Способ дифференциальной диагностики зубчатых новообразований толстой кишки

Изобретение относится к медицине, в частности к онкологии и патологической анатомии, а именно к дифференциальной диагностике зубчатых новообразований толстой кишки. Для этого проводят морфологические, иммуногистохимические и молекулярно-генетические исследования удаленных новообразований и одновременно происходит выявление в удаленном образовании, залитом в парафиновые блоки, в качестве дифференциально-диагностических критериев видов зубчатых новообразований наличия или отсутствия мутаций 2, 3, 4 экзона гена KRAS и мутации гена BRAFp.V600E методом полимеразной цепной реакции в реальном режиме времени и особенностей экспрессии муцинов-2, 5АС и -6 методом иммуногистохимии в зависимости от наличия или отсутствия мутаций генов KRAS и BRAF. Диагноз сидячей зубчатой аденомы устанавливают по отсутствию мутации гена KRAS и выраженной экспрессии муцина-2, экспрессии муцина-6 в дилатированных основаниях крипт, а также повышенной экспрессии муцина-2 и выраженной положительной экспрессии муцина-5АС в цитоплазме вдоль длины крипты при наличии мутации гена BRAF, либо отсутствию или очаговой умеренной экспрессии муцина-5АС вдоль длины крипты при отсутствии мутации гена BRAF. Диагноз традиционной зубчатой аденомы устанавливают по отсутствию мутации гена BRAF, отсутствию экспрессии муцина-6, а также выраженной экспрессии муцина-2 вдоль длины крипты или умеренной экспрессии муцина-2 в основаниях крипт и отсутствию экспрессии муцина 5АС при отсутствии мутации гена KRAS или очаговой экспрессии муцина 5АС с расположением в верхней части крипты и поверхностном эпителии наряду с выраженной экспрессией муцина-2 вдоль длины крипты при наличии мутации гена KRAS. Диагноз гиперпластического полипа устанавливают по наличию выраженной цитоплазматической экспрессии муцина-2 вдоль длины крипты, отрицательной экспрессии муцина-6 в основаниях крипт и очаговой положительной экспрессии муцина-5АС в дилатированных основаниях крипт независимо от наличия мутаций генов KRAS и BRAF. Изобретение обеспечивает морфологическую диагностику, позволяющую дифференцировать все три вида зубчатых новообразований толстой кишки, а также изобретение позволяет не только проводить диагностику при поступлении пациента в лечебно-профилактическое учреждение, но и по прошествии времени в случае необходимости уточнения диагноза или проверки правильности установления диагноза. 8 ил., 2 пр.

 

Изобретение относится к медицине, в частности к онкологии и патологической анатомии. Зубчатые новообразования толстой кишки - это гетерогенная группа опухолей с различным злокачественным потенциалом. В классификации Всемирной организации здравоохранения зубчатые колоректальные поражения делятся на 3 подтипа: 1. Гиперпластический полип; 2. Сидячая зубчатая аденома/полип (или зубчатая аденома/полип на широком основании) с или без цитологической атипией; 3. Традиционная зубчатая аденома [11].

Их дифференциальная диагностика затруднена, что обусловлено малоизученностью их молекулярно-биологических характеристик. До сих пор зубчатые новообразования диагностируются как доброкачественные эпителиальные опухоли или гиперпластические полипы толстой кишки. Важность повышения качества диагностики данных заболеваний обусловлена тем, что зубчатые поражения толстой кишки, преимущественно сидячая зубчатая аденома, являются предшественниками около 30% всех случаев колоректального рака [4].

Морфологическая диагностика зубчатых новообразований на сегодняшний день основана на выявлении в гистологических препаратах специфической структуры образований, в первую очередь зубчатого профиля эпителия и формы крипт.

Для традиционной зубчатой аденомы характерны эктопические крипты, расположенные под прямым углом относительно продольной оси основной крипты с зубчатым профилем поверхностного эпителия, эозинофильными изменениями цитоплазмы эпителиоцитов, бульбовидным расширением концевых отделов ворсинок (при их наличии). Основными признаками сидячей зубчатой аденомы являются расширение основания крипт с одновременным их уплощением, измененная форма крипт (разветвленная, в форме якоря, L-образная или перевернутая Т-образная форма), асимметрия пролиферативной зоны. Гиперпластические полипы характеризуются зубчатым профилем крипт, преимущественно в верхней трети и в поверхностном эпителии, прямой формой крипт с расширением к поверхности, симметрией пролиферативной зоны и отсутствием признаков дисплазии [3]. Однако далеко не во всех случаях при гистологическом исследовании удается выявить эти характерные признаки.

Существуют способы диагностики зубчатых образований, при которых традиционное микроскопическое исследование гистологических препаратов дополняется иммуногистохимическим выявлением факторов, определяющих пролиферативный потенциал, а также секреторного профиля новообразования [1].

Наиболее близким к заявляемому методу является способ дифференциальной диагностики сидячих зубчатых аденом и гиперпластических полипов с помощью иммуногистохимического определения в новообразовании экспрессии муцина 5АС и секреторного белка TFF1 (trefoil factor 1) [7]. Высокая экспрессия этих двух белков в верхней части крипт считалась характерной для гиперпластических полипов, слабая экспрессия этих белков вдоль крипты обнаруживалась в сидячей зубчатой аденоме. Недостатком данного метода является невозможность дифференциальной диагностики традиционной зубчатой аденомы.

Задача изобретения - разработать способ морфологической диагностики, позволяющий дифференцировать все три вида зубчатых новообразований толстой кишки.

Сущность метода заключается в дополнении традиционного гистологического исследования зубчатых новообразований иммуногистохимическими исследованиями с разработанной панелью антител с целью выявления экспрессии муцинов -2, -6 и 5АС совместно с молекулярно-генетическим исследованием для определения наличия мутаций генов BRAF и KRAS методом полимеразной цепной реакции в режиме реального времени, а также выявлением специфических характеристик экспрессии муцинов в зависимости от наличия или отсутствия мутаций генов BRAF и KRAS.

На сегодняшний день известно порядка двадцати видов муцинов. Выбор вышеуказанных муцинов основан на результатах проведенного нами исследования, выявившего эти виды муцинов как наиболее достоверные критерии дифференциальной диагностики с учетом их встречаемости и особенностей экспрессии в зависимости от наличия других признаков, таких как мутации генов BRAF и KRAS. Известно, что соматические мутации гена KRAS часто обнаруживают при раке толстой кишки и других злокачественных опухолях [5, 9]. Определение мутационного статуса гена KRAS имеет значение при планировании терапии блокаторами рецепторов эпидермального фактора роста, так как карциномы с мутацией KRAS резистентны к данным препаратам [8].

BRAF представляет собой RAS-регулируемую киназу, которая наряду с KRAS является еще одним участником сигнального пути Ras-Raf-MAPK, контролирующего клеточную пролиферацию, дифференцировку и апоптоз. Мутации в гене BRAF часто обнаруживаются в злокачественных опухолях человека, таких как колоректальный рак, немелкоклеточный рак легких, меланомы и папиллярный рак щитовидной железы [2, 6]. Определение мутации генов KRAS и BRAF используется для оценки потенциального риска злокачественной трансформации.

В заявляемом способе выявление мутаций генов KRAS и BRAF используется в качестве не только и не столько прогностического, но и дифференциально-диагностического критерия, непосредственно связанного с особенностями экспрессии муцинов в зубчатых новообразованиях, а также в качестве самостоятельного дифференциально-диагностического критерия. Предлагаемый способ осуществляют следующим образом.

Биопсийный материал после стандартной гистологической проводки заливают в парафин и изготавливают гистологические срезы.

Проводят микроскопирование гистологических срезов, окрашенных гематоксилином и эозином, проводят ШИК-реакцию в сочетании с альциановым синим, что позволяет установить наличие зубчатого новообразования, секретирующего муцины. Далее проводят иммуногистохимическое исследование с антителами к муцинам -2, -6, 5АС. Интерпретацию результатов иммуногистохимического исследования с указанными антителами осуществляют с учетом локализации позитивных опухолевых клеток (основание крипты, вдоль длины крипты и в поверхностном эпителии) и путем подсчета количества окрашенных опухолевых клеток на 100 клеток в 10 полях зрения (увеличение 400); полученные результаты выражают в процентах: 0 - отсутствие экспрессии, 1 - до 50% окрашенных клеток - очаговая экспрессия, более 50% окрашенных клеток - выраженная экспрессия муцина.

Из парафиновых блоков, которые использовали для изготовления гистологических срезов, выделяют ДНК с помощью коммерческих наборов по стандартной методике производителя и проводят определение наличия мутаций генов KRAS и BRAF методом полимеразной цепной реакции в режиме реального времени с помощью коммерческих наборов, позволяющих выявить мутации 2, 3, 4 экзона гена KRAS и мутацию гена BRAFp.V600E.

Технический результат заключается в определении вида зубчатого новообразования толстой кишки, а именно сидячей зубчатой аденомы, традиционной зубчатой аденомы или гиперпластического полипа по следующим признакам.

Для сидячей зубчатой аденомы характерными признаками являются:

- отсутствие мутации гена KRAS;

- выраженная экспрессия муцина-2 и экспрессия муцина-6 в дилатированных основаниях крипт;

- при наличии мутации гена BRAF характерно более яркое окрашивание с антителами к муцину-2, чем в сидячей зубчатой аденоме без мутации. BRAF-положительная сидячая зубчатая аденома имеет также выраженную положительную экспрессию муцина-5АС в цитоплазме вдоль длины крипты; - сидячую зубчатую аденому без мутации гена BRAF в большей части случаев характеризует очаговая умеренная экспрессия муцина 5АС вдоль длины крипты, в меньшей части случаев экспрессия этого муцина отсутствует.

Дифференциально-диагностическими признаками традиционной зубчатой аденомы являются:

- отсутствие мутации гена BRAF;

- отсутствие экспрессии муцина-6;

- при отсутствии мутации гена KRAS характерными признаками являются выраженная экспрессия муцина-2 вдоль длины крипты или умеренная экспрессия муцина-2 в основаниях крипт, отсутствие экспрессии муцина 5АС;

- при наличии мутации гена KRAS традиционная зубчатая аденома характеризуется очаговой экспрессией муцина 5АС с расположением в верхней части крипты и поверхностном эпителии наряду с выраженной экспрессией муцина-2 вдоль длины крипты;

Дифференциально-диагностическими признаками гиперпластического полипа являются:

- выраженная цитоплазматическая экспрессия муцина-2 вдоль длины крипты;

- отрицательная экспрессия муцина-6 в основаниях крипт;

- очаговая положительная экспрессия муцина-5АС в дилатированных основаниях крипт независимо от наличия мутаций генов KRAS и BRAF.

Таким образом, разработан способ дифференциальной диагностики видов зубчатых новообразований с исследованием залитого в парафин биоптата, что позволяет не только проводить диагностику при поступлении пациента в лечебно-профилактическое учреждение, но и по прошествии времени в случае необходимости уточнения диагноза или проверки правильности установления диагноза.

Пример 1.

Пациент Т., поступил в стационар с жалобами на рецидивирующие боли в правых отделах живота, преимущественно в правом подреберье, сухость во рту. При выполнении диагностической колоноскопии были выявлены эпителиальные образования толстой кишки и дивертикулез сигмовидной кишки без признаков дивертикулита. Было произведено удаление эпителиальных образований через эндоскоп холодным методом. В дальнейшем была произведена вырезка и обработка операционного материала с заливкой его в парафин.

Гистологические срезы толщиной 4 мкм были окрашены гематоксилином и эозином, проведена комбинированная ШИК-реакция в сочетании с альциановым синим. Иммуногистохимическое исследование проводилось с помощью иммуностейнеров «Leica Bond-maX» (Germany) и «Ventana Beuch Mark Ultra» (США). Иммуногистохимическая панель включала антитела к муцину-2 (клон Сср58), муцину 5АС (клон CLH2) и муцину-6 (клон MRQ - 20).

Для выявления мутаций генов KRAS и BRAF использованы парафиновые блоки с зубчатыми новообразованиями, из которых была выделена геномная ДНК (набором для выделения ДНК «DNA Sample Preparation Kit Cobas» «Roche», США).

Для определения мутаций генов KRAS и BRAF использовался метод полимеразной цепной реакции в режиме реального времени с набором реагентов «KRAS/BRAF Mutation Analysis Kit» («EntroGen», США); аналитическая панель включала мутации 2, 3, 4 экзона гена KRAS и мутацию гена BRAFp.V600E. Исследование проводилось на термоциклере «С1000 Touch» с оптическим модулем «CFX96» («Bio-Rad Laboratories», США). Данные прогонов обрабатывались с использованием программы «CFX Manager v2.1».

Проведено гистологическое исследование операционного материала. При гистологическом исследовании операционный материал был представлен фрагментами слизистой оболочки толстой кишки с гиперпластическими изменениями без дисплазии. На фиг. 1 представлен гистологический микропрепарат данного новообразования, окрашенный гематоксилином и эозином, с картиной зубчатого профиля поверхностного эпителия и вдоль длины крипты и большим количеством бокаловидных клеток.

Проведена оценка результатов иммуногистохимического исследования экспрессии муцинов.

На фиг. 2 видна выраженная экспрессия муцина-2 вдоль длины крипт и в поверхностном эпителии. На фиг. 3 продемонстрировано отсутствие экспрессии муцина-6. На фиг. 4 - слабая очаговая экспрессия эпителиоцитами муцина 5АС.

При проведении молекулярно-генетического исследования было выявлено отсутствие мутаций генов BRAF и KRAS.

На основании полученных данных проведенного морфологического и молекулярно-генетического исследования и совокупности соответствующих дифференциально-диагностических критериев был выставлен диагноз: «Гиперпластический полип толстой кишки».

Пример 2.

Пациентка С., поступила в стационар с жалобами на тянущие боли внизу живота, больше справа. После исключения гинекологической патологии пациентка была консультирована хирургом, назначившим колоноскопию. При выполнении диагностической колоноскопии было выявлено эпителиальное образование толстой кишки. Было произведено удаление эпителиального образования через эндоскоп. В дальнейшем была произведена вырезка и обработка операционного материала.

Гистологическое, иммуногистохимиеское исследование и выявление мутаций генов KRAS и BRAF проводилось как в примере 1.

На фиг. 5 представлен результат гистологического исследования препарата удаленного новообразования, окрашенный гематоксилином и эозином. Операционный материал был представлен мелкими фрагментами слизистой толстой кишки с наличием расширенных крипт с уплощенными основаниями; в поверхностном эпителии и на протяжении длины крипты определялась зубчатая поверхность.

На фиг. 6 представлен результат иммуногистохимического выявления муцина-2 с выраженной экспрессией муцина-2 вдоль длины крипты. На фиг. 7 показано наличие выраженной экспрессии муцина-6, локализованной в дилатированных оснований крипт. На фиг. 8 видна выраженная реакция с антителами к муцина 5АС вдоль длины крипты.

При проведении молекулярно-генетического исследования была выявлена мутация гена BRAF.

По совокупности признаков, выявленных при морфологическом и молекулярно-генетическом исследованиях был выставлен диагноз: «Сидячая зубчатая аденома толстой кишки без цитологической атипии».

Литература

1. Агейкина Н.В., Харлова О.А., Олейникова Н.А., Мальков П.Г., Князев М.В., Дуванский В.А. Диагностические критерии зубчатых новообразований толстой кишки // Доктор.ру. - 2017. - №2(131). -С. 56-62.

2. Bassa D. BRAF Mutation in Colorectal Cancer: An Update // Biomark Cancer, - 2015. - V. 7. - Supp.l 1. - P. 9-12.

3. Batts K.P. The pathology of serrated colorectal neoplasia: practical answers for common questions //Mod. Pathol. - 2015. - V. 28 (Suppl 1). - P. S80-D87.

4. Bettington M., Walker N., Rosty C., Brown I., Clouston A., Wockner L. The serrated pathway to colorectal carcinoma: current concepts and challenges // Histopathology. - 2013. - 62. - No. 3. - P. 367-386.

5. Burmer GC, Loeb LA. Mutations in the KRAS2 oncogene during progressive stages of human colon carcinoma - Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. - 1989. - V. 86. No. 7. - P. 2403-2407;

6. Davies H., Bignell G., Futreal A. Mutations of the BRAF gene in human cancer // Nature. - 2002. - V. 417. - P. 949-954.

7. Khaidakov M., Lai K.K., Roudachevski D., et al. Gastric Proteins MUC5AC and TFF1 as Potential Diagnostic Markers of Colonic Sessile Serrated Adenomas/Polyps // Am. J. Clin. Pathol. - 2016. - V. 146. - V. 5. - P. 530-537.

8. Bachet JB, Le Corre D., Boige V., Landi В., Emile J.F., , Tomasic G., Penna C., Ducreux M., Rougier P., Penault-Llorca F., Laurent-Puig P. KRAS mutation status is predictive of response to cetuximab therapy in colorectal cancer // Cancer Res. - 2006. - V. 66. - No. 8. - P. 3992-3995.

9. Tam I.Y., Chung L.P., Suen W.S., Wang E., Wong M. Distinct epidermal growth factor receptor and KRAS mutation patterns in non-small cell lung cancer patients with different tobacco exposure and clinicopathologic features//Clin. Cancer Res. - 2006. - V. 12. - No. 5. - P. 1647-1653.

10. Torlakovic E., Skovlund E., Snover D.C., Torlakovic G., Nesland J.M. Morphologic reappraisal of serrated colorectal polyps // Am. J. Surg. Pathol. - 2003 - V. 27. - No. 1. - P. 65-81.

11. WHO Claassification of Tumor of the Digestive System: The Fourth Edition. 2010, 417 р.

Способ дифференциальной диагностики зубчатых новообразований толстой кишки, заключающийся в морфологическом, иммуногистохимическом и молекулярно-генетическом исследовании удаленных новообразований и отличающийся одновременным выявлением в удаленном образовании, залитом в парафиновые блоки, в качестве дифференциально-диагностических критериев видов зубчатых новообразований наличия или отсутствия мутаций 2, 3, 4 экзона гена KRAS и мутации гена BRAFp.V600E методом полимеразной цепной реакции в реальном режиме времени и особенностей экспрессии муцинов-2, 5АС и -6 методом иммуногистохимии в зависимости от наличия или отсутствия мутаций генов KRAS и BRAF с установлением диагноза сидячей зубчатой аденомы по отсутствию мутации гена KRAS и выраженной экспрессии муцина-2, экспрессии муцина-6 в дилатированных основаниях крипт, а также повышенной экспрессии муцина-2 и выраженной положительной экспрессии муцина-5АС в цитоплазме вдоль длины крипты при наличии мутации гена BRAF, либо отсутствию или очаговой умеренной экспрессии муцина-5АС вдоль длины крипты при отсутствии мутации гена BRAF; с установлением диагноза традиционной зубчатой аденомы по отсутствию мутации гена BRAF, отсутствию экспрессии муцина-6, а также выраженной экспрессии муцина-2 вдоль длины крипты или умеренной экспрессии муцина-2 в основаниях крипт и отсутствию экспрессии муцина 5АС при отсутствии мутации гена KRAS или очаговой экспрессии муцина 5АС с расположением в верхней части крипты и поверхностном эпителии наряду с выраженной экспрессией муцина-2 вдоль длины крипты при наличии мутации гена KRAS и установлением диагноза гиперпластического полипа по наличию выраженной цитоплазматической экспрессии муцина-2 вдоль длины крипты, отрицательной экспрессии муцина-6 в основаниях крипт и очаговой положительной экспрессии муцина-5АС в дилатированных основаниях крипт независимо от наличия мутаций генов KRAS и BRAF.



 

Похожие патенты:
Изобретение относится к области молекулярной биологии, лабораторной диагностики, вирусологии и эпидемиологии и предназначено для генотипирования энтеровирусов методом секвенирования 1A-1B участка генома.

Изобретение относится к области биотехнологии, конкретно к иммуногенным эпитопам URLC10, и может быть использовано в медицине для лечения пациента, страдающего раком.

Изобретение относится к области биотехнологии, конкретно к иммуногенным эпитопам URLC10, и может быть использовано в медицине для лечения пациента, страдающего раком.

Изобретение относится к области биохимии, в частности к способу увеличения устойчивости растения к грибковой инфекции, вызываемой грибами семейства Sclerotiniaceae, включающему повышение в указанном растении экспрессии белка AtRLP30, а также к способу получения трансгенного растения с повышенной устойчивостью к грибковой инфекции, вызываемой грибами семейства Sclerotiniaceae, включающему трансформацию растения или растительной клетки с помощью нуклеотидной последовательности, кодирующей AtRLP30 или AtRLP30-подобный белок.

Изобретение относится к области биохимии, в частности к способу увеличения устойчивости растения к грибковой инфекции, вызываемой грибами семейства Sclerotiniaceae, включающему повышение в указанном растении экспрессии белка AtRLP30, а также к способу получения трансгенного растения с повышенной устойчивостью к грибковой инфекции, вызываемой грибами семейства Sclerotiniaceae, включающему трансформацию растения или растительной клетки с помощью нуклеотидной последовательности, кодирующей AtRLP30 или AtRLP30-подобный белок.

Изобретение относится к области медицины, а именно к лабораторной диагностике, основанной на генетическом методе выявления критериев, свидетельствующих о тяжести клинического течения гемофилии.
Изобретение относится к медицине и может быть использовано для ранней дифференциальной диагностики геморрагической лихорадки с почечным синдромом (ГЛПС) от обострения хронического пиелонефрита.

Изобретение относится к определению комплемент-зависимой цитотоксичности композиции. Способ определения комплемент-зависимой цитотоксичности композиции, содержащей первый сайт связывания, который специфически связывается с первым эпитопом первого антигена, конъюгированный с первым полипептидом Fc-области человеческого происхождения, и второй сайт связывания, который специфически связывается со вторым эпитопом второго антигена, конъюгированный со вторым полипептидом Fc-области человеческого происхождения, включает следующие стадии: инкубацию человеческой клетки, экспрессирующей первый антиген или первый антиген и второй антиген, с композицией, добавление к смеси стадии (а) кроличьего комплемента, определение клеточного лизиса и, таким образом, определение комплемент-зависимой цитотоксичности композиции.
Изобретение относится к области медицины, в частности к медицинской генетике и кардиологии, и предназначено для выявления предрасположенности пациента к атеросклерозу или наличия доклинических признаков этой патологии.
Изобретение относится к медицине, а именно к гигиене питания, и может быть использовано для оценки эффективности рационов лечебно-профилактического питания для работающих приоритетных профессий медной металлургии.

Изобретение относится к медицине, в частности к онкологии и патологической анатомии, а именно к дифференциальной диагностике зубчатых новообразований толстой кишки. Для этого проводят морфологические, иммуногистохимические и молекулярно-генетические исследования удаленных новообразований и одновременно происходит выявление в удаленном образовании, залитом в парафиновые блоки, в качестве дифференциально-диагностических критериев видов зубчатых новообразований наличия или отсутствия мутаций 2, 3, 4 экзона гена KRAS и мутации гена BRAFp.V600E методом полимеразной цепной реакции в реальном режиме времени и особенностей экспрессии муцинов-2, 5АС и -6 методом иммуногистохимии в зависимости от наличия или отсутствия мутаций генов KRAS и BRAF. Диагноз сидячей зубчатой аденомы устанавливают по отсутствию мутации гена KRAS и выраженной экспрессии муцина-2, экспрессии муцина-6 в дилатированных основаниях крипт, а также повышенной экспрессии муцина-2 и выраженной положительной экспрессии муцина-5АС в цитоплазме вдоль длины крипты при наличии мутации гена BRAF, либо отсутствию или очаговой умеренной экспрессии муцина-5АС вдоль длины крипты при отсутствии мутации гена BRAF. Диагноз традиционной зубчатой аденомы устанавливают по отсутствию мутации гена BRAF, отсутствию экспрессии муцина-6, а также выраженной экспрессии муцина-2 вдоль длины крипты или умеренной экспрессии муцина-2 в основаниях крипт и отсутствию экспрессии муцина 5АС при отсутствии мутации гена KRAS или очаговой экспрессии муцина 5АС с расположением в верхней части крипты и поверхностном эпителии наряду с выраженной экспрессией муцина-2 вдоль длины крипты при наличии мутации гена KRAS. Диагноз гиперпластического полипа устанавливают по наличию выраженной цитоплазматической экспрессии муцина-2 вдоль длины крипты, отрицательной экспрессии муцина-6 в основаниях крипт и очаговой положительной экспрессии муцина-5АС в дилатированных основаниях крипт независимо от наличия мутаций генов KRAS и BRAF. Изобретение обеспечивает морфологическую диагностику, позволяющую дифференцировать все три вида зубчатых новообразований толстой кишки, а также изобретение позволяет не только проводить диагностику при поступлении пациента в лечебно-профилактическое учреждение, но и по прошествии времени в случае необходимости уточнения диагноза или проверки правильности установления диагноза. 8 ил., 2 пр.

Наверх