. ф-лы, 10 табл., 4 пр.

 

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ, К КОТОРОЙ ОТНОСИТСЯ ИЗОБРЕТЕНИЕ

[0001] Настоящее изобретение относится к способу получения парвовируса, характеризующегося высоким титром инфекционности и высокой чистотой, в супернатанте культуры и к парвовирусу, характеризующемуся высоким титром инфекционности и высокой чистотой, получаемому этим способом.

УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

[0002] Вирусы инфицируют многие растения и животных, включая человека, а также многие микроорганизмы и размножаются в них. Некоторые из них представляют собой ДНК-вирусы, обладающие геномной ДНК, и некоторые из них представляют собой РНК-вирусы, обладающие геномной РНК. Каждый из этих вирусов имеет отличный механизм репликации. Многие вирусы вызывают вирусную инфекцию у животных, таких как человек, когда инфицируют их. Вирусы не могут сами себя реплицировать, но могут реплицироваться путем инфицирования клеток других животных, растений или микроорганизмов и использования способностей этих клеток. Клетки, позволяющие вирусам инфицировать их и расти в них, называются «клетками-хозяевами» этих вирусов. Тип клеток-хозяев, позволяющих вирусам инфицировать их и расти в них, зависит от типа вируса.

[0003] Парвовирус представляет собой небольшой вирус с одноцепочечной ДНК. Он представляет собой икосаэдрический вирус, имеющий диаметр настолько малый как приблизительно 20 нм, и он не имеет оболочки (непатентный документ 1). Парвовирус инфицирует животных, вызывая заболевание. Известные заболевания, вызываемые парвовирусом, включают инфекционную эритему, а также анемию и артрит, который парвовирус B19 вызывает у человека, анемию, обусловленную парвовирусом обезьян (SPV), энтерит, лейкопению и дистонию кошек, обусловленную парвовирусом кошек (FPV), энтерит и миокардит собак, обусловленный парвовирусом собак (CPV), мертворожденность у свиней, обусловленную парвовирусом свиней (PPV), энтерит коров, обусловленный парвовирусом коров (BPV), энтерит и миокардит гусей, обусловленный парвовирусом гусей (GPV) и энтерит и гепатит мышей, обусловленный мелким вирусом мышей (MVM) (непатентные документы 2 и 3). Парвовирус является важным в качестве патогена, вызывающего заболевания у животных, таких как собаки и кошки, содержащихся человеком. Известно, что собаки, инфицированные парвовирусом собак, страдают энтеритом, как описано выше, с развитием тяжелой диареи и рвоты и умирают (непатентный документ 3). У кошек, инфицированных парвовирусом, иногда развивается острый энтерит или лейкопения, и они могут умереть от вторичной инфекции. Плоды или новорожденные котята кошек, инфицированных вирусом, могут иметь повреждение центрального нерва или тимуса с развитием атаксии или смерти.

[0004] Для профилактики парвовирусной инфекции проводятся исследования вакцин против парвовируса (патентные документы 1 и 2). Для этих исследований необходимо получение вируса и использование вируса. Многие вирусы могут быть выращены и получены путем культивирования клеток-хозяев и инфицирования их вирусами. Получение вакцины путем ослабления или инактивации вируса достигается с помощью того же способа, что и получение вируса.

[0005] В фармацевтической промышленности необходимо оценить вирусную безопасность (продуктивность удаления) способа получения для того, чтобы быть уверенным в том, что фармацевтическое средство биологического происхождения, такой как рекомбинантное фармацевтическое средство (биофармацевтическое средство) или фармацевтическое антитело не загрязнено вирусом (вирусная безопасность). Вирусная безопасность, которая имеет индивидуальные стадии, анализируется путем добавления вируса к промежуточному продукту фармацевтического средства перед каждой стадией и определения количества вируса перед и после стадии. В частности, парвовирус свиней (PPV), который представляет собой вид парвовируса, очень часто используется для оценки вирусной безопасности производных плазмы, выполняемой с помощью способа, описанного в руководстве ICH (международной конференции по гармонизации технических требований к регистрации фармацевтических средств для использования человеком), предписывающем способ выбора вида вируса, используемого для оценки вирусной безопасности в биологических способах получения. Для оценки вирусной безопасности биофармацевтических средств очень часто используется мелкий вирус мышей (MVM), который представляет собой вид парвовируса. Таким образом, парвовирус часто используется для оценки вирусной безопасности способов получения биологических продуктов.

[0006] Вирус получают с помощью способа, в котором используют: лабораторное животное; яйца курицы; и тканевую культуру или культивируемые клетки (непатентный документ 4). Способ с использованием лабораторного животного или яиц курицы не удобен из-за высокой стоимости. Вместо него может быть использован способ с культивированием клеток. Парвовирус также получают с использованием способа культивирования клеток (патентный документ 1).

[0007] Для получения вируса, такого как парвовирус, обычной практикой является инфицирование культуральной системы клеток-хозяев посевным вирусом и последующая пролиферация и сбор вируса. Термин «посевной вирус» при использовании в настоящем описании относится к небольшому количеству вируса, используемого на начальной стадии роста вирусов, которое рассматривается как «посевное». При традиционном получении вирусов клетки-хозяева инфицируют посевным вирусом обычно в такое время, когда клетки-хозяева достигают конфлюэнтности и образуют стадию монослоя (непатентный документ 4, патентные документы с 3 по 6). Более конкретно, посевной вирус обычно инокулируют тогда, когда клетки-хозяева, инокулированные в культуральный сосуд, пролиферируют с распространением на всю поверхность дна культурального сосуда, потому что высокая плотность присутствующих клеток, которые могут быть инфицированы вирусом, представляет собой систему, которая обеспечивает местом получения большего количества вирусов. Обычно проходит от двух до трех дней от инокуляции клеток-хозяев в культуральный сосуд, когда они достигают стадии конфлюэнтности (непатентный документ 4). В этом конфлюэнтном состоянии клетки-хозяева находятся в стационарной фазе и не растут далее. Таким образом, при традиционном способе после завершения стадии роста культуры клеток-хозяев начинается инфицирование вирусом в условиях такого культурального окружения, когда рост клеток не происходит и вирус продуцируется в супернатанте культуры одновременно с гибелью клеток-хозяев, вызываемой инфицированием вирусом. Парвовирус не является исключением, и получение вируса осуществляется с помощью способа инфицирования им клеток в состоянии конфлюэнтности (непатентный документ 5 и непатентный документ 6), и титр инфекционности парвовируса, получаемого таким образом, составляет от 10⁵ до 10⁷ TCID₅₀/мл. В традиционной системе культивирования парвовирус добавляют к клеткам-хозяевам в состоянии конфлюэнтности, которое представляет собой состояние с наибольшим количеством клеток, и парвовирус, добавленный таким способом, растет в клетках-хозяевах и увеличивается при сопровождающейся гибели клеток-хозяев. С помощью сбора супернатанта в тот момент, когда титр инфекционности парвовируса становится наиболее высоким, может быть собран раствор парвовируса, имеющий наивысшую инфекционность. Излишне говорить, что парвовирус, полученный в культуральном супернатанте с помощью этого способа, собирают как суспензию в среде, полученной из клеточной культуры.

[0008] После того как раствор парвовируса получен как описано выше, из него удаляют загрязнения. В случае способа удаления такие загрязнения как обломки клеток удаляют с помощью разделения путем центрифугирования с низкой скоростью (непатентный документ 7).

Перечень цитируемых работ

Патентные документы

[0009] Патентный документ 1: WO2007/125605

Патентный документ 2: JP H 10-508485 T

Патентный документ 3: JP 2009-297036 A

Патентный документ 4: JP 2655876 B

Патентный документ 5: JP S 58-22008 B

Патентный документ 6: JPS 61-24370 A

Непатентные документы

[0010] Непатентный документ 1: Virus⋅Saikin Kansen new File, 1997, edited by Yoshiyuki Nagai and Haruo Watanabe, Yodosha Co., Ltd., p. 68

Непатентный документ 2: Virology, 1997, edited by Masakazu Hatanaka, Asakura Publishing Co., Ltd., p. 222-223

Непатентный документ 3: M. Azetaka, et. al, 1980, Jpn. J. Vet. Sci. 43: 243-255

Непатентный документ 4: Virus Jikkengaku Sohron edited by Gakuyukai, the National Institute of Health, 1973: 61, 113, 131, and 166-176

Непатентный документ 5: P. A. Bachmann, 1972, Proc. Soc. Exp. Biol. Med. (140) 4: 1369-1374

Непатентный документ 6: P. A. Bachmann et al., 1976, Zbl. Vet. Med. B., No. 23: 355-363

Непатентный документ 7: Virus Jikkengaku Kakuron, 1973, edited by Gakuyukai, the National Institute of Health, p. 22-23.

СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

ТЕХНИЧЕСКАЯ ЗАДАЧА

[0011] Как описано выше, существует необходимость получения парвовируса с высоким титром инфекционности для применения при оценке вирусной безопасности фармацевтических или биологических продуктов или при получении вакцин.

[0012] Кроме того, существует необходимость получения парвовируса с высоким титром инфекционности также для применения при оценке вирусной безопасности способов получения биологических продуктов, как описано выше. Тест на вирусную безопасность с помощью удаления вирусов фильтрацией осуществляют при моделировании стадии, при которой фактический способ получения осуществляют в уменьшенном масштабе. Для этого теста на вирусную безопасность требуется: во-первых, добавление вирусной суспензии в количестве, не вызывающем забивание фильтра; во-вторых, добавляемое количество должно представлять собой количество, дающее величину логарифмического сокращения (LRV) 4 или более, где величина представляет собой величину вирусной безопасности оцениваемой стадии. В первом случае требуется, чтобы добавляемое количество не вызывало забивание в результате добавления вируса, потому что различные параметры, включая скорость тока на этой стадии, должны быть равны параметрам фактического способа получения (WHO Technical Report, Series No. 924, 2004 162-165). Для достижения этого желательно добавление 1% или менее, предпочтительно 0,1% или менее в плане отношения объемов. Во втором случае, так как стадия, имеющая LRV 4 или более, рассматривается как робастная, эффективная и надежная стадия процесса удаления вируса, требуется, чтобы количество добавляемых вирусов представляло собой количество, способное дать в результате LRV 4 или более (WHO Technical Report, Series No. 924, 2004 163-164). Таким образом, требуется, чтобы LRV как показатель осуществления удаления вирусов составляла 4 или более, и добавляемое количество суспензии вирусов к промежуточному продукту желательно составляло 1% или менее, предпочтительно 0,1% в плане отношения объемов. Однако становится трудным достичь LRV 4 или более из-за таких проблем как потеря перед фильтрацией или количественная ошибка, когда добавляется 1% или 0,1% парвовируса с низким титром инфекционности, полученного с помощью традиционного способа культивирования (титр инфекционности: от 10⁵ до 10⁷ TCID₅₀/мл, [отношение {титр инфекционности парвовируса (TCID₅₀/мл)}:{концентрация загрязняющего белка (нг/мл)}=(менее 10):1]. В этом случае для получения LRV 4 или более без накладок объем добавляемого вируса должен быть увеличен, что, однако, вероятно, вызовет негативные эффекты, такие как забивание фильтра.

[0013] В последние годы качество удаления вирусов, когда вирусная нагрузка на единицу площади мембраны становится более высокой, чем при традиционной нагрузке, привлекает внимание в плане новых критериев оценки мембраны для удаления вирусов. При этой оценке более высокое количество раствора вирусов, чем при традиционном измерении, фильтруется так, что с повышением количества суспензии вирусов, более высокое количество загрязняющего белка, содержащегося в суспензии вирусов, фильтруется вместе с ними, приводя к увеличению вероятности возникновения негативных эффектов, таких как забивание фильтра. Следовательно, концентрацию загрязняющего белка, содержащегося в растворе вирусов, желательно дополнительно снизить.

[0014] Обычно для преодоления этой проблемы можно использовать способ концентрациивирусов с помощью осуществления метода ультрафильтрации и тем самым их осаждения и сходных методов. Такие методы, однако, одновременно концентрируют и загрязнения, что может неминуемо приводить к побочному влиянию загрязнений на результаты экспериментов или на фильтрацию через фильтр для удаления вирусов.

[0015] Кроме того, способ концентрации вируса с помощью ультрацентрифужного разделения в градиенте плотности, таком как ультрацентрифугирование в градиенте плотности цезия, ультрацентрифугирование в градиенте плотности сахарозы, является высоко трудоемким в проведении и требует трудоемкого квалифицированного исполнения метода. Кроме того, объем центрифужной пробирки для общих целей центрифугирования ограничен и это делает трудным масштабирование процесса, так что способ может обычно использоваться только в маломасштабном эксперименте, и промышленное использование такой стадии концентрации не практично.

[0016] Известен также способ получения суспензии вирусов с высоким титром инфекционности, сбора инфицированных клеток, повторное замораживание и оттаивание для принудительной и физической деструкции полученных клеток и тем самым сбора вируса, аккумулированного в клетках. Это представляет собой способ получения вирусов, обычно используемый для мелкого вируса мышей, но этот способ неминуемо вызывает смешивание вируса с большим количеством загрязнений в клетках-хозяевах.

[0017] Таким образом, предельно трудно использовать традиционный метод получения вирусов. Следовательно, существует потребность в способе более удобного и эффективного получения парвовируса высокой чистоты с высоким титром инфекционности без использования процедуры концентрации, такой как ультрацентрифужное разделение, требующее усложнения операции.

РЕШЕНИЕ ЗАДАЧИ

[0018] Авторы настоящего изобретения сначала обнаружили, что парвовирусы, имеющий титр инфекционности более высокий, чем получаемый обычным способом, получают путем инфицирования клеток-хозяев, имеющих плотность клеток в пределах существенно более низкого диапазона, который не использовался традиционно с посевным парвовирусом, при низкой множественности заражения (MOI) в пределах специфического диапазона и культивирования клеток-хозяев в течение предварительно определенного периода времени и сбора культурального супернатанта и, тем самым используется механизм роста, типичный для парвовируса (патент WO2014/080676).

[0019] Кроме того, с точки зрения решения описанной выше задачи авторы настоящего изобретения осуществили интенсивное исследование взаимоотношения между различными условиями (исходной плотностью клеток-хозяев или временем культивирования, включая время замены среды) в системе культивирования инокулированных клеток-хозяев посевным парвовирусом и пролиферации парвовируса и получения в результате этого вируса с титром инфекционности и чистотой. В результате неожиданно было обнаружено, что парвовирус, имеющий предельно высокий титр инфекционности и высокую чистоту, который не был получены традиционным методом, может быть получен с использованием способа, применяемого нетрадиционно, то есть способа, включающего определение количества клеток-хозяев во время инфицирования путем использования способа расчета, применяемого нетрадиционно, культивирования клеток-хозяев в течение предварительно определенного периода времени, замены культурального супернатанта бессывороточной средой один раз и сбора супернатанта после дополнительного культивирования в течение предварительно определенного периода времени.

При конкретном описании настоящее изобретение описывается следующим образом.

[1] Способ получения парвовируса с высокой степенью инфекционности и с высокой чистотой, включающий:

(a) стадию предварительного расчета каждые 24 часа зависимого от времени изменения плотности клеток в культуральном субстрате, когда клетки-хозяева инфицируются парвовирусом для каждой плотности клеток (A) при инфицировании вирусом;

(b) стадию определения на основе зависимого от времени изменения клеточной плотности, рассчитанной предварительно на стадии (a),

(b1) время (T_max) от инфицирования до времени пика зависимого от времени изменения плотности клеток,

(b2) плотность клеток (B_max) при T_max и A₁, которая представляет собой A, которая удовлетворяет следующему уравнению (1),

(b3) максимальную (A_max) плотность клеток A₁, при инфицировании вирусом и

(b4) A₂, которая удовлетворяет следующему уравнению (2),

B_max/A₁>1,2 Уравнение (1)

A_max≥A₂≥A_max/10 Уравнение (2)

(c) стадию инокуляции посевного парвовируса в культуральный субстрат, содержащий клетки-хозяева, имеющие плотность клеток A₂, где инфицирующий вирус, определенный в (b4) стадии (b), и сывороточная среда дают множественность заражения (MOI) от 0,001 до 0,1;

(d) стадию культивирования культивируемого продукта, содержащего клетки-хозяева и парвовирус, полученный на стадии (c), в течение периода времени T_max или более до менее (T_max+48) часов, где T_max определено в (b1) стадии (b);

(e) стадию замены культурального супернатанта, полученного на стадии (d) бессывороточной средой и культивирования в течение 12 часов или более; и

(f) стадию сбора содержащего парвовирус культурального супернатанта, полученного путем культивирования на стадии (e);

где на стадии (b) когда A, удовлетворяющая уравнению (1), отсутствует, стадии (a) и (b) осуществляют повторно путем использования другой плотности клеток A при инфицировании вирусом.

[2] Способ, описанный в [1], где клетки-хозяева представляют собой клетки, зависимые от адгезии.

[3] Способ, описанный в [1] или [2], где парвовирус представляет собой парвовирус свиней (PPV), парвовирус собак (CPV), мелкий парвовирус мышей (MVM), вирус крыс (RV), вирус H-1 (H-1), парвовирус кошек (FPV), парвовирус гусей (GPV) или парвовирус коров (BPV).

[4] Способ, описанный в любом из от [1] до [3], где стадия (e) представляет собой стадию замены культурального супернатанта бессывороточной средой и культивирования в течение 24 часов или более.

[5] Способ, описанный в любом из от [1] до [4], где стадия (b) включает стадию расчета B_max и A1', которая представляет собой A, которая удовлетворяет следующему уравнению (1'):

B_max/ A_1'≥2,0 Уравнение (1').

[6] Способ получения, описанный в любом из с [1] по [5], где культивирование на стадиях (d) и (e) осуществляют при температуре от 33°C или более до 39°C или менее.

[7] Способ получения, описанный в любом из с [1] по [6], где на стадиях (d) и (e), клетки-хозяева и парвовирус растут одновременно.

[8] Способ, описанный в любом из с [1] по [7], где стадия (f) включает стадию удаления свободных клеток-хозяев и остатков клеток-хозяев, содержащихся в культуральном супернатанте.

[9] Способ, описанный в [8], где стадию удаления осуществляют с использованием фильтрации через мембрану, имеющую размер пор от 0,2 мкм до 0,45 мкм.

[10] Парвовирус, имеющий титр инфекционности 10⁹ TCID₅₀/мл или более, полученный способом, описанным в любом из с [1] по [9].

[11] Парвовирус, происходящий из неконцентрированного супернатанта клеточной культуры, имеющий титр инфекционности 10⁹ TCID₅₀/мл или более и имеющий отношение {(титр инфекционности парвовируса (TCID₅₀/мл)}:{концентрация загрязняющего белка (нг/мл)} более 5000:1.

Полезные эффекты изобретения

[0021] В соответствии с настоящим изобретением парвовирус с высоким титром инфекционности и высокой чистотой может быть успешно и эффективно получен с помощью клеточной культуры. Это дает возможность исключить вредные эффекты, обусловленные более низким титром инфекционности и присутствием загрязняющих белков в процессе использования парвовируса.

ОПИСАНИЕ ВАРИАНТОВ ОСУЩЕСТВЛЕНИЯ

[0022] Вариант осуществления настоящего изобретения (который в настоящем документе далее будет обозначаться как «настоящий вариант осуществления») далее будет подробно описан в настоящем описании. Настоящее изобретение, однако, не ограничивается последующим вариантом осуществления и может быть модифицировано различным образом в пределах объема изобретения.

[0023] Настоящий вариант осуществления относится к способу получения парвовируса, имеющего такой высокий титр инфекционности как 10⁹ TCID₅₀/мл или более и имеющего титр вирусной инфекционности 5000 (TCID₅₀/мл)/(нг/мл) или более относительно концентрации загрязняющего белка, таким образом, имея высокую чистоту, включающему:

(a) стадию предварительного расчета каждые 24 часа зависимого от времени изменения плотности клеток в культуральном субстрате, когда клетки-хозяева инфицируются парвовирусом для каждой плотности клеток (A) при инфицировании вирусом;

(b) стадию определения на основе зависимого от времени изменения клеточной плотности, рассчитанной предварительно на стадии (a),

(b1) время (T_max) от инфицирования до времени пика зависимого от времени изменения плотности клеток,

(b2) плотность клеток (B_max) при T_max и A₁, которая представляет собой A, которая удовлетворяет следующему уравнению (1),

(b3) максимальную (A_max) плотность клеток A₁, при инфицировании вирусом и

(b4) A₂, которая удовлетворяет следующему уравнению (2),

B_max/A1>1,2 Уравнение (1)

A_max≥A2≥A_max/10 Уравнение (2)

(c) стадию инокуляции посевного парвовируса в культуральный субстрат, содержащий клетки-хозяева, имеющие плотность клеток A₂, где инфицирующий вирус, определенный в (b4) стадии (b), и сывороточная среда дают множественность заражения (MOI) от 0,001 до 0,1;

(d) стадию культивирования культивируемого продукта, содержащего клетки-хозяева и парвовирус, полученные на стадии (c), в течение периода времени T_max или более до менее (T_max+48) часов, где T_max определено в (b1) стадии (b);

(e) стадию замены культурального супернатанта, полученного на стадии (d), бессывороточной средой и культивирования в течение 12 часов или более; и

(f) стадию сбора содержащего парвовирус культурального супернатанта, полученного путем культивирования на стадии (e);

где на стадии (b), когда A, удовлетворяющая уравнению (1), отсутствует, стадии (a) и (b) осуществляют повторно путем использования другой плотности клеток A при инфицировании вирусом.

[0024] Стадия (a): сначала предварительно рассчитывают зависимое от времени изменение плотности клеток в культуральном субстрате, начиная от времени, когда клетки-хозяева парвовируса инфицируются парвовирусом, каждые 24 часа для каждой плотности клеток (A) при инфицировании вирусом. Клетки-хозяева могут выращиваться в субкультуре.

[0025] Парвовирус представляет собой вирус с небольшой линейной одноцепочечной ДНК. ДНК-вирус представляет собой вирус, обладающий геномной ДНК. Он синтезирует мРНК с геномной ДНК путем использования РНК-полимеразы клетки-хозяина, синтезирует белок на основе мРНК и растет. Большинство ДНК-вирусов содержат двухцепочечную ДНК, но парвовирус имеет линейную одноцепочечную ДНК в качестве геномной. Так как вирус не может расти, когда он имеет одноцепочечную ДНК, парвовирус обладает уникальным механизмом роста, при котором он начинает иметь двухцепочечную ДНК при использовании как РНК-полимеразы клетки-хозяина, так и ДНК-полимеразы и в результате растет.

[0026] В качестве вирусов, принадлежащих к семейству Parvoviridae, известны: три рода, принадлежащие к Parvovirinae, который представляет собой род Parvorivirus, который не нуждается в хелпере вируса для репликации вируса и растет автономно в клетке-хозяине, род Dependovirus, который нуждается в хелпере вируса, и род Erythrovirus, который специфически инфицирует эритроциты; и три рода, принадлежащие к Densovirinae, которые инфицируют насекомых, род Iteravirus и род денсовируса Aedes aegypti. В настоящем варианте осуществления термин «парвовирус» при использовании в настоящем варианте осуществления обозначает вирус, принадлежащий к роду Parvovirus. Вирусы, принадлежащие к роду Parvovirus, все имеют сходный механизм роста, так что способ по настоящему осуществлению может быть использован для них в целом.

[0027] Более конкретно, вирусы, принадлежащие к роду Parvovirus, не имеют ни хелперного белка для индукции метаболизма ДНК в клетках (покоящихся клетках), которые представляют собой клетки, чей рост находится в состоянии покоя, ни транскрипции двухцепочечной матрицы, так что они не могут экспрессировать их собственный ген до тех пор, пока механизм синтеза ДНК в клетке-хозяине не станет активным, начиная с S-фазы, и комплементарная цепь ДНК предоставляется клеткой-хозяином. Так как вирусы, принадлежащие к роду Parvovirus, не могут индуцировать метаболизм ДНК в клетках, чей рост находится в состоянии покоя, и, следовательно, не могут использовать их систему синтеза, они имеют механизм роста, при котором они инфицируют делящиеся и растущие клетки в S-фазе, и растут с ростом этих клеток.

[0028] Парвовирус (вирус, принадлежащий к роду Parvovirus) в настоящем варианте осуществления включает, но не ограничивается этим, парвовирус свиней (PPV), парвовирус собак (CPV), мелкий парвовирус мышей (MVM), вирус крыс (RV), вирус H-1 (H-1), парвовирус кошек (FPV), парвовирус гусей (GPV) или парвовирус коров (BPV). Эти вирусы аналогичны по размеру, структуре генома, структуре вирусной частицы и механизму роста, и они все подходят для применения в способе по настоящему варианту осуществления.

[0029] В настоящем варианте осуществления термин «парвовирус» обозначает как парвовирус, так и раствор парвовируса, который представляет собой раствор, содержащий парвовирус, если конкретно не указано иначе. Раствор парвовируса особенно не ограничивается до тех пор, пока он содержит парвовирус и он охватывает, например, культуральный супернатант после культивирования клетки-хозяина, инфицированной парвовирусом, и суспензию вирусов после удаления загрязнений из полученного культурального супернатанта.

[0030] «Клетка-хозяин» по настоящему варианту осуществления может представлять собой любой тип клеток до тех пор, пока они представляют собой клетки, восприимчивые к описанному выше парвовирусу (клетки, которые могут быть инфицированы парвовирусом). Примеры клеток, восприимчивых к парвовирусу, включают: клетки PK-13, клетки PK-15, клетки LCC-PK1, клетки ESK (эмбриональной почки свиней), клетки SK, клетки ST (семенников свиней) и клетки MPK (почки минисвиней), каждая из которых восприимчива к парвовирусу свиней; клетки MDCK (почки собак Mardin-Darby), клетки FEA (эмбриональных фибробластов кошек), клетки CRFK (почки кошек Crandell) и клетки FK-81 (эмбриональной почки кошек), каждая из которых восприимчива к парвовирусу собак; клетки A9 (фибробластов мыши) и клетки C6 (глиальные клетки мыши), каждая из которых восприимчива к мелкому вирусу мышей; клетки NRK (нормальной почки крыс), восприимчивые к вирусу крыс; клетки Molt-4 (T-клетки человека), клетки AV-1 (B-клетки человека) и клетки NC-37 (B-клетки человека), каждая из которых восприимчива к вирусу H-1; клетки CRFK, клетки Mya 1, клетки NLFK (Norden Laboratories Feline Kidney) и клетки A72, каждая из которых восприимчива к парвовирусу кошек; клетки GEF (эмбриональных фибробластов гусей), восприимчивые к парвовирусу гусей; и клетки BEK (эмбриональной почки коров), клетки-фибробласты легких буйволов и клетки EBTr (эмбриональной трахеи коров), каждая из которых восприимчива к парвовирусу коров. В качестве клетки-хозяина может быть предпочтительно использована клетка, вызывающая дегенерацию клетки в результате инфицирования. Например, клетки почки свиней могут быть использованы для парвовируса свиней, и клетки почки собак могут быть использованы для парвовируса собак. Клетка-хозяин не ограничивается клетками, описанными выше, клетки могут широко использоваться в качестве клеток-хозяев до тех пор, пока они представляют собой клетки, восприимчивые к парвовирусу, предпочтительно клетки, вызывающие дегенерацию клеток. В настоящем варианте осуществления в качестве «клетки-хозяина» могут быть использованы клетки животных, имеющие бесконечную способность к росту, и могут быть использованы клетки, обычно называемые «клеточной линией».

[0031] В настоящем варианте осуществления клетка-хозяин предпочтительно представляет собой клетку, зависимую от адгезии, с точки зрения легкости замены среды. «Клетка, зависимая от адгезии», представляет собой клетку, такую как мышечная клетка или клетка органа, которая не может выживать или расти без прикрепления к субстрату культуры. Клетка, зависимая от адгезии, культивируется после индукции ее прикрепления к поверхности дна или поверхности стенки культурального субстрата, такого как культуральный матрас или носитель, называемый микроносителем. Матрас или чашка Петри обычно используется для культивирования в небольшом масштабе. Культура с использованием микроносителя имеет преимущество в том, что она может быть легко успешно масштабирована (японский патент No. 398843, Успешный способ культивирования животных клеток с применением пористого носителя). В настоящем варианте осуществления могут быть также использованы плавающие клетки. «Плавающая клетка» растет в плавающем состоянии и культивируется в результате предоставления ей возможности стоять или перемешиваться, будучи суспендированной в среде. Плавающая клетка желательно культивируется при прикреплении, например, к микроносителю из-за трудности замены среды перед сбором культурального супернатанта.

[0032] В настоящем варианте осуществления «культуральный субстрат» не ограничивается по типу, и термин охватывает любой культуральный субстрат, обычно используемый в клеточной культуре, такой как культуральный сосуд, культуральный матрас, чашка Петри, вращающийся флакон или культуральный планшет.

[0033] Культивирование может быть осуществлено в условиях приблизительно 5% углекислого газа на среду, обычно используемую в данной области техники, такую как модифицированная среда Дульбекко-Игла (среда DMEM), среда Игла (среда MEM) или среда F-12, предпочтительно модифицированная среда Дульбекко-Игла (среда DMEM). Окружающая среда и условия культивирования не ограничиваются этим до тех пор, пока они подходят для роста клетки-хозяина. Температура культивирования может представлять собой температуру, подходящую для роста клеток-хозяев. Клетки-хозяева для парвовируса, как известно, растут в пределах диапазона от 33°С до 39°С (ʺIntroduction to Animal Cell Culturing Method (Biochemical Experimental Method 29), by Yutaka Matsutani/Gakkai Shuppan Centerʺ p. 14-15), так что температура культивирования может быть установлена предпочтительно на 33°С или выше и на 39°С или ниже, например, приблизительно на 37°С. Желательно использование среды, содержащей 10% или менее сыворотку животных (такую как сыворотка плодов телят, сыворотка телят или сыворотка лошадей), содержащую фактор роста клеток, и предпочтительным является использование той же среды, что и среда, используемая на стадиях (c) и (d), описываемых далее.

[0034] В настоящем варианте осуществления «титр инфекционности» представляет собой параметр, отражающий титр инфекционности вируса. Он имеет то же самое значение, что и «титр», часто используемый в производстве вирусов. Вирус невозможно увидеть даже при использовании оптического микроскопа, настолько он отличается от биологических клеток, плотность (количество вирусных частиц/объем) вируса не может быть измерена под микроскопом. Титр инфекционности, как параметр, позволяющий использовать способность инфицировать клетки-хозяева, применяется в качестве альтернативы количества или концентрации вируса. Например, когда добавляют суспензию вирусов, полученную путем разведения монослоя клеток-хозяев в подходящем отношении, количество вируса определяется как бляшка, и титр инфекционности может быть измерен в виде единицы, образующей бляшку (pfu/мл). Альтернативно, титр инфекционности может быть измерен как доза 50% инфицирования тканевой культуры (TCID₅₀)/мл, который представляет собой концентрацию, при которой инфицирование является позитивным у 50% клеток-хозяев при измерении при непрерывном разведении жидкости, содержащей вирус. В настоящем варианте осуществления используемый титр инфекционности парвовируса может быть измерен как TCID₅₀/мл, и титр инфекционности может быть выражен как TCID₅₀/мл. Титр инфекционности парвовируса может быть выражен с помощью другого параметра, такого как pfu/мл. В случае парвовируса, чей титр инфекционности может быть измерен с помощью другого параметра, легко может быть достигнут перевод между различными параметрами путем измерения титра инфекционности суспензий того же парвовируса с помощью этих двух параметров одновременно.

[0035] В настоящем варианте осуществления «расчет каждые 24 часа зависимого от времени изменения плотности клеток в культуральном субстрате, когда клетки-хозяева инфицируются парвовирусом», может быть осуществлен путем инокуляции клеток-хозяев, которые инфицированы парвовирусом при предварительно определенной множественности заражения (MOI), в культуральный сосуд, сбора полученных клеток каждые 24 часа и затем подсчета количества клеток в культуральном субстрате. Термин «множественность заражения» при применении в настоящем описании обозначает отношение добавленного количества вируса к количеству клеток-хозяев и представляется как (титр инфекционности вируса)/(количество клеток-хозяев). После того как клетки инфицированы парвовирусом, клетки сначала растут, и плотность клеток в культуральном субстрате повышается. После прохождения предварительно определенного времени клетки сенсибилизируются вирусом и начинают погибать, так что плотность клеток снижается после того как она достигает пика. Такое зависимое от времени изменение рассчитывается для каждой из культур, классифицируемых в соответствии с количеством клеток-хозяев при инфицировании парвовирусом.

[0036] Количество клеток может быть подсчитано с помощью метода, известного специалистам в данной области техники, например, следующим образом. Сначала небольшое количество протеиназы, такой как трипсин, или хелатирующий агент, такой как ЭДТА, или их смесь добавляют к клеткам, которые прикреплены к клеточному субстрату, для отъединения клеток-хозяев от культурального сосуда. После этого раствор клеток, высвобожденный таким образом, разводят средой, содержащей сыворотку, для подавления действия на высвобождение клеток, разведенный раствор вливают в гемоцитометр или тому подобное, и количество клеток считают под микроскопом. Альтернативно, количество клеток может быть рассчитано с использованием клеточного сортера или цитометра.

[0037] На стадии (a) настоящего варианта осуществления зависимое от времени изменение клеточной плотности после инфицирования рассчитывают каждые 24 часа для каждой из соответствующих различных плотностей клеток (A) при инфицировании вирусом. Способ выбора количества клеток при инфицировании вирусом на стадии (a) особенно не ограничивается до тех пор, пока A, которая удовлетворяет уравнению (1), может быть выбрана на стадии (b), которая будет описана ниже. Если не обнаруживается A, которая удовлетворяет уравнению (1) на стадии (b), стадии (a) и (b) могут быть осуществлены повторно с другой A.

В одном аспекте при клеточной плотности клеток-хозяев в конфлюэнтной стадии (эта плотность клеток будет называться в настоящем описании далее как «С») в виде стандарта в качестве A может быть выбрано приблизительно от C до C/100, например, приблизительно C, C/3, C/10, C/30 и C/100.

[0038] Стадия (b): подходящая плотность клеток при инфицировании вирусом определяется на основе зависимого от времени изменения плотности клеток, рассчитанного в соответствии со стадией (a).

(b1) Клетки-хозяева, инфицированные парвовирусом, растут в течение определенного времени после инфицирования, но затем их рост достигает своего пика, они гибнут в результате сенсибилизации вирусом, так что сначала определяют время от инфицирования до времени пика зависимого от времени изменения плотности клеток (T_max).

[0039] (b2) Затем определяют плотность клеток при T_max (B_max), и A₁, которая представляет собой A, которая удовлетворяет следующему уравнению (1).

B_max/A₁>1,2 Уравнение (1)

В случае механизма роста, характерного для парвовируса, вирус и клетки-хозяева растут одновременно, так что подходящее количество клеток A₁ при инфицировании вирусом, как предполагается, является таким, что количество клеток на пике времени T_max становится увеличенным более чем в 1,2 раза, например, в 1,5 раз или более, в 1,75 раз или более, более предпочтительно в 2,0 раза или более по сравнению с количеством клеток (A) при инфицировании вирусом. Не будучи связанными с теорией, когда A является слишком большой, предполагается, что клетки-хозяева сами не могут расти, потому что количество клеток близко к количеству клеток в конфлюэнтном состоянии и в результате B_max/A₁ имеет тенденцию к снижению, приводя к снижению количества вируса, продуцируемого на клетку.

[0040] (b3) Затем определяют максимум (A_max) плотности клеток A₁ при инфицировании вирусом.

(b4) A₂, которая удовлетворяет следующему уравнению (2), определяют на основе полученной A_max.

A_max≥A2≥A_max/10 Уравнение (2)

Когда A слишком мала, время пика плотности клеток (B_max) не ограничивается культуральным субстратом, так что B_max/A₁ поддерживается на высоком уровне, и количество продуцируемого вируса на клетку достигает своего предела. С другой стороны, концентрация вируса зависит от количества клеток-хозяев, так что, предполагается, что, так как A становится меньше, концентрация вируса имеет тенденцию к снижению.

На стадии (a) выбирают некоторые As, и подходящее число A клеток при инфицировании вирусом, как предполагается, является максимумом A (A_max) в A₁, которая представляет собой A в том случае, когда B_max/A удовлетворяет уравнению (1). Кроме того, парвовирус с высоким титром инфекционности и высокой чистотой может быть собран даже в результате снижения плотности клеток при инфицировании вирусом на приблизительно 1/10 от A_max. Не будучи связанными с теорией, предполагается, что даже если возникает некоторое снижение A относительно A_max, продуцируемое количество вируса на клетку повышается при снижении A так, что окончательно доступная концентрация парвовируса остается неизменной.

[0041] Стадия (с): затем посевной парвовирус инокулируют в культуральный субстрат, содержащий клетки-хозяева, имеющие подходящую плотность клеток A₂, определенную на стадии (b), и сывороточную среду, с получением MOI от 0,001 до 0,1.

[0042] На стадии (с) может быть получен культуральный субстрат, содержащий клетки-хозяева, имеющие подходящую плотность клеток, путем инокуляции клеток-хозяев в культуральный субстрат при плотности клеток вначале меньшей, чем A₂, и культивирования в течение предварительно определенного времени для повышения плотности клеток до A₂; или путем инокуляции сывороточной среды, содержащей клетки-хозяева, в количестве, дающем плотность клеток A₂ в культуральном субстрате. В качестве сывороточной среды может быть использована модифицированная среда Дульбекко-Игла (среда DMEM), среда Игла (среда MEM) или среда F-12, или тому подобные среды, содержащие, например, от 0,5% до 15%, предпочтительно от 1% до 10% сыворотки животных, такой как сыворотка плодов телят, сыворотка телят или сыворотка лошадей.

[0043] Важной характеристикой настоящего изобретения является то, что количество клеток при инфицировании вирусом определяют не на основе времени удвоения клеток-хозяев, не инфицированных вирусом, или их параметров в состоянии конфлюэнтности, а на основе зависимости от времени изменения клеточной плотности клеток-хозяев, инфицированных парвовирусом, как описано выше. Когда способ инфицирования вирусом клеток-хозяев в состоянии конфлюэнтности выполняется в соответствии с традиционными указаниями способа получения вируса, рост клеток-хозяев, инфицированных парвовирусом, не наблюдается. Клетки-хозяева дегенерируют из-за инфицирования и продолжают гибнуть. В настоящем варианте осуществления, с другой стороны, изобретатели настоящего изобретения успешно получили парвовирус с высоким титром инфекционности и высокой чистотой путем проведения инфицирования парвовирусом при плотности клеток-хозяев, которые имеет большое пространство, позволяющее клеткам-хозяевам расти в определенном отношении или более даже после инфицирования вирусом. Хотя в прошлом обнаружен метод с началом инфицирования при заметно низкой плотности клеток и возможностью одновременного осуществления роста клеток-хозяев и роста парвовируса (патент WO2014/080676), но парвовирус, имеющий более высокий титр инфекционности и более высокую чистоту, чем парвовирус, получаемый указанным выше методом, может быть получен с помощью настоящего варианта осуществления.

[0044] Затем на стадии (с) посевной парвовирус инокулируют в культуральный субстрат, содержащий клетки-хозяева, полученные, как описано выше, и имеющие клеточную плотность A2 с получением множественности заражения (MOI) от 0,001 до 0,1. Инокуляция посевного парвовируса может быть осуществлена с получением MOI от 0,001 до 0,1 одновременно с инокуляцией клеток-хозяев в культуральный субстрат. Альтернативно, культивирование клеток-хозяев может быть начато при более низкой плотности клеток и, когда плотность клеток достигнет описанной выше плотности A₂, посевной вирус может быть инокулирован с получением MOI от 0,001 до 0,1. Описанная выше предварительно определенная MOI представляет собой диапазон величин, обычно используемых в процессе роста парвовируса, и величины в пределах этого диапазона не влияют неблагоприятно на объект сбора - вирус с высокой концентрацией и высокой чистотой.

[0045] Стадия (d): после инокуляции посевного парвовируса культивируемый продукт, содержащий парвовирус и клетки-хозяева, культивируют в течение предварительно определенного времени. На стадии (d) рост клеток-хозяев и парвовируса происходит одновременно. Время культивирования представляет собой, как определено в (b1) стадии (b), (T_max), которое представляет собой время от инфицирования вирусом до времени пика зависимого от времени изменения клеточной плотности, или более до менее чем (T_max+48) часов, например, от T_max или более до (T_max+36) часов или менее, предпочтительно от T_max или более до (T_max+30) часов или менее, более предпочтительно от T_max или более до (T_max+24 часа) или менее. В процессе культивирования в течение предварительно определенного периода времени большинство посевных вирусов, которыми инфицированы клетки-хозяева, перехватывают функцию клеток-хозяев, дуплицируют себя в клетках-хозяевах и остаются в клетках.

[0046] Стадия (e): культуральный супернатант, полученный путем культивирования в течение предварительно определенного времени на стадии (d), содержит большое количество загрязняющих белков, происходящих из сыворотки, но многие из клеток-хозяев, инфицированных вирусом, все еще продолжают прикрепляться к культуральному субстрату. В настоящем варианте осуществления загрязняющие белки могут быть удалены, и парвовирус с высокой чистотой может быть собран путем замены сывороточной среды, используемой при культивировании, на бессывороточную среду. В качестве бессывороточной среды может быть использована среда, описанная на стадии (с), но не содержащая сыворотку.

[0047] После замены среды путем культивирования в течение 12 часов или более, предпочтительно в течение 18 часов или более, более предпочтительно в течение 24 часов или более, вирус высвобождается из клеток-хозяев, инфицированных вирусом, и может быть получен супернатант, содержащий вирус. Культивирование в течение 36 часов или более после замены среды, как предполагается, не влияет на титр инфекционности полученного парвовируса. Следовательно, с точки зрения стоимости культивирования время культивирования после замены среды устанавливается предпочтительно на 36 часов или менее.

[0048] Температура культивирования во время культивирования на стадиях (d) и (e) может быть установлена как температура, подходящая для роста клеток-хозяев, предпочтительно 33°С или выше и 39°С или ниже, например, приблизительно 37°С. Предпочтительно культивирование осуществляют в условиях, сходных с условиями культивирования на стадии (a). Следовательно, температура культивирования желательно устанавливается как температура, сопоставимая с температурой, при которой клеточная плотность клеток-хозяев, инфицированных парвовирусом, рассчитывается перед стадией (a).

[0049] Стадия (f): после культивирования в течение предварительно определенного времени собирается культуральный супернатант, содержащий парвовирус. При традиционном способе инфицированные клетки-хозяева разрушаются в результате повторяющихся циклов замораживания и оттаивания инфицированных клеток-хозяев для сбора вируса. В этом способе, однако, большое количество загрязнений высвобождается из клеток-хозяев во время их разрушения. В способе сбора культурального супернатанта, как предлагается в настоящем варианте осуществления, хотя неизбежной является примесь загрязнений, происходящих из клеток-хозяев, разрушенных вирусом, количество загрязнений крайне низко по сравнению с количеством в случае, когда клетки-хозяева разрушаются в результате замораживания и оттаивания. Кроме того, замена культурального супернатанта парвовируса и клеток-хозяев бессывороточной средой существенно снижает количество загрязнений, происходящих из сыворотки, по сравнению с культивированием с использованием только сывороточной среды. В настоящем варианте осуществления, следовательно, парвовирус с высоким титром инфекционности и высокой чистотой может быть легко собран из культурального супернатанта.

[0050] С помощью описанного выше способа по настоящему варианту осуществления может быть получен парвовирус с таким высоким титром инфекционности как 10⁹ TCID₅₀/мл.

[0051] Сбор на стадии (f) может включать стадию удаления загрязнений, таких как свободные клетки-хозяева и обломки клеток-хозяев. Эта стадия удаления может быть достигнута с помощью низкоскоростного центрифужного разделения в известных условиях. Альтернативно или дополнительно загрязнения могут быть удалены путем фильтрации через мембрану, имеющую размер пор от 0,1 до 0,5 мкм, предпочтительно от 0,2 до 0,45 мкм.

[0052] Сбор на стадии (f) может осуществляться предпочтительно без концентрации культурального супернатанта. Концентрирование загрязнений из-за стадии концентрации, которая будет описана ниже, следовательно, не будет происходить, и парвовирус с высокой чистотой может быть легко получен.

[0053] Как описано выше, путем осуществления культивирования и сбора парвовируса, может быть получен парвовирус с высокой чистотой, имеющий отношение {титр инфекционности парвовируса (TCID₅₀/мл)}:{концентрация загрязняющего белка (нг/мл)} более 5000:1, предпочтительно более 9000:1. Примеры «загрязнений» включают свободные клетки-хозяева или обломки клеток-хозяев, и белки, происходящие от клеток-хозяев или компонентов сыворотки. Свободные клетки-хозяева или обломки клеток-хозяев имеют большие размеры и легко могут быть удалены с помощью известного метода, такого как описанное выше центрифужное разделение или фильтрация, так что в одном аспекте настоящего варианта осуществления концентрация белка используется в качестве индекса, демонстрирующего отношение присутствующих загрязнений к вирусу.

Концентрация загрязняющего белка может быть измерена с использованием метода, известного специалистам в данной области техники, например, как представлено в примерах ниже, с помощью метода BCA, использующего коммерчески доступный реагент для определения белка, или тому подобного.

[0054] Настоящий вариант осуществления также относится к парвовирусу с высоким титром инфекционности и с высокой чистотой, происходящему из неконцентрированного супернатанта клеточной культуры.

В настоящем варианте осуществления термин «концентрирование» обозначает повышение концентрации вируса после концентрации по сравнению с концентрацией перед концентрированием, что означает повышение титра инфекционности. В одном аспекте парвовирус по настоящему варианту осуществления представляет собой парвовирус с высокой чистотой, полученный из культурального супернатанта без такого концентрации и, следовательно, не имеющий концентрированного загрязнения в результате концентрации.

Конкретные примеры метода концентрации включают: центрифугирование в градиенте плотности, например, ультрацентрифугирование в градиенте плотности цезия, ультрацентрифугирование в градиенте плотности сахарозы; ультрацентрифужное разделение; катионообменную колоночную хроматографию; ультрафильтрацию; фильтрацию тангенциальным потоком; химически индуцируемую преципитацию; хроматографию вируса адсорбционного типа; индуцируемую полимером агрегацию; и мембранную адсорбцию.

Методы, отличные от метода концентрации, включают центрифужное разделение (центрифужное разделение при 10000×g или менее и 100000×g⋅час или менее), отличное от ультрацентрифужного разделения, и фильтрацию через дезинфицирующую мембрану. Более конкретные примеры включают метод очистки, описанный ниже в примерах.

[0055] Как описано выше, парвовирус, имеющий низкую концентрацию загрязняющего белка и, следовательно, имеющий высокую чистоту и имеющий такой высокий титр инфекционности как 10⁹ TCID₅₀/мл или более, может быть получен в соответствии с настоящим вариантом осуществления, создавая возможность преодоления различных негативных эффектов, которые наступили бы в другом случае из-за недостаточного титра инфекционности в момент использования парвовируса. Далее в настоящем документе будут описаны три типичных варианта использования вируса.

[0056] Когда вирус используется для первого варианта применения, это значит для исследовательских целей, таких как поиск противовирусных агентов, присутствие загрязнений может иметь неблагоприятное последствие, такое как ингибирование предполагаемой реакции. Следовательно, необходимо получить вирус, имеющий титр инфекционности более высокий, чем титр вируса, фактически предлагаемого для тестирования ранее, и предложить его для исследования после его разведения во избежание влияния загрязнений. Для возможности измерения высокой вирусной ингибирующей активности при тестировании должен предлагаться вирус с высоким титром инфекционности, так что требуется вирус, имеющий более высокий титр инфекционности, чем этот. Это означает, что вирусная нагрузка, доступная из клеточной культуры, желательно должна быть более высокой. В соответствии с настоящим вариантом осуществления может быть получен парвовирус, имеющий такой высокий титр инфекционности как 10⁹ TCID₅₀/мл или более. Это создает возможность предложения его для исследования противовирусных агентов с использованием парвовируса в качестве исследуемого материала после разведения и тем самым создавать возможность снижения неожиданной реакции или вмешательства, обусловленных загрязнениями.

[0057] Когда вирус используется для второго варианта применения, это значит для оценки вирусной безопасности способа получения биологических продуктов, желательно, чтобы получаемый вирус имел высокую чистоту и высокий титр инфекционности. Как описано выше, в этом тесте вирусной безопасности в первую очередь требуется, чтобы дополнительное количество суспензии вируса подгонялось так, чтобы не забивался фильтр, и, во-вторых, чтобы суспензию вируса добавляли в количестве, дающем величину логарифмического сокращения (LRV), которая представляет собой величину вирусной безопасности оцениваемой стадии, 4 или более. Для LRV, составляющей 4 или более, вирус должен быть добавлен к промежуточному продукту (продукту, предоставляемому для стадии удаления вируса фильтрацией), в количестве, дающем титр инфекционности вируса 10⁴ TCID₅₀/мл. При рассмотрении количественной ошибки титра инфекционности вируса потеря на стадии перед фильтрацией за счет удаления агрегатов вирусных частиц и возможность повышения нижнего лимита определения вируса (когда фильтрующийся раствор характеризуется цитотоксичностью, определение нижнего лимита вируса повышается из-за того, что титр инфекционности должен быть измерен после разведения профильтрованного раствора) создается необходимость добавлять вирус для получения титра инфекционности 10⁶ TCID₅₀/мл или более. Для того чтобы достичь 10⁶ TCID₅₀/мл или более путем добавления 0,1% по объему суспензии вируса, требуется, чтобы титр инфекционности исходной вирусной суспензии составлял 10⁹ TCID₅₀/мл. Парвовирус, имеющий высокую чистоту и имеющий такой высокий титр инфекционности как 10⁹ TCID₅₀/мл или более, может быть получен в соответствии с настоящим вариантом осуществления так, что становится возможным существенно снизить добавляемое количество парвовируса и преодолеть проблему забивания фильтра загрязнениями, связанными с парвовирусом. Как описано выше, в качестве нового стандарта оценки фильтра для удаления вируса в настоящее время привлекает внимание показатель удаления вируса, когда нагрузочное количество вируса на единицу области мембраны является более высоким, чем традиционное количество, например, показатель удаления вируса при 10¹³ TCID₅₀/м² или более загруженного вируса. Вирус, имеющий титр инфекционности 10⁸ TCID₅₀/мл и собираемый традиционным способом, может быть нагружен только при фильтрации 1 л раствора, содержащего 1% вируса по объему, через фильтр 0,001 м² (патент WO14/080676). Парвовирус, имеющий высокую чистоту и такой высокий титр инфекционности как 10⁹ TCID₅₀/мл или более, может быть получен в соответствии с настоящим вариантом осуществления так, что это позволяет создать нагрузочное количество вируса 10¹³ TCID₅₀/м² или более в тех же условиях фильтрации, что и описанные выше.

[0058] Для третьего варианта применения также для получения вакцин вирус с высокой чистотой и высоким титром инфекционности, получаемый с помощью клеточной культуры, имеет преимущества при получении, потому что загрузка на стадии очистки вирусной вакцины, проводимой в последующем, может быть снижена. Вирус, имеющий низкую чистоту, делает стадию очистки обременительной, и вирус с низким титром инфекционности делает стадию очистки обременительной из-за относительного повышения концентрации загрязнений. Такой вирус, следовательно, не выгоден для получения. Парвовирус, имеющий высокую чистоту и настолько высокий титр инфекционности как 10⁹ TCID₅₀/мл или более, может быть получен в соответствии с настоящим вариантом осуществления также таким образом, что при получении парвовирусной вакцины количество вакцины в неочищенном материале, предназначенном для очистки, существенно увеличивается, делая возможным осуществление стадии очистки вакцины более эффективным при более низкой стоимости.

ПРИМЕРЫ

[0059] Настоящее изобретение далее будет описано более подробно на основе примеров и сравнительных примеров. Примеры, представленные в настоящем описании, являются типичными примерами, и настоящее изобретение не ограничивается ими.

[0060] [Пример 1: Зависимое от времени изменение клеточной плотности после инфицирования парвовирусом [1]]

Использовали клетки-хозяева парвовируса свиньи (PPV), клетки PK-15 (полученные от ATCC, каталожный No. CCL-33, чувствительные к парвовирусу, зависимые от адгезии клетки). Их культивировали в среде, полученной путем добавления 10% сыворотки плодов телят к модифицированной среде Дульбекко-Игла (среда DMEM, продукт Life Technologies, No. продукта 11965-092) (эту среду, которую получали таким образом, далее в настоящем документе обозначали как «сывороточная среда» и ее равным образом применяли в примерах, описанных ниже), в матрасе для тканевой культуры, имеющем область основания 75 см² и объем 15 мл (этот матрас далее в настоящем документе обозначали как «матрас» и его равным образом применяли в примерах, описанных ниже) в среде 37°C and 5% CO₂.

[0061] Затем клетки PK-15 высвобождали из матраса и клетки-хозяева, имеющие плотность (A) 1,8×10⁷ клеток/матрас (образец 1a), 6,0×10⁶ клеток/матрас (образец 1b), 3,0×10⁶ клеток/матрас (образец 1c), 1,2×10⁶ клеток/матрас (образец 1d), 6,0×10⁵ клеток/матрас (образец 1e) и 1,0×10⁵ клеток/матрас (образец 1f) распределяли совместно с 10 мл сывороточной среды в новые матрасы, соответственно. Эти плотности клеток A при инфицировании вирусом считали как представляемые C/1,67, C/5, C/10, C/25, C/50 и C/300, соответственно, предполагая, что клеточная плотность (C) клеток PK-15 при конфлюэнтном росте составляет 3,0×10⁷ клеток/матрас.

Клетки, имеющие каждое состояние клеточной плотности, распределяли в 3 матраса. Затем PPV инокулировали в каждый из матрасов с получением MOI 0,01, и их культивировали в среде 37°C и 5% CO₂. Клетки на поверхности дна матраса собирали в тот момент времени, когда их культивирование осуществляли в течение 24 часов, 48 часов и 72 часов после начала инфицирования, и рассчитывали плотность клеток (B).

Количество клеток рассчитывали следующим образом. Сначала небольшое количество протеазы, такой как трипсин, или хелатирующего агента, такого как ЭДТА, или их смесь добавляли к клеткам, которые прикреплены к клеточному субстрату, для высвобождения клеток-хозяев из культурального сосуда. После того, как полученный таким образом раствор клеток разводили средой, содержащей сыворотку, для подавления активности клеток в отношении открепления, разведенный раствор вливали в гемоцитометр или тому подобное, и количество клеток подсчитывали под микроскопом.

[0062] Клеточная плотность во время инфицирования вирусом (A=количество клеток/матрас) и отношение (B/A), определяемое из этой A, и клеточной плотности, измеряемой каждые 24 часа культивирования (B=количество клеток/матрас), представлены в таблице 1. Клетки обычно гибнут с ходом времени при инфицировании вирусом, но клетки, инфицированные парвовирусом, продолжают расти. При любой плотности клеток A при инфицировании вирусом суммарное количество клеток, как показано, повышается до прохождения периода времени 48 часов. Когда, однако, проходит период времени 72 часа, клетки, сенсибилизированные вирусом, гибнут, и суммарное количество клеток, как показано, заметно снижается.

В пределах тестируемого диапазона A, как только клеточная плотность при инфицировании вирусом становится выше, скорость роста клеток после инфицирования имеет тенденцию к снижению. Но это не тот случай, когда чем ниже клеточная плотность при инфицировании вирусом, тем выше скорость роста после инфицирования.

[0063] [Таблица 1]

Таблица 1: Отношение (B/A) {клеточная плотность клеток, инфицированных парвовирусом, после культивирования (B=клетки/матрас)}:{клеточная плотность при инфицировании вирусом (A=клетки/матрас)}

Время, прошедшее после инфицирования (часы)	Клеточная плотность при инфицировании вирусом (A=клетки/матрас)
Образец 1a 1,8×107	Образец 1b 6,0×106	Образец 1c 3,0×106	Образец 1d 1,2×106	Образец 1e 6,0×105	Образец 1f 1,0×105
0	1	1	1	1	1	1
24	1,13	1,75	2,30	2,04	2,43	1,98
48	1,20	2,10	2,84	3,60	3,47	3,50
72	0,14	0,42	0,52	0,02	0,67	0,03

[0064] [Пример 2: Замена среды после культивирования клеток, инфицированных парвовирусом [1]]

Клетки PK-15 субкультивировали способом, сходным с представленным в примере 1. Клетки-хозяева, имеющие клеточную плотность, сходную с плотностью образцов с 1a по 1f, соответственно, каждые распределяли совместно с 10 мл сывороточной среды в 6 матрасов в соответствии с соответствующими условиями клеточной плотности (образцы с 2a по 2f). Затем PPV инокулировали в каждый из матрасов с получением MOI 0,01, с последующим культивированием в среде 37°C и 5% CO₂. Культуральный супернатант удаляли из каждого из матрасов в момент, когда культура существовала в течение 48 часов и 72 часов после начала инфицирования, и клетки на поверхности дна промывали бессывороточной средой DMEM (которая далее будет обозначаться как «бессывороточная среда»). После добавления 10 мл бессывороточной среды проводили дальнейшее культивирование, и культуральный супернатант бессывороточной среды собирали из каждого из матрасов через 24 часа, 48 часов и 72 часа. Собранный таким образом культуральный супернатант бессывороточной среды центрифугировали при 3000 об/мин в течение 20 минут, и фракцию супернатанта фильтровали через 0,45 мкм фильтр («Millex-HV», продукт Millipore).

[0065] Титр инфекционности PPV измеряли с использованием 96-луночного планшета с помощью метода TCID₅₀ на основе CPE, используя клеточную дегенерацию. 50% титр инфекционности рассчитывали методом Reed-Muench (Medical Virology, 2000, Nankodo Co., Ltd., p. 171-172). Результаты представлены в таблице 2. В отношении числовых величин, представленных в таблице 2, титр инфекционности выражается как логарифмическая величина. Например, титр инфекционности 9,1 обозначает 10^9,1 TCID₅₀/мл. Как представлено в таблице 2, титр инфекционности вируса, полученный таким образом в образцах с 2b по 2e, является настолько высоким как 10⁹ TCID₅₀/мл или более, тогда как этот титр в образцах 2a и 2f, составляет менее 10⁹ TCID₅₀/мл в этих условиях.

[0066] [Таблица 2]

Таблица 2: Титр PPV в культуральном супернатанте клеток, инфицированных парвовирусом, при изменении времени культивировании перед и после замены среды (единица: log[TCID₅₀/мл])

Время культивирования перед заменой среды (часы)	Время культивирования после замены среды (часы)	Плотность клеток при инфицировании вирусом (клетки/матрас)
Образец 2a 1,8×107	Образец 2b 6,0×106	Образец 2c 3,0×106	Образец 2d 1,2×106	Образец 2e 6,0×105	Образец 2f 1,0×105
48	24	8,9	9,2	9,6	9,1	9,1	8,1
	48	8,5	9,1	9,4	9,4	9,1	7,9
72	8,2	9,3	9,2	9,1	9,2	8,2
72	24	8,6	9,6	9,0	9,3	9,1	8,3
	48	8,7	9,3	9,3	9,6	9,4	8,1
72	8,6	9,0	9,5	9,2	9,3	8,0

[0067] Кроме того, концентрацию загрязняющего белка измеряли с использованием реагента для определения белка (метод BCA) от Thermo Scientific, и определяли отношение титра инфекционности PPV (TCID₅₀/мл) к концентрации загрязняющего белка (нг/мл). Результаты представлены в таблице 3. Как показано в таблице 3, парвовирус высокой чистоты, имеющий заметно низкое отношение загрязняющего белка, получен в образцах с 2b по 2e. В образцах 2a и 2f, с другой стороны, отношение загрязняющего белка у парвовируса, полученного таким способом, было высоким по сравнению с отношением в образцах с 2b по 2e.

[0068] [Таблица 3]

Таблица 3: Отношение {титр PPV в культуральном супернатанте клеток, инфицированных парвовирусом (единица: log[TCID₅₀/мл])}:{загрязняющий белок (нг/мл)} в случае изменения времени культивирования перед и после замены среды

Время культивирования перед заменой среды (час)	Время культивирования после замены среды (час)	Плотность клеток при инфицировании вирусом (клетки/матрас)
Образец 2a 1,8×107	Образец 2b 6,0×106	Образец 2c 3,0×106	Образец 2d 1,2×106	Образец 2e 6,0×105	Образец 2f 1,0×105
48	24	30000:1	22000:1	28000:1	24000:1	22000:1	5300:1
	48	3100:1	13000:1	20000:1	22000:1	15000:1	3700:1
72	1200:1	23000:1	10000:1	12000:1	22000:1	6800:1
72	24	4100:1	32000:1	9000:1	23000:1	22000:1	3400:1
	48	5100:1	28000:1	23000:1	30000:1	23000:1	3000:1
72	3700:1	14000:1	40000:1	12000:1	20000:1	4500:1

[0069] Условия культивирования для получения парвовируса с высоким титром инфекционности и высокой чистотой определяли на основе описанных выше результатов примера 1 и примера 2.

Сначала на основе примера 1 зависимое от времени изменение клеточной плотности после инфицирования записывали каждые 24 часа для каждой из клеточных плотностей (A) при инфицировании вирусом; записывали клеточную плотность (B_max) во время пика (T_max=48 часов в настоящем примере), соответствующую каждой из клеточных плотностей при инфицировании вирусом, и рассчитывали отношение B_max/A, служащее в качестве показателя скорости клеточного роста после инфицирования. Принимается во внимание, что выбор клеточной плотности при инфицировании вирусом, при которой B_max/A становится, по меньшей мере, 1,2 или более (например, 1,5 или более, предпочтительно 1,75 или более, более предпочтительно 2,0 или более), дает продукцию парвовируса с высоким титром инфекционности и высокой чистотой. Другими словами, принимается во внимание то, что важно, чтобы A₁ и B_max удовлетворяли следующему уравнению (1), для того, чтобы получить парвовирус с высоким титром инфекционности и высокой чистотой.

B_max/A1>1,2 Уравнение (1)

[0070] Кроме того, принималось во внимание то, что парвовирус с высоким титром инфекционности и высокой чистотой может быть получен, тогда когда плотность клеток при инфицировании вирусом является максимальной (A_max) среди плотностей клеток при инфицированием вирусом, при которой B_max/A становится, по меньшей мере, 1,2 или более. Кроме того, принималось во внимание то, что даже когда описанная выше плотность снижается приблизительно на 1/10, количество продукции вируса на клетку возрастает из-за снижения A так, что концентрация парвовируса, полученная в конце, не изменяется, и может быть собран парвовирус с высоким титром инфекционности и высокой чистотой. Другими словами, для получения парвовируса с высоким титром инфекционности и высокой чистотой считалось важным, чтобы клеточная плотность клеток-хозяев при инфицировании вирусом удовлетворяла следующему уравнению (2):

A_max≥A2≥A_max/10 Уравнение (2)

[0071] На основе примера 2 считалось, что парвовирус с высоким титром инфекционности и высокой чистотой может быть получен путем доведения плотности клеток при инфицировании вирусом до пределов описанного выше диапазона, замены культурального супернатанта бессывороточной средой в то время, когда зависимое от времени изменение клеточной плотности достигает пика или после прохождения предварительно определенного периода времени после времени пика, и культивирования в течение предварительно определенного времени, например, в течение 12 часов или более, предпочтительно в течение 18 часов или более, более предпочтительно в течение 24 часов или более.

[0072] [Сравнительный пример 1]

Способом, сходным со способом примера 1, субкультивировали клетки PK-15. Клетки-хозяева, имеющие плотность, сходную с плотностью образцов с 1b по 1e, соответственно, каждые распределяли совместно с 10 мл сывороточной среды в 3 матраса в соответствии с условиями соответствующей клеточной плотности (образцы с 3b по 3e). Затем PPV инокулировали в каждый из матрасов с получением MOI 0,01 с последующим культивированием в среде 37°C и 5% CO₂. Культуральный супернатант удаляли из каждого из матрасов в момент, когда культура существовала в течение 96 часов после начала инфицирования, и клетки на поверхности дна матраса промывали бессывороточной средой DMEM (которую обозначали в настоящем описании далее как «бессывороточная среда»). После добавления 10 мл бессывороточной среды культивирование продолжали, и культуральный супернатант бессывороточной среды собирали из каждого из матрасов через 24 часа, 48 часов и 72 часа, соответственно. Собранный таким образом бессывороточный культуральный супернатант центрифугировали при 3000 об/мин в течение 20 минут (1710×g, 20 минут=570×g⋅час), и супернатантную фракцию фильтровали через 0,45 мкм фильтр (продукт Millipore).

[0073] Титр инфекционности PPV измеряли с использованием 96-луночного планшета с помощью метода, сходного с методом примера 2. Результаты представлены в таблице 4. Как представлено в таблице 4, соответствующие титры инфекционности вирусов, полученные в образцах с 3b по 3e, были низкими при любых условиях по сравнению с образцами с 2b по 2e, имеющими клеточную плотность при инфицировании вирусом, равную плотности образцов с 3b по 3e, соответственно, и не достигали 10⁹ TCID₅₀/мл или более. Было установлено, что время культивирования перед заменой среды имеет влияние на титр инфекционности получаемого таким образом вируса.

[0074] [Таблица 4]

Таблица 4: Титр PPV в культуральном супернатанте клеток, инфицированных парвовирусом, при культивировании, осуществляемом в течение 96 часов после инфицирования и последующем изменении времени культивирования после замены среды (единица: log[TCID₅₀/мл])

Время культивирования перед заменой среды (часы)	Время культивирования после замены среды (часы)	Клеточная плотность при инфицировании вирусом (клетки/матрас)
Образец 3b 6,0×106	Образец 3c 3,0×106	Образец 3d 1,2×106	Образец 3e 6,0×105
96	24	8,2	8,5	7,9	8,0
	48	8,0	8,2	8,2	8,0
72	8,0	8,3	8,3	8,2

[0075] Кроме того, способом, сходным со способом примера 2, определяли отношение титра инфекционности PPV (TCID₅₀/мл) к концентрации загрязняющего белка (нг/мл). Результаты представлены в таблице 5. Пропорция загрязняющего парвовирус белка, полученная в образцах с 3b по 3e, была выше, чем пропорция, полученная в образцах с 2b по 2e, имеющих клеточную плотность при инфицировании вирусом, равную плотности образцов с 3b по 3e, соответственно. Было установлено, что время культивирования перед заменой среды также имеет влияние на чистоту вируса, получаемого таким образом.

Из результатов примера 2 и сравнительного примера 1 заключается, что парвовирус с высоким титром инфекционности и высокой чистотой может быть получен путем замены бессывороточной средой после того как культивирование осуществлялось в течение менее 48 часов от времени, когда зависимое от времени изменение клеточной плотности достигает пика, например, в пределах 36 часов, предпочтительно в пределах 30 часов, более предпочтительно в пределах 24 часов.

[0076] [Таблица 5]

Таблица 5: Отношение {титр PPV в культуральном супернатанте клеток, инфицированных парвовирусом (единица: log[TCID₅₀/мл])}:{загрязняющий белок (нг/мл)}, когда культивирование осуществляется в течение 96 часов после инфицирования и затем изменяется время культивирования после замены среды

Время культивирования перед заменой среды (часы)	Время культивирования после замены среды (часы)	Плотность клеток при инфицировании вирусом (клетки/матрас)
Образец 3b 6,0×106	Образец 3c 3,0×106	Образец 3d 1,2×106	Образец 3e 6,0×105
96	24	3400:1	6500:1	1000:1	5000:1
	48	4000:1	6000:1	2300:1	1800:1
72	4300:1	4100:1	4600:1	3300:1

[0077] [Пример 3: Зависимое от времени изменение клеточной плотности после инфицирования парвовирусом [2]]

В качестве клеток-хозяев мелкого вируса мышей (MVM) использовали клетки A9 (полученные от ATCC, каталожный No. CCL-1.4, чувствительные к парвовирусу, зависимые от адгезии клетки), и их субкультивировали в сывороточной среде в матрасе в среде 37°C и 5% CO₂.

[0078] Затем клетки A9 высвобождали из матраса, и клетки-хозяева, имеющие клеточную плотность (A) 6,0×10⁶ клеток/матрас (образец 4a), 3,0×10⁶ клеток/матрас (образец 4b), 1,5×10⁶ клеток/матрас (образец 4c), 6,0×10⁵ клеток/матрас (образец 4d), 3,0×10⁵ клеток/матрас (образец 4e) и 1,0×10⁵ клеток/матрас (образец 4f) распределяли совместно с 10 мл сывороточной среды в новые матрасы, соответственно. Эти плотности клеток A при инфицировании вирусом считали как представляемые C/5, C/10, C/20, C/50, C/100 и C/300, соответственно, предполагая, что клеточная плотность (C) клеток A9 при конфлюэнтном росте составляет 3,0×10⁷ клеток/матрас.

Клетки, имеющие соответствующее состояние клеточной плотности, каждые распределяли в 3 матраса. Затем MVM инокулировали в каждый из матрасов с получением MOI 0,01, и затем культивировали в среде 37°C и 5% CO₂. Клетки на поверхности дна матраса собирали в тот момент времени, когда их культивирование осуществляли в течение 72 часов, 96 часов и 120 часов после начала инфицирования, и рассчитывали плотность клеток (B).

Количество клеток рассчитывали следующим образом. Сначала небольшое количество протеазы, такой как трипсин, или хелатирующего агента, такого как ЭДТА, или их смеси добавляли к клеткам, которые прикреплены к клеточному субстрату, и клетки-хозяева высвобождались из культурального сосуда. После того, как раствор высвобожденных таким образом клеток разводили средой, содержащей сыворотку, для подавления активности клеток в отношении открепления, разведенный раствор вливали в гемоцитометр или тому подобное, и количество клеток подсчитывали под микроскопом.

[0079] Клеточная плотность во время инфицирования вирусом (A=количество клеток/матрас) и отношение (B/A), определяемое из этой A и клеточной плотности, измеряемой каждые 24 часа культивирования (B=количество клеток/матрас) представлены в таблице 6. Клетки обычно гибнут с ходом времени при инфицировании вирусом, но клетки, инфицированные парвовирусом, продолжают расти. При любой плотности клеток A при инфицировании вирусом суммарное количество клеток, как показано, повышается до прохождения периода времени 72 часа. Когда, однако, проходит период времени 96 часов, клетки, сенсибилизированные вирусом, гибнут, и суммарное количество клеток, как показано, снижается.

В пределах тестируемого диапазона A, как только клеточная плотность при инфицировании вирусом становится выше, скорость роста клеток после инфицирования имеет тенденцию к снижению. Но это не тот случай, когда чем ниже клеточная плотность при инфицировании вирусом, тем выше скорость роста после инфицирования.

[0080] [Таблица 6]

Таблица 6: Отношение (B/A) {клеточная плотность клеток, инфицированных парвовирусом, после культивирования (B=клетки/матрас)}:{клеточная плотность во время инфицирования вирусом (A=клетки/матрас)}

Время, прошедшее после инфицирования (часы)	Плотность клеток при инфицировании вирусом (A=клетки/матрас)
Образец 4a 6,0×106	Образец 4b 3,0×106	Образец 4c 1,5×106	Образец 4d 6,0×105	Образец 4e 3,0×105	Образец 4f 1,0×105
0	1	1	1	1	1	1
72	1,09	1,49	2,30	3,04	3,42	2,97
96	1,18	2,21	4,17	4,60	4,90	4,25
120	1,11	2,17	3,91	4,52	3,76	3,11

[0081] [Пример 4: Замена среды после культивирования клеток, инфицированных парвовирусом [2]]

Клетки A9 субкультивировали способом, сходным с представленным в примере 3. Клетки-хозяева, имеющие клеточную плотность, сходную с плотностью у образцов с 4a по 4f, соответственно, каждые распределяли совместно с 10 мл сывороточной среды в 6 матрасов в соответствии с соответствующими условиями клеточной плотности (образцы с 5a по 5f). Затем MVM инокулировали в каждый из матрасов с получением MOI 0,01, с последующим культивированием в среде 37°C и 5% CO₂. Культуральный супернатант удаляли из каждого из матрасов в момент, когда культура существовала в течение 96 часов и 120 часов после начала инфицирования, и клетки на поверхности дна промывали бессывороточной средой. После добавления 10 мл бессывороточной среды проводили дальнейшее культивирование, и культуральный супернатант бессывороточной среды собирали из каждого из матрасов через 24 часа, 48 часов и 72 часа. Собранный таким образом культуральный супернатант бессывороточной среды центрифугировали при 3000 об/мин в течение 20 минут, и фракцию супернатанта фильтровали через 0,45 мкм фильтр («Millex-HV», продукт Millipore).

[0082] Титр инфекционности MVM измеряли способом, сходным со способом примера 2. Результаты представлены в таблице 7. В отношении числовых величин, представленных в таблице 7, титр инфекционности выражается как логарифмическая величина. Например, титр инфекционности 9,1 обозначает 10^9,1 TCID₅₀/мл. Как представлено в таблице 7, титр инфекционности вируса, полученный таким образом в образцах с 5b по 5e, является настолько высоким как 10⁹ TCID₅₀/мл или более, тогда как этот титр в образцах 5a и 5f, составляет менее 10⁹ TCID₅₀/мл в этих условиях.

[0083] [Таблица 7]

Таблица 7: Титр MVM в культуральном супернатанте клеток, инфицированных парвовирусом, при изменении времени культивировании перед и после замены среды (единица: log[TCID₅₀/мл])

Время культивирования перед заменой среды (часы)	Время культивирования после замены среды (часы)		Плотность клеток при инфицировании вирусом (клетки/матрас)
Образец 5a 6,0×106	Образец 5b 3,0×106	Образец 5c 1,5×106	Образец 5d 6,0×105	Образец 5e 3,0×105	Образец 5f 1,0×105
96	24	8,2	9,0	9,2	9,4	9,1	7,8
	48	7,8	9,0	9,5	9,1	9,0	8,5
72	7,9	9,3	9,2	9,0	9,0	7,5
120	24	8,5	9,1	9,3	9,1	9,2	8,2
	48	8,5	9,2	9,5	9,0	9,1	8,5
72	8,5	9,2	9,0	9,5	9,1	8,0

[0084] Кроме того, концентрацию загрязняющего белка измеряли с использованием реагента для определения белка (метод BCA) от Thermo Scientific, и определяли отношение титра инфекционности MVM (TCID₅₀/мл) к концентрации загрязняющего белка (нг/мл). Результаты представлены в таблице 8. Как показано в таблице 8, парвовирус высокой чистоты, имеющий заметно низкое отношение загрязняющего белка, получено в образцах с 5b по 5e. В образцах 5a и 5f, с другой стороны, отношение загрязняющего белка у парвовируса, полученного таким способом, было высоким по сравнению с отношением в образцах с 5b по 5e.

[0085] [Таблица 8]

Таблица 8: Отношение {титр MVM в культуральном супернатанте клеток, инфицированных парвовирусом (единица: log[TCID₅₀/мл])}:{загрязняющий белок (нг/мл)} при изменении времени культивирования перед и после замены среды

Время культивирования перед заменой среды (часы)	Время культивирования после замены среды (часы)		Плотность клеток при инфицировании вирусом (клетки/матрас)
Образец 5a 6,0×106	Образец 5b 3,0×106	Образец 5c 1,5×106	Образец 5d 6,0×105	Образец 5e 3,0×105	Образец 5f 1,0×105
96	24	5300:1	13000:1	17000:1	31000:1	12000:1	1200:1
	48	1100:1	24000:1	31000:1	16000:1	35000:1	4600:1
72	3900:1	16100:1	9400:1	9000:1	14000:1	1100:1
120	24	6300:1	22000:1	8900:1	19000:1	26000:1	5800:1
	48	8800:1	16000:1	26000:1	12000:1	9800:1	2700:1
72	4500:1	26000:1	20000:1	34000:1	16000:1	3800:1

[0086] Условия культивирования для получения парвовируса с высоким титром инфекционности и высокой чистотой определяли на основе описанных выше результатов примера 3 и примера 4.

Сначала на основе примера 3 зависимое от времени изменение клеточной плотности после инфицирования записывали каждые 24 часа для каждой из клеточных плотностей (A) при инфицировании вирусом; записывали клеточную плотность (B_max) во время пика (T_max=96 часов в настоящем примере), соответствующую каждой из клеточных плотностей при инфицировании вирусом; и рассчитывали отношение B_max/A, служащее в качестве показателя скорости клеточного роста после инфицирования. Принимаются во внимание результаты того, что выбор клеточной плотности при инфицировании вирусом, при которой B_max/A становится, по меньшей мере, 1,2 или более (например, 1,5 или более, предпочтительно 1,75 или более, более предпочтительно 2,0 или более), дает продукцию парвовируса с высоким титром инфекционности и высокой чистотой. Другими словами, принимается во внимание то, что важно, чтобы A₁ и B_max удовлетворяли следующему уравнению (1), для того, чтобы получить парвовирус с высоким титром инфекционности и высокой чистотой.

B_max/A1>1,2 Уравнение (1)

[0087] Кроме того, принималось во внимание то, что парвовирус с высоким титром инфекционности и высокой чистотой может быть получен, тогда когда плотность клеток при инфицировании вирусом является максимальной (A_max) плотностью клеток при инфицированием вирусом, при которой B_max/A становится, по меньшей мере, 1,2 или более. Кроме того, принималось во внимание то, что даже когда описанная выше плотность снижается приблизительно на 1/10, количество продукции вируса на клетку возрастает из-за снижения A так, что концентрация парвовируса, полученная в конце, не изменяется, и может быть собран парвовирус с высоким титром инфекционности и высокой чистотой. Другими словами, для получения парвовируса с высоким титром инфекционности и высокой чистотой считалось важным, чтобы клеточная плотность клеток-хозяев при инфицировании вирусом удовлетворяла следующему уравнению (2):

A_max≥A2≥A_max/10 Уравнение (2)

[0088] На основе примера 4 считалось, что парвовирус с высоким титром инфекционности и высокой чистотой может быть получен путем доведения плотности клеток при инфицировании вирусом до пределов описанного выше диапазона, замены культурального супернатанта бессывороточной средой в то время, когда зависимое от времени изменение клеточной плотности достигает пика или после прохождения предварительно определенного периода времени после времени пика, и культивирования в течение предварительно определенного времени, например, в течение 12 часов или более, предпочтительно в течение 18 часов или более, более предпочтительно в течение 24 часов или более.

[0089] [Сравнительный пример 2]

Способом, сходным со способом примера 3, субкультивировали клетки A9. Клетки-хозяева, имеющие плотность, сходную с плотностью образцов с 4b по 4e, соответственно, каждые распределяли в новый матрас (3 матраса для каждого образца) совместно с 10 мл сывороточной среды в соответствии с условиями соответствующей клеточной плотности (образцы с 6b по 6e). Затем MVM инокулировали в каждый из матрасов с получением MOI 0,01 с последующим культивированием в среде 37°C и 5% CO₂. Культуральный супернатант удаляли из каждого из матрасов в момент, когда культура существовала в течение 144 часов после начала инфицирования, и клетки на поверхности дна матраса промывали бессывороточной средой. После добавления 10 мл бессывороточной среды культивирование продолжали, и культуральный супернатант бессывороточной среды собирали из каждого из матрасов через 24 часа, 48 часов и 72 часа, соответственно. Собранный таким образом бессывороточный культуральный супернатант центрифугировали при 3000 об/мин в течение 20 минут (1710×g, 20 минут=570×g⋅час), и супернатантную фракцию фильтровали через 0,45 мкм фильтр (продукт Millipore).

[0090] Титр инфекционности MVM измеряли с использованием 96-луночного планшета с помощью метода, сходного с методом примера 2. Результаты представлены в таблице 9. Как представлено в таблице 9, соответствующие титры инфекционности вирусов, полученные в образцах с 6b по 6e, были низкими при любых условиях по сравнению с образцами с 5b по 5e, имеющими клеточную плотность при инфицировании вирусом, равную плотности образцов с 6b по 6e, соответственно, и не достигали 10⁹ TCID₅₀/мл или более. Было установлено, что время культивирования перед заменой среды имеет влияние на титр инфекционности получаемого таким образом вируса.

[0091] [Таблица 9]

Таблица 9: Титр MVM в культуральном супернатанте клеток, инфицированных парвовирусом, при культивировании, осуществляемом в течение 144 часов после инфицирования и последующем изменении времени культивирования после замены среды (единица: log[TCID₅₀/мл])

Время культивирования перед заменой среды (часы)	Время культивирования после замены среды (часы)	Плотность клеток при инфицировании вирусом (клетки/матрас)
Образец 6b 3,0×106	Образец 6c 1,5×106	Образец 6d 6,0×105	Образец 6e 3,0×105
144	24	8,1	7,9	8,5	7,5
	48	7,5	8,0	8,1	7,5
72	8,3	8,0	8,2	7,0

[0092] Кроме того, способом, сходным со способом примера 2, определяли отношение титра инфекционности MVM (TCID₅₀/мл) к концентрации загрязняющего белка (нг/мл). Результаты представлены в таблице 10. Пропорция загрязняющего белка, в парвовирусе, полученном в результате в образцах с 6b по 6e, была выше, чем пропорция, полученная в образцах с 5b по 5e, имеющих клеточную плотность при инфицировании вирусом, равную плотности образцов с 6b по 6e, соответственно. Было установлено, что время культивирования перед заменой среды также имеет влияние на чистоту вируса, получаемого таким образом.

Из результатов примера 4 и сравнительного примера 3 заключается, что парвовирус с высоким титром инфекционности и высокой чистотой может быть получен путем замены бессывороточной средой после осуществления культивирования в течение менее 48 часов от времени, когда зависимое от времени изменение клеточной плотности достигает пика, например, в пределах 36 часов, предпочтительно в пределах 30 часов, более предпочтительно в пределах 24 часов.

[0093] [Таблица 10]

Таблица 10: Отношение {титр MVM в культуральном супернатанте клеток, инфицированных парвовирусом (единица: log[TCID₅₀/мл])}:{загрязняющий белок (нг/мл)}, когда культивирование осуществляется в течение 144 часов после инфицирования и затем изменяется время культивирования после замены среды

Время культивирования перед заменой среды (часы)	Время культивирования после замены среды (часы)	Плотность клеток при инфицировании вирусом (клетки/матрас)
Образец 6b 3,0×106	Образец 6c 1,5×106	Образец 6d 6,0×105	Образец 6e 3,0×105
144	24	6300:1	3600:1	11000:1	1000:1
	48	2000:1	5000:1	3200:1	1500:1
72	8900:1	2800:1	4800:1	3300:1

Промышленная применимость

[0094] Парвовирус с высоким титром инфекционности и высокой чистотой может быть получен с использованием способа по настоящему изобретению. Этот парвовирус может использоваться для получения вирусного исследовательского материала для исследования противовирусных агентов, для получения вируса, используемого для оценки вирусной безопасности в процессе получения биологических продуктов (фармацевтических продуктов), для получения вакцин или тому подобного. Настоящее изобретение имеет промышленную применимость в этих областях деятельности.

[0095] По настоящей заявке испрашивается приоритет патентной заявки Японии No. 2015-218775, поданной 6 ноября 2015 г., содержание которой включено в настоящее описание в качестве ссылки.

1. Способ получения парвовируса, включающий:

(a) стадию предварительного расчета каждые 24 часа зависимого от времени изменения плотности клеток в культуральном субстрате, когда клетки-хозяева инфицируются парвовирусом, для каждой плотности клеток (A) при инфицировании вирусом;

(b) стадию определения на основе зависимого от времени изменения клеточной плотности, рассчитанной предварительно на стадии (a),

(b1) время (T_max) от инфицирования до времени пика зависимого от времени изменения плотности клеток,

(b2) плотность клеток (B_max) при T_max и A₁, которая представляет собой A, которая удовлетворяет следующему уравнению (1),

(b3) максимальную (A_max) плотность клеток A₁ при инфицировании вирусом и

(b4) A₂, которая удовлетворяет следующему уравнению (2),

B_max/A₁>1,2 Уравнение (1)

A_max≥A₂≥A_max/10 Уравнение (2)

(c) стадию инокуляции посевного парвовируса в культуральный субстрат, содержащий клетки-хозяева, имеющие плотность клеток A₂, где инфицирующий вирус, определенный в (b4) стадии (b), и сывороточная среда дают множественность заражения (MOI) от 0,001 до 0,1;

(d) стадию культивирования культивируемого продукта, содержащего клетки-хозяева и парвовирус, полученные на стадии (c), в течение периода времени T_max или более до менее (T_max+48) часов, где T_max определено в (b1) стадии (b);

(e) стадию замены культурального супернатанта, полученного на стадии (d), бессывороточной средой и культивирования в течение 12 часов или более; и

(f) стадию сбора содержащего парвовирус культурального супернатанта, полученного путем культивирования на стадии (e);

где на стадии (b), когда A, удовлетворяющая уравнению (1), отсутствует, стадии (a) и (b) осуществляют повторно путем использования другой плотности клеток A при инфицировании вирусом.

2. Способ по п.1, где клетки-хозяева представляют собой клетки, зависимые от адгезии.

3. Способ по п.1 или 2, где парвовирус представляет собой парвовирус свиней (PPV), парвовирус собак (CPV), мелкий парвовирус мышей (MVM), вирус крыс (RV), вирус H-1 (H-1), парвовирус кошек (FPV), парвовирус гусей (GPV) или парвовирус коров (BPV).

4. Способ по любому из пп. 1-3, где стадия (e) представляет собой стадию замены культурального супернатанта бессывороточной средой и культивирования в течение 24 часов или более.

5. Способ по любому из пп. 1-4, где стадия (b) включает стадию расчета B_max и A1', которая представляет собой A, которая удовлетворяет следующему уравнению (1'):

B_max/A_1'≥2,0 Уравнение (1').

6. Способ по любому из пп. 1-5, где культивирование на стадиях (d) и (e) осуществляют при температуре от 33°C или более до 39°C или менее.

7. Способ по любому из пп. 1-6, где на стадиях (d) и (e), клетки-хозяева и парвовирус растут одновременно.

8. Способ по любому из пп. 1-7, где стадия (f) включает стадию удаления свободных клеток-хозяев и обломков клеток-хозяев, содержащихся в культуральном супернатанте.

9. Способ по п. 8, где стадию удаления осуществляют с использованием фильтрации через мембрану, имеющую размер пор от 0,2 мкм до 0,45 мкм.