Способ диагностики вируса простого герпеса

Изобретение относится к медицине, а именно к иммунологии, и может быть использовано для диагностики вируса простого герпеса (ВПГ). Для этого готовят диагностический конъюгат из флуоресцирующих наночастиц типа InP/ZnS (далее - квантовые точки КТ) и антител к вирусу простого герпеса IgG. Используют буферные растворы. Диагностический конъюгат наносят на предметное стекло с биологическим материалом, содержащим клетки слизистой ротовой полости больного. Объект микроскопируют с помощью люминесцентного микроскопа. В случае наличия в материале больного специфического свечения клеток диагностируют вирус простого герпеса. Способ позволяет повысить чувствительность иммунофлуоресцентного анализа при диагностике вируса простого герпеса на раннем этапе инфекции, когда она себя еще не проявляет. 3 ил.

 

Изобретение относится к медицине, а именно: к иммунологическим исследованиям с использованием флуоресцентной диагностики, и может быть использовано для диагностики вируса простого герпеса (ВПГ).

Исследования биологических объектов с помощью нанотехнологий все активнее внедряются в сферу медицины. Не является исключением и ее раздел - вирусология, объекты исследования которой имеют в среднем размеры от 80 до 400 нм.

Известен способ диагностики герпесвирусной инфекции у беременных путем подсчета герпесных телец в периферической крови.

Для осуществления способа у беременных к 1-2 каплям лейкоцитарной взвеси, взятой после центрифугирования цельной крови пациента в пробирке, добавляют 0,5 мл сыворотки крови пациента. Выдерживают 15 минут в термостате при t=37°C и прибавляют 0,5 мл 0,5% нейтрального красного, приготовленного на физиологическом растворе при pH 7,4. Полученную смесь содержат 5 мин в термостате при t=37°C, после чего каплю смеси наносят на предметное стекло и изготовляют мазок центрифугированием в течение 4 секунд. После подсыхания мазка проводят подсчет герпесных телец на 100 лейкоцитов, при этом герпесные тельца представляют собой сближенные в силу повышения зарядности ганглиозидов лейкоциты. При содержании герпесных телец 3-5±0,3% судят о тяжелой стадии герпесвирусной инфекции, при 1-2,0±0,2% - о средней стадии заболевания, у здоровых беременных герпесные тельца практически не обнаруживаются. Авторы утверждают, что использование изобретения позволяет существенно сократить время исследования. (РФ, патент №2330286, G01N 33/48, 27.07.2008).

Результаты диагностики основываются на наборе статистических данных, что лишает известный способ возможности индивидуального подхода к пациенту, усредняет и снижает достоверность. Кроме того, большую роль в способе играет субъективный фактор, обусловленный подсчетом герпесных телец, что снижает достоверность способа. Также способ не позволяет диагностировать герпесвирусную инфекцию в начальной стадии. Данную инфекцию диагностируют только в средней и тяжелой стадиях. Это снижает чувствительность известного способа.

Известен способ дифференциальной диагностики хронической формы простого герпеса и субклинического "носительства" противогерпетических антител. В соответствии со способом, у лиц, имеющих в крови специфические антитела к ВПГ, определяют уровень pH кожи в зонах поражения. При величинах pH кожи менее 4,66 диагностируют хроническую форму ПГ, а при величинах pH более 6,08 диагностируют субклиническое «носительство» противогерпетических антител (РФ, патент №2516913 G01N 33/48, 20.05.2014).

Способ не позволяет диагностировать герпесвирусную инфекцию в стадии развития.

Широко используемым способом обнаружения вирусов в организме человека является иммуноферментный анализ (https://www.kp.ru/guide/immunofermentnyi-analiz.html).

Иммуноферментный анализ (ИФА) - это метод лабораторной диагностики, основанный на реакции «антиген-антитело», который позволяет выявить вещества белковой природы (в том числе ферменты, вирусы, фрагменты бактерий и другие компоненты биологических жидкостей). Основной биоматериал для проведения ИФА - это сыворотка крови. Результат анализа можно получить в течение 6 часов после забора крови.

В случае диагностики инфекционных заболеваний иммуноферментный анализ не позволяет найти самого возбудителя и определить его специфичные свойства: он лишь косвенно свидетельствует о присутствии чужеродного микроорганизма в теле человека по наличию антител. При этом достоверный диагноз возможно получить только на стадии развития заболевания, что снижает чувствительность способа ИФА. Кроме того, ИФА - сложный и не дешевый метод, и требует интерпретации результатов квалифицированного врача.

Информативным и достоверным при диагностики вирусной инфекции, в том числе и герпес-вирусной инфекции, является иммунофлуоресцентный анализ - это способ, основанный на использовании специфичности иммунологической реакции и чувствительности флуоресцентной микроскопии. Один из компонентов иммунной реакции, как правило, антитело, метится флуоресцирующим красителем (маркировка, конъюгирование). После возбуждения флуоресцирующего агента положение антигена становится доступным непосредственному наблюдению вследствие появления флуоресценции.

Иммунофлуоресцентный анализ (РИФ, реакция иммунофлуоресценции, реакция Кунса) - способ выявления специфических антигенов (АГ) с помощью антител (AT), конъюгированных с флюорохромом, обладающий высокой чувствительностью и специфичностью.

Предложенный в 1941 г. Кунсом, этот метод после многочисленных усовершенствований прочно вошел в лабораторную практику.

Метод включает следующие важные этапы:

- получение, характеристика и маркировка антисывороток;

- получение антигенного субстрата;

- проведение анализа, т.е. обработка флуоресцирующими антителами;

- микроскопический анализ флюоресценции препаратов. http://biofile.ru/bio/5482.html

Известен способ диагностики при герпетической инфекции, включающий клинический анализ мочи, крови, исследование соскоба из везикул, слюнной жидкости на данный вирус методом прямой и непрямой иммунофлюоресценции, определение антител в реакции пассивной гемагглютинации, определение сывороточных иммуноглобулинов основных классов (Ig A, M, G) (РФ, патент №2516913, G01N 33|48, 20.05.2014).

Данная методика довольно сложна в выполнении и содержит исследования, не раскрывающие основные патогенетические механизмы иммунологического реагирования организма пациента непосредственно на герпесвирусную инфекцию.

Наиболее близким к предлагаемому является прямая люминесцентная микроскопия - прямой иммунофлуоресцентный анализ, способ, называемый антигенным тестом, который можно осуществить за 30 минут (HalfpennyKC, WrightDW. Nanoparticle detection of respiratory infection // Wiley Interdiscip Rev NanomedNanobiotechnol. 2010 May; 2(3): 277-90; http://biofile.ru/bio/5482.html.

Прямой метод РИФ основан на том, что антигены тканей или микробы, обработанные иммунными сыворотками с антителами, меченными флуорохромами, способны светиться в УФ-лучах люминесцентного микроскопа. Бактерии в мазке, обработанные такой люминесцирующей сывороткой, светятся по периферии клетки в виде каймы зеленого цвета.

Однако способ прямой люминесцентной микроскопии не достаточно чувствителен для обнаружения присутствия вируса, в том числе и вируса простого герпеса, особенно на ранних стадиях инфекции, что снижает чувствительность способа (HalfpennyKC, WrightDW. Nanoparticle detection of respiratory infection // Wiley Interdiscip Rev NanomedNanobiotechnol. 2010 May: 2(3): 277-90; http://biofile.ru/bio/5482.html). Кроме того, в случае прямого иммунофлуоресцентного анализа возможно неспецифическое отложение меченых антител, что также снижает чувствительность известного способа.

При этом флуорофоры известны своей способностью быстро блекнуть и частично перекрывать свой спектр, что снижает эффективность использоваться для слежения окрашенного ими вируса (Chan W.C, Nie S.M. Quantum dot bioconjugates for ultrasensitive on isotopic detection. Science, 1998: 281: 2016-18; Parak WJ, PellegrinoT, Plank C. Labelling of cells with quantum dots. Nanotechnoiogy. 2005; 16: R9-25). Это снижает чувствительность иммунофлуоресцентного анализа, в том числе и прямой люминесцентной микроскопии.

Недостатком иммунофлуоресцентного анализа является также то, что в клеточных культурах, необходимо инкубировать инфекционный материал не менее 5 дней, затем использовать флуоресцентную покраску для выявления присутствия вируса. Главная проблема данного подхода в том, что вирус за это время продолжает размножаться в организме больного, которого на данный момент можно лечить лишь симптоматически. Это вызывает необходимость многих клиник включать в процесс диагностики такой метод как ПИР в реальном времени, который высоко чувствителен, но занимает от 3 до 6 часов и требует участие высоко обученного специалиста по молекулярной биологии (HalfpennyKC, WrightDW. Nanoparticle detection of respiratory infection // Wiley Interdiscip Rev Nano med Nanobiotechnol. 2010 May; 2(3): 277-90.).

Из вышеизложенного следует, что существует проблема повышения чувствительности иммунофлуоресцентного анализа при диагностике ВПГ.

Заявляемый способ диагностики ВПГ при осуществлении решает проблему повышения чувствительности иммунофлуоресцентного анализа при диагностике вируса простого герпеса. При этом заявляемый способ диагностики вируса простого герпеса при осуществлении обеспечивает достижение технического результата, заключающегося в возможности диагностики заболевания на раннем этапе инфекции, когда она себя еще не проявляет.

Сущность заявляемого изобретения состоит в том, что в способе диагностики вируса простого герпеса, включающем образование комплекса антиген - антитело, анализ оптических характеристик, новым является то, что готовят диагностический конъюгат из флуоресцирующих наночастиц (далее - квантовые точки КТ) и антител к вирусу простого герпеса (далее - ВПГ), при этом используют водорастворимые квантовые точки типа InP/ZnS с максимумом флуоресценции 565 нм, при этом исходный раствор содержит 1016 наночастиц в 1 мл водного раствора, в пределах погрешности измерительного прибора, из которого готовят коллоидный раствор КТ, а именно, 2,5 мл Трис-HCl буферного раствора I (трис(гидроксиметил)аминометан-HCl), содержащего 1 мг КТ, затем готовят буферный раствор II - 2,5 мл Трис-HCl, содержащий 10 мкг IgG и 5 мг 1-этил-3-(3-диметиламинопропил) карбодиимид гидрохлорид (1-ethyl-3-(3-dimethyl-aminopropyl)carbodiimidehydrochloride, EDC), при этом качестве источника антител к вирусу герпеса используют иммуноглобулин IgG, который получают из высокотитражной донорской сыворотки крови с титром антител в ИФА к ВПГ равным или более 1:1280, а затем концентрацию IgG доводят до 30 г/л, после этого готовят диагностический конъюгат, для чего Трис-HCl буферные растворы I и II смешивают при перемешивании на верхнеприводной мешалке и облучении на ультразвуковой бане с частотой 35 кГц, после чего реакционную массу помещают в холод и выдерживают 24 ч при температуре 4°C, полученный диагностический конъюгат наносят на предметное стекло с заранее приготовленным и фиксированным химически чистым ацетоном биологическим материалом, содержащим клетки слизистой ротовой полости больного, затем объект микроскопируют с помощью люминесцентного микроскопа, в случае наличия в материале больного специфического свечения клеток диагностируют ВПГ.

Технический результат достигается следующим образом.

Существенные признаки формулы изобретения: «Способ диагностики вируса простого герпеса, включающий образование комплекса антиген-антитело, анализ оптических характеристик, …» - являются неотъемлемой частью заявленного способа, так как обеспечивают его осуществимость, а, следовательно, обеспечивают достижение заявленного технического результата.

Один из способов повышения чувствительности иммунофлуоресцентного анализа - использование альтернативных флуоресцентных меток. В заявляемом способе идентификации ВПГ готовят диагностический конъюгат из флуоресцирующих наночастиц (КТ) и антител к ВПГ.

Квантовые точки - это люминесцирующие наноматериалы, возбуждающиеся под действием источника излучения. В настоящее время КТ широко используют в качестве флуоресцентных меток. Эффективность флуоресценции квантовых точек значительно превосходит органические флуорофоры. Их эмиссионные спектры достаточно узкие и симметричные, нет эффекта «красного хвоста», наличие FRET-эффекта - эффекта резонансного переноса энергии. КТ обладают узкими пиками в спектрах испускания (полуширина пика флуоресценции 20-30 нм), что обеспечивает феноменальную чистоту цвета.

Кроме того, КТ фотоустойчивы, т.е. способны долго светиться при воздействии на них излучения высокой мощности. При этом, вирус, меченный КТ, полностью сохраняет свои инфекционные свойства, что самое важное, а изображение обеспечивает полную информацию (MountainA. Genetherapy: the first decade. Trends Biotechnol. 2000; 18: 119-28.)

Схематически КТ состоит из ядра (в заявленном способе - фосфид индия InP), защитной оболочки из сульфида цинка ZnS и дополнительной оболочки из синтетических или природных полимеров (декстран, хитозан).

Имеющиеся на внешней оболочке химически активные группы (амино-, карбокси-, меркапто- и др.) могут быть ковалентно соединены с биологическими молекулами, в нашем случае - с антителами к вирусу простого герпеса, что позволяет создать диагностичекий конъюгат на основе КТ. В составе биоконъюгата КТ не теряют флуоресцентных свойств и могут быть отслежены с помощью конфокального микроскопа (ReissP, BleuseJ, PronA. High lyluminescent CdSe/ZnSecore/shell nanocrystal so flow size dispersion. NanoLett. 2002; 2: 781-4; Seisenberger G, Ried MU, Encfreb T, et al. Real-time single molecule imaging of the infection pathway of an adeno-associated virus. Science. 2001; 294: 1929-32).

В заявленном способе используют квантовые точки с максимумом флуоресценции 565 нм, что является оптимальным для уверенной идентификации вируса с помощью иммунофлуоресцентного анализа.

Очень важным для проведения диагностики и мониторинга проникновения КТ и их биоконъюгатов в клетку является способ получения КТ (неорганический или органический), перенос полученных КТ в оптимальную транспортную среду (вода, физиологический, лиофильный или жидкокристаллический раствор).

В заявляемом способе используют неорганические водорастворимые квантовые точки типа InP/ZnS. Это позволяет получить раствор наночастиц фосфида индия покрытого сульфидом цинка (InP/ZnS) непосредственно в водных растворах в одну стадию, без использования токсичных органический растворителей. Благодаря этому удается избежать дополнительных трудоемких операций, связанных с процессом солюбилизации (HeymanK. Quantumdots getsmaller // TheScientist 2005 - 19 (9) - Р. 35; Huang G.W., Cheii C.Y., Wu K.C et al. One-pot synthesis and characterization of high-quality CdSe/ZnX (X=S, Se) nanocrystals via the CdO precursor. J.Cryst Growth. 2004; 265: 250-9) и, кроме того, сохранить биологические свойства антител к вирусу и сам вирус, что является необходимым условием для исследования.

Кроме того, использование водорастворимых КТ позволяет выполнять исследования по принципу пассивных меток, в результате которого определенные рецепторные молекулы, такие как антитела, присоединяются к поверхности КТ. На первом этапе антитела захватываются поверхностью, к которой добавляется образец. На втором этапе антитела, меченные КТ, используются для визуальной и количественной оценки связанного аналита. Это позволяет осуществлять иммунологические исследования (Bentzen E.L., House F., Utley T.J. et al. Progression of respiratory syncytial virus infection monitored by fluorescent quantum dot probes // Nano Lett, - 2005, - N4, - P. 591-595).

Для приготовления диагностического конъюгата используют буферные растворы. Буферные растворы стабилизируют реакционную среду при образовании комплексов КТ - антитело. Растворы, содержащие буферные системы, обладают, вследствие этого, способностью поддерживать pH на постоянном уровне. Буферные растворы применяют для сохранения активной реакции среды на определенном неизменном уровне, если тот или иной процесс, например, выращивание культуры бактерий, проведение ферментативной реакции и т.п., а в нашем случае - сохранение специфичности антител к ВПГ, должен быть проведен при постоянном pH.

(http://бмэ.орг/index.php/%d0%91%d0%a3%d0%a4%d0%95%d0%a0%d0%9d%d0%ab%d0%95_%d0%a0%d0%90%d0%a1%d0%a2%d0%92%d0%9e%d0%а0%в0%ab#Буферные растворы; https://mipt.ru/upload/medialibrary/d74/UchebnPosobie%20).

В заявленном способе используют коллоидный раствор КТ, что предотвращает растекание диагностического конъюгата при использовании. Коллоидный раствор КТ в Трис-HCl буферном растворе для проведения модификации антителом готовят из исходного раствора наночастиц, который содержит 10¹⁶ наночастиц в 1 мл водного раствора, в пределах погрешности измерительного прибора (размера коллоидных частиц менее 10 нм).

Количественное содержание 10¹⁶ наночастиц в 1 мл водного раствора и размер коллоидных частиц менее 10 нм являются оптимальными и получены авторами опытным путем.

В качестве источника антител к ВПГ используют иммуноглобулин IgG. Использование для иммунодиагностики диагностики IgG широко известно при выполнении иммуноферментного анализа. В заявленном способе получают IgG из высокотитражной донорской сыворотки крови с титром антител в иммуноферментном анализе к вирусу герпеса простого равным или более 1:1280, при этом концентрацию IgG доводят до 30 г/л. В результате, как показал опыт, обеспечивается возможность получения оптимального количества антител к ВПГ для создания эффективного диагностического конъюгата путем формирования комплексов КТ - антитело. При этом количественные составляющие получены авторами опытным путем и являются оптимальными.

Подбор концентрации растворов является важным этапом при конъюгации.

Для приготовления диагностического конъюгата готовят коллоидный раствор КТ: 2,5 мл Трис-HCl буферного раствора I (трис(гидроксиметил)аминометан-HCl) с pH 7,4, содержащего 1 мг КТ.

Затем готовят 2,5 мл Трис-HCl буферного раствора II, содержащий 10 мкг IgG и 5 мг 1-этил-3-(3-диметиламинопропил) карбодиимид гидрохлорид (1-ethyl-3-(3-dimethyl-aminopropyl)carbodiimidehydrochloride, EDC) с pH 7,4.

Количественное содержание в мл I и II буферных растворов, pH среды, количественное содержание в растворах соответственно КТ и IgG оптимальны и получены авторами опытным путем.

Трис-HCl буферные растворы I и II смешивают путем перемешивания, например, на верхнеприводной мешалке и при одновременном облучении на ультразвуковой бане с частотой 35 кГц. После чего реакционную массу помещают в холод и выдерживают 24 ч при температуре 4°C. Использование для смешивания буферных растворов ультразвука предложено авторами изобретения. При этом частота ультразвука 35 Гц является оптимальной и получена опытным путем. Заявленные условия обработки создают оптимальные условия для равномерного смешения растворов, при этом применяемые условия обработки и хранения не нарушают целостности антител и квантовых точек.

Помимо, подбора концентрации растворов, важным этапом при конъюгации является время выдержки их с клетками. В заявленном способе реакционную массу помещают на холод и выдерживают 24 часа при температуре 4°C, тем самым приводят диагностический конъюгат в стабильное состояние. Температуре 4°C и длительность выдержки 24 часа получены авторами опытным путем и являются оптимальными, при которых сохраняется специфичность антител к ВПГ.

Для диагностики ВПГ используют клетки слизистой ротовой полости больного. Это обусловлено тем, что слизистая оболочка ротовой полости содержит клетки, которые формируют местный иммунитет. Кроме того, слизистая ротовой полости подвержена влиянию инфекционных агентов, которые прогрессируют при ослабленном иммунитете (https://www.pro-zuby.ru/parodontologiya/polost-rta/slizistaya-obolochka-polosti.html).

Биологический материал, содержащий клетки слизистой ротовой полости больного наносят на предметное стекло и фиксируют химически чистым ацетоном.

Затем на биологический материал наносят полученный диагностический конъюгат. После чего объект микроскопируют с помощью люминесцентного микроскопа. При образовании комплексов КТ + антитело + антиген в материале больного формируется специфическое свечение клеток, что говорит о наличии антигенов ВПГ, в результате последний диагностируют.

Таким образом, заявляемый способ диагностики ВПГ обеспечивает возможность использования при выполнении иммунофлуоресцентного анализа в качестве флуоресцирующих меток - квантовых точек. В заявленном способе это осуществляют благодаря использованию диагностического конъюгата из флуоресцирующих наночастиц и антител к данному вирусу, предлагаемому в соответствии с заявленной формулой изобретения. Продемонстрирована возможность увеличения чувствительности иммунофлуоресцентного анализа за счет использования КТ в качестве флуоресцирующих меток. При этом заявленный способ приготовления диагностического конъюгата исключает возможность неспецифической флюоресценции, которая может наблюдаться при выполнении известного иммунофлуоресцентного анализа вследствие избытка красителя, что так же в заявленном способе повышает чувствительность иммунофлуоресцентного анализа.

Авторами были выполнены исследования культуры клеток, искусственно зараженных ВПГ. При исследовании клеточных культур под люминесцентным микроскопом отмечалось специфическое свечение в единичных клетках.

Результаты выполненных лабораторных исследований подтверждают повышение чувствительности иммунофлюоресцентного анализа при использовании КТ в качестве флюоресцирующих меток. Это позволяет при осуществлении заявляемого способа диагностики ВПГ обеспечить достижение технического результата, заключающегося в возможности диагностики заболевания на раннем этапе инфекции.

Таким образом, из вышеизложенного следует, что заявляемый способ диагностики ВПГ при осуществлении решает проблему повышения чувствительности иммунофлюоресцентного анализа и обеспечивает достижение необходимого технического результата, заключающегося в возможности диагностики заболевания на раннем этапе инфекции.

На фиг. 1 изображена фотография образца клеточных культур, инфицированных ВПГ с внесенным диагностическим конъюгатом (КТ + антитела). Видно яркое светящееся ядро клетки; на фиг. 2 - фотография образца клеточных культур инфицированного ВПГ с внесенным гомологичным флуоресцирующим иммуноглобулином (известный способ иммунофлуоресцентного анализа). Нерезко видно светящееся ядро клетки; на фиг. 3 - фотография контрольного образца клеточных культур. Видны нативные, несветящиеся клетки.

Заявленный способ диагностики вируса простого герпеса осуществляют следующим образом.

Готовят диагностический конъюгат из флуоресцирующих наночастиц (далее - квантовые точки КТ) и антител к вирусу простого герпеса (далее - ВПГ). Используют водорастворимые квантовые точки типа InP/ZnS с максимумом флуоресценции 565 нм. Исходный раствор содержит 1016 наночастиц в 1 мл водного раствора, в пределах погрешности измерительного прибора, из которого готовят коллоидный раствор КТ, а именно, 2,5 мл Трис-HCl буферного раствора I (трис(гидроксиметил)аминометан-HCl), содержащего 1 мг КТ. Затем готовят буферный раствор II - 2,5 мл Трис-HCl, содержащий 10 мкг IgG и 5 мг 1-этил-3-(3-диметиламинопропил) карбодиимид гидрохлорид (1-ethyl-3-(3-dimethyl-aminopropyl)carbodiimidehydrochloride, EDC). В качестве источника антител к вирусу герпеса используют иммуноглобулин IgG, который получают из высокотитражной донорской сыворотки крови с титром антител в ИФА к ВПГ равным или более 1:1280, а затем концентрацию IgG доводят до 30 г/л. После этого готовят диагностический конъюгат, для чего Трис-HCl буферные растворы I и II смешивают при перемешивании на верхнеприводной мешалке и облучении на ультразвуковой бане с частотой 35 кГц, после чего реакционную массу помещают в холод и выдерживают 24 ч при температуре 4°C. Полученный диагностический конъюгат наносят на предметное стекло с заранее приготовленным и фиксированным химически чистым ацетоном биологическим Материалом, содержащим клетки слизистой ротовой полости больного. Объект микроскопируют с помощью люминесцентного микроскопа. В случае наличия в материале больного специфического свечения клеток диагностируют ВПГ.

Иммуноглобулин IgG выделяли следующим образом. После определения титра антител к вирусу герпеса простого ≥1:1280 в реакции ИФА, высокотитражные донорские сыворотки крови отбирали и объединяли в один пул, затем обрабатывали суспензией каолина, прогревали при 56°C в течение 30 мин и осаждали сульфатом аммония. Осадок отделяли центрифугированием, растворяли в дистиллированной воде, после чего соль удаляли диализом. Выделение и очистку IgG из сыворотки человека проводили методом препаративной колоночной хроматографии низкого давления. Перед заполнением хроматографической колонки сефадекс смешивали, отмывали 0,5 М NaOH, сорбент промывали водой до достижения нейтрального pH. Затем предварительно обработанную сыворотку наносили на хроматографическую колонку ХК 16 (LKB, Швеция) длиной 40 см, заполненную Sephadex G-100 (Pharmacia, Швеция). Объем наносимого образца - 500 мкл. Для подачи элюэнта на колонку использовали перистальтический насос Microperpex 2123. LKB (Швеция). Элюцию проводили фосфатным буферным раствором pH 7.4 при комнатной температуре со скоростью 5 мл/час. Для детекции разделяемых веществ использовали монитор Uvicord S2 2238 (LKB, Швеция) с ультрафиолетовой лампой с длиной волны 206 нм. Результат хроматографии фиксировали с помощью двухканального самописца с отметчиком событий LKB 2210. Отбор фракций проводили на коллекторе фракций Ultrorac 2070 LKB (Швеция) по 5 мл в пробирку. По окончании хроматографического разделения пиковые фракции объединяли и концентрировали на в диализных мешках против ПЭГ 6000 FerakBerlin в течение ночи при температуре 4°C. Регенерацию матриц проводили натрий-ацетатным буфером с pH 4,0. Липопротеиды удаляли 5% раствором твина-80 в ацетатном буфере. Концентрацию IgG доводили до 30 г/л.

Иммобилизацию иммуноглобулина G (IgG) осуществляли путем добавления к Трис-HCl раствору I, содержащего 1 мг КТ, Трис-HCl раствора II, содержащего 10 мкг IgG и 5 мг 1-этил-3-(3-диметиламинопропил) карбодиимид гидрохлорид (1-ethyl-3-(3-dimethyl-aminopropyl)carbodiimidehydrochloride, EDC) в качестве конденсирующего агента. Процесс проводили при облучении ультразвуком, после чего реакционную массу помещали на холод и выдерживали 24 ч при температуре 4°C.

Полученный таким способом диагностический конъюгат (КТ + антитело), наносили на предметное стекло с заранее приготовленным и фиксированным х/ч ацетоном биологическим материалом, содержащим клетки слизистой ротовой полости больного с предположительным диагнозом герпетическая инфекция. Затем объект микроскопировали с помощью люминесцентного микроскопа.

Использовали КТ InP/ZnS, с максимумом флуоресценции 565 нм, полученные из ООО НТИЦ «Нанотех-ДУБНА».

Проведенная диагностика выявления наличия антигенов ВПГ при окрашивании зараженных клеточных культур комплексами антитело + КТ (InP), показала отчетливо различимое яркое свечение в цитоплазме и ядрах клеток уже на ранних сроках заражения. Легко можно было подсчитать количество пораженных клеток по специфическому свечению.

Таким образом, использование предлагаемого в заявленном способе диагностики вируса простого герпеса диагностического конъюгата на основе квантовых точек позволяет проводить иммунофлуоресцентный анализ с большей чувствительностью, чем при обычной РИФ с использованием ФИТЦ. Как показал опыт, заявленный способ диагностики вируса простого герпеса, благодаря использованию в диагностическом конъюгате КТ, позволяет обнаружить присутствие инфекционного агента ВПГ в пределах одного часа после того, как вирус внедрился клетку и началась его репродукция.

Способ диагностики вируса простого герпеса, включающий образование комплекса антиген - антитело, анализ оптических характеристик, отличающийся тем, что готовят диагностический конъюгат из флуоресцирующих наночастиц (далее - квантовые точки КТ) и антител к вирусу простого герпеса (далее - ВПГ), при этом используют водорастворимые квантовые точки типа InP/ZnS с максимумом флуоресценции 565 нм, при этом исходный раствор содержит 1016 наночастиц в 1 мл водного раствора, в пределах погрешности измерительного прибора, из которого готовят коллоидный раствор КТ, а именно, 2,5 мл Трис-HCl буферного раствора I (трис(гидроксиметил)аминометан-НСl), содержащего 1 мг КТ, затем готовят буферный раствор II - 2,5 мл Трис-HCl, содержащий 10 мкг IgG и 5 мг 1-этил-3-(3-диметиламинопропил) карбодиимид гидрохлорид (l-ethyl-3-(3-dimethyl-aminopropyl)carbodiimidehydrochloride, EDC), при этом в качестве источника антител к вирусу герпеса используют иммуноглобулин IgG, который получают из высокотитражной донорской сыворотки крови с титром антител в ИФА к ВПГ равным или более 1:1280, а затем концентрацию IgG доводят до 30 г/л, после этого готовят диагностический конъюгат, для чего Трис-HCl буферные растворы I и II смешивают при перемешивании на верхнеприводной мешалке и облучении на ультразвуковой бане с частотой 35 кГц, после чего реакционную массу помещают в холод и выдерживают 24 ч при температуре 4°С, полученный диагностический конъюгат наносят на предметное стекло с заранее приготовленным и фиксированным химически чистым ацетоном биологическим материалом, содержащим клетки слизистой ротовой полости больного, затем объект микроскопируют с помощью люминесцентного микроскопа, в случае наличия в материале больного специфического свечения клеток диагностируют ВПГ.