Способ стимулирования прорастания растений наночастицами оксида церия с высокой антирадикальной и биологической активностью
Владельцы патента RU 2701950:
Федеральное Государственное бюджетное научное учреждение "Федеральный научный центр биологических систем и агротехнологий российской академии наук" (RU)
Изобретение относится к сельскохозяйственному производству и может быть использовано для активации прорастания семян в системе выращивания кормовых культур методом аэропоники и гидропоники. Способ заключается в обработке семян пшеницы Triticum vulgare суспензией наночастиц оксида церия, синтезированных в водном экстракте петрушки Petroselinum crispum, в концентрации 10-3-10-4 М. Обработанные семена оставляют проращивать на 7 дней. Техническим результатом является повышение энергии прорастания семян. 1 табл., 3 ил.
Изобретение относится к сельскохозяйственному производству и может быть использовано для активации произрастания семян в системе выращивания кормовых культур методом аэропоники и гидропоники.
Способ осуществляется обработкой семян стабилизированной водной суспензией наночастиц оксида церия, синтезированных в водном экстракте петрушки Petroselinun crispum. Лабораторные испытания показали высокую эффективность применения таких суспензий при концентрации наночастиц оксида церия 10-3 и 10-4 М. Данный способ обработки семян повышает скорость роста корней и побегов растений.
Перспективным направлением является внедрение новой, простой и более дешевой стратегии их синтеза с использованием биологических инструментов (бактерий, дрожжей, грибов и растений) методом «зеленой» нанотехнологии (1, 2). Метод основан на получении наночастиц (НЧ) металлов различной морфологии из солей соответствующих металлов с использованием в качестве восстанавливающих и стабилизирующих агентов экстрактов растений, содержащих метаболиты-восстановители (3). Важно отметить, что синтезированные в растительных экстрактах нанометаллы, в отличие от синтезированных физико-химическими методами прототипов, уже имеют функциализированную поверхность (4), присутствие которых, как правило, увеличению стабильности, биодоступности и эффективности созданных на их основе препаратов (5). В этом свете отпадает необходимость применения общепринятых специальных носителей, стабилизирующих дисперсии, механизмы действия которых на растения не до конца изучены, что не допускается в биологическом контроле безопасности наноматериалов (МУ 1.2.2968-11).
Существенно, что производство НЧ с использованием экстрактов растений имеет большие преимущества: низкая стоимость выращивания, короткие сроки производства, гибкий контроль за размером и формой (6-8). При использовании химического синтеза себестоимость НЧ в основном определяется стоимостью солей металлов и восстановителей, а в случае «зеленого» синтеза основная часть затрат будет определяться только стоимостью солей металлов, поскольку отходы растений из пищевой промышленности могут служить в качестве восстановителей. Этот факт еще раз подчеркивает экологические и экономические преимущества «зеленого» синтеза по сравнению с традиционными методами производства НЧ.
Исходя из этого очевидно, что синтез металлических НЧ в растительных экстрактах (растительных биомассах) имеет значительный потенциал и ряд существенных преимуществ по сравнению с традиционными методами синтеза. Разнообразие растительных экстрактов, типов солей металлов и способность варьировать состав реакционной смеси и условия проведения реакции путем изменения температуры, рН реакционной смеси и включения добавок биологического происхождения (биоматриц) позволяют создавать НЧ различных металлов определенного размера и формы. Обширное количество работ посвящено синтезу нано-, 
, Pd, ZnO, Fe3O4 из экстрактов растений (9-12). При этом только НЧ , синтезированные в экстрактах ряда растений были нацелены на применение в биологии за счет ряда специфических метаболических эффектов: высокая антибактериальная активность в отношении грамположительных и грамотрицательных патогенов Pseudomonas syringae, Xanthomonas oryzae, Burkholderia glumae и Bacillus thuringiensis (13), Escherichia coli, Shigella dysenteriae и Vibrio cholera; ингибирование жизнеспособности клеточной линии HeLa и клеточной линии рака легких А549 (6, 7).
Несмотря на большой объем работ в области «зеленого» синтеза до настоящего времени практически ни одно подобное исследование не доведено до статуса препарата с выраженным стимулирующим рост и развитие растений, хотя объективные условия и социальный заказ на это выражены достаточно отчетливо.
Существует способ предпосевной обработки семян пшеницы Triticum aestivum, стабилизированной электрохимически активированной водной суспензией дисперсных наночастиц железа в концентрации 0,035-0,0087%, повышает скорость роста корней и побегов на 30-40%, при этом эффективность извлечения растением железа из среды культивирования варьирует от 36,23 до 79,59% (14). Однако способ имеет требует приготовления электрохимически активированной катодной воды с рН 8-9 и редокспотенциалом Eh=-350…-400 мВ, что делает процесс длительным и трудоемким.
Задачей изобретения является создание нового способа получения наночастиц металлов среднего размера с дальнейшим биологическим приложением, т.е. более совместимых с живыми клетками. Технический результат, обеспечиваемый изобретением, заключается в получении наночастиц, обладающих протекторными и стимулирующими свойствами по сравнению с синтетическими прототипами.
При разработке технологии биогенного синтеза наночастиц с использованием растений важным этапом является выбор кандидатур на роль «биофабрик» и поставщиков восстанавливающих агентов. В качестве восстановителя ионов металлов в наночастицы могут выступать растительные фенольные соединения (ФС), обладающие сильными окислительно-восстановительными свойствами, поэтому с этих позиций растения с высоким содержанием ФС - лучшие кандидатуры. Эксперименты показали, что Петрушка кудрявая Petroselinum crispum содержит максимальное содержание полифенолов (1,198±0,346 мг/г сырой массы) и флавоноидов (0,975±0,063 мг/100 г) среди доступных видов растительного сырья, не требующих сложного культивирования (Anethum graveolens, Lactuca sativa, Brassica oleracea, Pisum sativum).
Способ осуществляется следующим способом. В первую очередь готовят водный экстракт из растения P. crispum - свежие листья измельчают в жидком азоте до порошкообразного состояния, добавляют дистиллированную воду в соотношении 1:10 (масса/объем), смесь перемешивают и кипятят в течение 30 мин. Далее процеживают экстракт через 2 слоя марли и центрифугируют 15 мин при 15000 об/мин. Супернатант пропускают через фильтр Millipore 0,45 μм и используют для дальнейшего синтеза. Далее в супернатант водного экстракта (20 мл) добавляют 0,862 г церия азотнокислого 6-водного Ce(NO3)3⋅6H2O (чда), нагревают при перемешивании 6 ч при 80-90°С. Образовавшийся осадок отделяют центрифугированием при 10000 об/мин в течение 10 мин, многократно промывают деионизированной водой для удаления несогласованных биомолекул из экстракта. Далее высушивают в печи горячим воздухом при 60°С в течение 6 ч и отжигают в муфельной печи при 500°С в течение 2 ч (3). Изменение цвета от светло-желтого до мутно-желтого указывает на формирование НЧ СеО2.
Далее полученные частицы СеО2 ресуспензируют в дистиллированной воде в количестве 1 г/л, суспензию обрабатывают в ультразвуковой ванне Elmasonic в течение 15 мин и характеризуют с использованием сканирующей электронной микроскопии.
Согласно изображениям, в образце присутствуют частицы от 50 нм до 1000 нм, запакованные в сплошной носитель-матрицу (Фиг. 1).
Механизмы защитных эффектов НЧ СеО2 на растительные организмы исследуют на модельном растении пшеницы Triticum vulgare по ранее описанным методикам (15, 16). Для начала семена Т. vulgare предварительно дезинфицируют и проращивают в климатической камере («Agilent», США) при 12-часовом освещении, температуре 22±1°С и влажности 80±5% в течение 48 ч. Далее проросшие семена (20 шт) переносят в отдельные чашки и добавляют суспензии НЧ СеО2 в концентрациях от 10-1 до 10-5 М. Образцы оставляют проращивать на 4, 7 и 14 дней и далее измеряют длину листьев и корней проростков. Процент энергии прорастания (Е) подсчитывают на 3-и сутки в постановке, когда семена сразу после замачивания поливают суспензией НЧ СеО2.
Сравнение антиоксидантной и биологической активности биосинтезированных металлов проводят с коммерческим нанопорошком СеО2 с размером частиц 15 нм, полученных газофазным методом в Казанском национальном научно-исследовательском технологическом университете им. А.Н. Туполева (гидродинамический радиус - 212±62 нм, дзета-потенциал -43 мВ).
Результаты ДФПГ-теста показывают увеличение антирадикальной активности наноматериалов по мере увеличения концентрации образцов, от 10-9 до 10-2 М (Фиг. 2). При этом, антиоксидантный потенциал биосинтезированных НЧ СеО2 в пересчете на тролокс был больше по сравнению с контролем на 63-68%, а синтетический аналог превышает контроль в меньшей степени - на 54,5-64,3% соответственно.
Вместе с тем, тестирование на семенах Т. vulgare показывает, что биогенные нанопорошки диоксида церия в большей степени инициируют процессы прорастания по сравнению с синтетическим прототипом, и даже в небольшой степени стимулируют пророст до 5-11,4% относительно интактных образцов (Фиг. 3).
Развернутый анализ метрических показателей проростков Т. vulgare после 48 ч воздействия НЧ CeO2 растительного и синтетического происхождения показывает высокую устойчивость растений к ним. При этом, диоксид церия на 7 день инкубации в большей степени стимулирует рост побегов растений, а на 14 день - корневой системы. Согласно данным, изложенным в табл. 1, при воздействии биогенных частиц оксида церия в разведении от 10-2 до 10-5 М в течение 7 дней происходит достоверное увеличение длины листьев проростков на 18,6-35,4% относительно контроля, а после 14 дней экспозиции показатель доходит до 32,6-37%. Похожая тенденция развивается и при проращивании растений в среде синтетического аналога: происходит достоверное стимулирование длины листьев при воздействии небольших концентраций металла менее 10-4 М) на 7 день до 22-28% и на 14 день - 26-28% соответственно.
На 14 день инкубации с нанопорошком диоксида церия происходит увеличение длины корня до 42-44,4% в случае с частицами, полученными в экстракте растений, и до 31-34% - при обработке растений нанометаллом, полученным физико-химическим способом.
Таким образом, наиболее достоверно эффективны для обработки растений оказались нанопорошки, полученные методом «зеленого» синтеза в экстракте P. crispum, в разведениях от 10-2 до 10-5 М, причем максимальный стимулирующий эффект проявляет концентрация 10-3 и 10-4 М на 7 день эксперимента.
Список литературы
1. Gericke М., Pinches A. Biological synthesis of metal nanoparticles. Hydrometallurgy 2006. 83: 132-140.
2. Dhillon G.S., Brar S.K., Kaur S., Verma M. Green approach for nanoparticle biosynthesis by fungi: Current trends and applications. Crit. Rev. Biotechnol. 2012. 32: 49-73. doi: 10.3109/07388551.2010.550568.
3. Makarov V.V., Love A.J., Sinitsyna O.V., Makarova S.S., Yaminsky I.V., Taliansky M.E., Kalinina N.O. Green nanotechnologies: synthesis of metal nanoparticles using plants. Acta Naturae. 2014. 6: 35-44.
4. Singaravelu G., Arockiamary J.S., Kumar V.G., Govindaraju K.A novel extracellular synthesis of monodisperse gold nanoparticles using marine alga, Sargassum wightii Greville // Colloids and Surfaces B: Biointerfaces. 2007. Vol. 57. №1. P. 97-101.
5. Milani N. Dissolution kinetics of macronutrient fertilizers coated with manufactured zinc oxide nanoparticles // J. Agric. Food Chem. 2012. V. 60. P. 3991-3998. doi: 10.1021/jf205191y
6. Valodkar M., Jadeja R.N., Thounaojam M.C., Devkar R.V., Thakore S. Biocompatible synthesis of peptide capped copper nanoparticles and their biological effecton tumor cells. Mater. Chem. Phys. 2011a. 128: 83-89.
7. Valodkar M., Nagar P.S., Jadeja R.N., Thounaojam M.C., Devkar R.V., Thakore S. Euphorbiaceae latex induced green synthesis of non-cytotoxic metallic nanoparticle solutions: A rational approach to antimicrobial applications. Colloids Surf. A. 2011b. 384: 337-344.
8. Velmurugan P. et al. Synthesis and characterization ofnanosilver with antibacterial properties using Pinus densiflorayoung cone extract. J. Photochem. Photobiol. B. 2015. 147: 63-68.
9. Zargar M., Hamid A.A., Bakar F.A. et al. Green synthesis and antibacterial effect of silver nanoparticles using Vitex negundo L. Molecules. 2011. 16. 8: 6667-6676.
10. Kumar G.V., Gokavarapu D.S., Rajeswari A. et al. Facile green synthesis of gold nanoparticles using leaf extract of antidiabetic potent Cassia auriculata. Colloids and Surfaces B: Biointerfaces. 2011.87. 1: 159-163.
11. Mahdavi M., Namvar F., Ahmad M.В., and Mohamad R., "Green biosynthesis and characterization of magnetic iron oxide (Fe3O4) nanoparticles using seaweed (Sargassum muticum) aqueous extract // Molecules. 2013. Vol. 18. №5. P. 5954-5964.
12. Azizi S., Ahmad M.B., Namvar F., Mohamad R. Green biosynthesis and characterization of zinc oxide nanoparticles using brown marine macroalga Sargassum muticum aqueous extract // Materials Letters. 2014. Vol. 116. P. 275-277.
13. Velmurugan P. et al. Synthesis and characterization ofnanosilver with antibacterial properties using Pinus densiflorayoung cone extract. J. Photochem. Photobiol. B. 2015. 147: 63-68.
14 Мирошников С., Сизова E., Дерябин Д., Дерябина Т., Рогачев Б. Способ предпосевной обработки семян. https://findpatent.ru/patent/258/2582499.html (аналог)
15. Lebedev S.V., Korotkova A.M., Osipova E.A. Influence of Fe 0 nanoparticles, magnetite Fe3O4 nanoparticles, and iron (II) sulfate (FeSO4) solutions on the content of photosynthetic pigments in Triticum vulgare //Russian journal of plant physiology. - 2014. - T. 61. - №. 4. - C. 564-569.
16. Korotkova A.M., Lebedev S.V., Sizova E.A. Investigation of mechanisms of prooxidant effects of nanoparticles transition metals in the test Triticum vulgare // Международный научно-исследовательский журнал. - 2015. - №. 8 (39) Part 3. - С. 14-19.
Способ стимулирования прорастания семян пшеницы Triticum vulgare биогенными наночастицами оксида церия, заключающийся в том, что проросшие в течение 48 часов семена пшеницы обрабатывают суспензией наночастиц оксида церия, синтезированных в водном экстракте петрушки Petroselinum crispum, в концентрации 10-3-10-4 М и оставляют проращивать на 7 дней.
