Способ получения l-аминокислот с помощью алкалифильной бактерии
Группа изобретений относится к области биотехнологии. Предложена аланиндегидрогеназа, отличающаяся тем, что указанный фермент имеет последовательность, которая по меньшей мере на 85% идентична последовательности под SEQ ID NO: 72. Предложен полинуклеотид, кодирующий указанную аланиндегидрогеназу. Предложен рекомбинантный микроорганизм рода Corynebacterium для получения L-аланина, L-валина, L-глутамата и L-лизина, при этом содержащий по меньшей мере одну указанную аланиндегидрогеназу и/или по меньшей мере один указанный полинуклеотид. Предложен способ получения в избыточном количестве L-аминокислоты с помощью микроорганизма рода Corynebacterium, отличающийся тем, что указанный полинуклеотид, кодирующий указанный полипептид, встроен в рекомбинантный микроорганизм рода Corynebacterium с помощью клонирующего или экспрессионного вектора, при этом указанная аминокислота выбрана из группы, содержащей L-аланин, L-валин, L-глутамат и L-лизин. Группа изобретений позволяет получать L-аланин, L-валин, L-глутамат и L-лизин в избыточном количестве с помощью указанного микроорганизма. 4 н. и 2 з.п. ф-лы, 3 табл., 4 пр.
Настоящее изобретение относится к способу получения L-аминокислот, в котором используют алкалифильную бактерию, в частности штамм вида Corynebacterium humireducens.
Способы получения L-аминокислот, в которых используют бактерии рода Corynebacterium, известны специалистам в данной области.
Хотя известно множество видов коринебактерий, в данных способах обычно используют бактерии вида Corynebacterium glutamicum, поскольку было установлено, что этот вид является особенно предпочтительным для получения L-аминокислот.
Целью настоящего изобретения являлось получение нового штамма, который можно применять непосредственно в качестве альтернативы C. glutamicum для получения L-аминокислот, поскольку он характеризуется продуцированием в избыточном количестве по меньшей мере одной L-аминокислоты, или может считаться по меньшей мере перспективным исходным штаммом для создания нового штамма, продуцирующего L-аминокислоты.
Для того чтобы предоставить штамму статус предполагаемого исходного штамма для создания нового штамма, продуцирующего L-аминокислоты, достаточно избыточного продуцирования L-аминокислоты в относительно невысоком количестве. Соответственно увеличения выхода аминокислот у исходного штамма возможно достичь с помощью сверхэкспрессии или аттенуации генов или ферментов, в отношении которых известно, что они способствуют продуцированию соответствующих аминокислот или оказывают негативное воздействие на продуцирование, и необязательно с помощью непрямого мутагенеза.
Согласно настоящему изобретению было обнаружено, что алкалифильная бактерия, а именно бактерия вида Corynebacterium humireducens, уже по своей природе продуцирует в избыточных количествах L-аминокислоты L-аланин, L-глутаминовую кислоту и L-валин.
Более того, путем культивирования в питательной среде, которая содержит AEC и необязательно треонин, можно получить штамм C. humireducens, который продуцирует значительные количества L-лизина.
Таким образом, штамм C. humireducens одновременно представляет собой подходящую отправную точку для получения других штаммов, продуцирующих L-аминокислоты. Так, за счет соответствующего изменения метаболизма у бактерий, указанное продуцирование в избыточном количестве L-аминокислот можно приспособить для продуцирования в избыточном количестве других L-аминокислот.
Природное продуцирование в избыточном количестве L-аланина предположительно является результатом наличия высокоэффективной аланиндегидрогеназы, которая была выявлена у C. humireducens. До настоящего времени аланиндегидрогеназы были описаны лишь для нескольких других коринебактерий, но они не являются такими активными аланиндегидрогеназами, присутствие которых уже приводит к накоплению L-аланина в клетке дикого типа.
Природное продуцирование в избыточном количестве L-глутамата является предположительно результатом наличия высокоэффективных генов hut (гены «утилизации гистидина»). Кластер hut включает четыре гена hutU (уроканатгидратаза), hutI (имидазолонпропионаза), hutH (гистидинаммиаклиаза) и hutG (формимидоилглутамаза). Гены hut до настоящего времени были описаны лишь у нескольких коринебактерий, но они не являются такими активными генами hut, присутствие которых уже приводит к накоплению L-глутамата в клетке дикого типа.
Таким образом, настоящее изобретение, прежде всего, относится к способу получения в избыточном количестве L-аминокислоты, характеризующемуся тем, что в указанном способе применяют алкалифильную бактерию, предпочтительно алкалифильную коринеформную бактерию, в частности алкалифильную коринебактерию, особенно предпочтительно C. humireducens.
Алкалифильные бактерии в соответствии с настоящим изобретением являются предпочтительно галотолерантными и/или восстанавливающими гуминовые кислоты.
В соответствии с настоящим изобретением термин «алкалифильная бактерия» необходимо понимать как означающий бактерию, которая способна расти при значении pH от 8,5 до 11. Предпочтительно данный термин необходимо понимать как означающий бактерию, которая способна расти при значении pH от 9 до 10,5.
В соответствии с настоящим изобретением термин «галотолерантная бактерия» необходимо понимать как означающий бактерию, которая способна расти при значениях водной активности от 0,6 до 0,98. Предпочтительно данный термин необходимо понимать как означающий бактерию, которая способна расти при значениях водной активности от 0,75 до 0,9.
«L-аминокислоту» в соответствии с настоящим изобретением необходимо понимать как, в частности, протеиногенные L-аминокислоты.
В данном случае L-аминокислота предпочтительно выбрана из L-аланина, L-валина, L-аминокислот семейства глутамата, в частности L-глутамата, L-глутамина, L-пролина и L-аргинина, и L-аминокислот семейства аспартата, в частности L-аспартата, L-аспарагина, L-метионина, L-лизина, L-изолейцина и L-треонина. Особенно предпочтительно L-аминокислота выбрана из L-аланина, L-валина, L-глутамата, L-метионина, L-лизина и L-треонина, в особенности из L-аланина, L-валина, L-глутамата и L-лизина.
Штамм C. humireducens был впервые описан в публикации Wu и соавт. (International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology (2011), 61, 882-887). Указанный штамм депонировали в DSMZ под номером доступа DSM 45392, а его 16S rRNA депонировали в EMBL под номером доступа GQ421281. Исходный штамм представляет собой галотолерантную, алкалифильную, восстанавливающую гуминовые кислоты бактерию.
Дополнительную информацию относительно C. humireducens можно найти в следующих публикациях: Wu и соавт. (Microb. Biotechnol. (2013), 6(2), 141-149), Lin и соавт. (Bioresour. Technol. (2013), 136, 302-308).
Соответственно, настоящее изобретение также дополнительно относится к аланиндегидрогеназе (Ald), характеризующейся тем, что указанный фермент имеет последовательность, которая по меньшей мере на 85 или 90%, предпочтительно по меньшей мере на 92, 94, 96 или 98%, в особенности на 100% идентична последовательности под SEQ ID NO: 72.
Также настоящее изобретение дополнительно относится к полинуклеотиду, который кодирует аланиндегидрогеназу в соответствии с настоящим изобретением. Предпочтение отдают полинуклеотиду, имеющему последовательность, которая по меньшей мере на 70 или 75%, предпочтительно по меньшей мере на 80 или 85%, особенно предпочтительно по меньшей мере на 90 или 95%, в особенности на 100% идентична последовательности в положениях 301-1365 под SEQ ID NO: 71, и/или полинуклеотиду, который гибридизируется в жестких условиях с полинуклеотидом, последовательность которого является комплементарной последовательности в положениях 301-1365 под SEQ ID NO: 71.
Также настоящее изобретение дополнительно относится к ферментам кластера hut, выбранным из
a) уроканатгидратазы (hutU), характеризующейся тем, что указанный фермент имеет последовательность, которая по меньшей мере на 85 или 90%, предпочтительно по меньшей мере на 92, 94, 96 или 98%, в особенности на 100% идентична последовательности под SEQ ID NO: 190;
b) имидазолонпропионазы (hutI), характеризующейся тем, что указанный фермент имеет последовательность, которая по меньшей мере на 85 или 90%, предпочтительно по меньшей мере на 92, 94, 96 или 98%, в особенности на 100% идентична последовательности под SEQ ID NO: 192;
c) гистидинаммиаклиазы (hutН), характеризующейся тем, что указанный фермент имеет последовательность, которая по меньшей мере на 85 или 90%, предпочтительно по меньшей мере на 92, 94, 96 или 98%, в особенности на 100% идентична последовательности под SEQ ID NO: 194; и
d) формимидоилглутамазы, характеризующейся тем, что указанный фермент имеет последовательность, которая по меньшей мере на 85 или 90%, предпочтительно по меньшей мере на 92, 94, 96 или 98%, в особенности на 100% идентична последовательности под SEQ ID NO: 196.
Также настоящее изобретение дополнительно относится к полинуклеотидам, которые кодируют гены кластера hut в соответствии с настоящим изобретением. В данном случае предпочтение отдают следующим полинуклеотидам:
a) полинуклеотид, который кодирует уроканатгидратазу (hutU) и имеет последовательность, которая по меньшей мере на 70 или 75%, предпочтительно по меньшей мере на 80 или 85%, особенно предпочтительно по меньшей мере на 90 или 95%, в особенности на 100% идентична последовательности в положениях 301-1983 под SEQ ID NO: 189, и/или гибридизируется в жестких условиях с полинуклеотидом, последовательность которого является комплементарной последовательности в положениях 301-1983 под SEQ ID NO: 189;
b) полинуклеотид, который кодирует имидазолонпропионазу (hutU) и имеет последовательность, которая по меньшей мере на 70 или 75%, предпочтительно по меньшей мере на 80 или 85%, особенно предпочтительно по меньшей мере на 90 или 95%, в особенности на 100% идентична последовательности в положениях 301-1509 под SEQ ID NO: 191, и/или гибридизируется в жестких условиях с полинуклеотидом, последовательность которого является комплементарной последовательности в положениях 301-1509 под SEQ ID NO: 191;
с) полинуклеотид, который кодирует гистидинаммиаклиазу (hutН) и имеет последовательность, которая по меньшей мере на 70 или 75%, предпочтительно по меньшей мере на 80 или 85%, особенно предпочтительно по меньшей мере на 90 или 95%, в особенности на 100% идентична последовательности в положениях 301-1851 под SEQ ID NO: 193, и/или гибридизируется в жестких условиях с полинуклеотидом, последовательность которого является комплементарной последовательности в положениях 301-1851 под SEQ ID NO: 193; и
d) полинуклеотид, который кодирует формимидоилглутамазу (hutG) и имеет последовательность, которая по меньшей мере на 70 или 75%, предпочтительно по меньшей мере на 80 или 85%, особенно предпочтительно по меньшей мере на 90 или 95%, в особенности на 100% идентична последовательности в положениях 301-1209 под SEQ ID NO: 195, и/или гибридизируется в жестких условиях с полинуклеотидом, последовательность которого является комплементарной последовательности в положениях 301-1209 под SEQ ID NO: 195.
В соответствии с настоящим изобретением под «жесткими условиями» следует понимать отмывание при концентрации солей 1x SSC и 0,1% по весу SDS при температуре 80°C.
Настоящее изобретение также дополнительно относится к полинуклеотидам, которые комплементарны кодирующим полинуклеотидам в соответствии с настоящим изобретением.
Соответственно, настоящее изобретение также дополнительно относится к векторам, в частности клонирующим и экспрессионным векторам, которые содержат полинуклеотиды в соответствии с настоящим изобретением. Данные векторы можно встраивать соответствующим образом в микроорганизмы, в частности в коринеформные бактерии, в особенности рода Corynebacterium, или энтеробактерии, в особенности рода Escherichia.
Кроме того, полинуклеотид в соответствии с настоящим изобретением с целью экспрессии кодируемых генов можно также встраивать в геном микроорганизмов, в частности в геном коринеформных бактерий, в частности бактерий рода Corynebacterium, или в геном энтеробактерий, в особенности бактерий рода Escherichia.
Настоящее изобретение также дополнительно относится к соответствующим рекомбинантным микроорганизмам, предпочтительно к бактериям, в частности к коринеформным бактериям, в особенности бактериям рода Corynebacterium, особенно предпочтительно к видам C. humireducens или C. glutamicum, а также к энтеробактериям, в особенности к бактериям рода Escherichia, содержащим одну аланиндегидрогеназу в соответствии с настоящим изобретением, и/или один или более ферментов, предпочтительно все ферменты кластера hut в соответствии с настоящим изобретением, и/или один или более полинуклеотидов в соответствии с настоящим изобретением, и/или векторы в соответствии с настоящим изобретением.
В этом отношении предпочтительным объектом являются рекомбинантные коринебактерии, в частности бактерии вида C. humireducens и вида C. glutamicum, содержащие аланиндегидрогеназу в соответствии с настоящим изобретением, и/или полинуклеотид, кодирующий указанный фермент, и/или по меньшей мере один вектор, содержащий указанный полинуклеотид.
В этом отношении предпочтительным объектом являются рекомбинантные коринебактерии, в частности бактерии вида C. humireducens и вида C. glutamicum, содержащие по меньшей мере один фермент, предпочтительно все ферменты кластера hut, и/или полинуклеотиды, кодирующие указанные ферменты, и/или по меньшей мере один вектор, содержащий указанные полинуклеотиды.
Настоящее изобретение также конкретно относится к рекомбинантным микроорганизмам, предпочтительно к бактериям, в частности к коринеформным бактериям, в особенности бактериям рода Corynebacterium, за исключением вида C. humireducens, в частности к виду C. glutamicum, содержащим одну аланиндегидрогеназу в соответствии с настоящим изобретением, и/или один или более, предпочтительно все ферменты кластера hut в соответствии с настоящим изобретением, и/или один или более полинуклеотидов в соответствии с настоящим изобретением, и/или векторы в соответствии с настоящим изобретением.
В соответствии с настоящим изобретением «рекомбинантный микроорганизм» или «рекомбинантную бактерию» необходимо понимать как микроорганизм или бактерию, которых подвергали по меньшей мере одной генноинженерной манипуляции. В этом отношении генноинженерная манипуляция может, в частности, представлять собой целенаправленную или случайную мутацию, встраивание чужеродного гена и/или сверхэкспрессию или аттенуацию гена хозяина или чужеродного гена. Рекомбинантный микроорганизм в соответствии с настоящим изобретением или рекомбинантная бактерия в соответствии с настоящим изобретением предпочтительно характеризуется сверхэкспрессией или аттенуацией по меньшей мере одного гена. В особенно предпочтительном варианте осуществления микроорганизм в соответствии с настоящим изобретением или бактерия в соответствии с настоящим изобретением характеризуются сверхэкспрессией аланиндегидрогеназы в соответствии с настоящим изобретением или полинуклеотида, кодирующего указанный фермент. В дополнительном особенно предпочтительном варианте осуществления микроорганизм в соответствии с настоящим изобретением или бактерия в соответствии с настоящим изобретением характеризуются сверхэкспрессией по меньшей мере одного фермента кластера hut в соответствии с настоящим изобретением, в частности всех ферментов кластера hut в соответствии с настоящим изобретением, или соответствующих полинуклеотидов, кодирующих данные ферменты.
В пределах рода Corynebacterium предпочтение отдают штаммам в соответствии с настоящим изобретением, которые относятся к следующим видам: Corynebacterium efficiens, такой как типовой штамм DSM44549, Corynebacterium glutamicum, такой как типовой штамм ATCC13032 или штамм R, Corynebacterium ammoniagenes, такой как типовой штамм ATCC6871, Corynebacterium humireducens, такой как типовой штамм DSM 45392, и Corynebacterium pekinese, такой как штамм CGMCC № 5361.
Особое предпочтение отдают видам Corynebacterium glutamicum и Corynebacterium humireducens. Если в контексте данной заявки упоминают штамм Corynebacterium humireducens, то указанный штамм представляет собой предпочтительно штамм DSM 45392 или происходящий от него штамм.
Некоторые представители вида Corynebacterium glutamicum также известны из уровня техники под другими названиями. Данные штаммы, например, включают: Corynebacterium acetoacidophilum ATCC13870, Corynebacterium lilium DSM20137, Corynebacterium melassecola ATCC17965, Brevibacterium flavum ATCC14067, Brevibacterium lactofermentum ATCC13869 и Brevibacterium divaricatum ATCC14020. Также для Corynebacterium glutamicum использовали эквивалентный термин «Micrococcus glutamicus». Некоторые представители вида Corynebacterium efficiens также были упомянуты в предшествующем уровне техники как Corynebacterium thermoaminogenes, как, например, штамм FERM BP-1539.
Информацию в отношении таксономической классификации штаммов группы коринеформных бактерий можно найти, в частности, в Seiler (Journal of General Microbiology 129, 1433-1477 (1983)), Kinoshita (1985, Glutamic Acid Bacteria, p 115-142), в Demain and Solomon (ed), Biology of Industrial Microorganisms. The Benjamin/Cummins Publishing Co., London, UK, Kämpfer and Kroppenstedt (Canadian Journal of Microbiology 42, 989-1005 (1996)), Liebl и соавт. (International Journal of Systematic Bacteriology 41, 255-260 (1991)), Fudou и соавт. (International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology 52, 1127-1131 (2002)) и в US-A-5250434.
Штаммы с обозначение «ATCC» можно получить из Американской коллекции типовых культур (Манассас, Вайоминг, США). Штаммы с обозначением «DSM» можно получить из Немецкой коллекции микроорганизмов и клеточных культур (German Microorganism and Cell Culture collection) (DSMZ, Брауншвейг, Германия). Штаммы с обозначением «NRRL» можно получить из Коллекции запатентованных культур службы сельскохозяйственных исследований (ARS, Пеория, Иллинойс, США). Штаммы с обозначением «FERM» можно получить из Национального института перспективных технических наук и технологий (AIST Tsukuba Central 6, 1-1-1 Higashi, Тсукуба Ибараки, Япония). Штаммы с обозначением «CGMCC» можно получить из Центральной коллекции культур основных микроорганизмов (CGMCC, Пекин, Китай).
Настоящее изобретение также дополнительно относится к способу получения в избыточном количестве L-аминокислоты, характеризующемуся тем, что в указанном способе применяют аланиндегидрогеназу в соответствии с настоящим изобретением, и/или по меньшей мере один фермент кластера hut в соответствии с настоящим изобретением, предпочтительно все ферменты кластера hut в соответствии с настоящим изобретением, и/или по меньшей мере один полинуклеотид в соответствии с настоящим изобретением, и/или рекомбинантный микроорганизм в соответствии с настоящим изобретением, предпочтительно рекомбинантную бактерию в соответствии с настоящим изобретением, в частности рекомбинантную коринеформную бактерию в соответствии с настоящим изобретением, особенно предпочтительно рекомбинантную коринебактерию в соответствии с настоящим изобретением, в особенности коринебактерию видов C. humireducens или C. glutamicum. В предпочтительном варианте осуществления в соответствии с настоящим изобретением по меньшей мере один полинуклеотид в соответствии с настоящим изобретением или полипептид, кодируемый указанным полинуклеотидом, используют в данном случае в сверхэкспрессируемой форме.
Предпочтительным объектом настоящего изобретения в этом отношении является способ получения в избыточном количестве L-аминокислоты, характеризующийся тем, что в указанном способе применяют аланиндегидрогеназу в соответствии с настоящим изобретением, и/или по меньшей мере один полинуклеотид, кодирующий указанный фермент, и/или по меньшей мере один вектор, содержащий указанный полинуклеотид, и/или рекомбинантную коринебактерию, предпочтительно видов C. humireducens или C. glutamicum, которая содержит аланиндегидрогеназу в соответствии с настоящим изобретением и/или по меньшей мере один полинуклеотид, кодирующий указанный фермент, и/или по меньшей мере один вектор, содержащий указанный полинуклеотид.
Таким образом, дополнительным предпочтительным объектом настоящего изобретения также является способ получения в избыточном количестве L-аминокислоты, характеризующийся тем, что в указанном способе применяют по меньшей мере один фермент кластера hut в соответствии с настоящим изобретением, предпочтительно все ферменты кластера hut в соответствии с настоящим изобретением, и/или по меньшей мере один полинуклеотид кодирующий указанный(указанные) фермент(ферменты), предпочтительно полинуклеотиды, кодирующие все ферменты кластера hut в соответствии с настоящим изобретением, и/или по меньшей мере один вектор, содержащий указанный(указанные) полинуклеотид(полинуклеотиды), и/или рекомбинантную коринебактерию, предпочтительно вида C. humireducens или C. glutamicum, которая содержит по меньшей мере один фермент кластера hut в соответствии с настоящим изобретением, предпочтительно все ферменты кластера hut в соответствии с настоящим изобретением, и/или по меньшей мере один полинуклеотид, кодирующий указанный(указанные) фермент(ферменты), предпочтительно полинуклеотиды, кодирующие все ферменты кластера hut в соответствии с настоящим изобретением, и/или по меньшей мере один вектор, содержащий указанный(указанные) полинуклеотид(полинуклеотиды).
В данном случае L-аминокислота предпочтительно выбрана из L-аланина, L-валина, L-аминокислот семейства глутамата, в частности L-глутамата, L-глутамина, L-пролина и L-аргинина, и L-аминокислот семейства аспартата, в частности L-аспартата, L-аспарагина, L-метионина, L-лизина, L-изолейцина и L-треонина, особенно предпочтительно выбрана из L-аланина, L-валина, L-глутамата, L-метионина, L-лизина и L-треонина, в особенности из L-аланина, L-валина, L-глутамата и L-лизина.
Используемая в способе получения коринебактерия в соответствии с настоящим изобретением предпочтительно выбрана из C. humireducens и C. glutamicum.
«Продуцировать(получать) в избыточном количестве» или «продуцирование(получение) в избыточном количестве» по отношению к L-аминокислотам в соответствии с настоящим изобретением необходимо понимать в том значении, что микроорганизмы продуцируют L-аминокислоты в соответствии с их собственными потребностями, при этом аминокислоты либо концентрируются в клетке, либо секретируются в окружающую питательную среду, где они накапливаются. В данном случае микроорганизмы предпочтительно характеризуются способностью к концентрированию или накоплению в клетке или в питательной среде ≥ (по меньшей мере) 0,25 г/л, ≥0,5 г/л, ≥1,0 г/л, ≥1,5 г/л, ≥2,0 г/л, ≥4 г/л или ≥10 г/л соответствующих L-аминокислот в течение ≤ (не более) 120 часов, ≤96 часов, ≤48 часов, ≤36 часов, ≤24 часов или ≤12 часов.
В соответствии с настоящим изобретением рекомбинантные микроорганизмы, в которые были встроены полинуклеотиды в соответствии с настоящим изобретением и/или векторы в соответствии с настоящим изобретением, в предпочтительном варианте осуществления уже имеют способность к продуцированию в избыточном количестве L-аминокислоты перед встраиванием в них полинуклеотидов и/или векторов в соответствии с настоящим изобретением. Исходные штаммы предпочтительно представляют собой штаммы, которые были получены путем мутагенеза и селекции, с помощью методик рекомбинантной ДНК или путем комбинации обоих методик.
Является очевидным и не требует дополнительного пояснения тот факт, что рекомбинантный микроорганизм в соответствии с настоящим изобретением также может быть получен таким способом, при котором в диком штамме, в котором присутствует или был встроен полинуклеотид в соответствии с настоящим изобретением и/или вектор в соответствии с настоящим изобретением, и посредством дополнительных подходящих генноинженерных манипуляций, что вызывает продуцирование L-аминокислоты или повышение продуцирования L-аминокислоты.
Настоящее изобретение также дополнительно относится к другим полинуклеотидам из C. humireducens, а также к полипептидам, кодируемым указанными полинуклеотидами. Сверхэкспрессия соответствующих полинуклеотидов или полипептидов может оказывать положительное воздействие на продуцирование определенных L-аминокислот.
Таким образом, настоящее изобретение также относится к
a) треониндегидратазе (IlvA, EC 4.3.1.19) с последовательностью, которая по меньшей мере на 90, 95 или 98%, предпочтительно на 100% идентична последовательности под SEQ ID NO: 106, и кодирующим ее полинуклеотидам,
b) субъединице ацетолактатсинтазы (IlvB) c последовательностью, которая по меньшей мере на 90, 95 или 98%, предпочтительно на 100% идентична последовательности под SEQ ID NO: 98, и кодирующим ее полинуклеотидам,
с) изомероредуктазе (IlvC, EC 1.1.1.86) с последовательностью, которая по меньшей мере на 90, 95 или 98%, предпочтительно на 100% идентична последовательности под SEQ ID NO: 100, и кодирующим ее полинуклеотидам,
d) дегидратазе дигидроксикислот (IlvD, EC 4.2.1.9) с последовательностью, которая по меньшей мере на 90, 95 или 98%, предпочтительно на 100% идентична последовательности под SEQ ID NO: 102, и кодирующим ее полинуклеотидам,
e) трансаминазе (IlvE, EC 2.6.1.42) с последовательностью, которая по меньшей мере на 90, 95 или 98%, предпочтительно на 100% идентична последовательности под SEQ ID NO: 104, и кодирующим ее полинуклеотидам,
f) ацетолактатсинтазе (IlvH, EC 2.2.1.6) с последовательностью, которая по меньшей мере на 90, 95 или 98%, предпочтительно на 100% идентична последовательности под SEQ ID NO: 122, и кодирующим ее полинуклеотидам,
g) 3-метил-2-оксобутаноат-гидроксиметилтрансферазе (PanB, EC 2.1.2.11) с последовательностью, которая по меньшей мере на 90, 95 или 98%, предпочтительно на 100% идентична последовательности под SEQ ID NO: 118, и кодирующим ее полинуклеотидам,
h) пантотенатсинтазе (PanC, EC 6.3.2.1) с последовательностью, которая по меньшей мере на 90, 95 или 98%, предпочтительно на 100% идентична последовательности под SEQ ID NO: 120, и кодирующим ее полинуклеотидам,
i) глутаматдегидрогеназе (Gdh) с последовательностью, которая по меньшей мере на 90, 95 или 98%, предпочтительно на 100% идентична последовательности под SEQ ID NO: 124, и кодирующим ее полинуклеотидам,
j) глутаминсинтетазе (глутаминсинтетазе 1) с последовательностью, которая по меньшей мере на 90, 95 или 98%, предпочтительно на 100% идентична последовательности под SEQ ID NO: 126, и кодирующим ее полинуклеотидам,
k) глутаминсинтетазе (глутаминсинтетазе 2) с последовательностью, которая по меньшей мере на 90, 95 или 98%, предпочтительно на 100% идентична последовательности под SEQ ID NO: 128, и кодирующим ее полинуклеотидам,
l) глутаматсинтазе с последовательностью, которая по меньшей мере на 90, 95 или 98%, предпочтительно на 100% идентична последовательности под SEQ ID NO: 130, и кодирующим ее полинуклеотидам,
m) изоцитратдегидрогеназе с последовательностью, которая по меньшей мере на 90, 95 или 98%, предпочтительно на 100% идентична последовательности под SEQ ID NO: 132, и кодирующим ее полинуклеотидам,
n) аконитатгидразе с последовательностью, которая по меньшей мере на 90, 95 или 98%, предпочтительно на 100% идентична последовательности под SEQ ID NO: 134, и кодирующим ее полинуклеотидам,
o) цитратсинтазе с последовательностью, которая по меньшей мере на 90, 95 или 98%, предпочтительно на 100% идентична последовательности под SEQ ID NO: 136, и кодирующим ее полинуклеотидам,
p) аминопептидазе С (PepC) с последовательностью, которая по меньшей мере на 90, 95 или 98%, предпочтительно на 100% идентична последовательности под SEQ ID NO: 138, и кодирующим ее полинуклеотидам,
q) пируватдегидрогеназе с последовательностью, которая по меньшей мере на 90, 95 или 98%, предпочтительно на 100% идентична последовательности под SEQ ID NO: 140, и кодирующим ее полинуклеотидам,
r) пируваткиназе (пируваткиназе 1) с последовательностью, которая по меньшей мере на 90, 95 или 98%, предпочтительно на 100% идентична последовательности под SEQ ID NO: 142, и кодирующим ее полинуклеотидам,
s) пируваткиназе (пируваткиназе 2) с последовательностью, которая по меньшей мере на 90, 95 или 98%, предпочтительно на 100% идентична последовательности под SEQ ID NO: 144, и кодирующим ее полинуклеотидам,
t) енолазе с последовательностью, которая по меньшей мере на 90, 95 или 98%, предпочтительно на 100% идентична последовательности под SEQ ID NO: 146, и кодирующим ее полинуклеотидам,
u) 2,3-бисфосфоглицерат-зависимой фосфоглицератмутазе (GpmA) с последовательностью, которая по меньшей мере на 90, 95 или 98%, предпочтительно на 100% идентична последовательности под SEQ ID NO: 148, и кодирующим ее полинуклеотидам,
v) фосфоглицераткиназе (Pgk) с последовательностью, которая по меньшей мере на 90, 95 или 98%, предпочтительно на 100% идентична последовательности под SEQ ID NO: 150, и кодирующим ее полинуклеотидам,
w) глицеральдегид-3-фосфат-дегидрогеназе (глицерин-3-фосфат-дегидрогеназе 1) с последовательностью, которая по меньшей мере на 90, 95 или 98%, предпочтительно на 100% идентична последовательности под SEQ ID NO: 152, и кодирующим ее полинуклеотидам,
x) глицеральдегид-3-фосфат-дегидрогеназе (глицерин-3-фосфат-дегидрогеназе 2) с последовательностью, которая по меньшей мере на 90, 95 или 98%, предпочтительно на 100% идентична последовательности под SEQ ID NO: 154, и кодирующим ее полинуклеотидам,
y) триозофосфатизомеразе (TpiA) с последовательностью, которая по меньшей мере на 90, 95 или 98%, предпочтительно на 100% идентична последовательности под SEQ ID NO: 156, и кодирующим ее полинуклеотидам,
z) фруктозобисфосфатальдолазе с последовательностью, которая по меньшей мере на 90, 95 или 98%, предпочтительно на 100% идентична последовательности под SEQ ID NO: 158, и кодирующим ее полинуклеотидам,
aa) 1-фосфофруктокиназе с последовательностью, которая по меньшей мере на 90, 95 или 98%, предпочтительно на 100% идентична последовательности под SEQ ID NO: 160, и кодирующим ее полинуклеотидам,
bb) 6-фосфофруктокиназе с последовательностью, которая по меньшей мере на 90, 95 или 98%, предпочтительно на 100% идентична последовательности под SEQ ID NO: 162, и кодирующим ее полинуклеотидам,
cc) гомосеринкиназe (ThrB, EC 2.7.1.39) с последовательностью, которая по меньшей мере на 90, 95 или 98%, предпочтительно на 100% идентична последовательности под SEQ ID NO: 4, и кодирующим ее полинуклеотидам,
dd) цистеинсинтазе (CBS, CysK) с последовательностью, которая по меньшей мере на 90, 95 или 98%, предпочтительно на 100% идентична последовательности под SEQ ID NO: 22, и кодирующим ее полинуклеотидам,
ee) цистатионин-бета-лиазе (AecD) с последовательностью, которая по меньшей мере на 90, 95 или 98%, предпочтительно на 100% идентична последовательности под SEQ ID NO: 26, и кодирующим ее полинуклеотидам,
ff) аспартатполуальдегиддегидрогеназе (Asd, EC 1.2.1.11) с последовательностью, которая по меньшей мере на 90, 95 или 98%, предпочтительно на 100% идентична последовательности под SEQ ID NO: 28, и кодирующим ее полинуклеотидам,
gg) малой субъединице транспортера аминокислот с разветвленной цепью (BrnE) с последовательностью, которая по меньшей мере на 90, 95 или 98%, предпочтительно на 100% идентична последовательности под SEQ ID NO: 30, и кодирующим ее полинуклеотидам,
hh) большой субъединице транспортера аминокислот с разветвленной цепью (BrnF) с последовательностью, которая по меньшей мере на 90, 95 или 98%, предпочтительно на 100% идентична последовательности под SEQ ID NO: 32, и кодирующим ее полинуклеотидам,
ii) серинацетилтрансферазе (CysE) с последовательностью, которая по меньшей мере на 90, 95 или 98%, предпочтительно на 100% идентична последовательности под SEQ ID NO: 34, и кодирующим ее полинуклеотидам,
jj) цистеинсинтазе (CysK) с последовательностью, которая по меньшей мере на 90, 95 или 98%, предпочтительно на 100% идентична последовательности под SEQ ID NO: 36, и кодирующим ее полинуклеотидам,
kk) Н-белку системы расщепления глицина (GcvH) с последовательностью, которая по меньшей мере на 90, 95 или 98%, предпочтительно на 100% идентична последовательности под SEQ ID NO: 38, и кодирующим его полинуклеотидам,
II) P-белку системы расщепления глицина (GcvP) с последовательностью, которая по меньшей мере на 90, 95 или 98%, предпочтительно на 100% идентична последовательности под SEQ ID NO: 40, и кодирующим его полинуклеотидам,
mm) T-белку системы расщепления глицина (GcvT) с последовательностью, которая по меньшей мере на 90, 95 или 98%, предпочтительно на 100% идентична последовательности под SEQ ID NO: 42, и кодирующим его полинуклеотидам,
nn) серингидроксиметилтрансферазе (GlyA) с последовательностью, которая по меньшей мере на 90, 95 или 98%, предпочтительно на 100% идентична последовательности под SEQ ID NO: 44, и кодирующим ее полинуклеотидам,
oo) необязательно устойчивой к ингибированию конечным продуктом гомосериндегидрогеназе (Hom, EC 1.2.1.11) с последовательностью, которая по меньшей мере на 90, 95 или 98%, предпочтительно на 100% идентична последовательности под SEQ ID NO: 46, и кодирующим ее полинуклеотидам,
pp) липоилсинтазе (LipA) с последовательностью, которая по меньшей мере на 90, 95 или 98%, предпочтительно на 100% идентична последовательности под SEQ ID NO: 48, и кодирующим ее полинуклеотидам,
qq) липоилтрансферазе (LipВ) с последовательностью, которая по меньшей мере на 90, 95 или 98%, предпочтительно на 100% идентична последовательности под SEQ ID NO: 50, и кодирующим ее полинуклеотидам,
rr) дигидролипоилдегидрогеназе (Lpd) с последовательностью, которая по меньшей мере на 90, 95 или 98%, предпочтительно на 100% идентична последовательности под SEQ ID NO: 52, и кодирующим ее полинуклеотидам,
ss) липоатпротеинлигазе (LplA) с последовательностью, которая по меньшей мере на 90, 95 или 98%, предпочтительно на 100% идентична последовательности под SEQ ID NO: 94, и кодирующим ее полинуклеотидам,
tt) дигидролипоилдегидрогеназе (GcvL) с последовательностью, которая по меньшей мере на 90, 95 или 98%, предпочтительно на 100% идентична последовательности под SEQ ID NO: 96, и кодирующим ее полинуклеотидам,
uu) предпочтительно устойчивой к ингибированию конечным продуктом аспартаткиназе (LysC, EC 2.7.2.4) с последовательностью, которая по меньшей мере на 90, 95 или 98%, предпочтительно на 100% идентична последовательности под SEQ ID NO: 54, и кодирующим ее полинуклеотидам,
vv) цистатионин-гамма-синтазе (MetB) с последовательностью, которая по меньшей мере на 90, 95 или 98%, предпочтительно на 100% идентична последовательности под SEQ ID NO: 56, и кодирующим ее полинуклеотидам,
ww) 5,10-метилентетрагидрофолатредуктазе (MetF) с последовательностью, которая по меньшей мере на 90, 95 или 98%, предпочтительно на 100% идентична последовательности под SEQ ID NO: 58, и кодирующим ее полинуклеотидам,
xx) гомосерин-О-ацетилтрансферазе (MetX) с последовательностью, которая по меньшей мере на 90, 95 или 98%, предпочтительно на 100% идентична последовательности под SEQ ID NO: 60, и кодирующим ее полинуклеотидам,
yy) О-ацетилгомосеринлиазе (MetY) с последовательностью, которая по меньшей мере на 90, 95 или 98%, предпочтительно на 100% идентична последовательности под SEQ ID NO: 62, и кодирующим ее полинуклеотидам,
zz) предпочтительно устойчивой к ингибированию конечным продуктом пируваткарбоксилазе (Pyc, EC 6.4.1.1) с последовательностью, которая по меньшей мере на 90, 95 или 98%, предпочтительно на 100% идентична последовательности под SEQ ID NO: 64, и кодирующим ее полинуклеотидам,
aaa) необязательно устойчивой к ингибированию конечным продуктом D-3-фосфоглицератдегидрогеназе (SerA) с последовательностью, которая по меньшей мере на 90, 95 или 98%, предпочтительно на 100% идентична последовательности под SEQ ID NO: 66, и кодирующим ее полинуклеотидам,
bbb) фосфосеринфосфатазе (SerB) с последовательностью, которая по меньшей мере на 90, 95 или 98%, предпочтительно на 100% идентична последовательности под SEQ ID NO: 68, и кодирующим ее полинуклеотидам,
ccc) фосфосеринаминотрансферазе (SerС) с последовательностью, которая по меньшей мере на 90, 95 или 98%, предпочтительно на 100% идентична последовательности под SEQ ID NO: 70, и кодирующим ее полинуклеотидам,
ddd) субъединице сульфатаденилилтрансферазы (CysD), которая по меньшей мере на 90, 95 или 98%, предпочтительно на 100% идентична последовательности под SEQ ID NO: 74, и кодирующим ее полинуклеотидам,
eee) аденозинфосфосульфатредуктазе (CysH) с последовательностью, которая по меньшей мере на 90, 95 или 98%, предпочтительно на 100% идентична последовательности под SEQ ID NO: 76, и кодирующим ее полинуклеотидам,
fff) сульфитредуктазе (CysI) с последовательностью, которая по меньшей мере на 90, 95 или 98%, предпочтительно на 100% идентична последовательности под SEQ ID NO: 78, и кодирующим ее полинуклеотидам,
ggg) бета-цепи НАДФ-зависимой глутаматсинтетазе (CysJ) с последовательностью, которая по меньшей мере на 90, 95 или 98%, предпочтительно на 100% идентична последовательности под SEQ ID NO: 80, и кодирующим ее полинуклеотидам,
hhh) большой субъединице сульфатаденилилтрансферазы (CysN), которая по меньшей мере на 90, 95 или 98%, предпочтительно на 100% идентична последовательности под SEQ ID NO: 82, и кодирующим ее полинуклеотидам,
iii) цистатионин-бета-синтазе (CysY) с последовательностью, которая по меньшей мере на 90, 95 или 98%, предпочтительно на 100% идентична последовательности под SEQ ID NO: 84, и кодирующим ее полинуклеотидам,
jjj) транспортеру сульфата (CysZ) с последовательностью, которая по меньшей мере на 90, 95 или 98%, предпочтительно на 100% идентична последовательности под SEQ ID NO: 86, и кодирующим его полинуклеотидам,
kkk) 5-метилтетрагидроптероилтриглутаматгомоцистеинметилтрансферазе (MetЕ) с последовательностью, которая по меньшей мере на 90, 95 или 98%, предпочтительно на 100% идентична последовательности под SEQ ID NO: 88, и кодирующим ее полинуклеотидам,
lll) пептидил-tRNA-гидролазе 1 (PtH1) с последовательностью, которая по меньшей мере на 90, 95 или 98%, предпочтительно на 100% идентична последовательности под SEQ ID NO: 90, и кодирующим ее полинуклеотидам,
mmm) пептидил-tRNA-гидролазе 2 (PtH2) с последовательностью, которая по меньшей мере на 90, 95 или 98%, предпочтительно на 100% идентична последовательности под SEQ ID NO: 92, и кодирующим ее полинуклеотидам,
nnn) диаминопимелатдегидрогеназе (Ddh, EC 1.4.1.16) с последовательностью, которая по меньшей мере на 90, 95 или 98%, предпочтительно на 100% идентична последовательности под SEQ ID NO: 202, и кодирующим ее полинуклеотидам,
ooo) диаминопимелатдекарбоксилазе (LysA, EC 4.1.1.20) с последовательностью, которая по меньшей мере на 90, 95 или 98%, предпочтительно на 100% идентична последовательности под SEQ ID NO: 164, и кодирующим ее полинуклеотидам,
ppp) аспартатаминотрансферазе (AaT, EC 2.6.1.1) с последовательностью, которая по меньшей мере на 90, 95 или 98%, предпочтительно на 100% идентична последовательности под SEQ ID NO: 166, и кодирующим ее полинуклеотидам,
qqq) экспортеру L-лизина (LysE, пермеазе эффлюкса лизина) с последовательностью, которая по меньшей мере на 90, 95 или 98%, предпочтительно на 100% идентична последовательности под SEQ ID NO: 168, и кодирующим его полинуклеотидам,
rrr) дигидропиколинатредуктазе (DapB, EC 1.3.1.26) с последовательностью, которая по меньшей мере на 90, 95 или 98%, предпочтительно на 100% идентична последовательности под SEQ ID NO: 170, и кодирующим ее полинуклеотидам,
sss) глюкозо-6-фосфат-дегидрогеназе (EC 1.1.1.49) с последовательностью, которая по меньшей мере на 90, 95 или 98%, предпочтительно на 100% идентична последовательности под SEQ ID NO: 172, и кодирующим ее полинуклеотидам,
ttt) субъединице Zwf глюкозо-6-фосфат-дегидрогеназы (Zwf, EC 1.1.1.49) с последовательностью, которая по меньшей мере на 90, 95 или 98%, предпочтительно на 100% идентична последовательности под SEQ ID NO: 186, и кодирующим ее полинуклеотидам,
uuu) субъединице OpcA глюкозо-6-фосфат-дегидрогеназы (OpcA, EC 1.1.1.49) с последовательностью, которая по меньшей мере на 90, 95 или 98%, предпочтительно на 100% идентична последовательности под SEQ ID NO: 188, и кодирующим ее полинуклеотидам,
vvv) дегидрогеназе фосфоглюконовой кислоты (Gnd, EC 1.1.1.44) с последовательностью, которая по меньшей мере на 90, 95 или 98%, предпочтительно на 100% идентична последовательности под SEQ ID NO: 174, и кодирующим ее полинуклеотидам.
Настоящее изобретение также дополнительно относится к векторам, содержащим упомянутые выше полинуклеотиды, а также к рекомбинантным микроорганизмам, содержащим упомянутые выше ферменты, и/или полинуклеотиды, и/или векторы. В предпочтительном варианте осуществления соответствующий полипептид и/или полинуклеотид в данном случае присутствует в микроорганизме в сверхэкспрессируемой форме. Рекомбинантные микроорганизмы в данном случае предпочтительно являются коринеформными бактериями, в особенности коринебактериями, в частности коринебактериями видов C. humireducens или C. glutamicum.
Таким образом, настоящее изобретение также дополнительно относится к способу получения в избыточном количестве L-аминокислоты, предпочтительно выбранной из L-аланина, L-валина, L-аминокислот семейства глутамата, в частности L-глутамата, L-глутамина, L-пролина и L-аргинина, и из L-аминокислот семейства аспартата, в частности L-аспартата, L-аспарагина, L-метионина, L-лизина, L-изолейцина и L-треонина, в частности предпочтительно выбранной из L-аланина, L-валина, L-глутамата, L-метионина, L-лизина и L-треонина, в особенности из L-аланина, L-валина, L-глутамата и L-лизина, в котором по меньшей мере один, предпочтительно по меньшей мере два, три или четыре упомянутых полинуклеотидов присутствуют в сверхэкспрессируемой форме, при этом способ предпочтительно осуществляют с использованием коринебактерий, в частности коринебактерий видов C. humireducens или C. glutamicum.
Настоящее изобретение также дополнительно относится к другим полинуклеотидам из C. humireducens, а также к полипептидам, кодируемым указанными полинуклеотидами. Инактивация или аттенуация соответствующих полинуклеотидов или полипептидов может оказывать положительное воздействие на продуцирование определенных L-аминокислот.
Таким образом, настоящее изобретение также относится к
а) треонинсинтазе (ThrC, EC 4.2.3.1) с последовательностью, которая по меньшей мере на 90, 95 или 98%, предпочтительно на 100% идентична последовательности под SEQ ID NO: 108, и кодирующим ее полинуклеотидам,
b) изопропилмалатсинтазe (LeuA, EC 2.3.3.13) с последовательностью, которая по меньшей мере на 90, 95 или 98%, предпочтительно на 100% идентична последовательности под SEQ ID NO: 110, и кодирующим ее полинуклеотидам,
c) изопропилмалатдегидрогеназe (LeuB, EC 1.1.1.85) с последовательностью, которая по меньшей мере на 90, 95 или 98%, предпочтительно на 100% идентична последовательности под SEQ ID NO: 112, и кодирующим ее полинуклеотидам,
d) субъединицам изопропилмалатизомеразы (LeuCD, EC 4.2.1.33) с последовательностями, которые по меньшей мере на 90, 95 или 98%, предпочтительно на 100% идентичны последовательностям под SEQ ID NO: 114 или SEQ ID NO: 116, и кодирующим их полинуклеотидам,
е) субъединицам сукцинил-CoA-лигазы (SucCD, EC 6.2.1.5) с последовательностями, которые по меньшей мере на 90, 95 или 98%, предпочтительно на 100% идентичны последовательностям под SEQ ID NO: 198 или SEQ ID NO: 200, и кодирующим их полинуклеотидам,
f) ДНК-связывающему домену HTH tetR-типа (McbR) с последовательностью, которая по меньшей мере на, 90, 95 или 98%, предпочтительно на 100% идентична последовательности под SEQ ID NO: 2, и кодирующим его полинуклеотидам,
g) гомосеринкиназе (ThrB, EC 2.7.1.39) с последовательностью, которая по меньшей мере на 90, 95 или 98%, предпочтительно на 100% идентична последовательности под SEQ ID NO: 4, и кодирующим ее полинуклеотидам,
h) глюкозо-6-фосфат-изомеразе (Pgi, EC 5.3.1.9) с последовательностью, которая по меньшей мере на 90, 95 или 98%, предпочтительно на 100% идентична последовательности под SEQ ID NO: 6, и кодирующим ее полинуклеотидам,
і) фосфоенолпируваткарбоксикиназe (Pck, EC 4.1.1.32) с последовательностью, которая по меньшей мере на 90, 95 или 98%, предпочтительно на 100% идентична последовательности под SEQ ID NO: 8, и кодирующим ее полинуклеотидам,
j) D-метионин-связывающему липопротеину (MetQ) с последовательностью, которая по меньшей мере на 90, 95 или 98%, предпочтительно на 100% идентична последовательности под SEQ ID NO: 10, и кодирующим его полинуклеотидам,
k) транспортеру метионина (MetР) с последовательностью, которая по меньшей мере на 90, 95 или 98%, предпочтительно на 100% идентична последовательности под SEQ ID NO: 12, и кодирующим его полинуклеотидам,
k) АТФ-зависимому транспортеру метионина (MetN) с последовательностью, которая по меньшей мере на 90, 95 или 98%, предпочтительно на 100% идентична последовательности под SEQ ID NO: 14, и кодирующим его полинуклеотидам,
m) S-аденозилметионинсинтазе (MetK) с последовательностью, которая по меньшей мере на 90, 95 или 98%, предпочтительно на 100% идентична последовательности под SEQ ID NO: 16, и кодирующим ее полинуклеотидам,
n) пермеазe системы импорта метионина (MetI) с последовательностью, которая по меньшей мере на 90, 95 или 98%, предпочтительно на 100% идентична последовательности под SEQ ID NO: 18, и кодирующим ее полинуклеотидам,
o) 4-гидрокси-тетрагидродипиколинатсинтазe (DapA, EC 4.3.3.7) с последовательностью, которая по меньшей мере на 90, 95 или 98%, предпочтительно на 100% идентична последовательности под SEQ ID NO: 20, и кодирующим ее полинуклеотидам,
p) карбоксилатаминлигазе с последовательностью, которая по меньшей мере на 90, 95 или 98%, предпочтительно на 100% идентична последовательности под SEQ ID NO: 24, и кодирующим ее полинуклеотидам,
q) малат:хинон-оксидоредуктазe (Mqo, EC 1.1.99.16) с последовательностью, которая по меньшей мере на 90, 95 или 98%, предпочтительно на 100% идентична последовательности под SEQ ID NO: 176, и кодирующим ее полинуклеотидам,
r) субъединице Е1р пируватдегидрогеназного комплекса (AceE, EC 1.2.4.1) с последовательностью, которая по меньшей мере на 90, 95 или 98%, предпочтительно на 100% идентична последовательности под SEQ ID NO: 178, и кодирующим ее полинуклеотидам,
s) цитратсинтазe (GltA, EC 4.1.3.7) с последовательностью, которая по меньшей мере на 90, 95 или 98%, предпочтительно на 100% идентична последовательности под SEQ ID NO: 180, и кодирующим ее полинуклеотидам,
t) малатдегидрогеназe (Mdh, EC 1.1.1.37) с последовательностью, которая по меньшей мере на 90, 95 или 98%, предпочтительно на 100% идентична последовательности под SEQ ID NO: 182, и кодирующим ее полинуклеотидам,
u) UDP-N-ацетилмурамоилаланил-D-глутамат-2,6-диаминопимелатлигазe (MurE, EC 6.3.2.13) с последовательностью, которая по меньшей мере на 90, 95 или 98%, предпочтительно на 100% идентична последовательности под SEQ ID NO: 184, и кодирующим ее полинуклеотидам.
Настоящее изобретение также дополнительно относится к векторам, содержащим упомянутые выше полинуклеотиды, а также к рекомбинантным микроорганизмам, содержащим упомянутые выше ферменты, и/или полинуклеотиды, и/или векторы. В предпочтительном варианте осуществления соответствующий полипептид и/или полинуклеотид в данном случае присутствует в микроорганизме в инактивированной или аттенуированной форме. Рекомбинантные микроорганизмы в данном случае предпочтительно являются коринеформными бактериями, в частности коринебактериями, в особенности коринебактериями видов C. humireducens или C. glutamicum, в особенности вида C. humireducens.
Таким образом, настоящее изобретение также дополнительно относится к способу получения в избыточном количестве L-аминокислоты, предпочтительно выбранной из L-аланина, L-валина, L-аминокислот семейства глутамата, в частности L-глутамата, L-глутамина, L-пролина и L-аргинина, и из L-аминокислот семейства аспартата, в частности L-аспартата, L-аспарагина, L-метионина, L-лизина, L-изолейцина и L-треонина, особенно предпочтительно выбранной из L-аланина, L-валина, L-глутамата, L-метионина, L-лизина и L-треонина, в особенности из L-аланина, L-валина, L-глутамата и L-лизина, в котором по меньшей мере один, предпочтительно по меньшей мере два, три или четыре упомянутых полинуклеотида присутствуют в инактивированной или аттенуированной форме, при этом способ предпочтительно осуществляют с использованием коринебактерий, в частности коринебактерий видов C. humireducens или C. glutamicum. Таким образом, в предпочтительном варианте осуществления по меньшей мере один, предпочтительно по меньшей мере два, три или четыре полинуклеотида из упомянутых в подробном списке выше присутствуют в сверхэкспрессируемой форме.
В предпочтительном варианте осуществления микроорганизмы или бактерии в соответствии с настоящим изобретением, в частности коринебактерии в соответствии с настоящим изобретением, в особенности коринебактерии в соответствии с настоящим изобретением видов C. humireducens или C. glutamicum, в частности штаммы, продуцирующие в избыточном количестве L-валин, по настоящему изобретению имеют по меньшей мере один, предпочтительно по меньшей мере 2 или 3, в частности предпочтительно по меньшей мере 4 или 5 из следующих компонентов:
а) сверхэкспрессируемый полинуклеотид (ген ilvA), который кодирует треониндегидратазу (IIvA EC 4.3.1.19), предпочтительно треониндегидратазу с последовательностью, которая по меньшей мере на 90, 95 или 98%, предпочтительно на 100% идентична последовательности под SEQ ID NO: 106,
b) сверхэкспрессируемый полинуклеотид (ген ilvB), который кодирует субъединицу ацетолактатсинтазы (IlvB), предпочтительно субъединицу ацетолактатсинтазы с последовательностью, которая по меньшей мере на 90, 95 или 98%, предпочтительно на 100% идентична последовательности под SEQ ID NO: 98,
c) сверхэкспрессируемый полинуклеотид (ген ilvN), который кодирует предпочтительно устойчивую к ингибированию конечным продуктом субъединицу ацетолактатсинтазы (IlvN, EC 4.1.3.18),
d) сверхэкспрессируемый полинуклеотид (ген ilvC), который кодирует изомероредуктазу (IIvC, EC 1.1.1.86), предпочтительно изомероредуктазу с последовательностью, которая по меньшей мере на 90, 95 или 98%, предпочтительно на 100% идентична последовательности под SEQ ID NO: 100,
e) сверхэкспрессируемый полинуклеотид (ген ilvD), который кодирует дегидратазу дигидроксикислот (IIvD, EC 4.2.1.9), предпочтительно дегидратазу дигидроксикислот с последовательностью, которая по меньшей мере на 90, 95 или 98%, предпочтительно на 100% идентична последовательности под SEQ ID NO: 102,
f) сверхэкспрессируемый полинуклеотид (ген ilvE), который кодирует трансаминазу (IIvE, EC 2.6.1.42), предпочтительно трансаминазу с последовательностью, которая по меньшей мере на 90, 95 или 98%, предпочтительно на 100% идентична последовательности под SEQ ID NO: 104,
g) сверхэкспрессируемый полинуклеотид (ген ilvH), который кодирует ацетолактатсинтазу (IIvH, EC 2.2.1.6), предпочтительно ацетолактатсинтазу с последовательностью, которая по меньшей мере на 90, 95 или 98%, предпочтительно на 100% идентична последовательности под SEQ ID NO: 122,
h) аттенуированный полинуклеотид (ген thrB), который кодирует гомосеринкиназу (ThrB, EC 2.7.1.39), предпочтительно гомосеринкиназу с последовательностью, которая по меньшей мере на 90, 95 или 98%, предпочтительно на 100% идентична последовательности под SEQ ID NO: 4,
i) аттенуированный полинуклеотид (ген thrC), который кодирует треонинсинтазу (ThrC, EC 4.2.3.1), предпочтительно треонинсинтазу с последовательностью, которая по меньшей мере на 90, 95 или 98%, предпочтительно на 100% идентична последовательности под SEQ ID NO: 108,
j) сверхэкспрессируемый полинуклеотид (ген hom), который кодирует необязательно устойчивую к ингибированию конечным продуктом гомосериндегидрогеназу (Hom, EC 1.2.1.11), предпочтительно гомосериндегидрогеназу с последовательностью, которая по меньшей мере на 90, 95 или 98%, предпочтительно на 100% идентична последовательности под SEQ ID NO: 46,
k) аттенуированный полинуклеотид (ген leuA), который кодирует необязательно устойчивую к ингибированию конечным продуктом изопропилмалатсинтазу (LeuA, EC 2.3.3.13), предпочтительно изопропилмалатсинтазу с последовательностью, которая по меньшей мере на 90, 95 или 98%, предпочтительно на 100% идентична последовательности под SEQ ID NO: 110,
l) аттенуированный полинуклеотид (ген leuВ), который кодирует изопропилмалатдегидрогеназу (LeuB, EC 1.1.1.85), предпочтительно изопропилмалатдегидрогеназу с последовательностью, которая по меньшей мере на 90, 95 или 98%, предпочтительно на 100% идентична последовательности под SEQ ID NO: 112,
m) аттенуированныe полинуклеотиды (гены leuCD), которые кодируют субъединицы изопропилмалатизомеразы (LeuCD, EC 4.2.1.33), предпочтительно субъединицы изопропилмалатизомеразы с последовательностями, которые по меньшей мере на 90, 95 или 98%, предпочтительно на 100% идентичны последовательностям под SEQ ID NO: 114 и SEQ ID NO: 116,
n) сверхэкспрессируемый полинуклеотид (ген panB), который кодирует 3-метил-2-оксобутаноат-гидроксиметилтрансферазу (PanB, EC 2.1.2.11), предпочтительно 3-метил-2-оксобутаноат-гидроксиметилтрансферазу с последовательностью, которая по меньшей мере на 90, 95 или 98%, предпочтительно на 100% идентична последовательности под SEQ ID NO: 118,
o) сверхэкспрессируемый полинуклеотид (ген panC), который кодирует пантотенатсинтазу (PanC, EC 6.3.2.1), предпочтительно пантотенатсинтазу с последовательностью, которая по меньшей мере на 90, 95 или 98%, предпочтительно на 100% идентична последовательности под SEQ ID NO: 120.
Настоящее изобретение также дополнительно соответственно относится к способу получения в избыточном количестве L-аминокислоты, в частности L-валина, в котором используют такой микроорганизм или такую бактерию.
В дополнительном предпочтительном варианте осуществления в соответствии с настоящим изобретением микроорганизмы или бактерии в соответствии с настоящим изобретением, в частности коринебактерии в соответствии с настоящим изобретением, в особенности коринебактерии в соответствии с настоящим изобретением видов C. humireducens или C. glutamicum, в частности продуцирующие в избыточном количестве L-глутамат штаммы в соответствии с настоящим изобретением имеют по меньшей мере один, предпочтительно по меньшей мере два или три, в частности предпочтительно по меньшей мере четыре или пять из следующих компонентов, в частности предпочтительно в комбинации со сверхэкспрессией по меньшей мере одного гена hut в соответствии с настоящим изобретением, в частности в комбинации со сверхэкспрессией всех генов hut в соответствии с настоящим изобретением:
а) сверхэкспрессируемый полинуклеотид (gdh), который кодирует глутаматдегидрогеназу (Gdh), предпочтительно глутаматдегидрогеназу с последовательностью, которая по меньшей мере на 90, 95 или 98%, предпочтительно на 100% идентична последовательности под SEQ ID NO: 124,
b) сверхэкспрессируемый полинуклеотид, который кодирует глутаминсинтетазу (глутаминсинтетазу 1), предпочтительно глутаминсинтетазу с последовательностью, которая по меньшей мере на 90, 95 или 98%, предпочтительно на 100% идентична последовательности под SEQ ID NO: 126,
c) сверхэкспрессируемый полинуклеотид, который кодирует глутаминсинтетазу (глутаминсинтетазу 2), предпочтительно глутаминсинтетазу с последовательностью, которая по меньшей мере на 90, 95 или 98%, предпочтительно на 100% идентична последовательности под SEQ ID NO: 128,
d) сверхэкспрессируемый полинуклеотид, который кодирует глутаматсинтазу, предпочтительно глутаматсинтазу с последовательностью, которая по меньшей мере на 90, 95 или 98%, предпочтительно на 100% идентична последовательности под SEQ ID NO: 130,
e) сверхэкспрессируемый полинуклеотид, который кодирует изоцитратдегидрогеназу, предпочтительно изоцитратдегидрогеназу с последовательностью, которая по меньшей мере на 90, 95 или 98%, предпочтительно на 100% идентична последовательности под SEQ ID NO: 132,
f) сверхэкспрессируемый полинуклеотид, который кодирует аконитатгидразу, предпочтительно аконитатгидразу с последовательностью, которая по меньшей мере на 90, 95 или 98%, предпочтительно на 100% идентична последовательности под SEQ ID NO: 134,
g) сверхэкспрессируемый полинуклеотид, который кодирует цитратсинтазу, предпочтительно цитратсинтазу с последовательностью, которая по меньшей мере на 90, 95 или 98%, предпочтительно на 100% идентична последовательности под SEQ ID NO: 136,
h) сверхэкспрессируемый полинуклеотид (pepC), который кодирует аминопептидазу С (PepC), предпочтительно аминопептидазу C с последовательностью, которая по меньшей мере на 90, 95 или 98%, предпочтительно на 100% идентична последовательности под SEQ ID NO: 138,
i) сверхэкспрессируемый полинуклеотид, который кодирует пируватдегидрогеназу, предпочтительно пируватдегидрогеназу с последовательностью, которая по меньшей мере на 90, 95 или 98%, предпочтительно на 100% идентична последовательности под SEQ ID NO: 140,
j) сверхэкспрессируемый полинуклеотид, который кодирует пируваткиназу (пируваткиназу 1), предпочтительно пируваткиназу с последовательностью, которая по меньшей мере на 90, 95 или 98%, предпочтительно на 100% идентична последовательности под SEQ ID NO: 142,
k) сверхэкспрессируемый полинуклеотид, который кодирует пируваткиназу (пируваткиназу 2), предпочтительно пируваткиназу с последовательностью, которая по меньшей мере на 90, 95 или 98%, предпочтительно на 100% идентична последовательности под SEQ ID NO: 144,
l) сверхэкспрессируемый полинуклеотид, который кодирует енолазу, предпочтительно енолазу с последовательностью, которая по меньшей мере на 90, 95 или 98%, предпочтительно на 100% идентична последовательности под SEQ ID NO: 146,
m) сверхэкспрессируемый полинуклеотид (gpmA), который кодирует 2,3-бисфосфоглицерат-зависимую фосфоглицератмутазу (GpmA), предпочтительно фосфоглицератмутазу с последовательностью, которая по меньшей мере на 90, 95 или 98%, предпочтительно на 100% идентична последовательности под SEQ ID NO: 148,
n) сверхэкспрессируемый полинуклеотид (pgk), который кодирует фосфоглицераткиназу (Pgk), предпочтительно фосфоглицераткиназу с последовательностью, которая по меньшей мере на 90, 95 или 98%, предпочтительно на 100% идентична последовательности под SEQ ID NO: 150,
o) сверхэкспрессируемый полинуклеотид, который кодирует глицеральдегид-3-фосфат-дегидрогеназу (глицеральдегид-3-фосфат-дегидрогеназу 1), предпочтительно глицеральдегид-3-фосфат-дегидрогеназу с последовательностью, которая по меньшей мере на 90, 95 или 98%, предпочтительно на 100% идентична последовательности под SEQ ID NO: 152,
p) сверхэкспрессируемый полинуклеотид, который кодирует глицеральдегид-3-фосфат-дегидрогеназу (глицеральдегид-3-фосфат-дегидрогеназу 2), предпочтительно глицеральдегид-3-фосфат-дегидрогеназу с последовательностью, которая по меньшей мере на 90, 95 или 98%, предпочтительно на 100% идентична последовательности под SEQ ID NO: 154,
q) сверхэкспрессируемый полинуклеотид (tpiA), который кодирует триозофосфатизомеразу (TpiA), предпочтительно триозофосфатизомеразу с последовательностью, которая по меньшей мере на 90, 95 или 98%, предпочтительно на 100% идентична последовательности под SEQ ID NO: 156,
r) сверхэкспрессируемый полинуклеотид, который кодирует фруктозобисфосфатальдолазу, предпочтительно фруктозобисфосфатальдолазу с последовательностью, которая по меньшей мере на 90, 95 или 98%, предпочтительно на 100% идентична последовательности под SEQ ID NO: 158,
s) сверхэкспрессируемый полинуклеотид, который кодирует 1-фосфофруктокиназу, предпочтительно 1-фосфофруктокиназу с последовательностью, которая по меньшей мере на 90, 95 или 98%, предпочтительно на 100% идентична последовательности под SEQ ID NO: 160,
t) сверхэкспрессируемый полинуклеотид, который кодирует 6-фосфофруктокиназу, предпочтительно 6-фосфофруктокиназу с последовательностью, которая по меньшей мере на 90, 95 или 98%, предпочтительно на 100% идентична последовательности под SEQ ID NO: 162,
u) сверхэкспрессируемый полинуклеотид (pgi), который кодирует глюкозо-6-фосфат-изомеразу, предпочтительно глюкозо-6-фосфат-изомеразу с последовательностью, которая по меньшей мере на 90, 95 или 98%, предпочтительно на 100% идентична последовательности под SEQ ID NO: 6,
v) аттенуированные полинуклеотиды (sucCD), которые кодируют субъединицы сукцинил-CoA-лигазы (SucCD, EC 6.2.1.5), предпочтительно субъединицы сукцинил-CoA-лигазы с последовательностями, которые по меньшей мере на 90, 95 или 98%, предпочтительно на 100% идентичны последовательностям под SEQ ID NO: 198 или SEQ ID NO: 200.
Настоящее изобретение также дополнительно соответственно относится к способу получения в избыточном количестве L-аминокислоты, в частности L-глутамата, в котором используют такой микроорганизм или такую бактерию.
В дополнительном предпочтительном варианте осуществления в соответствии с настоящим изобретением микроорганизмы или бактерии в соответствии с настоящим изобретением, в частности коринебактерии в соответствии с настоящим изобретением, в особенности коринебактерии в соответствии с настоящим изобретением видов C. humireducens или C. glutamicum, в частности продуцирующие в избыточном количестве L-аланин штаммы в соответствии с настоящим изобретением имеют по меньшей мере один, предпочтительно по меньшей мере два или три, в частности предпочтительно по меньшей мере четыре или пять из следующих компонентов, в частности предпочтительно в комбинации со сверхэкспрессией гена ald в соответствии с настоящим изобретением:
а) сверхэкспрессируемый полинуклеотид (alaD), который кодирует аланиндегидрогеназу (AlaD), предпочтительно аланиндегидрогеназу коринебактерий,
b) сверхэкспрессируемый полинуклеотид (gapA), который кодирует глицеральдегид-3-фосфат-дегидрогеназу (GapA), предпочтительно глицеральдегид-3-фосфат-дегидрогеназу коринебактерий,
c) инактивированный или аттенуированный полинуклеотид (IdhA), который кодирует L-лактат-дегидрогеназу (LdhA), предпочтительно L-лактат-дегидрогеназу коринебактерий,
d) инактивированный или аттенуированный полинуклеотид (ppc), который кодирует фосфоенолпируваткарбоксилазу (Ppc), предпочтительно фосфоенолпируваткарбоксилазу коринебактерий,
e) инактивированный или аттенуированный полинуклеотид (alr), который кодирует аланинрацемазу (Alr), предпочтительно аланинрацемазу коринебактерий.
Настоящее изобретение также дополнительно соответственно относится к способу получения в избыточном количестве L-аминокислоты, в частности L-аланина, в котором используют такой микроорганизм или такую бактерию.
В дополнительном предпочтительном варианте осуществления микроорганизмы или бактерии в соответствии с настоящим изобретением, в частности коринебактерии в соответствии с настоящим изобретением, в особенности коринебактерии в соответствии с настоящим изобретением видов C. humireducens или C. glutamicum, в частности штаммы, продуцирующие в избыточном количестве L-метионин, имеют по меньшей мере один, предпочтительно по меньшей мере два или три, в частности предпочтительно по меньшей мере четыре или пять из следующих компонентов:
а) аттенуированный полинуклеотид (mcbR), который кодирует ДНК-связывающий домен HTH tetR-типа (McbR), предпочтительно ДНК-связывающий домен с последовательностью, которая по меньшей мере на 90, 95 или 98%, предпочтительно на 100% идентична последовательности под SEQ ID NO: 2,
b) аттенуированный полинуклеотид (ген thrB), который кодирует гомосеринкиназу (ThrB, EC 2.7.1.39), предпочтительно гомосеринкиназу с последовательностью, которая по меньшей мере на 90, 95 или 98%, предпочтительно на 100% идентична последовательности под SEQ ID NO: 4,
c) аттенуированный полинуклеотид (pgi), который кодирует глюкозо-6-фосфат-изомеразу (Pgi, EC 5.3.1.9), предпочтительно глюкозо-6-фосфат-изомеразу с последовательностью, которая по меньшей мере на 90, 95 или 98%, предпочтительно на 100% идентична последовательности под SEQ ID NO: 6,
d) аттенуированный полинуклеотид (pck), который кодирует фосфоенолпируваткарбоксикиназу (Pck, EC 4.1.1.32), предпочтительно фосфоенолпируваткарбоксикиназу с последовательностью, которая по меньшей мере на 90, 95 или 98%, предпочтительно на 100% идентична последовательности под SEQ ID NO: 8,
e) аттенуированный полинуклеотид (metQ), который кодирует D-метионин-связывающий липопротеин (MetQ), предпочтительно D-метионин-связывающий липопротеин с последовательностью, которая по меньшей мере на 90, 95 или 98%, предпочтительно на 100% идентична последовательности под SEQ ID NO: 10,
f) аттенуированный полинуклеотид (metP), который кодирует транспортер метионина (MetР), предпочтительно транспортер метионина с последовательностью, которая по меньшей мере на 90, 95 или 98%, предпочтительно на 100% идентична последовательности под SEQ ID NO: 12,
g) аттенуированный полинуклеотид (metN), который кодирует АТФ-зависимый транспортер метионина (MetN), предпочтительно АТФ-зависимый транспортер метионина с последовательностью, которая по меньшей мере на 90, 95 или 98%, предпочтительно на 100% идентична последовательности под SEQ ID NO: 14,
h) аттенуированный полинуклеотид (metK), который кодирует S-аденозилметионинсинтазу (MetК), предпочтительно S-аденозилметионинсинтазу с последовательностью, которая по меньшей мере на 90, 95 или 98%, предпочтительно на 100% идентична последовательности под SEQ ID NO: 16,
i) аттенуированный полинуклеотид (metI), который кодирует пермеазу системы импорта метионина (MetI), предпочтительно пермеазу системы импорта метионина с последовательностью, которая по меньшей мере на 90, 95 или 98%, предпочтительно на 100% идентична последовательности под SEQ ID NO: 18,
j) аттенуированный полинуклеотид (dapA), который кодирует 4-гидрокси-тетрагидродипиколинатсинтазу (DapA), предпочтительно 4-гидрокси-тетрагидродипиколинатсинтазу с последовательностью, которая по меньшей мере на 90, 95 или 98%, предпочтительно на 100% идентична последовательности под SEQ ID NO: 20,
k) сверхэкспрессируемый полинуклеотид (CBS, cysK), который кодирует цистеинсинтазу (CBS, CysK), предпочтительно цистеинсинтазу с последовательностью, которая по меньшей мере на 90, 95 или 98%, предпочтительно на 100% идентична последовательности под SEQ ID NO: 22,
l) аттенуированный полинуклеотид, который кодирует карбоксилатаминлигазу, предпочтительно карбоксилатаминлигазу с последовательностью, которая по меньшей мере на 90, 95 или 98%, предпочтительно на 100% идентична последовательности под SEQ ID NO: 24,
m) сверхэкспрессируемый полинуклеотид (aecD), который кодирует цистатионин-бета-лиазу (AecD), предпочтительно цистатионин-бета-лиазу с последовательностью, которая по меньшей мере на 90, 95 или 98%, предпочтительно на 100% идентична последовательности под SEQ ID NO: 26,
n) сверхэкспрессируемый полинуклеотид (asd), который кодирует аспартатполуальдегиддегидрогеназу (Asd), предпочтительно аспартатполуальдегиддегидрогеназу с последовательностью, которая по меньшей мере на 90, 95 или 98%, предпочтительно на 100% идентична последовательности под SEQ ID NO: 28,
o) сверхэкспрессируемый полинуклеотид (metH), который кодирует 5-метилтетрагидрофолатгомоцистеинметилтрансферазу (MetH, EC 2.1.1.13),
p) сверхэкспрессируемый полинуклеотид (brnE), который кодирует малую субъединицу транспортера аминокислот с разветвленной цепью (BrnE), предпочтительно субъединицу с последовательностью, которая по меньшей мере на 90, 95 или 98%, предпочтительно на 100% идентична последовательности под SEQ ID NO: 30,
q) сверхэкспрессируемый полинуклеотид (brnF), который кодирует большую субъединицу транспортера аминокислот с разветвленной цепью (BrnF), предпочтительно субъединицу с последовательностью, которая по меньшей мере на 90, 95 или 98%, предпочтительно на 100% идентична последовательности под SEQ ID NO: 32,
r) сверхэкспрессируемый полинуклеотид (cysE), который кодирует серинацетилтрансферазу (CysE), предпочтительно серинацетилтрансферазу с последовательностью, которая по меньшей мере на 90, 95 или 98%, предпочтительно на 100% идентична последовательности под SEQ ID NO: 34,
s) сверхэкспрессируемый полинуклеотид (cysK), который кодирует цистеинсинтазу (CysK), предпочтительно цистеинсинтазу с последовательностью, которая по меньшей мере на 90, 95 или 98%, предпочтительно на 100% идентична последовательности под SEQ ID NO: 36,
t) сверхэкспрессируемый полинуклеотид (gcvH), который кодирует Н-белок системы расщепления глицина (GcvH), предпочтительно Н-белок с последовательностью, которая по меньшей мере на 90, 95 или 98%, предпочтительно на 100% идентична последовательности под SEQ ID NO: 38,
u) сверхэкспрессируемый полинуклеотид (gcvP), который кодирует P-белок системы расщепления глицина (GcvP), предпочтительно P-белок с последовательностью, которая по меньшей мере на 90, 95 или 98%, предпочтительно на 100% идентична последовательности под SEQ ID NO: 40,
v) сверхэкспрессируемый полинуклеотид (gcvT), который кодирует T-белок системы расщепления глицина (GcvT), предпочтительно T-белок с последовательностью, которая по меньшей мере на 90, 95 или 98%, предпочтительно на 100% идентична последовательности под SEQ ID NO: 42,
w) сверхэкспрессируемый полинуклеотид (glyA), который кодирует серингидроксиметилтрансферазу (GlyA), предпочтительно серингидроксиметилтрансферазу с последовательностью, которая по меньшей мере на 90, 95 или 98%, предпочтительно на 100% идентична последовательности под SEQ ID NO: 44,
x) сверхэкспрессируемый полинуклеотид (hom), который кодирует необязательно устойчивую к ингибированию конечным продуктом гомосериндегидрогеназу (Hom), предпочтительно гомосериндегидрогеназу с последовательностью, которая по меньшей мере на 90, 95 или 98%, предпочтительно на 100% идентична последовательности под SEQ ID NO: 46,
y) сверхэкспрессируемый полинуклеотид (lipA), который кодирует липоилсинтазу (LipA), предпочтительно липоилсинтазу с последовательностью, которая по меньшей мере на 90, 95 или 98%, предпочтительно на 100% идентична последовательности под SEQ ID NO: 48,
z) сверхэкспрессируемый полинуклеотид (lipB), который кодирует липоилтрансферазу (LipB), предпочтительно липоилтрансферазу с последовательностью, которая по меньшей мере на 90, 95 или 98%, предпочтительно на 100% идентична последовательности под SEQ ID NO: 50,
аа) сверхэкспрессируемый полинуклеотид (lpd), который кодирует дигидролипоилдегидрогеназу (Lpd), предпочтительно дигидролипоилдегидрогеназу с последовательностью, которая по меньшей мере на 90, 95 или 98%, предпочтительно на 100% идентична последовательности под SEQ ID NO: 52,
bb) сверхэкспрессируемый полинуклеотид (lplA), который кодирует липоатпротеинлигазу (LplA), предпочтительно липоатпротеинлигазу с последовательностью, которая по меньшей мере на 90, 95 или 98%, предпочтительно на 100% идентична последовательности под SEQ ID NO: 94,
сс) сверхэкспрессируемый полинуклеотид (gcvL), который кодирует дигидролипоилдегидрогеназу (GcvL), предпочтительно дигидролипоилдегидрогеназу с последовательностью, которая по меньшей мере на 90, 95 или 98%, предпочтительно на 100% идентична последовательности под SEQ ID NO: 96,
dd) сверхэкспрессируемый полинуклеотид (lysC), который кодирует предпочтительно устойчивую к ингибированию конечным продуктом аспартаткиназу (LysC), предпочтительно аспартаткиназу с последовательностью, которая по меньшей мере на 90, 95 или 98%, предпочтительно на 100% идентична последовательности под SEQ ID NO: 54,
ее) сверхэкспрессируемый полинуклеотид (metB), который кодирует цистатионин-гамма-синтазу (MetB), предпочтительно цистатионин-гамма-синтазу с последовательностью, которая по меньшей мере на 90, 95 или 98%, предпочтительно на 100% идентична последовательности под SEQ ID NO: 56,
ff) сверхэкспрессируемый полинуклеотид (metF), который кодирует 5,10-метилентетрагидрофолатредуктазу (MetF), предпочтительно 5,10-метилентетрагидрофолатредуктазу с последовательностью, которая по меньшей мере на 90, 95 или 98%, предпочтительно на 100% идентична последовательности под SEQ ID NO: 58,
gg) сверхэкспрессируемый полинуклеотид (metX), который кодирует гомосерин-О-ацетилтрансферазу (MetX), предпочтительно гомосерин-О-ацетилтрансферазу с последовательностью, которая по меньшей мере на 90, 95 или 98%, предпочтительно на 100% идентична последовательности под SEQ ID NO: 60,
hh) сверхэкспрессируемый полинуклеотид (metY), который кодирует O-ацетилгомосеринлиазу (MetY), предпочтительно O-ацетилгомосеринлиазу с последовательностью, которая по меньшей мере на 90, 95 или 98%, предпочтительно на 100% идентична последовательности под SEQ ID NO: 62,
ii) сверхэкспрессируемый полинуклеотид (pyc), который кодирует пируваткарбоксилазу (Рyc), предпочтительно пируваткарбоксилазу с последовательностью, которая по меньшей мере на 90, 95 или 98%, предпочтительно на 100% идентична последовательности под SEQ ID NO: 64,
jj) сверхэкспрессируемый полинуклеотид (serA), который кодирует необязательно устойчивую к ингибированию конечным продуктом D-3-фосфоглицератдегидрогеназу (SerA), предпочтительно D-3-фосфоглицератдегидрогеназу с последовательностью, которая по меньшей мере на 90, 95 или 98%, предпочтительно на 100% идентична последовательности под SEQ ID NO: 66,
kk) сверхэкспрессируемый полинуклеотид (serB), который кодирует фосфосеринфосфатазу (serB), предпочтительно фосфосеринфосфатазу с последовательностью, которая по меньшей мере на 90, 95 или 98%, предпочтительно на 100% идентична последовательности под SEQ ID NO: 68,
ll) сверхэкспрессируемый полинуклеотид (serC), который кодирует фосфосеринаминотрансферазу (SerC), предпочтительно фосфосеринаминотрансферазу с последовательностью, которая по меньшей мере на 90, 95 или 98%, предпочтительно на 100% идентична последовательности под SEQ ID NO: 70,
mm) сверхэкспрессируемый полинуклеотид (cysD), который кодирует субъединицу сульфатаденилилтрансферазы (CysD), предпочтительно субъединицу с последовательностью, которая по меньшей мере на 90, 95 или 98%, предпочтительно на 100% идентична последовательности под SEQ ID NO: 74,
nn) сверхэкспрессируемый полинуклеотид (cysH), который кодирует аденозинфосфосульфатредуктазу (CysH), предпочтительно аденозинфосфосульфатредуктазу с последовательностью, которая по меньшей мере на 90, 95 или 98%, предпочтительно на 100% идентична последовательности под SEQ ID NO: 76,
oo) сверхэкспрессируемый полинуклеотид (cysI), который кодирует сульфитредуктазу (CysI), предпочтительно сульфитредуктазу с последовательностью, которая по меньшей мере на 90, 95 или 98%, предпочтительно на 100% идентична последовательности под SEQ ID NO: 78,
pp) сверхэкспрессируемый полинуклеотид (cysJ), который кодирует (CysJ), предпочтительно (CysJ) с последовательностью, которая по меньшей мере на 90, 95 или 98%, предпочтительно на 100% идентична последовательности под SEQ ID NO: 80,
qq) сверхэкспрессируемый полинуклеотид (cysN), который кодирует субъединицу сульфатаденилилтрансферазы (CysD), предпочтительно субъединицу с последовательностью, которая по меньшей мере на 90, 95 или 98%, предпочтительно на 100% идентична последовательности под SEQ ID NO: 82,
rr) сверхэкспрессируемый полинуклеотид (cysY), который кодирует цистатионин-бета-синтазу (CysY), предпочтительно цистатионин-бета-синтазу с последовательностью, которая по меньшей мере на 90, 95 или 98%, предпочтительно на 100% идентична последовательности под SEQ ID NO: 84,
ss) сверхэкспрессируемый полинуклеотид (cysZ), который кодирует гипотетический транспортер сульфата (CysZ), предпочтительно транспортер сульфата с последовательностью, которая по меньшей мере на 90, 95 или 98%, предпочтительно на 100% идентична последовательности под SEQ ID NO: 86,
tt) сверхэкспрессируемый полинуклеотид (metE), который кодирует 5-метилтетрагидроптероилтриглутаматгомоцистеинметилтрaнсферазу (MetE), предпочтительно белок с последовательностью, которая по меньшей мере на 90, 95 или 98%, предпочтительно на 100% идентична последовательности под SEQ ID NO: 88,
uu) сверхэкспрессируемый полинуклеотид (ptH1), который кодирует пептидил-tRNA-гидролазу 1 (PtH1), предпочтительно пептидил-tRNA-гидролазу 1 с последовательностью, которая по меньшей мере на 90, 95 или 98%, предпочтительно на 100% идентична последовательности под SEQ ID NO: 90,
vv) сверхэкспрессируемый полинуклеотид (ptH2), который кодирует пептидил-tRNA-гидролазу 2 (PtH2), предпочтительно пептидил-tRNA-гидролазу 2 с последовательностью, которая по меньшей мере на 90, 95 или 98%, предпочтительно на 100% идентична последовательности под SEQ ID NO: 92.
Настоящее изобретение также дополнительно соответственно относится к способу получения в избыточном количестве L-аминокислоты, в частности L-метионина, в котором используют такой микроорганизм или такую бактерию.
В дополнительном предпочтительном варианте осуществления микроорганизмы или бактерии в соответствии с настоящим изобретением, в частности коринебактерии в соответствии с настоящим изобретением, в особенности коринебактерии в соответствии с настоящим изобретением видов C. humireducens или C. glutamicum, в частности штаммы, продуцирующие в избыточном количестве L-лизин, имеют по меньшей мере один, предпочтительно по меньшей мере 2 или 3, в частности предпочтительно по меньшей мере 4 или 5 из следующих компонентов:
а) сверхэкспрессируемый полинуклеотид (ген dapA), который кодирует дигидродипиколинатсинтазу (DapA, EC 4.2.1.52), предпочтительно дигидродипиколинатсинтазу с последовательностью, которая по меньшей мере на 90, 95 или 98%, предпочтительно на 100% идентична последовательности под SEQ ID NO: 20,
b) сверхэкспрессируемый полинуклеотид (lysC), который кодирует предпочтительно устойчивую к ингибированию конечным продуктом аспартаткиназу (LysC, EC 2.7.2.4), предпочтительно аспартаткиназу с последовательностью, которая по меньшей мере на 90, 95 или 98%, предпочтительно на 100% идентична последовательности под SEQ ID NO: 54,
c) сверхэкспрессируемый полинуклеотид (ddh), который кодирует диаминопимелатдегидрогеназу (Ddh, EC 1.4.1.16), предпочтительно диаминопимелатдегидрогеназу с последовательностью, которая по меньшей мере на 90, 95 или 98%, предпочтительно на 100% идентична последовательности под SEQ ID NO: 202,
d) сверхэкспрессируемый полинуклеотид (asd), который кодирует аспартатполуальдегиддегидрогеназу (Asd, EC 1.2.1.11), предпочтительно аспартатполуальдегиддегидрогеназу с последовательностью, которая по меньшей мере на 90, 95 или 98%, предпочтительно на 100% идентична последовательности под SEQ ID NO: 28,
e) сверхэкспрессируемый полинуклеотид (lysA), который кодирует диаминопимелатдекарбоксилазу (LysA, EC 4.1.1.20), предпочтительно диаминопимелатдекарбоксилазу с последовательностью, которая по меньшей мере на 90, 95 или 98%, предпочтительно на 100% идентична последовательности под SEQ ID NO: 164,
f) сверхэкспрессируемый полинуклеотид (aat), который кодирует аспартатаминотрансферазу (AaT, EC 2.6.1.1), предпочтительно аспартатаминотрансферазу с последовательностью, которая по меньшей мере на 90, 95 или 98%, предпочтительно на 100% идентична последовательности под SEQ ID NO: 166,
g) сверхэкспрессируемый полинуклеотид (lysЕ), который кодирует экспортер L-лизина (LysE, пермеазу эффлюкса лизина), предпочтительно экспортер L-лизина с последовательностью, которая по меньшей мере на 90, 95 или 98%, предпочтительно на 100% идентична последовательности под SEQ ID NO: 168,
h) сверхэкспрессируемый полинуклеотид (pyc), который кодирует пируваткарбоксилазу (Pyc, EC 6.4.1.1), предпочтительно пируваткарбоксилазу с последовательностью, которая по меньшей мере на 90, 95 или 98%, предпочтительно на 100% идентична последовательности под SEQ ID NO: 64,
i) сверхэкспрессируемый полинуклеотид (dapF), который кодирует диаминопимелатэпимеразу (DapF, EC 5.1.1.7),
j) сверхэкспрессируемый полинуклеотид (dapВ), который кодирует дигидропиколинатредуктазу (DapВ, EC 1.3.1.26), предпочтительно дигидропиколинатредуктазу с последовательностью, которая по меньшей мере на 90, 95 или 98%, предпочтительно на 100% идентична последовательности под SEQ ID NO: 170,
k) сверхэкспрессируемый полинуклеотид, который кодирует глюкозо-6-фосфат-дегидрогеназу (EC 1.1.1.49), предпочтительно глюкозо-6-фосфат-дегидрогеназу с последовательностью, которая по меньшей мере на 90, 95 или 98%, предпочтительно на 100% идентична последовательности под SEQ ID NO: 172,
l) сверхэкспрессируемый полинуклеотид (zwf), который кодирует субъединицу Zwf глюкозо-6-фосфат-дегидрогеназы (Zwf, EC 1.1.1.49), предпочтительно субъединицу Zwf с последовательностью, которая по меньшей мере на 90, 95 или 98%, предпочтительно на 100% идентична последовательности под SEQ ID NO: 186,
m) сверхэкспрессируемый полинуклеотид (opcA), который кодирует субъединицу OpcA глюкозо-6-фосфат-дегидрогеназы (OpcA, EC 1.1.1.49), предпочтительно субъединицу OpcA с последовательностью, которая по меньшей мере на 90, 95 или 98%, предпочтительно на 100% идентична последовательности под SEQ ID NO: 188,
n) сверхэкспрессируемый полинуклеотид (gnd), который кодирует дегидрогеназу фосфоглюконовой кислоты (Gnd, EC 1.1.1.44), предпочтительно дегидрогеназу фосфоглюконовой кислоты с последовательностью, которая по меньшей мере на 90, 95 или 98%, предпочтительно на 100% идентична последовательности под SEQ ID NO: 174,
о) инактивированный или аттенуированный полинуклеотид (mqo), который кодирует малат:хинон-оксидоредуктазу (Mqo, EC 1.1.99.16), предпочтительно малат:хинон-оксидоредуктазу с последовательностью, которая по меньшей мере на 90, 95 или 98%, предпочтительно на 100% идентична последовательности под SEQ ID NO: 176,
р) инактивированный или аттенуированный полинуклеотид, который кодирует субъединицу Е1р пируватдегидрогеназного комплекса (AceE, EC 1.2.4.1), предпочтительно субъединицу Е1р с последовательностью, которая по меньшей мере на 90, 95 или 98%, предпочтительно на 100% идентична последовательности под SEQ ID NO: 178,
q) инактивированный или аттенуированный полинуклеотид (gltA), который кодирует цитратсинтазу (GltA, EC 4.1.3.7), предпочтительно цитратсинтазу с последовательностью, которая по меньшей мере на 90, 95 или 98%, предпочтительно на 100% идентична последовательности под SEQ ID NO: 180,
r) инактивированный или аттенуированный полинуклеотид (mdh), который кодирует малатдегидрогеназу (Mdh, EC 1.1.1.37), предпочтительно малатдегидрогеназу с последовательностью, которая по меньшей мере на 90, 95 или 98%, предпочтительно на 100% идентична последовательности под SEQ ID NO: 182,
s) инактивированный или аттенуированный полинуклеотид (murE), который кодирует UDP-N-ацетилмурамоилаланил-D-глутамат-2,6-диаминопимелатлигазу, 6-диаминопимелатлигазу (MurE, EC 6.3.2.13), предпочтительно фермент с последовательностью, которая по меньшей мере на 90, 95 или 98%, предпочтительно на 100% идентична последовательности под SEQ ID NO: 184.
Настоящее изобретение также дополнительно соответственно относится к способу получения в избыточном количестве L-аминокислоты, в частности L-лизина, в котором используют такой микроорганизм или такую бактерию.
Упомянутые выше полинуклеотиды и полипептиды, используемые или подлежащие использованию в способе в соответствии с настоящим изобретением, предпочтительно происходят из коринебактерий, в частности из C. glutamicum или C. humireducens, особенно предпочтительно из C. humireducens.
«Сверхэкспрессию» в соответствии с настоящим изобретением в общем необходимо понимать, как увеличение внутриклеточной концентрации или активности рибонуклеиновой кислоты, белка (полипептида) или фермента, которые кодируются соответствующей ДНК, в микроорганизме по сравнению с исходным штаммом (родительским штаммом) или штаммом дикого типа. Термин «исходный штамм» (родительский штамм) означает штамм, при воздействии на который в результате достигают сверхэкспрессии.
Увеличение концентрации или активности может быть достигнуто, например, путем увеличения числа копий соответствующих кодирующих полинуклеотидов, хромосомных или внехромосомных, по меньшей мере на одну копию.
Широко используемый способ увеличения числа копий предусматривает введение соответствующего кодирующего полинуклеотида в вектор, предпочтительно плазмиду, которая реплицируется в микроорганизме, в частности в коринеформной бактерии. Кроме того, в качестве векторов можно использовать транспозоны, инсерционные элементы (IS-элементы) или фаги. Множество подходящих векторов известно из уровня техники.
Другим широко применяемым способом достижения сверхэкспрессии является способ амплификации гена в хромосоме. В данном способе по меньшей мере одну дополнительную копию представляющего интерес полинуклеотида встраивают в хромосому коринеформной бактерии. Такие способы амплификации описаны, например, в WO 03/014330 или WO 03/040373.
Дополнительный способ достижения сверхэкспрессии предусматривает связывание соответствующего гена или аллеля функциональным образом (функциональное связывание) с промотором или кассетой экспрессии. Подходящие промоторы для Corynebacterium glutamicum, описаны, например, на фиг. 1 обзорной статьи Patek и соавт. (Journal of Biotechnology 104(1-3), 311-323 (2003)) и в обширном обзоре, таком как "Handbook of Corynebacterium glutamicum" (Eds.: Lothar Eggeling and Michael Bott, CRC Press, Boca Raton, US (2005)), или в книге "Corynebacteria, Genomics and Molecular Biology" (Ed.: Andreas Burkovski, Caister Academic Press, Norfolk, UK (2008)). Таким же образом можно использовать варианты промотора dapA, например, промотор A25, описанный в публикации Vasicova и соавт. (Journal of Bacteriology 181, 6188-6191 (1999)). Кроме того, можно использовать промотор gap из Corynebacterium glutamicum (EP 06007373). И наконец, можно использовать хорошо известные промоторы T3, T7, SP6, M13, lac, tac и trc, описанные в публикациях Amann и соавт. (Gene 69(2), 301-315 (1988)) и Amann and Brosius (Gene 40(2-3), 183-190 (1985)). Такой промотор может быть встроен, например, выше соответствующего гена, как правило, на расстоянии приблизительно 1-500 пар нуклеотидных оснований от стартового кодона.
Оказывая воздействия посредством сверхэкспрессии повышают активность или концентрацию соответствующего полипептида предпочтительно по меньшей мере на 10%, 25%, 50%, 75%, 100%, 150%, 200%, 300%, 400% или 500%, предпочтительно не более чем на 1000% или 2000%, исходя из активности или концентрации указанного полипептида в штамме до осуществления воздействия, которое в результате приводит к сверхэкспрессии.
Концентрацию белка можно определить с помощью 1- и 2-мерного разделения белков в геле и последующего оптического определения концентрации белка в геле с использованием соответствующего аналитического программного обеспечения. Общепринятый способ подготовки геля с белками для коринеформных бактерий и идентификации указанных белков представляет собой процедуру, описанную в Hermann и соавт. (Electrophoresis, 22:1712-23 (2001)). Концентрацию белка также можно определить с помощью вестерн-блот-гибридизации с использованием антитела, специфичного для белка, подлежащего обнаружению (Sambrook et al., Molecular Cloning: a laboratory manual. 2nd Ed. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1989) и последующей оптической оценкой с использованием соответствующего программного обеспечения для определения концентрации (Lohaus and Meyer (1998) Biospektrum 5:32-39; Lottspeich, Angewandte Chemie 38: 2630-2647 (1999)). Активность можно определить с помощью подходящего ферментного анализа.
«Аттенуация» в соответствии с настоящим изобретением относится к снижению внутриклеточной концентрации или активности рибонуклеиновой кислоты, белка (полипептида) или фермента, которые кодируются соответствующей ДНК, в микроорганизме по сравнению с исходным штаммом (родительским штаммом) или штаммом дикого типа. Исходный штамм (родительский штамм) относится к штамму, при воздействии на который в результате осуществляется аттенуация.
Аттенуация может быть достигнута путем снижения экспрессии полипептида, например, путем использования слабого промотора или использования аллеля, кодирующего полипептид, характеризующийся низкой активностью, при этом необязательно данные средства воздействия могут быть объединены. Аттенуация также может быть достигнута посредством полного блокирования экспрессии полипептида, например, путем инактивирования кодирующего гена.
Оказывая воздействие посредством аттенуации уменьшают активность или концентрацию соответствующего полипептида предпочтительно по меньшей мере на 10%, 25%, 50%, 75%, предпочтительно не более чем на 100%, исходя из активности или концентрации указанного полипептида в штамме до осуществления воздействия, которое в результате приводит к аттенуации. В предпочтительном варианте осуществления аттенуация предусматривает практически полную инактивацию экспрессии соответствующего полипептида.
Устойчивые к ингибированию конечным продуктом ферменты по отношению к продуцированию аминокислот в общем необходимо понимать как ферменты, которые по сравнению с исходной формой характеризуются пониженной чувствительностью к ингибированию продуцируемыми L-аминокислотами и/или их аналогами.
В частности, под устойчивыми к ингибированию конечным продуктом аспартаткиназами (LysCFBR) подразумевают аспартаткиназы, которые по сравнению с исходной формой демонстрируют меньшую чувствительность к ингибированию смесями лизина и треонина, или смесями AEC (аминоэтилцистеина) и треонина, или лизина в отдельности, или AEC в отдельности. С целью получения лизина предпочтительно используют соответствующие штаммы, которые содержат такие устойчивые к ингибированию конечным продуктом или десенсибилизированные аспартаткиназы.
Например, следующие устойчивые к ингибированию конечным продуктом аспартаткиназы из C. glutamicum известны из ссылочных публикаций: A279T, A279V, S301F, S301Y, T308I, T311I, R320G, G345D, S381F. По отношению к устойчивым к ингибированию конечным продуктом аспартаткиназам из C. glutamicum необходимо также сослаться на следующие публикации: JP1993184366-A, JP1994062866-A, JP1994261766-A, JP1997070291-A, JP1997322774-A, JP1998165180-A, JP1998215883-A, US5688671-A, EP0387527, WO00/63388, US3732144, JP6261766, Jetten и соавт. (1995; Applied Microbiology Biotechnology 43: 76-82). Устойчивые к ингибированию конечным продуктом аспартаткиназы из C. glutamicum депонированы в NCBI GenBank под следующими номерами доступа: E05108, E06825, E06826, E06827, E08177, E08178, E08179, E08180, E08181, E08182, E12770, E14514, E16352, E16745, E16746, I74588, I74589, I74590, I74591, I74592, I74593, I74594, I74595, I74596, I74597, X57226, L16848, L27125.
В соответствии с настоящим изобретением предпочтительно используют следующие устойчивые к ингибированию конечным продуктом аспартаткиназы из C. humireducens: D274Y, A279E, S301Y, T308I, T311I, G359D.
Для получения треонина предпочтение также отдают использованию штаммов, содержащих соответствующую устойчивую к ингибированию конечным продуктом гомосериндегидрогеназу (HomFBR).
Для получения изолейцина и для получения валина предпочтение также отдают использованию штаммов, содержащих соответствующую устойчивую к ингибированию конечным продуктом ацетолактатсинтазу.
Для получения лейцина предпочтение также отдают использованию штаммов, содержащих соответствующую устойчивую к ингибированию конечным продуктом изопропилмалатсинтазу (LeuAFBR).
Для получения пролина предпочтение также отдают использованию штаммов, содержащих соответствующую устойчивую к ингибированию конечным продуктом глутамат-5-киназу (ProBFBR).
Для получения аргинина предпочтение также отдают использованию штаммов, содержащих соответствующую устойчивую к ингибированию конечным продуктом орнитинкарбамоилтрансферазу (ArgFFBR).
Для получения серина предпочтение также отдают использованию штаммов, содержащих соответствующую устойчивую к ингибированию конечным продуктом D-3-фосфоглицератдегидрогеназу (SerAFBR).
Для получения метионина предпочтение также отдают использованию штаммов, содержащих соответствующую устойчивую к ингибированию конечным продуктом D-3-фосфоглицератдегидрогеназу (SerAFBR) и/или устойчивые к ингибированию конечным продуктом пируваткарбоксилазы (PycFBR).
Для получения триптофана предпочтение также отдают использованию штаммов, содержащих соответствующую устойчивую к ингибированию конечным продуктом фосфо-2-дегидро-3-дезоксигептонатальдолазу (AroGFBR или AroHFBR).
По отношению к еще более предпочтительным свойствам штаммов C. humireducens, продуцирующих в избыточном количестве L-аминокислоты, которые подлежат использованию в соответствии с настоящим изобретением, необходимо сослаться на публикацию Wu и соавт. (2011), которую цитировали выше, и другие вышеупомянутые публикации.
Микроорганизмы в соответствии с настоящим изобретением, в частности бактерии рода Corynebacterium, можно культивировать непрерывно – как описано, например, в WO 05/021772 - или прерывисто посредством периодического процесса (периодическое культивирование или периодический способ), или посредством процесса периодического культивирования с подпиткой или повторяющегося периодического культивирования с подпиткой c целью получения L-аминокислот. Общий обзор известных способов культивирования доступен в учебнике Chmiel (Bioprozesstechnik 1. Einführung in die Bioverfahrenstechnik [Bioprocess Technology 1. Introduction to Bioprocess Technology] (Gustav Fischer Verlag, Stuttgart, 1991)) или в пособии Storhas (Bioreaktoren und periphere Einrichtungen [Bioreactors and Peripheral Devices] (Vieweg Verlag, Braunschweig/Wiesbaden, 1994)).
Подлежащие использованию культуральная среда или среда для ферментации должна надлежащим образом удовлетворять потребностям конкретных штаммов. Описания питательных сред для разных микроорганизмов представлены в справочнике «Manual of Methods for General Bacteriology» от Американского общества по бактериологии (American Society for Bacteriology) (Washington D.C, USA, 1981). Выражения культуральная среда и среда для ферментации или просто среда являются взаимозаменяемыми.
Используемые источники углерода могут представлять собой сахара и углеводы, такие как глюкоза, сахароза, лактоза, фруктоза, мальтоза, мелассы, содержащие сахарозу растворы, полученные при переработке сахарной свеклы или сахарного тростника, крахмал, гидролизат крахмала и целлюлозу, масла и жиры, такие как соевое масло, подсолнечное масло, арахисовое масло и кокосовый жир, жирные кислоты, такие как пальмитиновая кислота, стеариновая кислота и линолевая кислота, спирты, такие как глицерин, метанол и этанол, а также органические кислоты, такие как уксусная кислота или молочная кислота.
В качестве источников азота можно использовать органические азотсодержащие соединения, такие как пептоны, дрожжевой экстракт, мясной экстракт, солодовый экстракт, жидкий кукурузный экстракт, соевая мука и мочевина, или неорганические соединения, такие как сульфат аммония, хлорид аммония, фосфат аммония, карбонат аммония и нитрат аммония. Источники азота можно использовать по отдельности или в виде смеси.
Используемые источники фосфора могут представлять собой фосфорную кислоту, дигидрофосфат калия или гидроортофосфат калия или соответствующие натрийсодержащие соли.
Культуральная питательная среда должна дополнительно содержать соли, например, в виде хлоридов или сульфатов металлов, таких как натрий, калий, магний, кальций и железо, например, сульфат магния или сульфат железа, которые необходимы для роста. Наконец, незаменимые факторы роста, такие как аминокислоты, например, гомосерин, и витамины, например, тиамин, биотин или пантотеновая кислота, можно использовать в дополнение к вышеуказанным веществам.
Указанное сырье можно вносить в культуральную среду в виде единой смеси или можно подавать надлежащим образом в ходе культивирования.
Значение pH в культуре можно контролировать посредством применения надлежащим способом основных соединений, таких как гидроксид натрия, гидроксид калия, аммиак или водный раствор аммиака, или кислых соединений, таких как фосфорная кислота или серная кислота. Как правило, pH доводят до значения от 6,0 до 9,0, предпочтительно от 6,5 до 8. Для контроля пенообразования можно использовать пеногасители, например, сложные полигликолевые эфиры жирных кислот. Для поддержания стабильности плазмид необходимо добавлять в среду селективные вещества, такие как, например, антибиотики. Для поддержания аэробных условий кислород или кислородные газовые смеси, например, воздух, подают в культуру. Также возможно использование жидкостей, обогащенных перекисью водорода. При необходимости ферментацию проводят при повышенном давлении, например, при давлении от 0,03 до 0,2 МПа. Температура культуры обычно составляет от 20°C до 45°C и предпочтительно от 25°C до 40°C. В периодических процессах культивирование продолжают до образования максимального количества требуемой L-аминокислоты. Данной цели достигают, как правило, в пределах от 10 часов до 160 часов. В непрерывных способах возможны более длительные периоды культивирования. Результатом активности бактерий является повышение концентрации (накопление) L-аминокислоты в ферментационной среде и/или в бактериальных клетках.
Примеры подходящих ферментационных сред приведены, в том числе, в описаниях патентов US 5770409, US 5840551 и US 5990350 или US 5275940.
Анализ L-аминокислот для определения концентрации в один или более моментов времени в ходе ферментации можно осуществить путем разделения L-аминокислот с помощью ионообменной хроматографии, предпочтительно катионообменной хроматографии, с последующим пост-колоночным получением производных с использованием нингидрина, как описано в публикации Spackman и соавт. (Analytical Chemistry 30: 1190-1206 (1958)). Также возможным является использование орто-фталальдегида вместо нингидрина для пост-колоночного получения производных. Обзорную статью по ионообменной хроматографии можно найти в публикации Pickering (LC·GC (Magazine of Chromatographic Science) 7(6), 484-487 (1989)).
Также можно осуществить предколоночное получение производных, например, с помощью ортофталевого альдегида или фенилизотиоцианата, и разделить полученные аминокислотные производные с помощью обращенно-фазовой хроматографии (RP), предпочтительно в форме высокоэффективной жидкостной хроматографии (HPLC). Такой способ описан, например, в публикации Lindroth и соавт. (Analytical Chemistry 51: 1167-1174 (1979)).
Детекцию осуществляют фотометрически (поглощение, флуоресценция).
Обзор анализа аминокислот можно найти, среди прочего, в учебнике “Bioanalytik”, авторы Lottspeich and Zorbas (Spektrum Akademischer Verlag, Heidelberg, Germany 1998).
Соответственно, настоящее изобретение также относится к способу получения L-аминокислоты, характеризующемуся тем, что осуществляют следующие стадии:
а) ферментация микроорганизмов в соответствии с настоящим изобретением, в частности коринеформных бактерий, предпочтительно бактерий рода Corynebacterium, особенно предпочтительно видов Corynebacterium glutamicum или Corynebacterium humireducens, в подходящей питательной среде, и
b) накопление L-аминокислот в питательной среде и/или в клетках упомянутых бактерий.
Продукт, содержащий L-аминокислоты, затем восстанавливают, или получают, или извлекают в жидкой или твердой форме.
Результатом проведения ферментации является ферментационный бульон, который содержит соответствующую L-аминокислоту.
Ферментационный бульон означает ферментационную среду или питательную среду, в которой микроорганизм культивировали в течение определенного периода времени и при определенной температуре. Ферментационная среда или среды, используемые при ферментации, содержит/содержат все вещества или компоненты, которые обеспечивают размножение микроорганизма и образование требуемой L-аминокислоты.
Соответственно, по завершении ферментации полученный в результате бульон, содержит
a) биомассу (клеточную массу) микроорганизма, при этом указанная биомасса образовалась в результате размножения клеток указанного микроорганизма,
b) L-аминокислоту, образовавшуюся в ходе ферментации,
c) органические побочные продукты, образовавшиеся в ходе ферментации, и
d) компоненты используемой ферментационной среды или сырья, такие как, например, витамины, такие как биотин, или соли, такие как сульфат магния, которые не были поглощены в ходе ферментации.
Органические побочные продукты включают вещества, которые продуцируются используемыми микроорганизмами при ферментации в дополнение к требуемому соединению, и они необязательно секретируются клетками. Они также включают сахара, такие как, например, трегалоза.
Ферментационный бульон удаляют из сосуда для культивирования или резервуара для ферментации, при необходимости собирают, и используют для получения продукта, содержащего L-аминокислоты, в жидкой или твердой форме. Выражение «извлечение продукта, содержащего L-аминокислоты» также используют для данного контекста. В самом простом случае ферментационный бульон, содержащий L-аминокислоты, собственно представляет собой извлеченный продукт.
С помощью одного или более воздействий, выбранных из группы, включающей
а) от частичного (от >0% до <80%) до полного (100%) или практически полного (≥80%, ≥90%, ≥95%, ≥96%, ≥97%, ≥98%, ≥99%) удаления воды,
b) от частичного (от >0% до <80%) до полного (100%) или практически полного (≥80%, ≥90%, ≥95%, ≥96%, ≥97%, ≥98%, ≥99%) удаления биомассы, при этом последнюю необязательно инактивируют перед удалением,
c) от частичного (от >0% до <80%) до полного (100%) или практически полного (≥80%, ≥90%, ≥95%, ≥96%, ≥97%, ≥98%, ≥99%, ≥99,3%, ≥99,7%) удаления органических побочных продуктов, образовавшихся в ходе ферментации, и
d) от частичного (>0%) до полного (100%) или практически полного (≥80%, ≥90%, ≥95%, ≥96%, ≥97%, ≥98%, ≥99%, ≥99,3%, ≥99,7%) удаления компонентов использованной ферментационной среды или сырья — тех компонентов, которые не были поглощены в ходе ферментации,
из ферментационного бульона, обеспечивается концентрирование или очистка L-аминокислоты. Посредством данного способа выделяют продукты с требуемым содержанием L-аминокислоты.
Удаление воды (воздействие a) от частичного (от >0% до <80%) до полного (100%) или практически полного (от ≥80% до <100%) также обозначено как высушивание.
Полное или практически полное удаление воды, биомассы, органических побочных продуктов и непоглощенных компонентов используемой ферментационной среды дает в результате чистые (≥80% по весу, ≥90% по весу) или высокой степени очистки (≥95% по весу, ≥97% по весу, ≥99% по весу) формы продукта на основе L-аминокислот. Для воздействий, упомянутых в a), b), c) и d), доступно множество протоколов, доступных из предшествующего уровня техники.
Демонстрационные примеры
Пример 1. Анализ эффективности продуцирования L-аланина и L-валина
Для анализа эффективности продуцирования L-аланина/L-валина штамм C. humireducens (DSM 45392) культивировали во встряхиваемой колбе. Для этой цели штамм C. humireducens инкубировали в 10 мл жидкой среды BHI (Brain Heart Infusion; Merck) (37 г/л в H2O) при 37°C, при 200 об./мин. в течение 24 ч. в качестве прекультуры. Затем 10 мл среды во встряхиваемой колбе инокулировали до OD660 0,2 и культивировали при 37°C при 200 об./мин. в течение 48 ч. Для приготовления указанной среды 20 г сульфата аммония, 0,4 г MgSO4*7H2O, 0,6 г KH2PO4 и 10 г дрожжевого экстракта растворяли в 750 мл H2O. Значение pH раствора доводили до 7,8 с помощью 20% NH4OH и затем раствор автоклавировали. Затем добавляли 4 мл раствора витаминов (значение pH 7 доводили при помощи NH4OH), включающего 0,25 г/л тиамина, 50 мг/л цианокобаламина, 25 мг/л биотина и 1,25 г/л пиридоксина. Кроме того, добавляли 140 мл стерильно фильтрованного 50% раствора глюкозы и 50 г автоклавированного сухого CaCO3, а затем объем среды доводили до одного литра.
После культивирования супернатант четырех параллельных культур анализировали в каждом случае с помощью HPLC для определения содержания аланина и валина с пределом обнаружения ≥0,01 г/л.
Штамм вида C. humireducens после культивирования в течение 48 ч. в среде во встряхиваемом флаконе при 37°C, 200 об./мин. в масштабе встряхиваемого флакона обеспечивал приблизительно 0,81 г/л аланина (выход чистого продукта: 0,011 галанина/гглюкозы) и 1,6 г/л валина (выход чистого продукта: 0,022 гвалина/гглюкозы) (Таб. 1).
Таблица 1. Аналитические данные из эксперимента с культивированием во встряхиваемой колбе штамма вида C. humireducens. Показаны значения, полученные после культивирования клеток, и данные для незасеянной среды.
| Аланин (г/л) | Валин (г/л) | |
| C. humireducens | 1,27 | 1,9 |
| Питательная среда без клеток | 0,46 | 0,3 |
Пример 2. Анализ эффективности продуцирования глутамата
Для анализа эффективности продуцирования L-глутамата штамм вида C. humireducens (DSM 45392) культивировали во встряхиваемой колбе. Для этой цели штамм C. humireducens инкубировали в 10 мл жидкой среды BHI (Brain Heart Infusion; Merck) (37 г/л в H2O) при 37°C, при 200 об./мин. в течение 24 ч. в качестве прекультуры. Затем 10 мл среды во встряхиваемой колбе инокулировали до OD660 0,2 и культивировали при 37°C при 200 об./мин. в течение 48 ч. Для приготовления указанной среды 20 г сульфата аммония, 0,4 г MgSO4*7H2O, 0,6 г KH2PO4 и 10 г дрожжевого экстракта растворяли в 750 мл H2O. Значение pH раствора доводили до 7,8 с помощью 20% NH4OH и затем раствор автоклавировали. Затем добавляли 4 мл раствора витаминов (значение pH 7 доводили при помощи NH4OH), включающего 0,25 г/л тиамина, 50 мг/л цианокобаламина, 25 мг/л биотина и 1,25 г/л пиридоксина. Кроме того, добавляли 140 мл стерильно фильтрованного 50% раствора глюкозы и 50 г автоклавированного сухого CaCO3. Затем добавляли 5 мл 400 мM стерильно фильтрованного маточного раствора, а затем среду доводили до одного литра.
После культивирования супернатант четырех параллельных культур анализировали в каждом случае с помощью HPLC для определения содержания глутамата с пределом обнаружения ≥0,01 г/л.
Штамм вида C. humireducens после культивирования в течение 48 ч. в среде во встряхиваемом флаконе при 37°C, 200 об./мин. в масштабе встряхиваемого флакона обеспечивал приблизительно 1,8 (+/-0,6) г/л L-глутамата. Начальная концентрация L-глутамата в среде составляла 0,78 (+/-0,1) г/л.
Пример 3. Скрининг устойчивых к AEC клонов
Каждый из десяти отдельных клонов штамма дикого типа C. humireducens (DSM 45392) культивировали в 10 мл жидкой питательной среды (Brain Heart Infusion; Merck) (37 г/л H2O) во встряхиваемых колбах в течение ночи при 37°C и 200 об./мин. Затем в каждом случае 100 мкл ночной культуры высевали на чашки с минимальной агаровой питательной средой с 25 мM S-2-аминоэтил-L-цистеина (AEC) (MW=164 г/моль) и инкубировали в течение трех дней при 37°C. Для получения минимальной среды 5 г (NH4)2SO4, 5 г мочевины, 2 г KH2PO4, 2 г K2HPO4 и 10 г MOPS растворяли в 750 мл H2O, значение pH доводили до 7,6 с 1M KOH и смесь автоклавировали. Оставшиеся компоненты составляли и стерильно фильтровали по отдельности. С этой целью 20 мл 50% (вес/об.) глюкозы, 1 мл 1% (вес/объем) CaCl2, 1 мл 1M MgSO4, 1 мл 0,02% биотина и 1 мл раствора микроэлементов (1 г FeSO4 x 7H2O, 1 г MnSO4 x 7H2O, 0,1 г ZnSO4 x 7H2O, 0,021 г CuSO4 x 5H2O и 0,002 г NiCl2 x 6H2O на 100 мл H2O) добавляли к среде, а затем доводили до объема 1000 мл стерильной H2O. Для культивирования на чашках с плотной питательной средой 15 г/л агар-агара (Merck) добавляли в питательную среду.
Отдельные видимые колонии высевали на чашки со свежей минимальной агаровой питательной средой с 25 мM AEC и 12,5 мM треонина в виде отдельного штриха и инкубировали в течение трех дней при 37°C. Затем в каждом случае 10 мл жидкой питательной среды BHI (Brain Heart Infusion; Merck) (37 г/л в H2O) во встряхиваемом флаконе инокулировали отдельный клон и инкубировали в течение ночи при 37°C со встряхиванием при 200 об./мин, а затем обрабатывали с использованием 10% глицерина и хранили при -80°C в качестве референтных образцов.
Секвенирование и анализ последовательности участка lysC
С целью анализа последовательности участков lysC выделенных отдельных клонов, соответствующий участок гена lysC амплифицировали с помощью праймеров (lysC_for: 5´AGACGAAAGGCGGCCTACAC3´ и lysC_rev: 5´TCCAGGATCGAGCGCATCAC3´) и с использованием методики ПЦР. Полученные последовательности ДНК анализировали с использованием программного обеспечения Clone Manager. С помощью анализа последовательности гена lysC у выделенных клонов C. Humireducens,, устойчивых к AEC + треонин, идентифицировали следующие точечные мутации.
Таблица 2. Идентифицированные изменения в гене lysC клонов C. humireducens, устойчивых к AEC + треонин, и вызванные ими аминокислотные замены.
| Клоны C. humireducens | Точечная мутация | AA замена |
| C. humireducens_AEC_Thr_r#1 | C → T | T308I |
| C. humireducens_AEC_Thr_r#2 | G → A | G359D |
| C. humireducens_AEC_Thr_r#3 | C → T | T311I |
| C. humireducens_AEC_Thr_r#4 | C → T | T311I |
| C. humireducens_AEC_Thr_r#5 | G → T | D274Y |
| C. humireducens_AEC_Thr_r#6 | C → T | T308I |
| C. humireducens_AEC_Thr_r#7 | C → A | S301Y |
| C. humireducens_AEC_Thr_r#9 | C → T | T308I |
| C. humireducens_AEC_Thr_r#10 | C → A | A279E |
Пример 4. Анализ эффективности продуцирования L-лизина
Штамм вида C. humireducens и выделенные отдельные клоны в результате скрининга устойчивых к AEC + треонин клонов культивировали во встряхиваемых флаконах и подвергали анализу эффективности в отношении синтеза ими лизина в масштабе встряхиваемого флакона. С этой целью штамм C. humireducens и выделенные клоны C. humireducens, устойчивые к AEC + треонин, инкубировали в 10 мл жидкой питательной среды BHI (Brain Heart Infusion; Merck) (37 г/л в H2O) в качестве прекультуры при 37°C и 200 об./мин. в течение 24 ч. Затем 10 мл питательной среды из встряхиваемого флакона инокулировали при OD660 0,2 и культивировали при 37°C при 200 об./мин. в течение 48 ч. Для приготовления данной среды 7,5 г кукурузного экстракта (50%), 20 г морфолинопропансульфоновой кислоты (MOPS), 25 г (NH4)2SO4, 0,1 г KH2PO4, 1 г MgSO4*7H2O, 0,01 г CaCl2*2H2O, 0,01 г FeSO4*7H2O и 0,005 г MnSO4*H2O растворяли в 750 мл H2O, значение pH доводили до 7,0 с помощью водного аммиака и смесь автоклавировали. Затем добавляли 25 г сухого автоклавированного CaCO3. Оставшиеся компоненты составляли и стерильно фильтровали по отдельности. С этой целью 90 мл 50% (вес/об.) глюкозы и 10 мл раствора 30 мг/л тиамина и 20 мг/л биотина добавляли в культуральную среду и затем доводили до объема 1000 мл стерильной H2O.
После культивирования, в каждом случае проводили HPLC анализ супернатанта двух параллельных культур для определения содержания L-лизина с пределом обнаружения ≥0,01 г/л. Конечные титры и выходы лизина в культурах показаны в следующей таблице.
Таблица 3. Средние значения и стандартное отклонение конечных значений титра лизина для двух параллельных культур клонов C. humireducens, устойчивых к AEC + треонин, через 48 ч. культивирования в питательной среде во встряхиваемом флаконе при 37°C и 200 об./мин.
| Лизин (г/л) | ||
| Среднее значение | Станд. отклон. | |
| Штамм вида C. humireducens | 0,13 | 0,01 |
| C. humireducens_AEC_Thr_r#1 | 1,33 | 0,08 |
| C. humireducens_AEC_Thr_r#2 | 1,33 | 0,08 |
| C. humireducens_AEC_Thr_r#3 | 1,25 | 0,01 |
| C. humireducens_AEC_Thr_r#4 | 1,29 | 0,01 |
| C. humireducens_AEC_Thr_r#5 | 1,24 | 0,09 |
| C. humireducens_AEC_Thr_r#6 | 0,85 | 0,04 |
| C. humireducens_AEC_Thr_r#7 | 1,12 | 0,00 |
| C. humireducens_AEC_Thr_r#9 | 1,18 | 0,02 |
| C. humireducens_AEC_Thr_r#10 | 1,34 | 0,03 |
1. Аланиндегидрогеназа, отличающаяся тем, что указанный фермент имеет последовательность, которая по меньшей мере на 85% идентична последовательности под SEQ ID NO: 72.
2. Полинуклеотид, который кодирует аланиндегидрогеназу, выбранную из группы, включающей:
a) полинуклеотиды, которые кодируют аланиндегидрогеназу по п. 1;
b) полинуклеотид, который является комплементарным полинуклеотидам согласно (a).
3. Рекомбинантный микроорганизм рода Corynebacterium для получения L-аланина, L-валина, L-глутамата и L-лизина, отличающийся тем, что указанный микроорганизм содержит по меньшей мере одну аланиндегидрогеназу по п. 1 и/или по меньшей мере один полинуклеотид по п. 2.
4. Рекомбинантный микроорганизм по п. 3, отличающийся тем, что аланиндегидрогеназа по п. 1 и/или полинуклеотид по п. 2 присутствует в указанном микроорганизме в сверхэкспрессируемой форме.
5. Рекомбинантный микроорганизм по п. 3 или 4, отличающийся тем, что указанный микроорганизм является коринебактерией, предпочтительно вида C. humireducens или C. glutamicum.
6. Способ получения в избыточном количестве L-аминокислоты с помощью микроорганизма рода Corynebacterium, отличающийся тем, что полинуклеотид по п. 2, кодирующий полипептид по п. 1, встроен в рекомбинантный микроорганизм рода Corynebacterium с помощью клонирующего или экспрессионного вектора, при этом указанная аминокислота выбрана из группы, содержащей L-аланин, L-валин, L-глутамат и L-лизин.
