Новое антитело против tie-2 человека

Изобретение относится к области биохимии, в частности к антителу против Tie2 человека, содержащему четыре вариабельные области тяжелой цепи и четыре вариабельные области легкой цепи, две тяжелые цепи и четыре легкие цепи, а также к фармацевтической композиции его содержащей. Также раскрыто применение вышеуказанного антитела против Tie2 человека для профилактики или лечения диабетической ретинопатии, для профилактики или лечения критической ишемии конечностей, а также для профилактики или лечения диабетического отека желтого пятна. Изобретение позволяет эффективно осуществлять лечение таких заболеваний, как критическая ишемия конечностей, диабетический отек желтого пятна и диабетическая ретинопатия. 10 н. и 4 з.п. ф-лы, 7 ил., 9 табл., 17 пр.

 

Область техники

[0001]

Настоящее изобретение относится к новому антителу против Tie-2 человека.

Уровень техники

[0002]

Тирозинкиназа с доменом Ig и доменами гомологии с EGF 2 (Tie2) представляет собой тирозинкиназу рецепторного типа. Известно, что Tie2 в основном экспрессируется в клетках эндотелия сосудов. В качестве лиганда, известны ангиопоэтин-1 (Ang-1) и ангиопоэтин-2 (Ang-2), представляющие собой секретируемые гликопротеины мультимерного типа.

[0003]

Ang-1 функционирует как агонист для Tie2. Обнаружено, что когда Tie2 связывается с Ang-1, он подвергается аутофосфорилированию посредством формирования мультимера и передает сигнал в клетку, таким образом, стимулируя антиапоптотическое действие на клетки эндотелия сосудов, стабилизацию сосудов посредством ингибирующиего проникновение действия на кровеносные сосуды, созревания и ремоделирования сосудов (Cell, 1996, Vol. 87, pp. 1171-1180; Genes Dev., 1994, Vol. 8, pp. 1897-1909; Science, 1999, Vol. 286, pp. 2511-2514; и Nat. Struct. Biol., 2003, Vol. 10, pp. 38-44). Кроме того, известно также, что Ang-1 обладает сосудорасширяющим и усиливающим кровоток действием посредством продукции оксида азота посредством активации Tie2 (Pharmacol. Res., 2014, Vol. 80, pp. 43-51). Кроме того, полагают, что Ang-1 вносит вклад в стабилизацию кровеносных сосудов посредством ингибирования интернализации кадгерина эндотелия сосудов посредством активации Tie2 (Dev. Cell, 2008, Vol. 14, pp. 25-36). С другой стороны, полагают, что Ang-2 является способным активировать Tie2 на клетках эндотелия сосудов, но считают, что его активация является частичной, по сравнению с Ang-1 (Mol. Cell Biol., 2009, Vol. 29, pp. 2011 -2022). Ang-2 связывается с тем же участком Tie2 по существу с такой же аффинностью, как Ang-1, и в результате, предполагают, что Ang-2 функционирует как эндогенный антагонист Tie2 с той точки зрения, что активация Tie2 посредством Ang-1 заменяется частичной активацией Ang-2 (Science, 1997, Vol. 277, pp. 55-60).

[0004]

Опубликовано увеличение концентрации Ang-2 в крови при заболевании, индуцированном чувствительностью сосудов, которую считают одной из причин таких заболеваний, как диабет, диабетическая ретинопатия, сепсис и острая почечная недостаточность (Atherosclerosis, 2005, Vol. 180, pp. 113-118; Br. J. Ophthalmol., 2004, Vol. 88, pp. 1543-1546; Critical Care, 2009, Vol. 13, p. 207; и Intensive Care Med., 2010, Vol. 36, pp. 462-470).

[0005]

Относительно важности для диабетической ретинопатии и диабетического отека желтого пятна, опубликовано, что концентрация Ang-2 в плазме крови или стекловидном теле пациентов увеличена (Br. J. Ophthalmol., 2004, Vol. 88, pp. 1543-1546; и Br. J. Ophthalmol., 2005, Vol. 89, pp. 480-483). Кроме того, известно также, что в кровеносных сосудах сетчатки пациентов с диабетической ретинопатией, потеря перицитов, являющихся основными продуцирующими Ang-1 клетками (Cell, 1996, Vol. 87, pp. 1161-1169) является одним из характерных поражений (Retina, 2013, Fifth edition, pp. 925-939). Известно, что диабетический отек желтого пятна вовлечен в утолщение желтого пятна в качестве одного из его условий, однако, опубликовано также, что у пациентов с увеличением внутриглазной концентрации Ang-1 из-за хирургического удаления стекловидного тела, утолщение желтого пятна уменьшается (Br. J. Ophthalmol., 2005, Vol. 89, pp. 480-483). Кроме того, с тех точек зрения, что в моделях отека сетчатки на мышах с потерей перицитов в кровеносных сосудах в сетчатке, наблюдают отек сетчатки и кровоизлияние в сетчатку, и начало патологии ингибируют посредством введения в стекловидное тело Ang-1 (J. Clin. Invest., 2002, Vol. 110, pp. 1619-1628), и что в тесте с использованием модели диабетической ретинопатии на мышах, нарушения клеток эндотелия сосудов в сетчатке ингибируют посредством введения аденовируса, содержащего ген, кодирующий Ang-1 (Am. J. Pathol., 2002, Vol. 160, pp. 1683-1693), предположили, что Ang-1 обладает действием для улучшения этих состояний. В то же время, опубликовано, что у генетически модифицированных мышей, обладающих Ang-2, специфически сверхэкспрессированным в сетчатке, повреждение клеток сетчатки увеличено (Acta. Diabetol. 2010, Vol. 47, pp. 59-64).

[0006]

Опубликовано, что в отношении критической ишемии конечностей, количество Ang-2 в плазме крови увеличено у пациентов с заболеваниями периферических артерий, и количество Ang-2, экспрессированного в мышцах ишемизированной конечности или тканях кожи у пациентов с критической ишемией конечностей, является высоким (J. Am. Coll. Cardial., 2008, Vol. 52, pp. 387-393; и Int. Angiol., 2011, Vol. 30, pp. 25-34). Более того, в тесте с использованием модели ишемии задних конечностей на крысах, восстановление кровотока и антиапоптотический эффект в ишемизированной конечности стимулируют посредством введения вирусного вектора, содержащего ген, кодирующий Ang-1 (Angiogenesis, 2009, Vol. 12, pp. 243-249). С той точки зрения, что опубликовано, что количество зрелых кровеносных сосудов, покрытых гладкомышечными клетками, увеличивают в пограничной зоне области инфаркта посредством введения вируса, содержащего ген, кодирующий Ang-1, в модели лигирования коронарной артерии у мышей db/db в качестве модели диабета типа 2 на животных (Diabetes, 2008, Vol. 57, pp. 3335-3343), можно ожидать эффекта стимуляции созревания нестабильных неоваскулярных сосудов посредством активации сигналов Tie2.

[0007]

Опубликовано антитело, обладающее агонистическим действием на Tie2 человека, мышиное моноклональное антитело 15B8 (Патентный документ 1). Опубликовано, что 15B8 связывает Tie2 человека для индукции антиапоптотического действия в клетках эндотелия сосудов человека HUVEC (Патентный документ 1)

Связанная область

Патентный документ

[0008]

[Патентный документ 1] WO 2000/018804

Описание изобретения

Проблемы, подлежащие решению посредством изобретения

[0009]

Целью настоящего изобретения является предоставление антитела против Tie2 человека для предотвращения или лечения диабетического отека желтого пятна, диабетической ретинопатии или критической ишемии конечностей посредством связывания Tie2 человека для активации Tie2 человека.

Средства для решения проблем

[0010]

Авторы настоящего изобретения недавно многократно проводили масштабные и изобретательские исследования для получения антитела против Tie2 человека, и в результате обнаружили, что получено тетравалентное антитело против Tie2 человека, содержащее вариабельную область тяжелой цепи, состоящую из аминокислотной последовательности из аминокислот номер 1-122 из SEQ ID NO: 2 и вариабельную область легкой цепи, состоящую из аминокислотной последовательности аминокислот номер 1-113 из SEQ ID NO: 4 (примеры 1-8), и таким образом, антитело против Tie2 человека связывает Tie2 человека (пример 12), индуцирует антиапоптотическое действие в экспрессирующих Tie2 человека клетках BaF3 (примеры 9 и 11), и ингибирует повышенную проницаемость сосудов в модели повышенной проницаемости сосудов на крысах (примеры 10 и 13). В результате они получили такое антитело против Tie2 человека, таким образом, завершив настоящее изобретение.

[0011]

Таким образом, настоящее изобретение может включать следующее изобретение в качестве материала или способа, обладающего медицинской или промышленной применимостью.

[1] Антитело против Tie2 человека или его антигенсвязывающий фрагмент, содержащие четыре вариабельные области тяжелой цепи и четыре вариабельные области легкой цепи, где

вариабельная область тяжелой цепи содержит CDR1, состоящую из аминокислотной последовательности из аминокислот номер 31-35 из SEQ ID NO: 2, CDR2, состоящую из аминокислотной последовательности из аминокислот номер 50-66 из SEQ ID NO: 2, и CDR3, состоящую из аминокислотной последовательности из аминокислот номер 99-111 из SEQ ID NO: 2;

вариабельная область легкой цепи содержит CDR1, состоящую из аминокислотной последовательности из аминокислот номер 24-39 из SEQ ID NO: 4, CDR2 состоящую из аминокислотной последовательности из аминокислот номер 55-61 из SEQ ID NO: 4, и CDR3, состоящую из аминокислотной последовательности из аминокислот номер 94-102 из SEQ ID NO: 4; и

одна вариабельная область тяжелой цепи и одна вариабельная область легкой цепи составляют один антигенсвязывающий участок, и антитело или его антигенсвязывающий фрагмент содержит четыре антигенсвязывающих участка.

[2] Антитело против Tie2 человека или его антигенсвязывающий фрагмент из [1], выбранные из (1) или (2) ниже:

(1) антитело против Tie2 человека или его антигенсвязывающий фрагмент, содержащие четыре вариабельные области тяжелой цепи и четыре вариабельные области легкой цепи, в которых

вариабельная область тяжелой цепи состоит из аминокислотной последовательности из аминокислот номер 1-122 из SEQ ID NO: 2,

вариабельная область легкой цепи состоит из аминокислотной последовательности из аминокислот номер 1-113 из SEQ ID NO: 4, и

одна вариабельная область тяжелой цепи и одна вариабельная область легкой цепи составляют один антигенсвязывающий участок, и антитело или его антигенсвязывающ фрагмент содержит четыре антигенсвязывающих участка; и

(2) антитело против Tie2 человека или его антигенсвязывающий фрагмент, представляющие собой антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, полученные в результате посттрансляционной модификации антитела против Tie2 человека или его антигенсвязывающего фрагмента из (1).

[3] Антитело против Tie2 человека из [1], где

антитело содержит две тяжелые цепи и четыре легкие цепи;

каждая тяжелая цепь содержит две структуры, состоящие из вариабельной области тяжелой цепи, содержащей CDR1, состоящую из аминокислотной последовательности из аминокислот номер 31-35 из SEQ ID NO: 2, CDR2, состоящую из аминокислотной последовательности из аминокислот номер 50-66 из SEQ ID NO: 2, и CDR3, состоящую из аминокислотной последовательности из аминокислот номер 99-111 из SEQ ID NO: 2, и области CH1, области CH2 и области CH3, и карбокси-конец (C-конец) одной из структур связан с амино-концом (N-концом) другой структуры через линкер; и

каждая легкая цепь содержит вариабельную область легкой цепи, содержащую CDR1, состоящую из аминокислотной последовательности из аминокислот номер 24-39 из SEQ ID NO: 4, CDR2, состоящую из аминокислотной последовательности из аминокислот номер 55-61 из SEQ ID NO: 4, и CDR3, состоящую из аминокислотной последовательности из аминокислот номер 94-102 из SEQ ID NO: 4, и константную область легкой цепи.

[4] Антитело против Tie2 человека из [3], выбранное из (1) или (2) ниже:

(1) антитело против Tie2 человека, содержащее две тяжелые цепи и четыре легкие цепи, в котором

каждая тяжелая цепь содержит две структуры, состоящие из вариабельной области тяжелой цепи, состоящей из аминокислотной последовательности из аминокислот номер 1-122 из SEQ ID NO: 2, и области CH1, области CH2 и области CH3, и C-конец одной из структур связан с N-концом другой структуры через линкер; и

каждая легкая цепь содержит вариабельную область легкой цепи, состоящую из аминокислотной последовательности из аминокислот номер 1-113 из SEQ ID NO: 4, и константную область легкой цепи; и

(2) антитело против Tie2 человека, представляющее собой антитело, полученное в результате посттрансляционной модификации антитела против Tie2 человека из (1).

[5] Антитело против Tie2 человека из [4], где

антитело против Tie2 человека содержит две тяжелые цепи и четыре легкие цепи;

каждая тяжелая цепь содержит две структуры, состоящие из вариабельной области тяжелой цепи, состоящей из аминокислотной последовательности из аминокислот номер 1-122 из SEQ ID NO: 2, и области CH1, области CH2 и области CH3, и C-конец одной из структур связан с N-концом другой структуры через линкер; и

каждая легкая цепь содержит вариабельную область легкой цепи, состоящую из аминокислотной последовательности из аминокислот номер 1-113 из SEQ ID NO: 4, и константную область легкой цепи.

[6] Антитело против Tie2 человека, представляющее собой антитело, полученное в результате посттрансляционной модификации антитела против Tie2 человека из [5].

[7] Антитело против Tie2 человека из [6], где посттрансляционная модификация представляет собой пироглутамилирование на N-конце вариабельной области тяжелой цепи и/или делецию лизина на C-конце тяжелой цепи.

[8] Антитело против Tie2 человека по любому из [3]-[7], содержащее константную область тяжелой цепи, представляющую собой константную область Igγl человека или константную область Igγ4 человека.

[9] Антитело против Tie2 человека из [8], в котором константная область Igγl человека представляет собой константную область Igγl человека, обладающую вариантами аминокислот L234A, L235A и P331S, или константную область Igγl человека, обладающую вариантами аминокислот L234A, L235A, P331S и I253A.

[10] Антитело против Tie2 человека из [8], в котором константная область Igγ4 человека представляет собой константную область Igγ4 человека, обладающую вариантами аминокислот S228P и L235E.

[11] Антитело против Tie2 человека по любому из [3]-[7], содержащее константную область легкой цепи, представляющую собой константную область Igκ человека.

[12] Антитело против Tie2 человека по любому из [3]-[7], содержащее константную область тяжелой цепи, представляющую собой константную область Igγl человека или константную область Igγ4 человека, и константную область легкой цепи, представляющую собой константную область Igκ человека.

[13] Антитело против Tie2 человека из [12], в котором константная область Igγl человека представляет собой константную область Igγl человека, обладающую вариантами аминокислот L234A, L235A и P331S, или константную область Igγl человека, обладающую вариантами аминокислот L234A, L235A, P331S и I253A.

[14] Антитело против Tie2 человека из [12], в котором константная область Igγ4 человека представляет собой константную область Igγ4 человека, обладающую вариантами аминокислот S228P и L235E.

[15] Антитело против Tie2 человека по любому из [3]-[7], в котором линкер представляет собой пептидный линкер, содержащий 5-70 аминокислот.

[16] Антитело против Tie2 человека из [15], в котором линкер содержит аминокислотную последовательность шарнирной области или ее часть.

[17] Антитело против Tie2 человека из [16], в котором линкер содержит аминокислотную последовательность, показанную в SEQ ID NO: 13.

[18] Антитело против Tie2 человека из [4], содержащее две тяжелые цепи, состоящие из аминокислотной последовательности, показанной в SEQ ID NO: 2, и четыре легкие цепи, состоящие из аминокислотной последовательности, показанной в SEQ ID NO: 4.

[19] Антитело против Tie2 человека из [4], содержащее две тяжелые цепи, состоящие из аминокислотной последовательности, показанной в SEQ ID NO: 6, и четыре легкие цепи, состоящие из аминокислотной последовательности, показанной в SEQ ID NO: 4.

[20] Антитело против Tie2 человека из [4], содержащее две тяжелые цепи, состоящие из аминокислотной последовательности, показанной в SEQ ID NO: 10, и четыре легкие цепи, состоящий из аминокислотной последовательности, показанной в SEQ ID NO: 4.

[21] Антитело против Tie2 человека, представляющее собой антитело, полученное в результате посттрансляционной модификации антитела против Tie2 человека по любому из [18]-[20]

[22] Антитело против Tie2 человека из [21], где посттрансляционная модификация представляет собой пироглутамилирование на N-конце вариабельной области тяжелой цепи и/или делецию лизина на C-конце тяжелой цепи.

[23] Антитело против Tie2 человека из [21], содержащее две тяжелые цепи, состоящие из аминокислотной последовательности из аминокислот номер 1-678 из SEQ ID NO: 2 и четыре легкие цепи, состоящие из аминокислотной последовательности, показанной в SEQ ID NO: 4.

[24] Тетравалентное антитело против Tie2 человека или его антигенсвязывающий фрагмент, связывающиеся с тем же самым эпитопом Tie2 человека, что и антитело против Tie2 человека из [18] или [23].

[25] Тетравалентное антитело против Tie2 человека или его антигенсвязывающий фрагмент из [24], где эпитоп Tie2 человека представляет собой эпитоп Tie2 человека, содержащий аминокислоты из аминокислотных номеров 192, 195 и 197 из No. доступа NP 000450.2.

[26] Полинуклеотид, содержащий последовательность оснований, кодирующую вариабельную область тяжелой цепи антитела против Tie2 человека или ее антигенсвязывающий фрагмент из [2].

[27] Полинуклеотид, содержащий последовательность оснований, кодирующую вариабельную область легкой цепи антитела против Tie2 человека или ее антигенсвязывающий фрагмент из [2].

[28] Полинуклеотид, содержащий последовательность оснований, кодирующую тяжелую цепь антитела против Tie2 человека по любому из [18]-[20].

[29] Полинуклеотид, содержащий последовательность оснований, кодирующую легкую цепь антитела против Tie2 человека по любому из [18]-[20].

[30] Экспрессирующий вектор, содержащий полинуклеотид из [26] и/или [27].

[31] Экспрессирующий вектор, содержащий полинуклеотид из [28] и/или [29].

[32] Клетка-хозяин, трансформированная экспрессирующим вектором из [30], которая выбрана из группы, состоящей из (a)-(d) ниже:

(a) клетка-хозяин, трансформированная экспрессирующим вектором, содержащим полинуклеотид, содержащий последовательность оснований, кодирующую вариабельную область тяжелой цепи антитела против Tie2 человека или ее антигенсвязывающий фрагмент из [2], и полинуклеотид, содержащий последовательность оснований, кодирующую вариабельную область легкой цепи антитела или ее антигенсвязывающий фрагмент;

(b) клетка-хозяин, трансформированная экспрессирующим вектором, содержащим полинуклеотид, содержащий последовательность оснований, кодирующую вариабельную область тяжелой цепи антитела против Tie2 человека или ее антигенсвязывающий фрагмент из [2], и экспрессирующим вектором, содержащим полинуклеотид, содержащий последовательность оснований, кодирующую вариабельную область легкой цепи антитела или ее антигенсвязывающий фрагмент;

(c) клетка-хозяин, трансформированная экспрессирующим вектором, содержащим полинуклеотид, содержащий последовательность оснований, кодирующую вариабельную область тяжелой цепи антитела против Tie2 человека или его антигенсвязывающий фрагмент из [2]; и

(d) клетка-хозяин, трансформированная экспрессирующим вектором, содержащим полинуклеотид, содержащий последовательность оснований, кодирующую вариабельную область легкой цепи антитела против Tie2 человека или ее антигенсвязывающий фрагмент из [2].

[33] Клетка-хозяин, трансформированная экспрессирующим вектором из [31], выбранным из группы, состоящей из (a)-(d) ниже:

(a) клетка-хозяин, трансформированная экспрессирующим вектором, содержащим полинуклеотид, содержащий последовательность оснований, кодирующую тяжелую цепь антитела против Tie2 человека по любому из [18]-[20], и полинуклеотид, содержащий последовательность оснований, кодирующую легкую цепь антитела;

(b) клетка-хозяин, трансформированная экспрессирующим вектором, содержащим полинуклеотид, содержащий последовательность оснований, кодирующую тяжелую цепь антитела против Tie2 человека по любому из [18]-[20], и экспрессирующим вектором, содержащим полинуклеотид, содержащий последовательность оснований, кодирующую легкую цепь антитела;

(c) клетка-хозяин, трансформированная экспрессирующим вектором, содержащим полинуклеотид, содержащий последовательность оснований, кодирующую тяжелую цепь антитела против Tie2 человека по любому из [18]-[20]; и

(d) клетка-хозяин, трансформированная экспрессирующим вектором, содержащим полинуклеотид, содержащий последовательность оснований, кодирующую легкую цепь антитела против Tie2 человека по любому из [18]-[20].

[34] Способ получения антитела против Tie2 человека или его антигенсвязывающего фрагмента, включающий культивирование клетки-хозяина(клеток-хозяев), выбранных из группы, состоящей из (a)-(c) ниже, для экспрессии тетравалентного антитела против Tie2 человека или его антигенсвязывающего фрагмента:

(a) клетка-хозяин, трансформированная экспрессирующим вектором, содержащим полинуклеотид, содержащий последовательность оснований, кодирующую вариабельную область тяжелой цепи антитела против Tie2 человека или ее антигенсвязывающий фрагмент из [2], и полинуклеотид, содержащий последовательность оснований, кодирующую вариабельную область легкой цепи антитела или ее антигенсвязывающий фрагмент;

(b) клетка-хозяин, трансформированная экспрессирующим вектором, содержащим полинуклеотид, содержащий последовательность оснований, кодирующую вариабельную область тяжелой цепи антитела против Tie2 человека или ее антигенсвязывающий фрагмент из [2], и экспрессирующим вектором, содержащим полинуклеотид, содержащий последовательность оснований, кодирующую вариабельную область легкой цепи антитела или ее антигенсвязывающий фрагмент; и

(c) клетка-хозяин, трансформированная экспрессирующим вектором, содержащим полинуклеотид, содержащий последовательность оснований, кодирующую вариабельную область тяжелой цепи антитела против Tie2 человека или ее антигенсвязывающий фрагмент из [2], и клетка-хозяин трансформированная экспрессирующим вектором, содержащим полинуклеотид, содержащий последовательность оснований, кодирующую вариабельную область легкой цепи антитела или ее антигенсвязывающий фрагмент.

[35] Способ получения антитела против Tie2 человека, включающий культивирование клетки-хозяина(клеток-хозяев), выбранной из группы, состоящей из (a)-(c) ниже, для экспрессии антитела против Tie2 человека:

(a) клетка-хозяин, трансформированная экспрессирующим вектором, содержащим полинуклеотид, содержащий последовательность оснований, кодирующую тяжелую цепь антитела против Tie2 человека по любому из [18]-[20], и полинуклеотид, содержащий последовательность оснований, кодирующую легкую цепь антитела;

(b) клетка-хозяин, трансформированная экспрессирующим вектором, содержащим полинуклеотид, содержащий последовательность оснований, кодирующую тяжелую цепь антитела против Tie2 человека по любому из [18]-[20], и экспрессирующим вектором, содержащим полинуклеотид, содержащий последовательность оснований, кодирующую легкую цепь антитела; и

(c) клетка-хозяин, трансформированная экспрессирующим вектором, содержащим полинуклеотид, содержащий последовательность оснований, кодирующую тяжелую цепь антитела против Tie2 человека по любому из [18]-[20], и клетка-хозяин, трансформированная экспрессирующим вектором, содержащим полинуклеотид, содержащий последовательность оснований, кодирующую легкую цепь антитела против Tie2 человека.

[36] Антитело против Tie2 человека или его антигенсвязывающий фрагмент, полученные способом по [34].

[37] Антитело против Tie2 человека, полученное способом по [35].

[38] Фармацевтическая композиция, содержащая антитело против Tie2 человека или его антигенсвязывающий фрагмент по любому из [1]-[23], [36] и [37], и фармацевтически приемлемый наполнитель.

[39] Фармацевтическая композиция, содержащая антитело против Tie2 человека из [5], антитело против Tie2 человека из [6] и фармацевтически приемлемый наполнитель.

[40] Фармацевтическая композиция, содержащая антитело против Tie2 человека из [18], антитело против Tie2 человека из [23], и фармацевтически приемлемый наполнитель.

[41] Фармацевтическая композиция по любому из [38]-[40], представляющая собой фармацевтическую композицию для предотвращения или лечения диабетического отека желтого пятна, диабетической ретинопатии или критической ишемии конечностей.

[42] Способ предотвращения или лечения диабетического отека желтого пятна, диабетической ретинопатии или критической ишемии конечностей, включающий введение терапевтически эффективного количества антитела против Tie2 человека или его антигенсвязывающего фрагмента по любому из [1]-[23], [36] и [37].

[43] Антитело против Tie2 человека или его антигенсвязывающий фрагмент по любому из [1]-[23], [36] и [37], для предотвращения или лечения диабетического отека желтого пятна, диабетической ретинопатии или критической ишемии конечностей.

[44] Применение антитела против Tie2 человека или его антигенсвязывающего фрагмента по любому из [1]-[23], [36] и [37] для изготовления фармацевтической композиции для предотвращения или лечения диабетического отека желтого пятна, диабетической ретинопатии или критической ишемии конечностей.

[0012]

Антитело против Tie-2 человека или его антигенсвязывающий фрагмент включает антитело, слитое с другим пептидом или белком, и модификацию, имеющую слитое с ним модифицирующее средство.

Эффекты изобретения

[0013]

Антитело против Tie2 человека по настоящему изобретению можно использовать в качестве средства для предотвращения или лечения диабетического отека желтого пятна, диабетической ретинопатии или критической ишемии конечностей посредством связывания с Tie2 человека для активации Tie2 человека.

Краткое описание рисунков

[0014]

На фиг. 1 показан пример формата тетравалентного антитела против Tie2 человека по настоящему изобретению.

[0015]

На фиг. 2 показано ингибирующее действие на проницаемость сосудов полностью человеческого 2-16A2 и TIE-1-Igγ1-WT в модели проницаемости сосудов на крысах. На вертикальной оси указан уровень просачивания синего красителя Эванса (****: p <0,0001 по сравнению с группой носителя).

[0016]

На фиг. 3 показано ингибирующее действие на проницаемость сосудов TIE-1-Igγ1-LALA в модели проницаемости сосудов на крысах. На вертикальной оси указан уровень просачивания синего красителя Эванса (****: p <0,0001 по сравнению с группой носителя).

[0017]

На фиг. 4 показано ингибирующее действие на отек сетчатки TIE-1-Igγ1-LALA в модели на мышах с потерей перицитов в кровеносных сосудах сетчатки. На вертикальной оси указана сумма площади слоя нервных волокон сетчатки и слоя ганглиозных клеток сетчатки (##: p < 0,005 по сравнению с контрольной группой, *: p < 0,05 по сравнению с группой носителя).

[0018]

На фиг. 5 показано улучшающее кровоток действие TIE-1-Igγ1-LALA в модели на мышах с ишемией задних конечностей. На вертикальной оси указан уровень кровотока. (*: p < 0,05 по сравнению с контрольной группой, **: p < 0,01 по сравнению с контрольной группой).

[0019]

На фиг. 6 показан репрезентативный пример результатов феномена поверхностного плазмонного резонанса в качестве анализа эпитопов TIE-1-Igγ1-LALA. На вертикальной оси указан ответ связывания (Резонансных единиц: RU) и на горизонтальной оси указано время (секунд).

[0020]

На фиг. 7 показаны результаты ELISA в качестве анализа эпитопов TIE-1-Igγ1-LALA. На вертикальной оси указана интенсивность люминесценции, и на горизонтальной оси указана концентрация TIE-1-Igγ1-LALA (нг/мл).

Варианты осуществления изобретения

[0021]

Далее в настоящем документе, настоящее изобретение описано подробно.

[0022]

У антител существует пять классов IgG, IgM, IgA, IgD и IgE. Основная структура молекулы антитела обладает общей для каждого из классов конфигурацией из тяжелых цепей, обладающих молекулярной массой 50000-70000, и легких цепей, обладающих молекулярной массой 20000-30000. Тяжелая цепь, как правило, состоит из полипептидной цепи, содержащей приблизительно 440 аминокислот, обладает отличной структурой для каждого из классов и обозначена как Igγ, Igμ, Igα, Igδ и Igε, соответствующие IgG, IgM, IgA, IgD и IgE, соответственно. Кроме того, четыре подкласса IgG1, IgG2, IgG3 и IgG4 присутствуют в IgG, и соответствующие им тяжелые цепи, соответственно, обозначают как Igγ1, Igγ2, Igγ3 и Igγ4. Легкая цепь, как правило, состоит из полипептидной цепи, содержащей приблизительно 220 аминокислот, из которой известны два типа, тип L и тип К, и их обозначают как Igλ и Igκ. В пептидной конфигурации основной структуры молекул антител, две гомологичные тяжелые цепи и две гомологичные легкие цепи связаны дисульфидными связями (связями S-S) и нековалентными связями, и их молекулярная масса составляет 150000-190000. Два вида легких цепей могут спариваться с любой тяжелой цепью.

[0023]

Что качается внутрицепьевых связей S-S, четыре из связей S-S присутствуют в тяжелой цепи (пять в Igμ и Igε) и две из них присутствуют в легкой цепи; одна петля сформирована из 100-110 аминокислотных остатков, и эта стерическая структура является сходной среди петель и обозначена как структурная единица или домен. Домен, локализованный с амино-концевой стороны (N-концевой стороны) как в тяжелой цепи, так и в легкой цепи, аминокислотная последовательность которого не является постоянной даже в случае образца из одного и того же класса (подкласса) из одного и того же животного, обозначен как вариабельная область, и соответствующие домены обозначены как вариабельная область тяжелой цепи и вариабельная область легкой цепи. Аминокислотная последовательность с карбокси-концевой стороны (C-концевой стороны) от вариабельной области является почти постоянной в каждом классе или подклассе и обозначена как константная область.

[0024]

Конфигурация антигенсвязывающего участка антитела составлена из вариабельной области тяжелой цепи (VH) и вариабельной области легкой цепи (VL), и специфичность связывания зависит от аминокислотной последовательности этого участка. С другой стороны, такие виды биологической активности, как связывание с компонентами комплемента и различными клетками, отражают различия в структурах константной области среди каждого класса Ig. Понятно, что изменчивость вариабельных областей легких цепей и тяжелых цепей по большей части ограничена тремя небольшими гипервариабельными областями, присутствующими в обеих цепях, и эти области обозначены как определяющие комплементарность области (CDR: CDR1, CDR2 и CDR3 с N-концевой стороны). Оставшаяся часть вариабельной области обозначена как каркасная область (FR) и является относительно постоянной.

[0025]

Что касается константной области, константная область тяжелой цепи состоит из трех областей, каждая из которых названа областью CH1, областью CH2 и областью CH3 по порядку со стороны вариабельной области. Константная область легкой цепи состоит из одной области. Пептидная последовательность, называемая шарнирной областью, присутствует между областью CH1 и областью CH2. Шарнирная область вносит вклад в подвижность структуры, состоящей из вариабельной области тяжелой цепи и области CH1.

[0026]

Кроме того, различные виды антигенсвязывающих фрагментов, содержащих VH и VL антитела, обладают антигенсвязывающей активностью. Например, одноцепочечный фрагмент вариабельной области (scFv), Fab, Fab' и F(ab')₂ являются примерами типичных антигенсвязывающих фрагментов. Fab представляет собой одновалентный антигенсвязывающий фрагмент, составленный из легкой цепи и фрагмента тяжелой цепи, содержащего VH, область CH1 и часть шарнирной области. Fab' представляет собой одновалентный антигенсвязывающий фрагмент, составленный из легкой цепи и фрагмента тяжелой цепи, содержащего VH, область CH1 и часть шарнирной области, и остатки цистеина, составляющие связь S-S между тяжелыми цепями, содержатся в части шарнирной области. F(ab')₂ представляет собой двухвалентный антигенсвязывающий фрагмент, обладающий димерной структурой, в которой два Fab' фрагмента связаны друг с другом через связь S-S между тяжелыми цепями в шарнирной области. scFv представляет собой одновалентный антигенсвязывающий фрагмент, составленный из VH и VL, соединенных линкерным пептидом.

[0027]

Антитело, имеющее два или более антигенсвязывающих участка, обозначено как мультивалентное антитело. Среди них, антитело, имеющее четыре антигенсвязывающих участка, обозначено как тетравалентное антитело. Для тетравалентного антитела опубликованы различные форматы (структуры) (Nat. Rev. Immunol. 2010, Vol. 10, pp. 301-316; J. Immunol., 2003, Vol. 170, pp. 4854-4861; Mol. Immunol., 2000, Vol. 37, pp. 1067-1077; Biochem. J., 2007, Vol. 406, pp. 237-246; и J. Immunol. Methods, 2003, Vol. 279, pp. 219-232). Например, опубликовано тетравалентное антитело, в котором каждый из N-концов вариабельной области тяжелой цепи и вариабельной области легкой цепи двухвалентного антитела связаны с С-концами вариабельной области тяжелой цепи и вариабельной области легкой цепи через линкер; тетравалентное антитело, содержащее две тяжелые цепи и четыре легкие цепи, в котором каждая тяжелая цепь содержит две структуры, состоящие из вариабельной области тяжелой цепи и области CH1; тетравалентное антитело, в котором С-концы scFv связаны с каждым стрептавидином из тетрамерного стрептавидина один за другим; тетравалентное антитело, в котором С-концы scFv связаны с каждым p53 из тетрамерного p53 один за другим; и тетравалентное антитело, в котором N-концы области CH3 связаны с С-концами димерного scFv через линкер.

[0028]

<Антитело против Tie2 человека по настоящему изобретению>

Антитело против Tie2 человека или его антигенсвязывающий фрагмент по настоящему изобретению включает антитело против Tie2 человека или его антигенсвязывающий фрагмент, обладающие следующими характеристиками.

Антитело против Tie2 человека или его антигенсвязывающий фрагмент, содержащие четыре вариабельные области тяжелой цепи и четыре вариабельные области легкой цепи, в которых вариабельная область тяжелой цепи состоит из аминокислотной последовательности из аминокислот номер 1-122 из SEQ ID NO: 2,

вариабельная область легкой цепи состоит из аминокислотной последовательности из аминокислот номер 1-113 из SEQ ID NO: 4, и

одна вариабельная область тяжелой цепи и одна вариабельная область легкой цепи составляют один антигенсвязывающий участок, и антитело или его антигенсвязывающий фрагмент содержат четыре антигенсвязывающих участка.

[0029]

Антитело против Tie2 человека или его антигенсвязывающий фрагмент по настоящему изобретению не является конкретно ограниченным при условии, что они представляют собой тетравалентное антитело, и различные форматы тетравалентного антитела, описанные, например, в Nat. Rev. Immunol. 2010, Vol. 10, pp. 301-316, J. Immunol., 2003, Vol. 170, pp. 4854-4861; Mol. Immunol., 15 2000, Vol. 37, pp. 1067-1077; Biochem. J., 2007, Vol. 406, pp. 237-246; J. Immunol. Methods, 2003, Vol. 279, pp. 219-232; и т.п., можно использовать для антитела против Tie2 человека или его антигенсвязывающего фрагмента по настоящему изобретению.

[0030]

Предпочтительно, антитело против Tie2 человека по настоящему изобретению содержит две тяжелые цепи и четыре легкие цепи,

каждая тяжелая цепь содержит две структуры, состоящие из вариабельной области тяжелой цепи, состоящей из аминокислотной последовательности из аминокислот номер 1-122 из SEQ ID NO: 2 и области CH1, области CH2 и области CH3, и C-конец одной из структур связан с N-концом другой структуры через линкер, и

каждая легкая цепь содержит вариабельную область легкой цепи, состоящую из аминокислотной последовательности из аминокислот номер 1-113 из SEQ ID NO: 4, и константную область легкой цепи.

Далее в настоящем документе, тетравалентное антитело в этом формате обозначено как тандемное антитело, и его пример показан на фиг. 1.

[0031]

В случае, когда антитело против Tie2 человека по настоящему изобретению представляет собой тандемное антитело, константную область (например, константную область из Igγ1, Igγ2, Igγ3 или Igγ4 в качестве константной области тяжелой цепи, и константную область из Igλ или Igκ в качестве константной области легкой цепи) из любого подкласса можно выбирать в качестве константной области. Константная область тяжелой цепи (включая область CH1, область CH2 и область CH3) предпочтительно представляет собой константную область Igγ1 человека или константную область Igγ4 человека. Константная область легкой цепи предпочтительно представляет собой константную область Igκ человека.

[0032]

В случае, когда константную область Igγ1 человека используют в качестве константной области тяжелой цепи антитела против Tie2 человека по настоящему изобретению, примеры области CH1, области CH2 и области CH3 константной области Igγ1 человека включают область CH1, состоящую из аминокислотной последовательности из аминокислот номер 350-447 из SEQ ID NO: 8, область CH2, состоящую из аминокислотной последовательности из аминокислот номер 463-572 из SEQ ID NO: 8, и область CH3, состоящую из аминокислотной последовательности из аминокислот номер 573-679 из SEQ ID NO: 8.

[0033]

В случае, когда константную область Igγ1 человека используют в качестве константной области тяжелой цепи антитела против Tie2 человека по настоящему изобретению, константную область Igγ1 человека, обладающую введенными вариантами аминокислот, такими как L234A (обладающую заменой лейцина в 234-м аминокислотном положении на аланин в соответствии с индексом EU, таким как Kabat), L235A (обладающую заменой лейцина в 235-м аминокислотном положении на аланин в соответствии с индексом EU, таким как Kabat) и P33IS (обладающую заменой пролина в 331-м аминокислотном положении на серин в соответствии с индексом EU, таким как Kabat), также можно использовать, чтобы уменьшить активность антитела в антителозависимой клеточной цитотоксичности или комплементзависимой цитотоксичности (Mol. Immunol., 1992, Vol. 29, No.5, pp. 633-639). Кроме того, с точки зрения фармакокинетики, константную область Igγ1 человека, в которую введены варианты аминокислот, такие как 1253A (обладающую заменой изолейцина в 253-м аминокислотном положении на аланин в соответствии с индексом EU, таким как Kabat), также можно использовать для достижения быстрого выведения из крови (J. Immunol., 1997, Vol. 158, pp. 2211 -2217). Номера остатков в отношении введения варианта аминокислоты в константную область антитела, применяемые в настоящем описании, находятся в соответствии с индексом EU (Kabat et al., 1991, Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed., United States Public Health Service, National Institute of Health, Bethesda).

[0034]

В случае, когда константную область Igγ1 человека используют в качестве константной области тяжелой цепи антитела против Tie2 человека по настоящему изобретению, константная область Igγ1 человека предпочтительно представляет собой константную область Igγ1 человека, обладающую вариантами аминокислот из L234A, L235A, и P331S, или L234A, L235A, P331S и I253A. Примеры области CH1, области CH2 и области CH3 из константной области Igγ1 человека, обладающей вариантами аминокислот из L234A, L235A и P331S, включают область CH1, состоящую из аминокислотной последовательности из аминокислот номер 350-447 из SEQ ID NO: 2, область CH2, состоящую из аминокислотной последовательности из аминокислот номер 463-572 из SEQ ID NO: 2, и область CH3, состоящую из аминокислотной последовательности из аминокислот номер 573-679 из SEQ ID NO: 2. Примеры области CH1, области CH2 и области CH3 константной области Igγ1 человека, обладающей вариантами аминокислот из L234A, L235A, РЗЗ1S и I253A, включают область CH1, состоящую из аминокислотной последовательности из аминокислот номер 350-447 из SEQ ID NO: 6, область CH2, состоящую из аминокислотной последовательности из аминокислот номер 463-572 из SEQ ID NO: 6, и область CH3, состоящую из аминокислотной последовательности из аминокислот номер 573-679 из SEQ ID 5 NO: 6.

[0035]

В случае, когда константную область Igγ4 человека используют в качестве константной области тяжелой цепи антитела против Tie2 человека по настоящему изобретению, константную область Igγ4 человека, обладающую введенными вариантами аминокислот, такими как S228P (обладающую заменой серина в 228-м аминокислотном положении на пролин в соответствии с индексом EU, таким как Kabat) и L235E (обладающую заменой лейцина в 235-м аминокислотном положении на глутаминовую кислоту в соответствии с индексом EU, таким как Kabat) также можно использовать, чтобы ингибировать обмен Fab-фрагментами (Drug Metab. Dispos., 2010, Vol. 38, No.l, pp. 84-91).

[0036]

В случае, когда константную область Igγ4 человека используют в качестве константной области тяжелой цепи антитела против Tie2 человека по настоящему изобретению, константная область Igγ4 человека предпочтительно представляет собой константную область Igγ4 человека, обладающую вариантами аминокислот S228P и L235E. Примеры области CH1, области CH2 и области CH3 константной области Igγ4 человека, обладающей вариантами аминокислот из S228P и L235E, включают область CH1, состоящую из аминокислотной последовательности из аминокислот номер 350-447 из SEQ ID NO: 10, область CH2, состоящую из аминокислотной последовательности из аминокислот номер 460-569 из SEQ ID NO: 10, и область CH3, состоящую из аминокислотной последовательности из аминокислот номер 570-676 из SEQ ID NO: 10.

[0037]

Примеры константной области Igκ человека включают константную область Igκ человека, состоящую из аминокислотной последовательности из аминокислот номер 114-219 из SEQ ID NO: 4.

[0038]

Предпочтительно, в случае когда антитело против Tie2 человека по настоящему изобретению представляет собой тандемное антитело, константная область тяжелой цепи представляет собой константную область Igγ1 человека или константную область Igγ4 человека, и константная область легкой цепи представляет собой константную область Igκ человека. В случае, когда константная область тяжелой цепи представляет собой константную область Igγ1 человека, константная область Igγ1 человека предпочтительно представляет собой константную область Igγ1 человека, обладающую вариантами аминокислот из L234A, L235A и P331S, или константную область Igγ1 человека, обладающую вариантами аминокислот из L234A, L235A, P331S и 1253A. В случае, когда константная область тяжелой цепи представляет собой константную область Igγ4 человека, константная область Igγ4 человека предпочтительно представляет собой константную область Igγ4 человека, обладающую вариантами аминокислот из S228P и L235E.

[0039]

В случае, когда антитело против Tie2 человека по настоящему изобретению представляет собой тандемное антитело, в качестве линкера, соединяющего структуры, состоящие из вариабельной области тяжелой цепи и области CH1, можно использовать любой пептид (пептидный линкер) при условии, что антитело обладает такой функцией. Длину и аминокислотную последовательность пептидного линкера может соответствующим образом выбирать специалист в данной области. Пептидный линкер предпочтительно обладает длиной 5-70 аминокислот. Пептидный линкер предпочтительно содержит аминокислотную последовательность шарнирной области или ее часть. Шарнирная область означает область, существующую между областью CH1 и областью CH2 антитела, и примеры шарнирной области, подлежащей использованию, включают шарнирную область IgG1 или IgG3. Часть шарнирной области означает область, обладающую по меньшей мере 5 последовательными аминокислотами в шарнирной области, и предпочтительно, означает область, обладающую по меньшей мере 5 последовательными аминокислотами от N-конца шарнирной области. Примеры части шарнирной области включают область, обладающую 5 последовательными аминокислотами от N-конца (состоящую из аминокислотной последовательности из аминокислот номер 1-5 из SEQ ID NO: 13) в случае шарнирной области IgG1 и область, обладающую 12 последовательными аминокислотами от N-конца (состоящую из аминокислотной последовательности из аминокислот номер 1-12 из SEQ ID NO: 14) в случае шарнирной области IgG3. В одном варианте осуществления линкер содержит аминокислотную последовательность области, обладающей по меньшей мере 5 последовательными аминокислотами от N-конца шарнирной области и содержит аминокислотную последовательность GlySer на C-конце линкера.

Примеры такого линкера включают пептидный линкер, состоящий из аминокислотной последовательности, показанной в любой из SEQ ID NO: 13-20, и линкер предпочтительно состоит из аминокислотной последовательности, показанной в SEQ ID NO: 13.

[0040]

В одном варианте осуществления антитело против Tie2 человека по настоящему изобретению представляет собой антитело против Tie2 человека, обладающее любой из следующих характеристик i)-iv).

i) Антитело против Tie2 человека, содержащее две тяжелые цепи, состоящие из аминокислотной последовательности, показанной в SEQ ID NO: 2, и четыре легкие цепи, состоящие из аминокислотной последовательности, показанной в SEQ ID NO: 4.

ii) Антитело против Tie2 человека, содержащее две тяжелые цепи, состоящие из аминокислотной последовательности, показанной в SEQ ID NO: 6, и четыре легкие цепи, состоящие из аминокислотной последовательности, показанной в SEQ ID NO: 4.

iii) Антитело против Tie2 человека, содержащее две тяжелые цепи, состоящие из аминокислотной последовательности, показанной в SEQ ID NO: 8, и четыре легкие цепи, состоящие из аминокислотной последовательности, показанной в SEQ ID NO: 4.

iv) Антитело против Tie2 человека, содержащее две тяжелые цепи, состоящие из аминокислотной последовательности, показанной в SEQ ID NO: 10, и четыре легкие цепи, состоящие из аминокислотной последовательности, показанной в SEQ ID NO: 4.

Известно, что когда антитело экспрессируется в клетках, антитело модифицируется после трансляции. Примеры посттрансляционной модификации включают отщепление лизина на С-конце тяжелой цепи посредством карбоксипептидазы; модификация глутамина или глутаминовой кислоты на N-конце тяжелой цепи и легкой цепи до пироглутаминовой кислоты посредством пироглутамилирования; гликозилирование; окисление; дезамидирование; и гликирование, и известно, что такие посттрансляционные модификации возникают в различных антителах (Journal of Pharmaceutical Sciences, 2008, Vol. 97, p. 2426-2447).

[0042]

Антитело против Tie2 человека или его антигенсвязывающий фрагмент по настоящему изобретению включают антитело против Tie2 человека или его антигенсвязывающий фрагмент, которые подверглись посттрансляционной модификации. Примеры антитела против Tie2 человека или его антигенсвязывающнго фрагмента по настоящему изобретению, которые подверглись посттрансляционной модификации, включают антитела против Tie2 человека или их антигенсвязывающие фрагменты, которые подверглись пироглутамилированию на N-конце вариабельной области тяжелой цепи и/или делеции лизина на С-конце тяжелой цепи. В данной области известно, что такая посттрансляционная модификация, обусловленная пироглутамилированием на N-конце и делецией лизина на С-конце, не оказывает какого-либо влияния на активность антитела (Analytical Biochemistry, 2006, Vol. 348, p. 24-39).

[0043]

В одном варианте осуществления антитело против Tie2 человека по настоящему изобретению представляет собой антитело против Tie2 человека, обладающее любой из следующих характеристик (1)-(4).

(1) Антитело против Tie2 человека, содержащее две тяжелые цепи, состоящие из аминокислотной последовательности, в которой глутаминовая кислота из аминокислотного номера 1 из SEQ ID NO: 2 модифицирована до пироглутаминовой кислоты, и/или лизин из аминокислотного номера 679 из SEQ ID NO: 2 делетирован, и четыре легкие цепи, состоящие из аминокислотной последовательности, показанной в SEQ ID NO: 4.

(2) Антитело против Tie2 человека, содержащее две тяжелые цепи, состоящие из аминокислотной последовательности, в которой глутаминовая кислота из аминокислотного номера 1 из SEQ ID NO: 6 модифицирована до пироглутаминовой кислоты, и/или лизин из аминокислотного номера 679 из SEQ ID NO: 6 делетирован, и четыре легкие цепи, состоящие из аминокислотной последовательности, показанной в SEQ ID NO: 4.

(3) Антитело против Tie2 человека, содержащее две тяжелые цепи, состоящие из аминокислотной последовательности, в которой глутаминовая кислота из аминокислотного номера 1 из SEQ ID NO: 8 модифицирована до пироглутаминовой кислоты, и/или лизин из аминокислотного номера 679 из SEQ ID NO: 8 делетирован, и четыре легкие цепи, состоящие из аминокислотной последовательности, показанной в SEQ ID NO: 4.

(4) Антитело против Tie2 человека, содержащее две тяжелые цепи, состоящие из аминокислотной последовательности, в которой глутаминовая кислота из аминокислотного номера 1 из SEQ ID NO: 10 модифицирована до пироглутаминовой кислоты, и/или лизин из аминокислотного номера 676 из SEQ ID NO: 10 делетирован, и четыре легкие цепи, состоящие из аминокислотной последовательности, показанной в 5 SEQ ID NO: 4.

[0044]

В одном варианте осуществления антитело против Tie2 человека по настоящему изобретению представляет собой антитело против Tie2 человека, обладающее следующими характеристиками.

Антитело против Tie2 человека, содержащее две тяжелые цепи, состоящие из аминокислотной последовательности из аминокислот номер 1-678 из SEQ ID NO: 2, и четыре легкие цепи, состоящие из аминокислотной последовательности, показанной в SEQ ID NO: 4.

[0045]

Настоящее изобретение, кроме того, относится к антителу против Tie2 человека или его антигенсвязывающему фрагменту, обладающим следующими характеристиками.

Антитело против Tie2 человека или его антигенсвязывающий фрагмент, содержащие четыре вариабельные области тяжелой цепи и четыре вариабельные области легкой цепи,

в которых вариабельная область тяжелой цепи содержит CDR1, состоящую из аминокислотной последовательности из аминокислот номер 31-35 из SEQ ID NO: 2, CDR2, состоящую из аминокислотной последовательности из аминокислот номер 50-66 из SEQ ID NO: 2, и CDR3, состоящую из аминокислотной последовательности из аминокислот номер 99-111 из SEQ ID NO: 2,

вариабельная область легкой цепи содержит CDR1, состоящую из аминокислотной последовательности из аминокислот номер 24-39 из SEQ ID NO: 4, CDR2, состоящую из аминокислотной последовательности из аминокислот номер 55-61 из SEQ ID NO: 4, и CDR3, состоящую из аминокислотной последовательности из аминокислот номер 94-102 из SEQ ID NO: 4, и

одна вариабельная область тяжелой цепи и одна вариабельная область легкой цепи составляют один антигенсвязывающий участок, и антитело или его антигенсвязывающий фрагмент содержат четыре антигенсвязывающих участка.

[0046]

Дополнительно, настоящее изобретение, кроме того, относится к антителу против Tie2 человека, обладающему следующими характеристиками.

Антитело против Tie2 человека, содержащее две тяжелые цепи и четыре легкие цепи, в котором каждая тяжелая цепь содержит две структуры, состоящие из вариабельной области тяжелой цепи, содержащей CDR1, состоящую из аминокислотной последовательности из аминокислот номер 31-35 из SEQ ID NO: 2, CDR2, состоящую из аминокислотной последовательности из аминокислот номер 50-66 из SEQ ID NO: 2, и CDR3, состоящую из аминокислотной последовательности из аминокислот номер 99-111 из SEQ ID NO: 2, и области CH1, области CH2 и области CH3, и карбокси-конец одной из структур связан с амино-концом другой структуры через линкер, и

каждая легкая цепь содержит вариабельную область легкой цепи, содержащую CDR1, состоящую из аминокислотной последовательности из аминокислот номер 24-39 из SEQ ID NO: 4, CDR2, состоящую из аминокислотной последовательности из аминокислот номер 55-61 из SEQ ID NO: 4, и CDR3, состоящую из аминокислотной последовательности из аминокислот номер 94-102 из SEQ ID NO: 4, и константной области легкой цепи.

[0047]

Антитело против Tie2 человека по настоящему изобретению представляет собой антитело, которое связывается с Tie2 человека. Связывается ли антитело с Tie2 человека (No. доступа NP_000450.2), можно подтверждать с использованием известного способа измерения активности связывания. Примеры способа измерения активности связывания включают способ твердофазного иммуноферментного анализа (ELISA) или т.п. В случае использования ELISA, в иллюстративном способе, белок, сформированный посредством слияния Tie2 человека с Fc человека, иммобилизуют на планшете для ELISA, и тестируемое антитело добавляют к ним для реакции. Проводят реакцию вторичного антитела, такого как меченное биотином антитело против IgG, с продуктом реакции, промывают, и затем проводят реакцию со стрептавидином, с которым связан фермент, такой как щелочная фосфатаза. После промывки, можно подтверждать, связывается ли тестируемое антитело с Tie2 человека, посредством проведения измерения активности с использованием детектирующего активность реагента (например, в случае щелочной фосфатазы, хемилюминесцентного Ultra Sensitive AP Microwell и/или мембранного субстрата (450 нм) (BioFX, APU4-0100-01) или т.п.)). В качестве конкретного способа оценки активности, можно использовать, например, такой же способ, как описанный в примере 12, как описано далее.

[0048]

Антитело против Tie2 человека по настоящему изобретению, кроме того, включает антитело, связывающееся с Tie2, происходящим из других животных (например, Tie2 обезьяны) в дополнение к связыванию с Tie2 человека, при условии, что оно представляет собой антитело, связывающееся с Tie2 человека.

[0049]

Предпочтительно, антитело против Tie2 человека по настоящему изобретению связывается с Tie2 человек, и кроме того, обладает антиапоптотической активностью в отношении экспрессирующих Tie2 человека клеток. В качестве конкретного способа для оценки того, обладает ли антитело антиапоптотической активностью в отношении экспрессирующих Tie2 человека клеток, можно использовать, например, такой же способ, как описанный в примере 4, как описано далее.

[0050]

Антитело против Tie2 человека или его антигенсвязывающий фрагмент по настоящему изобретению включают тетравалентное антитело против Tie2 человека или его антигенсвязывающий фрагмент, связывающиеся с таким же эпитопом Tie2 человека, как антитело против Tie2 человека, содержащее две тяжелые цепи, состоящие из аминокислотной последовательности, показанной в SEQ ID NO: 2, и четыре легкие цепи, состоящие из аминокислотной последовательности, показанной в SEQ ID NO: 4, или как антитело против Tie2 человека, содержащее две тяжелые цепи, состоящие из аминокислотной последовательности из аминокислот номер 1-678 из SEQ ID NO: 2 и четыре легкие цепи, состоящие из аминокислотной последовательности, показанной в SEQ ID NO: 4. В настоящем документе, эпитоп относится к участку антигена, узнаваемому антителом.

[0051]

Антитело против Tie2 человека или его антигенсвязывающий фрагмент по настоящему изобретению включают тетравалентное антитело против Tie2 человека или его антигенсвязывающий фрагмент, связывающиеся с эпитопом, содержащим по меньшей мере одну аминокислоту из аминокислот из аминокислотных номеров 192, 195 и 197 Tie2 человека (No. доступа NP_000450.2).

[0052]

Более того, антитело против Tie2 человека или его антигенсвязывающий фрагмент по настоящему изобретению включают тетравалентное антитело против Tie2 человека или его антигенсвязывающий фрагмент, связывающиеся с эпитопом, содержащим аминокислоты из аминокислотных номеров 192, 195 и 197 Tie2 человека (No. доступа NP 000450,2).

[0053]

Тетравалентное антитело против Tie2 человека или его антигенсвязывающий фрагмент, связывающиеся с таким же эпитопом Tie2 человека, как антитело против Tie2 человека, содержащее две тяжелые цепи, состоящие из аминокислотной последовательности, показанной в SEQ ID NO: 2, и четыре легкие цепи, состоящие из аминокислотной последовательности, показанной в SEQ ID NO: 4, или как антитело против Tie2 человека, содержащее две тяжелые цепи, состоящие из аминокислотной последовательности из аминокислот номер 1-678 из SEQ ID NO: 2, и четыре легкие цепи, состоящие из аминокислотной последовательности, показанной в SEQ ID NO: 4, можно получать с использованием известного способа определения эпитопа. Примеры способа определения эпитопа включают масс-спектрометрию с обменом водорода/дейтерия, рентгеновский анализ кристаллической структуры, ELISA и феномен поверхностного плазмонного резонанса с использованием мутанта Tie2 человека с заменой аминокислот, частичного пептида Tie2 человека или т.п., и т.п.

[0054]

Можно проверять, связывается ли тестируемое антитело с таким же эпитопом Tie2 человека, как антитело против Tie2 человека, содержащее две тяжелые цепи, состоящие из аминокислотной последовательности, показанной в SEQ ID NO: 2 и четыре легкие цепи, состоящие из аминокислотной последовательности, показанной в SEQ ID NO: 4, или как антитело против Tie2 человека, содержащее две тяжелые цепи, состоящие из аминокислотной последовательности из аминокислот номер 1-678 из SEQ ID NO: 2, и четыре легкие цепи, состоящие из аминокислотной последовательности, показанной в SEQ ID NO: 4 с использованием хорошо известного способа для определения эпитопа, как описано выше. В случае использования масс-спектрометрии с обменом водорода/дейтерия, каждый из Tie2 человека с заменой на дейтерий в отсутствие тестируемого антитела и Tie2 человека с заменой на дейтерий в присутствии тестируемого антитела разделяют на пептиды, и измеряют количество молекул каждого пептида для расчета отношения замены на дейтерий. Эпитоп Tie2 человека для тестируемого антитела можно определять из различия отношений замены на дейтерий в Tie2 человека в соответствии с присутствием или отсутствием тестируемого антитела. В случае использования ELISA, получают Tie2 человека с точечной мутацией. Мутантный Tie2 человека иммобилизуют, и тестируемое антитело добавляют к нему, чтобы подвергнуть реакции. После реакции, вторичное антитело, такое как меченное биотином антитело против легкой цепи каппа человека, подвергают реакции и отмывке. Затем, меченный щелочной фосфатазой стрептавидин (Thermo Fisher Scientific, 21324) подвергают реакции с ним и отмывке. Затем, можно идентифицировать, связывается или нет тестируемое антитело с мутантным Tie2 человека, посредством проведения измерения активности с использованием хемилюминесцентного Ultra Sensitive AP Microwell и/или мембранного субстрата (450 нм), или т.п. Можно определять эпитоп тестируемого антитела посредством оценки активности связывания с различными типами мутантного Tie2 человека. В случае, когда эпитоп тестируемого антитела содержит по меньшей мере одну аминокислоту в эпитопе антитела против Tie2 человека, содержащего две тяжелые цепи, состоящие из аминокислотной последовательности, показанной в SEQ ID NO: 2, и четыре легкие цепи, состоящие из аминокислотной последовательности, показанной в SEQ ID NO: 4, или антитела против Tie2 человека, содержащего две тяжелые цепи, состоящие из аминокислотной последовательности из аминокислот номер 1-678 из SEQ ID NO: 2, и четыре легкие цепи, состоящие из аминокислотной последовательности, показанной в SEQ ID NO: 4, можно определять, что тестируемое антитело связывается с таким же эпитопом Tie2 человека, как антитело против Tie2 человека, содержащее две тяжелые цепи, состоящие из аминокислотной последовательности, показанной в SEQ ID NO: 2, и четыре легкие цепи, состоящие из аминокислотной последовательности, показанной в SEQ ID NO: 4, или как антитело против Tie2 человека, содержащее тяжелую цепь, состоящую из аминокислотной последовательности из аминокислот номер 1-678 из SEQ ID NO: 2, и легкую цепь, состоящую из аминокислотной последовательности, показанной в SEQ ID NO: 4.

[0055]

Антитело против Tie2 человека или его антигенсвязывающий фрагмент по настоящему изобретению может легко получать специалист в данной области, с использованием способа, известного в данной области, на основании информации о последовательности вариабельной области тяжелой цепи и вариабельной области легкой цепи антитела по настоящему изобретению, как описано в настоящем описании. Антитело против Tie2 человека или его антигенсвязывающий фрагмент по настоящему изобретению не являются конкретно ограниченными, но их можно получать в соответствии со способом, описанным в <Способ получения антитела против Tie2 человека по настоящему изобретению и антитело против Tie2 человека, полученное этим способом>, например, как описано далее.

[0056]

Антитело против Tie2 человека или его антигенсвязывающий фрагмент по настоящему изобретению далее очищают по мере необходимости, и составляют в соответствии с общепринятым способом. Его можно использовать для предотвращения или лечения относящихся к кровеносным сосудам заболеваний, таких как диабетическая ретинопатия, диабетический отек желтого пятна, сепсис, острые повреждения печени, острые повреждения почек, острые повреждения легких, синдром системной воспалительной реакции, окклюзионное заболевание периферических артерий или критическая ишемия конечностей.

[0057]

<Полинуклеотид по настоящему изобретению>

Полинуклеотид по настоящему изобретению включает полинуклеотид, содержащий последовательность оснований, кодирующую вариабельную область тяжелой цепи антитела против Tie2 человека или ее антигенсвязывающий фрагмент по настоящему изобретению, и полинуклеотид, содержащий последовательность оснований, кодирующую вариабельную область легкой цепи антитела против Tie2 человека или ее антигенсвязывающий фрагмент по настоящему изобретению.

[0058]

В одном варианте осуществления полинуклеотид, содержащий последовательность оснований, кодирующую вариабельную область тяжелой цепи антитела против Tie2 человека или ее антигенсвязывающий фрагмент по настоящему изобретению, представляет собой полинуклеотид, содержащий последовательность оснований, кодирующую вариабельную область тяжелой цепи, состоящую из аминокислотной последовательности из аминокислот номер 1-122 из SEQ ID NO: 2.

[0059]

Примеры полинуклеотида, содержащего последовательность оснований, кодирующую вариабельную область тяжелой цепи, показанную в аминокислотной последовательности из аминокислот номер 1-122 из SEQ ID NO: 2, включают полинуклеотид, содержащий последовательность оснований из оснований номер 1-366 из SEQ ID NO: 1.

[0060]

В предпочтительном варианте осуществления полинуклеотид, содержащий последовательность оснований, кодирующую вариабельную область тяжелой цепи антитела против Tie2 человека или ее антигенсвязывающий фрагмент по настоящему изобретению, представляет собой полинуклеотид, содержащий последовательность оснований, кодирующую тяжелую цепь, состоящую из аминокислотной последовательности, показанной в SEQ ID NO: 2, полинуклеотид, содержащий последовательность оснований, кодирующую тяжелую цепь, состоящую из аминокислотной последовательности, показанной в SEQ ID NO: 6, полинуклеотид, содержащий последовательность оснований, кодирующую тяжелую цепь, состоящую из аминокислотной последовательности, показанной в SEQ ID NO: 8, или полинуклеотид, содержащий последовательность оснований, кодирующую тяжелую цепь, состоящую из аминокислотной последовательности, показанной в SEQ ID NO: 10.

[0061]

Примеры полинуклеотида, содержащего последовательность оснований, кодирующую тяжелую цепь, состоящую из аминокислотной последовательности, показанной в SEQ ID NO: 2, включают полинуклеотид, содержащий последовательность оснований, показанную в SEQ ID NO: 1. Примеры полинуклеотида, содержащего последовательность оснований, кодирующую тяжелую цепь, состоящую из аминокислотной последовательности, показанной в SEQ ID NO: 6, включают полинуклеотид, содержащий последовательность оснований, показанную в SEQ ID NO: 5. Примеры полинуклеотида, содержащего последовательность оснований, кодирующую тяжелую цепь, состоящую из аминокислотной последовательности, показанной в SEQ ID NO: 8, включают полинуклеотид, содержащий последовательность оснований, показанную в SEQ ID NO: 7. Примеры полинуклеотида, содержащего последовательность оснований, кодирующую тяжелую цепь, состоящую из аминокислотной последовательности, показанной в SEQ ID NO: 10, включают полинуклеотид, содержащий последовательность оснований, показанную в SEQ ID NO: 9.

[0062]

В одном варианте осуществления полинуклеотид, содержащий последовательность оснований, кодирующую вариабельную область легкой цепи антитела против Tie2 человека или ее антигенсвязывающий фрагмент по настоящему изобретению, представляет собой полинуклеотид, содержащий последовательность оснований, кодирующую вариабельную область легкой цепи, состоящую из аминокислотной последовательности из аминокислот номер 1-113 из SEQ ID NO: 4.

[0063]

Примеры полинуклеотида, содержащего последовательность оснований, кодирующую вариабельную область легкой цепи, показанную в аминокислотной последовательности из аминокислот номер 1-113 из SEQ ID NO: 4, включают полинуклеотид, содержащий последовательность оснований из оснований номер 1-339 из SEQ ID NO: 3.

[0064]

В предпочтительном варианте осуществления полинуклеотид, содержащий последовательность оснований, кодирующую вариабельную область легкой цепи антитела против Tie2 человека или ее антигенсвязывающий фрагмент по настоящему изобретению, представляет собой полинуклеотид, содержащий последовательность оснований, кодирующую легкую цепь, состоящий из аминокислотной последовательности, показанной в SEQ ID NO: 4.

[0065]

Примеры полинуклеотида, содержащего последовательность оснований, кодирующую легкую цепь, состоящую из аминокислотной последовательности, показанной в SEQ ID NO: 4, включают полинуклеотид, содержащий последовательность оснований, показанную в SEQ ID NO: 3.

[0066]

Полинуклеотид по настоящему изобретению может легко получать специалист в данной области с использованием известного в данной области способа на основании последовательности оснований. Например, полинуклеотид по настоящему изобретению можно синтезировать с использованием известного в данной области способа синтеза генов. В качестве способа синтеза генов, можно использовать различные способы, такие как способ синтеза генов антител, описанный в WO90/07861, известные специалисту в данной области. Кроме того, после получения полинуклеотида по настоящему изобретению, можно получать другие полинуклеотиды по настоящему изобретению посредством введения вариантов в предопределенный участок полинуклеотида. В качестве такого способа введения вариантов, можно использовать различные способы, известные специалисту в данной области, такие как способ сайт-специфического мутагенеза (Current Protocols in Molecular Biology edit., 1987, John Wiley & Sons Section 8.1-8.5).

[0067]

<Экспрессирующий вектор по настоящему изобретению>

Экспрессирующий вектор по настоящему изобретению включает полинуклеотид, содержащий последовательность оснований, кодирующую вариабельную область тяжелой цепи антитела против Tie2 человека или ее антигенсвязывающий фрагмент по настоящему изобретению, и/или полинуклеотид, содержащий последовательность оснований, кодирующую вариабельную область легкой цепи антитела против Tie2 человека или ее антигенсвязывающий фрагмент по настоящему изобретению. Тетравалентные антитела в различных форматах и способы их получения хорошо известны в данной области, и экспрессирующий вектор по настоящему изобретению может легко получать специалист в данной области в соответствии с такими способами получения или форматами тетравалентных антител, подлежащих экспрессии.

[0068]

Предпочтительные примеры экспрессирующего вектора по настоящему изобретению включают экспрессирующий вектор, содержащий полинуклеотид, содержащий последовательность оснований, кодирующую тяжелую цепь антитела против Tie2 человека по настоящему изобретению, экспрессирующий вектор, содержащий полинуклеотид, содержащий последовательность оснований, кодирующую легкую цепь антитела против Tie2 человека по настоящему изобретению, и экспрессирующий вектор, содержащий полинуклеотид, содержащий последовательность оснований, кодирующую тяжелую цепь антитела против Tie2 человека по настоящему изобретению, и полинуклеотид, содержащий последовательность оснований, кодирующую легкую цепь антитела.

[0069]

Экспрессирующий вектор, используемый для экспрессии полинуклеотида по настоящему изобретению, не является конкретно ограниченным при условии, что полинуклеотид, содержащий последовательность оснований, кодирующую вариабельную область тяжелой цепи антитела против Tie2 человека или ее антигенсвязывающий фрагмент по настоящему изобретению, и/или полинуклеотид, содержащий последовательность оснований, кодирующую вариабельную область легкой цепи антитела против Tie2 человека или ее антигенсвязывающий фрагмент по настоящему изобретению, можно экспрессировать в различных клетках-хозяевах из эукариотических клеток (например, клеток животных, клеток насекомых, клеток растений и дрожжей) и/или прокариотических клеток (например, Escherichia coli), и можно получать кодируемые ими полипептиды. Примеры экспрессирующего вектора включают плазмидные векторы, вирусные векторы (например, аденовирус, аденоассоциированный вирус, вирус Сендай или ретровирус) и т.п. Предпочтительно, можно использовать pEE6.4 или pEE12.4 (Lonza, Inc.). Кроме того, гены антител можно экспрессировать с использованием экспрессирующих векторов, заранее содержащих гены константной области Ig человека, таких как AG-γ1 или AG-κ (например, см. WO94/20632).

[0070]

Экспрессирующий вектор по настоящему изобретению может содержать промотор, функционально связанный с полинуклеотидом по настоящему изобретению. Примеры промотора для экспрессии полинуклеотида по изобретению с помощью клеток животных, включают промотор, происходящий из вируса, такого как CMV, RSV или SV40, промотор актина, промотор EF (фактора элонгации) 1α и промотор теплового шока. Примеры промоторов для экспрессии с помощью бактерий (например, Escherichia) включают промотор trp, промотор lac, промотор λPL и промотор tac. Кроме того, примеры промоторов для экспрессии с помощью дрожжей включают промотор GAL1, промотор GAL10, промотор PH05, промотор PGK, промотор GAP и промотор ADH.

[0071]

В случае использования клеток животных, клеток насекомых, или дрожжей в качестве клеток-хозяев, экспрессирующий вектор по настоящему изобретению может содержать инициирующий кодон и терминирующий кодон. В этом случае, экспрессирующий вектор по настоящему изобретению может содержать энхансерную последовательность, нетранслируемую область с 5'-стороны и с 3'-стороны от генов, кодирующих антитело по настоящему изобретению или вариабельную область тяжелой цепи, или вариабельную область легкой цепи, секреторную сигнальную последовательность, участок стыковки при сплайсинге, участок полиаденилирования или реплицируемую единицу. Когда Escherichia coli используют в качестве клетки-хозяина, экспрессирующий вектор по настоящему изобретению может содержать инициирующий кодон, терминирующий кодон, терминаторную область и реплицируемую единицу. В этом случае, экспрессирующий вектор по настоящему изобретению может содержать селективный маркер (например, гены устойчивости к тетрациклину, гены устойчивости к ампициллину, гены устойчивости к канамицину, гены устойчивости к неомицину или гены дигидрофолатредуктазы), который, как правило, используют по необходимости.

[0072]

<Трансформированная клетка-хозяин по настоящему изобретению>

Трансформированная клетка-хозяин по настоящему изобретению включает клетку-хозяина, трансформированную экспрессирующим вектором по настоящему изобретению, выбранную из группы, состоящей из (a)-(d) ниже:

(a) клетка-хозяин, трансформированная экспрессирующим вектором, содержащим полинуклеотид, содержащий последовательность оснований, кодирующую вариабельную область тяжелой цепи антитела против Tie2 человека или ее антигенсвязывающий фрагмент по настоящему изобретению, и полинуклеотид, содержащий последовательность оснований, кодирующую вариабельную область легкой цепи антитела или ее антигенсвязывающий фрагмент;

(b) клетка-хозяин, трансформированная экспрессирующим вектором, содержащим полинуклеотид, содержащий последовательность оснований, кодирующую вариабельную область тяжелой цепи антитела против Tie2 человека или ее антигенсвязывающий фрагмент по настоящему изобретению, и экспрессирующим вектором, содержащим полинуклеотид, содержащий последовательность оснований, кодирующую вариабельную область легкой цепи антитела или ее антигенсвязывающий фрагмент;

(c) клетка-хозяин, трансформированная экспрессирующим вектором, содержащим полинуклеотид, содержащий последовательность оснований, кодирующую вариабельную область тяжелой цепи антитела против Tie2 человека или ее антигенсвязывающий фрагмент по настоящему изобретению; и

(d) клетка-хозяин, трансформированная экспрессирующим вектором, содержащим полинуклеотид, содержащий последовательность оснований, кодирующую вариабельную область легкой цепи антитела против Tie2 человека или ее антигенсвязывающий фрагмент по настоящему изобретению.

[0073]

В одном варианте осуществления трансформированная клетка-хозяин по настоящему изобретению представляет собой клетку-хозяина, трансформированную экспрессирующим вектором по настоящему изобретению, выбранную из группы, состоящей из (a)-(d) ниже:

(a) клетка-хозяин, трансформированная экспрессирующим вектором, содержащим полинуклеотид, содержащий последовательность оснований, кодирующую тяжелую цепь антитела против Tie2 человека по настоящему изобретению, и полинуклеотид, содержащий последовательность оснований, кодирующую легкую цепь антитела;

(b) клетка-хозяин, трансформированная экспрессирующим вектором, содержащим полинуклеотид, содержащий последовательность оснований, кодирующую тяжелую цепь антитела против Tie2 человека по настоящему изобретению, и экспрессирующим вектором, содержащим полинуклеотид, содержащий последовательность оснований, кодирующую легкую цепь антитела;

(c) клетка-хозяин, трансформированная экспрессирующим вектором, содержащим полинуклеотид, содержащий последовательность оснований, кодирующую тяжелую цепь антитела против Tie2 человека по настоящему изобретению; и

(d) клетка-хозяин, трансформированная экспрессирующим вектором, содержащим полинуклеотид, содержащий последовательность оснований, кодирующую легкую цепь антитела против Tie2 человека по настоящему изобретению.

[0074]

Предпочтительные примеры трансформированной клетки-хозяина по настоящему изобретению включают клетку-хозяина, трансформированную экспрессирующим вектором, содержащим полинуклеотид, содержащий последовательность оснований, кодирующую тяжелую цепь антитела против Tie2 человека по настоящему изобретению, и полинуклеотид, содержащий последовательность оснований, кодирующую легкую цепь антитела, и клетку-хозяина, трансформированную экспрессирующим вектором, содержащим полинуклеотид, содержащий последовательность оснований, кодирующую тяжелую цепь антитела против Tie2 человека по настоящему изобретению, и экспрессирующим вектором, содержащим полинуклеотид, содержащий последовательность оснований, кодирующую легкую цепь антитела.

[0075]

Трансформированная клетка-хозяин не является конкретно ограниченной при условии, что клетка-хозяин является подходящей для используемого экспрессирующего вектора, трансформирована экспрессирующим вектором, и может экспрессировать антитело. Примеры трансформированной клетки-хозяина включают различные клетки, такие как природные клетки или искусственно полученные клетки, которые являются общепринятыми в области настоящего изобретения (например, клетки животных (например, клетки CHO-K1SV), клетки насекомых (например, Sf9), бактерии (например, Escherichia), дрожжи (например, Saccharomyces или Pichia) или т.п.). Предпочтительно, можно использовать культивируемые клетки, такие как клетки CHO (клетки CHO-K1 SV, клетки CHO-DG 44 или т.п.), клетки 293 или клетки NS0.

[0076]

Способ трансформации клетки-хозяина не является конкретно ограниченным, однако можно использовать, например, способ с фосфатом кальция или способ электропорации.

[0077]

<Способ получения антитела против Tie2 человека по настоящему изобретению и антитело против Tie2 человека, полученное этим способом>

Примеры способа получения антитела против Tie2 человека или его антигенсвязывающего фрагмента по настоящему изобретению включают способ получения антитела против Tie2 человека или его антигенсвязывающего фрагмента, включающий культивирование клетки-хозяина(клеток-хозяев), выбранной из группы, состоящей из (a)-(c) ниже, для экспрессии тетравалентного антитела против Tie2 человека или его антигенсвязывающего фрагмента:

(a) клетка-хозяин, трансформированная экспрессирующим вектором, содержащим полинуклеотид, содержащий последовательность оснований, кодирующую вариабельную область тяжелой цепи антитела против Tie2 человека или ее антигенсвязывающий фрагмент по настоящему изобретению, и полинуклеотид, содержащий последовательность оснований, кодирующую вариабельную область легкой цепи антитела или его антигенсвязывающий фрагмент;

(b) клетка-хозяин, трансформированная экспрессирующим вектором, содержащим полинуклеотид, содержащий последовательность оснований, кодирующую вариабельную область тяжелой цепи антитела против Tie2 человека или ее антигенсвязывающий фрагмент по настоящему изобретению, и экспрессирующим вектором, содержащим полинуклеотид, содержащий последовательность оснований, кодирующую вариабельную область легкой цепи антитела или ее антигенсвязывающий фрагмент; и

(c) клетка-хозяин, трансформированная экспрессирующим вектором, содержащим полинуклеотид, содержащий последовательность оснований, кодирующую вариабельную область тяжелой цепи антитела против Tie2 человека или ее антигенсвязывающий фрагмент по настоящему изобретению, и клетка-хозяин, трансформированная экспрессирующим вектором, содержащим полинуклеотид, содержащий последовательность оснований, кодирующую вариабельную область легкой цепи антитела или ее антигенсвязывающий фрагмент.

[0078]

В одном варианте осуществления, примеры способа получения антитела против Tie2 человека по настоящему изобретению включают способ получения антитела против Tie2 человека, включающий культивирование клетки-хозяина(клеток-хозяев), выбранной из группы, состоящей из (a)-(c) ниже, для экспрессии антитела против Tie2 человека:

(a) клетка-хозяин, трансформированная экспрессирующим вектором, содержащим полинуклеотид, содержащий последовательность оснований, кодирующую тяжелую цепь антитела против Tie2 человека по настоящему изобретению, и полинуклеотид, содержащий последовательность оснований, кодирующую легкую цепь антитела;

(b) клетка-хозяин, трансформированная экспрессирующим вектором, содержащим полинуклеотид, содержащий последовательность оснований, кодирующую тяжелую цепь антитела против Tie2 человека по настоящему изобретению, и экспрессирующим вектором, содержащим полинуклеотид, содержащий последовательность оснований, кодирующую легкую цепь антитела; и

(c) клетка-хозяин, трансформированная экспрессирующим вектором, содержащим полинуклеотид, содержащий последовательность оснований, кодирующую тяжелую цепь антитела против Tie2 человека по настоящему изобретению, и клетка-хозяин, трансформированная экспрессирующим вектором, содержащим полинуклеотид, содержащий последовательность оснований, кодирующую легкую цепь антитела.

[0079]

Способ получения антитела против Tie2 человека по настоящему изобретению не является конкретно ограниченным при условии, что он включает стадию культивирования трансформированных клеток-хозяев по настоящему изобретению для экспрессии антитела против Tie2 человека. Примеры предпочтительных клеток-хозяев для применения в способе включают предпочтительные трансформированные клетки-хозяева по настоящему изобретению, как описано выше.

[0080]

Трансформированную клетку-хозяина можно культивировать известными способами. Условия культивирования, например, температуру, pH среды для культивирования и время культивирования выбирают соответствующим образом. В случае, когда клетка-хозяин представляет собой клетку животного, примеры среды для культивирования включают среду для культивирования MEM, дополненную приблизительно от 5% до 20% эмбриональной бычьей сыворотки (Science, 1959, Vol. 130, No. 3373, p. 432 to 7), среду для культивирования DMEM (Virology, 1959, Vol. 8, p. 396) и среду для культивирования RPMI1640 (J. Am. 25 Mde. Assoc., 1967, Vol. 199, p. 519), среду для культивирования 199 (Exp. Biol. Med., 1950, Vol. 73, p. 1 to 8). pH среды для культивирования предпочтительно составляет приблизительно от 6 до 8, и культивирование, как правило, проводят при приблизительно 30°C-40°C в течение приблизительно 15 часов - 72 часов при воздушной вентиляции и перемешивании, при необходимости. В случае, когда клетка-хозяин представляет собой клетку насекомого, в качестве среды для культивирования, можно использовать, например, среду для культивирования Грейса (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1985, Vol. 82, p. 8404), дополненную эмбриональной бычьей сывороткой. pH среды для культивирования предпочтительно составляет приблизительно от 5 до 8, и культивирование, как правило, проводят при приблизительно 20°C - 40°C в течение приблизительно 15 часов - 100 часов при воздушной вентиляции и перемешивании, при необходимости. В случае, когда клетка-хозяин представляет собой Escherichia coli или дрожжи, в качестве среды для культивирования подходит, например, жидкая среда для культивирования, дополненная источником питательных веществ. Является предпочтительным, чтобы питательная среда для культивирования содержала источник углерода, неорганический источник азота или органический источник азота, необходимые для роста трансформированной клетки-хозяина. Примеры источника углерода включают глюкозу, декстран, растворимый крахмал и сахарозу, и примеры неорганического источника азота или органического источника азота включают соли аммония, соли нитраты, аминокислоты, жидкий кукурузный экстракт, пептон, казеин, мясной экстракт, жмых соевых бобов и картофельный экстракт. Другие питательные вещества (например, неорганические соли (например, хлорид кальция, дигидрофосфат натрия и хлорид магния), витамины) и антибиотики (например, тетрациклин, неомицин, ампициллин и канамицин) можно включать при желании. pH среды для культивирования предпочтительно составляет приблизительно от 5 до 8. В случае, когда клетка-хозяин представляет собой Escherichia coli, предпочтительные примеры среды для культивирования включают среду для культивирования LB и среду для культивирования M9 (Mol. Clo., Cold Spring Harbor Laboratory, Vol. 3, A2.2). Культивирование, как правило, проводят при приблизительно 14°C - 39°C в течение приблизительно 3 часов - 24 часов при воздушной вентиляции и перемешивании, при необходимости. В случае, когда клетка-хозяин представляет собой дрожжи, в качестве среды для культивирования, можно использовать, например, минимальную среду Буркхолдера (Proc. Natl. Acad, Sci, USA, 1980, Vol. 77, p. 4505). Культивирование, как правило, проводят при приблизительно 20°C - 35°C в течение приблизительно 14 часов - 144 часов при воздушной вентиляции и перемешивании, при необходимости. Посредством проведения культивирования описанным выше образом, можно экспрессировать антитело против Tie2 человека или его антигенсвязывающий фрагмент по настоящему изобретению.

[0081]

Способ получения антитела против Tie2 человека или его антигенсвязывающего фрагмента по настоящему изобретению может включать извлечение, предпочтительно, выделение или очистку, антитела против Tie2 человека или его антигенсвязывающего фрагмента из трансформированной клетки-хозяина в дополнение к культивированию трансформированной клетки-хозяина по настоящему изобретению для экспрессии антитела против Tie2 человека или его антигенсвязывающего фрагмента. Примеры способа выделения или очистки включают способы с использованием растворимости, такие как высаливание и способ осаждения растворителем, способы с использованием различий в молекулярной массе, такие как диализ, ультрафильтрация и гель-фильтрация, способы с использованием электрического заряда, такие как ионообменная хроматография и хроматография на гидроксилапатите, способы с использованием специфической аффинности, такие как аффинная хроматография, способы с использованием различий в гидрофобности, такие как обращеннофазовая высокоэффективная жидкостная хроматография, и способы с использованием различий в изоэлектрической точке, такие как форез с изоэлектрическим фокусированием. Предпочтительно, антитело, накопленное в культуральном супернатанте, можно очищать посредством различных видов хроматографии, например, хроматографии на колонке с использованием колонки с белком A или колонки с белком G.

[0082]

Антитело против Tie2 человека или его антигенсвязывающий фрагмент по настоящему изобретению включают также антитело против Tie2 человека или его антигенсвязывающий фрагмент, полученные способом получения антитела против Tie2 человека или его антигенсвязывающего фрагмента по настоящему изобретению.

[0083]

<Фармацевтическая композиция по настоящему изобретению>

Фармацевтические композиции по настоящему изобретению включают фармацевтическую композицию, содержащую антитело против Tie2 человека или его антигенсвязывающий фрагмент по настоящему изобретению и фармацевтически приемлемые наполнители. Фармацевтическую композицию по настоящему изобретению можно получать общепринятым способом, с использованием общепринятых в данной области наполнителей, то есть, наполнителей для медицины или носителей для медицины. Примеры лекарственных форм фармацевтических композиций включают парентеральное лекарственное средство, такое как лекарственное средство для инъекции и лекарственное средство для капельной инфузии, и их можно вводить посредством внутривенного введения, подкожного введения, внутриглазного введения или т.п. При получении лекарственного средства, наполнители, носители и добавки в соответствии с лекарственными формами можно использовать в пределах фармацевтически приемлемого диапазона.

[0084]

Фармацевтические композиции по настоящему изобретению могут содержать множество видов антител против Tie2 человека или их антигенсвязывающих фрагментов по настоящему изобретению. Например, настоящее изобретение включает фармацевтическую композицию, содержащую антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, не подвергнутые посттрансляционной модификации, и антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, полученные в результате посттрансляционной модификации антитела или его антигенсвязывающего фрагмента.

[0085]

В одном варианте осуществления фармацевтическая композиция по настоящему изобретению, содержащая антитело против Tie2 человека или его антигенсвязывающий фрагмент, включает фармацевтическую композицию, как описано ниже.

Фармацевтическая композиция, содержащая антитело против Tie2 человека или его антигенсвязывающий фрагмент, в которой антитело против Tie2 человека или его антигенсвязывающий фрагмент содержит четыре вариабельные области тяжелой цепи и четыре вариабельные области легкой цепи, вариабельная область тяжелой цепи состоит из аминокислотной последовательности из аминокислот номер 1-122 из SEQ ID NO: 2, вариабельная область легкой цепи состоит из аминокислотной последовательности из аминокислот номер 1-113 из SEQ ID NO: 4, одна вариабельная область тяжелой цепи и одна вариабельная область легкой цепи составляют один антигенсвязывающий участок, и антитело или его антигенсвязывающий фрагмент содержит четыре антигенсвязывающих участка, и антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, полученные в результате посттрансляционной модификации антитела или его антигенсвязывающего фрагмента.

[0086]

В одном варианте осуществления фармацевтическая композиция, содержащая антитело против Tie2 человека по настоящему изобретению, включает фармацевтическую композицию, как описано ниже.

Фармацевтическая композиция, содержащая антитело против Tie2 человека, представляющее собой антитело против Tie2 человека, и антитело сформировано посредством посттрансляционной модификации антитела, содержащего две тяжелые цепи и четыре легкие цепи, в котором каждая тяжелая цепь содержит две структуры, состоящие из вариабельной области тяжелой цепи, состоящей из аминокислотной последовательности из аминокислот номер 1-122 из SEQ ID NO: 2, и области CH1, области CH2 и области CH3, и C-конец одной из структур связан с N-концом другой структуры через линкер, и каждая легкая цепь содержит вариабельную область легкой цепи, состоящую из аминокислотной последовательности из аминокислот номер 1-113 из SEQ ID NO: 4, и константную область легкой цепи, и антитело содержит четыре антигенсвязывающих участка, и антитело, полученное в результате посттрансляционной модификации антитела.

[0087]

Фармацевтические композиции по настоящему изобретению включают также фармацевтическую композицию, содержащую антитело, в котором лизин на C-конце тяжелой цепи делетирован, антитело или его антигенсвязывающий фрагмент с посттрансляционной модификацией N-конца, антитело, в котором лизин на C-конце тяжелой цепи делетирован и выполнена посттрансляционная модификация N-конца, и/или антитело, имеющее лизин на C-конце тяжелой цепи и не имеющее посттрансляционной модификации на N-конце.

[0088]

В одном варианте осуществления, фармацевтическая композиция по настоящему изобретению, содержащая антитело против Tie2 человека, включает фармацевтическую композицию, содержащую по меньшей мере два вида антител против Tie2 человека, выбранных из (1)-(4) ниже.

(1) Антитело против Tie2 человека, содержащее две тяжелые цепи, состоящие из аминокислотной последовательности из аминокислот номер 1-678 из SEQ ID NO: 2, и четыре легкие цепи, состоящие из аминокислотной последовательности, показанной в SEQ ID NO: 4.

(2) Антитело против Tie2 человека, содержащее две тяжелые цепи, состоящие из аминокислотной последовательности из SEQ ID NO: 2, в которой глутаминовая кислота из аминокислотного номера 1 модифицирована до пироглутаминовой кислоты, и четыре легкие цепи, состоящие из аминокислотной последовательности, показанной в SEQ ID NO: 4.

(3) Антитело против Tie2 человека, содержащее две тяжелые цепи, состоящие из аминокислотной последовательности из аминокислот номер 1-678 из SEQ ID NO: 2, в которой глутаминовая кислота из аминокислотного номера 1 модифицирована до пироглутаминовой кислоты, и четыре легкие цепи, состоящие из аминокислотной последовательности, показанной в SEQ ID NO: 4.

(4) Антитело против Tie2 человека, содержащее две тяжелые цепи, состоящие из аминокислотной последовательности, показанной в SEQ ID NO: 2, и четыре легкие цепи, состоящие из аминокислотной последовательности, показанной в SEQ ID NO: 4.

[0089]

В одном варианте осуществления фармацевтическая композиция по настоящему изобретению, содержащая антитело против Tie2 человека, включает фармацевтическую композицию, содержащую по меньшей мере два вида антител против Tie2 человека, выбранных из (1)-(4) ниже.

(1) Антитело против Tie2 человека, содержащее две тяжелые цепи, состоящие из аминокислотной последовательности из аминокислот номер 1-678 из SEQ ID NO: 6, и четыре легкие цепи, состоящие из аминокислотной последовательности, показанной в SEQ ID NO: 4.

(2) Антитело против Tie2 человека, содержащее две тяжелые цепи, состоящие из аминокислотной последовательности из SEQ ID NO: 6, в которой глутаминовая кислота из аминокислотного номера 1 модифицирована до пироглутаминовой кислоты, и четыре легкие цепи, состоящие из аминокислотной последовательности, показанной в SEQ ID NO: 4.

(3) Антитело против Tie2 человека, содержащее две тяжелые цепи, состоящие из аминокислотной последовательности из аминокислот номер 1-678 из SEQ ID NO: 6, в которой глутаминовая кислота из аминокислотного номера 1 модифицирована до пироглутаминовой кислоты, и четыре легкие цепи, состоящие из аминокислотной последовательности, показанной в SEQ ID NO: 4.

(4) Антитело против Tie2 человека, содержащее две тяжелые цепи, состоящие из аминокислотной последовательности, показанной в SEQ ID NO: 6, и четыре легкие цепи, состоящие из аминокислотной последовательности, показанной в SEQ ID NO: 4.

[0090]

В одном варианте осуществления, фармацевтическая композиция по настоящему изобретению, содержащая антитело против Tie2 человека, включает фармацевтическую композицию, содержащую по меньшей мере два вида антител против Tie2 человека, выбранных из (1)-(4) ниже.

(1) Антитело против Tie2 человека, содержащее две тяжелые цепи, состоящие из аминокислотной последовательности из аминокислот номер 1-678 из SEQ ID NO: 8, и четыре легкие цепи, состоящие из аминокислотной последовательности, показанной в SEQ ID NO: 4.

(2) Антитело против Tie2 человека, содержащее две тяжелые цепи, состоящие из аминокислотной последовательности из SEQ ID NO: 8, в которой глутаминовая кислота из аминокислотного номера 1 модифицирована до пироглутаминовой кислоты, и четыре легкие цепи, состоящие из аминокислотной последовательности, показанной в SEQ ID NO: 4.

(3) Антитело против Tie2 человека, содержащее две тяжелые цепи, состоящие из аминокислотной последовательности из аминокислот номер 1-678 из SEQ ID NO: 8, в которой глутаминовая кислота из аминокислотного номера 1 модифицирована до пироглутаминовой кислоты, и четыре легкие цепи, состоящие из аминокислотной последовательности, показанной в SEQ ID NO: 4.

(4) Антитело против Tie2 человека, содержащее две тяжелые цепи, состоящие из аминокислотной последовательности, показанной в SEQ ID NO: 8, и четыре легкие цепи, состоящие из аминокислотной последовательности, показанной в SEQ ID NO: 4.

[0091]

В одном варианте осуществления фармацевтическая композиция по настоящему изобретению, содержащая антитело против Tie2 человека, включает фармацевтическую композицию, содержащую по меньшей мере два вида антител против Tie2 человека, выбранных из (1)-(4) ниже.

(1) Антитело против Tie2 человека, содержащее две тяжелые цепи, состоящие из аминокислотной последовательности из аминокислот номер 1-675 из SEQ ID NO: 10, и четыре легкие цепи, состоящие из аминокислотной последовательности, показанной в SEQ ID NO: 4.

(2) Антитело против Tie2 человека, содержащее две тяжелые цепи, состоящие из аминокислотной последовательности из SEQ ID NO: 10, в которой глутаминовая кислота из аминокислотного номера 1 модифицирована до пироглутаминовой кислоты, и четыре легкие цепи, состоящие из аминокислотной последовательности, показанной в SEQ ID NO: 4.

(3) Антитело против Tie2 человека, содержащее две тяжелые цепи, состоящие из аминокислотной последовательности из аминокислот номер 1-675 из SEQ ID NO: 10, в которой глутаминовая кислота из аминокислотного номера 1 модифицирована до пироглутаминовой кислоты, и четыре легкие цепи, состоящие из аминокислотной последовательности, показанной в SEQ ID NO: 4.

(4) Антитело против Tie2 человека, содержащее две тяжелые цепи, состоящие из аминокислотной последовательности, показанной в SEQ ID NO: 10, и четыре легкие цепи, состоящие из аминокислотной последовательности, показанной в SEQ ID NO: 4.

[0092]

В одном варианте осуществления фармацевтическая композиция по настоящему изобретению, содержащая антитело против Tie2 человека или его антигенсвязывающий фрагмент, включает также фармацевтическую композицию, как описано ниже.

Фармацевтическая композиция, содержащая антитело против Tie2 человека, содержащее две тяжелые цепи, состоящие из аминокислотной последовательности, показанной в SEQ ID NO: 2, и четыре легкие цепи, состоящие из аминокислотной последовательности, показанной в SEQ ID NO: 4, антитело против Tie2 человека, содержащее две тяжелые цепи, состоящие из аминокислотной последовательности из аминокислот номер 1-678 из SEQ ID NO: 2, и четыре легкие цепи, состоящие из аминокислотной последовательности, показанной в SEQ ID NO: 4, и фармацевтически приемлемый наполнитель.

[0093]

Количество антитела против Tie2 человека или его антигенсвязывающего фрагмента по настоящему изобретению, добавленного в состав, меняется в зависимости от степени симптомов и возраста пациента, лекарственной формы препарата, подлежащего использованию, титра связывания антитела или т.п., и можно использовать, например, количество, добавленное от приблизительно 0,001 мг/кг до 100 мг/кг.

[0094]

Фармацевтическую композицию по настоящему изобретению можно использовать в качестве средства для предотвращения или лечения относящихся к кровеносным сосудам заболеваний, например, диабетической ретинопатии, диабетического отека желтого пятна, сепсиса, острых повреждений печени, острых повреждений почек, острых повреждений легких, синдрома системной воспалительной реакции, окклюзионного заболевания периферических артерий или критической ишемии конечностей.

[0095]

Настоящее изобретение относится к фармацевтической композиции для предотвращения или лечения диабетического отека желтого пятна, диабетической ретинопатии или критической ишемии конечностей, содержащей антитело против Tie2 человека по настоящему изобретению. Кроме того, настоящее изобретение относится к способу для предотвращения или лечения диабетического отека желтого пятна, диабетической ретинопатии, или критической ишемии конечностей, включающей введение терапевтически эффективного количества антитела против Tie2 человека по настоящему изобретению. Кроме того, настоящее изобретение относится к антителу против Tie2 человека по настоящему изобретению для применения в предотвращении или лечении диабетического отека желтого пятна, диабетической ретинопатии или критической ишемии конечностей. Кроме того, настоящее изобретение относится к применению антитела против Tie2 человека по настоящему изобретению для получения фармацевтической композиции для предотвращения или лечения диабетического отека желтого пятна, диабетической ретинопатии, или критической ишемии конечностей.

[0096]

<Слитое антитело и модификация антитела>

Любой специалист в данной области может получить слитое антитело, в котором антитело или его антигенсвязывающий фрагмент слиты с другим пептидом или белком, и может также получать модификацию антитела, в которой модифицирующее средство связано с использованием известного в данной области способа. Антитело против Tie2 человека или его антигенсвязывающий фрагмент по настоящему изобретению включает антитело и его антигенсвязывающий фрагмент в форме такого слитого белка или модификации. Например, антитело против Tie2 человека или его антигенсвязывающий фрагмент, содержащие четыре вариабельные области тяжелой цепи и четыре вариабельные области легкой цепи, в которых вариабельная область тяжелой цепи состоит из аминокислотной последовательности из аминокислот номер 1-122 из SEQ ID NO: 2, вариабельная область легкой цепи состоит из аминокислотной последовательности из аминокислот номер 1-113 из SEQ ID NO: 4, одна вариабельная область тяжелой цепи и одна вариабельная область легкой цепи составляют один антигенсвязывающий участок, и антитело или его антигенсвязывающий фрагмент содержат четыре антигенсвязывающий участка, включает антитело против Tie2 человека или его антигенсвязывающий фрагмент, слитые с другим пептидом или белком, и антитело против Tie2 человека или его антигенсвязывающий фрагмент, обладающие связанным с ними модифицирующим средством. Другой пептид или белок для применения в слиянии не являются конкретно ограниченными при условии, что антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по настоящему изобретению в форме слитого белка обладают активностью связывания с Tie2 человека, и их примеры включают человеческий сывороточный альбумин, различные пептиды-метки, искусственные пептиды с мотивом спирали, связывающий мальтозу белок, глутатион-S-трансферазу, различные токсины, и другие пептиды или белки, способные стимулировать мультимеризацию. Модифицирующее средство для применения в модификации не является конкретно ограниченным при условии, что антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по настоящему изобретению в форме модифицированного антитело обладают активностью связывания с Tie2 человека, и его примеры включают полиэтиленгликоль, сахарные цепи, фосфолипиды, липосомы и низкомолекулярные соединения.

[0097]

Настоящее изобретение описано, и представлены конкретные примеры, указанные для лучшего понимания, но они представляют собой просто примеры, и настоящее изобретение не ограничено ими.

Примеры

[0098]

Что касается аспектов с использованием коммерчески доступных наборов или реагентов, эксперименты проводили в соответствии с описанным способом, если конкретно не указано иначе. Для удобства, концентрация в моль/л представлена как M. Например, 1 M водный раствор оксида натрия означает водный раствор оксида натрия 1 моль/л.

[0099]

(Пример 1: Получение гибридомы, продуцирующей антитело против Tie2 человека)

Антитело получали с использованием мышей «VelocImmune» (Технология антител VelocImmune: Regeneron, Inc. (Патент США No. 6596541)) -технология разработки человеческих моноклональных антител. Рекомбинантный химерный белок Tie2-Fc человека (R&D, 313-TI-100) инъецировали мыши VelocImmune, вместе с адъювантом для вызова иммунного ответа, так чтобы провести иммунизацию. В соответствии с обычным способом, лимфоузел иммунизированной мыши выделяли, и лимфоциты собирали и проводили слияние клеток с клетками миеломы мышиного происхождения SP2/0 (ATCC: CRL-1581), таким образом получая гибридому. Получали моноклоны гибридомы, и каждый клон культивировали в среде для гибридом CD (Invitrogen), представляющей собой бессывороточную среду для культивирования. Антитело очищали из полученного культурального супернатанта с использованием колонки с белком G (GE Healthcare). Антитело, полученное с использованием технологии VelocImmune, представляет собой антитело, обладающее вариабельной областью человеческого антитела и константной областью мышиного антитела (обозначено также как химерное антитело).

[0100]

(Пример 2: Анализ ELISA клеток)

Для измерения антигенсвязывающей активности антитела, связывание антитела с каждым из Tie2 человека, Tie2 обезьяны, Tie2 крысы и Tie2 мыши оценивали посредством анализа ELISA клеток с использованием экспрессирующих Tie2 человека клеток CHO, экспрессирующих Tie2 обезьяны клеток CHO, экспрессирующих Tie2 крысы клеток CHO и экспрессирующих Tie2 мыши клеток CHO.

[0101]

(Пример 3: Оценка конкурентной активности с использованием модифицированного Ang-1)

Для оценки активности антитела в конкуренции с Ang-2, оценивали ингибирование связывания модифицированного Ang-1 (Proc. Natl. Acad. Sci., 2004, Vol. 101, pp. 5547-5552, также обозначаемого как COMP-Ang1.) с Tie2. COMP-Ang1 представляет собой модифицированный Ang-1, в котором участок, не участвующий в связывании с Tie2, модифицирован, и конкурентное действие против Ang-2 можно оценивать посредством оценки конкурентного действия против COMP-Ang1 с той точки зрения, что способность COMP-Ang1 связываться с Tie2 сохраняется (Proc. Natl. Acad. Sci. 2004, Vol. 101, pp. 5547-5552), и Ang-1 и Ang-2 связываются с одним и тем же участком Tie2 с таким же уровнем аффинности (Science, 1997, Vol. 277, pp. 55-60).

[0102]

Вектор, экспрессирующий COMP-Ang1, вводили в клетку HEK293. COMP-Ang1 очищали из культурального супернатанта клеток HEK293 и метили биотином. Меченный биотином COMP-Ang1 и очищенное антитело, полученное в примере 1, смешивали, и смесь добавляли в планшет с иммобилизованным рекомбинантным химерным белком Tie2-Fc человека. Для детекции меченного биотином COMP-Ang1, связанного таким образом, использовали меченную стрептавидином HRP. К этому добавляли реагент TMB для проявления окрашивания (Dako, SI599) и оставляли стоять. Затем, к этому добавляли 2 M серную кислоту для остановки реакции и измеряли оптическую плотность при 450 нм. Таким образом, оценивали конкурентное действие антитела против COMP-Ang1.

[0103]

(Пример 4: Оценка антиапоптотической активности с использованием экспрессирующих Tie2 человека клеток BaF3)

Линию про-B-клеток мыши BaF3, стабильно экспрессирующих Tie2 человека (далее в настоящем документе также обозначаемых экспрессирующие Tie2 человека клетки BaF3), получали посредством введения плазмиды, содержащей ген Tie2 человека, показанный в SEQ ID NO: 21, в клетки способом электропорации, описанным в Immunity, 1998, Vol. 9, pp. 677-686. Далее в настоящем документе, антиапоптотическую активность антитела оценивали с использованием таких же клеток.

[0104]

Экспрессирующие Tie2 человека клетки BaF3 суспендировали в среде RPMI1640 (Life Technologies), дополненной 0,05% фетальным бычьим сывороточным альбумином, при 2×10⁵ клеток/мл, и распределяли в количестве 80 мкл на лунку в 96-луночный планшет для плавающих клеток (Sumitomo Bakelite Co., Ltd., MS-8096R). Затем к этому добавляли 20 мкл очищенного антитела, полученного в примере 1, или Ang-1. После культивирования в течение 72 часов в инкубаторе с CO₂, установленном на 37°C, 50 мкл суспензии клеток переносили в белый 96-луночный планшет (Nunc, 236108). В соответствии с описанием набора реагентов для определения количества внутриклеточного АТФ CellTiter Glo Luminescent Cell Viability Kit (Promega), посредством добавления 50 мкл раствора субстрата, разведенного прилагаемым буфером, к суспензии клеток, измеряли жизнеспособность клеток, таким образом оценивая антиапоптотическую активность.

[0105]

По результатам примеров 2-4, обнаружены антитела против Tie2 человека, обладающие активностью связывания с Tie2 человека, Tie2 обезьяны, Tie2 крысы и Tie2 мыши, активностью конкуренции с COMP-Ang1 и антиапоптотической активностью. Раствор очищенных антител, содержащий антитело против Tie2 человека, обозначенное 2-16, описанное далее, обладал по существу такой же антиапоптотической активностью, как Ang-1 в примере 4, однако раствор очищенных антител, содержащий антитело мыши против Tie2 человека 15B8 (Патентный документ 1), обладал только приблизительно 60% от максимальной активности Ang-1.

[0106]

(Пример 5: Анализ раствора очищенных антител с использованием эксклюзионной хроматографии и электрофореза)

Растворы очищенных антител, идентифицированных в примерах 2-4 выше, анализировали посредством эксклюзионной хроматографии. В результате, три фракции детектировали в соответствующих растворах очищенных антител. В результате анализа растворов соответствующих фракций посредством электрофореза, обнаружено, что соответствующие фракции включают мономеры, димеры, тримеры или обладающие более высокой валентностью мультимеры антител, соответственно.

[0107]

Затем, растворы соответствующих фракций оценивали в отношении антиапоптотической активности способом, показанным в примере 4. В результате в фракциях, содержащих димеры, и в фракциях, содержащих тримеры или мультимеры с более высокой валентностью, обнаружена сильная антиапоптотическая активность. С другой стороны, в фракциях, содержащих мономеры соответствующих антител, антиапоптотическая активность по существу не обнаружена. 15B8 анализировали также посредством эксклюзионной хроматографии, как описано выше, и в результате, детектировали фракции, обладающие димерами или мультимерами с более высокой валентностью, но фракций, содержащих мономеры, по существу не детектировали.

[0108]

Из вышеуказанного, обнаружено, что в любом антителе, идентифицированном в примерах 2-4, фракции, содержащие антитела, сформированные в димеры или мультимеры более высокого порядка, обладали сильной антиапоптотической активностью. Полагают, что антитела, имеющие четыре или более валентности, обладают сильной антиапоптотической активностью посредством активации Tie2, поскольку димер представляет собой тетравалентное антитело.

[0109]

(Пример 6: Оценка антиапоптотической активности посредством перекрестно сшитого антитела)

Из исследований в примере 5, заключили, что доведение валентности антитела против Tie2 человека до 4 или выше является важным для индукции антиапоптотической активности посредством Tie2. Таким образом, оценивали антиапоптотическую активность антитела против Tie2 человека, которое подвергали мультимеризации посредством проведения перекрестного связывания с антителом против IgG мыши. В качестве клеток, использовали экспрессирующие Tie2 человека клетки BaF3 и клетки эндотелия сосудов человека HUVEC, эндогенно экспрессирующие Tie2 человека.

[0110]

Экспрессирующие Tie2 человека клетки BaF3 и HUVEC культивировали в среде RPMI1640 и в бессывороточной среде EBM-2 (Lonza), соответственно, к ним добавляли раствор антител, содержащий антитела против Tie2 человека, идентифицированные в примерах 2-4. К этому добавляли антитело против IgG мыши для перекрестного сшивания антител. С использованием люминесцентного анализа жизнеспособности клеток CellTiter Glo Luminescent Viability, измеряли жизнеспособность клеток. Посредством измерения жизнеспособности, оценивали антиапоптотическую активность.

[0111]

В результате обнаружено, что перекрестно сшитое антитело с антителом против Tie2 человека (химерное антитело), обозначенное 2-16, обладает сильной антиапоптотической активностью по отношению к Tie2 человека.

[0112]

(Пример 7: Секвенирование двухвалентного антитела против Tie2 человека)

Ген, кодирующий тяжелую и легкую цепи антитела, клонировали из гибридомы, продуцирующей антитело против Tie2 человека 2-16, и секвенировали.

[0113]

После секвенирования антитела, каркасную область (FR) легкой и тяжелой цепей 2-16 заменили на FR из другого человеческого антитела, чтобы улучшить физические свойства и стабильность антитела, таким образом, получая модифицированную вариабельную область антитела против Tie2 человека 2-16A2.

[0114]

Ген, кодирующий сигнальную последовательность (Protein Engineering, 1987, Vol. 1, No.6, pp. 499-505), и ген константной области Igγ1 человека (состоящий из последовательности оснований из оснований номер 367-1356 из SEQ ID NO: 11), присоединяли с 5'-стороны и 3'-стороны, соответственно, к гену вариабельной области тяжелой цепи 2-16A2, и ген тяжелой цепи вставляли в вектор GS pEE6.4. Затем ген, кодирующий сигнальную последовательность (Protein Engineering, 1987, Vol. 1, No.6, pp. 499-505), и ген константной области (состоящий из последовательности оснований из оснований номер 340-657 из SEQ ID NO: 3) цепи κ человека, присоединяли с 5'-стороны и 3'-стороны, соответственно, к гену вариабельной области легкой цепи. Этот ген легкой цепи вставляли в вектор GS pEE12.4. Последовательность гена тяжелой цепи и последовательность гена легкой цепи полученного антитела анализировали с использованием секвенатора.

[0115]

Последовательность оснований тяжелой цепи полностью человеческого антитела 2-16A2 (полностью человеческого 2-16A2) и аминокислотная последовательность, кодируемая последовательностью оснований, показаны в SEQ ID NO: 11 и 12, соответственно. Кроме того, последовательность оснований легкой цепи антитела и аминокислотная последовательность, кодируемая последовательностью оснований, показаны в SEQ ID NO: 3 и 4, соответственно. Вариабельная область тяжелой цепи, показанной в SEQ ID NO: 12, состоит из аминокислотной последовательности из аминокислот номер 1-122 из SEQ ID NO: 12, и вариабельная область легкой цепи, показанной в SEQ ID NO: 4, состоит из аминокислотной последовательности из аминокислот номер 1-113 из SEQ ID 5 NO: 4.

[0116]

С использованием вектора GS, как описано выше, в который вставлены каждый из генов тяжелой цепи и легкой цепи полностью человеческого 2-16A2, проводили экспрессию антитела с использованием двух типов способов, то есть, транзиторной экспрессии и стабильной экспрессии. Что касается транзиторной экспрессии, клетки FreeStyle 293 (Invitrogen), культивированные в среде для экспрессии FreeStyle 293 (Invitrogen) при приблизительно 1000000 клеток/мл, трансфицировали обоими экспрессирующими векторами для тяжелой цепи и легкой цепи, как описано выше, с использованием набора для трансфекции 293 Fectin (Invitrogen) и культивировали в течение 5 суток. Альтернативно, клетки Expi 293 (Invitrogen), культивированные в среде для экспрессии Expi 293 (Invitrogen) при приблизительно 3000000 клеток/мл, трансфицировали обоими экспрессирующими векторами для тяжелой цепи и легкой цепи, как описано выше, с использованием набора для трансфекции ExpiFectamine 293 (Invitrogen), и культивировали в течение 7 суток. Альтернативно, клетки CHO-K1 SV (Lonza), культивированные в среде для экспрессии CD-CHO (Invitrogen) при приблизительно 10000000 клеток/мл, трансфицировали обоими экспрессирующими векторами для тяжелой цепи и легкой цепи, как описано выше, с использованием способа электропорации, и культивировали в течение 7 суток. Полностью человеческое антитело очищали из каждого из культуральных супернатантов с использованием колонки с белком A или колонки с белком G (GE HealthCare). Что касается стабильной экспрессии, вектор GS, как описано выше, в который вставлены каждый из генов тяжелой цепи и легкой цепи антитела, расщепляли с помощью рестрикционных ферментов NotI и Pvul, и лигировали с использованием Ligation-Convenience Kit (NIPPONGENE) в качестве набора для лигирования или реагента для лигирования, Ligation high Ver. 2 (TOYOBO), таким образом, конструируя вектор GS, в который вставлены оба гена тяжелой цепи и легкой цепи. Антитело экспрессировали посредством трансфекции экспрессирующим вектором клеток CHO-K1 SV. Полностью человеческое антитело очищали из культуральных супернатантов посредством колонки с белком A, колонки с белком G или MabSelect SuRe (GE Healthcare, 17-5438-02).

[0117]

(Пример 8: Получение тетравалентного антитела против Tie2 человека)

Получали тетравалентное антитело против Tie2 человека. Тетравалентное антитело, полученное в настоящем примере, включает две тяжелые цепи и четыре легкие цепи. Каждая тяжелая цепь содержит две структуры, состоящие из вариабельной области тяжелой цепи и области CH1, и дополнительно содержит область CH2 и область CH3, в которых C-конец одной из структур, состоящей из вариабельной области тяжелой цепи и области CH1, связан с N-концом другой структуры через линкер. Каждая легкая цепь содержит вариабельную область легкой цепи и константную область легкой цепи. Формат настоящего тетравалентного антитела показан на фиг. 1.

[0118]

Получали ген, кодирующий тяжелую цепь тетравалентного антитела против Tie2 человека, в котором C-конец структуры (состоящей из аминокислотной последовательности из аминокислот номер 1-220 из SEQ ID NO: 12), состоящий из вариабельной области тяжелой цепи и области CH1 полностью человеческого 2-16A2, связан с N-концом тяжелой цепи полностью человеческого 2-16A2 через линкер, состоящий из аминокислотной последовательности, показанной в SEQ ID NO: 13. Ген, кодирующий сигнальную последовательность (Protein Engineering, 10 1987, Vol. 1, No. 6, pp. 499-505), присоединяли с 5'-стороны к полученному гену тяжелой цепи и вставляли в вектор GS pEE6.4. Вышеуказанный вектор для тяжелой цепи и вектор GS pEE12.4, в который вставлен ген легкой цепи полностью человеческого антитела 2-16A2, полученный в примере 7, комбинировали для получения тетравалентного антитела против Tie2 человека с использованием такого же способа экспрессии и очистки антитела, как описанный в примере 7. Тетравалентное антитело против Tie2 человека обозначено TIE-1-Igγl-WT.

[0119]

Получали ген, кодирующий тяжелую цепь тетравалентного антитела против Tie2 человека, обладающего константной областью тяжелой цепи из TIE-1-Igγ1-WT, замененной на константную область Igγ4 человека (состоящую из аминокислотной последовательности из аминокислот номер 123-220 из SEQ ID NO: 10, и состоящую из аминокислотной последовательности из аминокислот номер 350-676 из SEQ ID NO: 10) с аминокислотными мутациями S228P и L235E. Ген, кодирующий сигнальную последовательность (Protein Engineering, 1987, Vol. 1, No. 6, pp. 499-505), присоединяли с 5'-стороны к полученному гену тяжелой цепи и вставляли в вектор GS pEE6.4. Вышеуказанный вектор для тяжелой цепи и вектор GS pEEl2.4, в который вставлен ген легкой цепи полностью человеческого 2-16A2, полученного в примере 7, комбинировали для получения тетравалентного антитела против Tie2 человека с использованием такого же способа экспрессии и очистки антител, как описано в примере 7. Тетравалентное антитело против Tie2 человека с IgG4 обозначено как TIE-1-Igγ4-PE.

[0120]

Последовательность оснований тяжелой цепи TIE-1-Igγl-WT и аминокислотная последовательность, колируемая последовательностью оснований, показаны в SEQ ID NO: 7 и 8, соответственно. Последовательность оснований тяжелой цепи из TIE-1-Igγ4-PE и аминокислотная последовательность, колируемая последовательностью оснований, показаны в SEQ ID NO: 9 и 10, соответственно. Легкие цепи обоих антител являются такими же, как легкая цепь полностью человеческого антитела 2-16A2, и последовательность оснований легкой цепи и аминокислотная последовательность, кодируемая последовательностью оснований антитела, показаны в SEQ ID NO: 3 и 4, соответственно.

[0121]

С использованием такого же способа, получали тетравалентное антитело против Tie2 человека, в котором аминокислотные варианты L234A, L235A и P331S введены в константную область тяжелой цепи TIE-1-Igγ1-WT (обозначенное TIE-1-Igγ1-LALA), и тетравалентное антитело против Tie2 человека, в котором аминокислотные варианты L234A, L235A, P331S и I253A введены в константную область тяжелой цепи TIE-1-Igγ1-WT (обозначенное TIE-1-Igγ1-1253A).

[0122]

Последовательность оснований тяжелой цепи и аминокислотная последовательность, кодируемая последовательностью оснований, для TIE-1-Igγl-LALA показаны в SEQ ID NO: 1 и 2, соответственно. Последовательность оснований тяжелой цепи и аминокислотная последовательность, кодируемая последовательностью оснований, для TIE-1-Igγ1-1253A показаны в SEQ ID NO: 5 и 6, соответственно. Легкие цепи обоих антител являлись такими же, как легкая цепь полностью человеческого 2-16A2, и последовательность оснований легкой цепи и аминокислотная последовательность, кодируемая последовательностью оснований антитела, показаны в SEQ ID NO: 3 и 4, соответственно.

[0123]

Вариабельные области тяжелых цепей четырех видов тетравалентного антитела против Tie2 человека, показанных в SEQ ID NO: 2, 6, 8 и 10, являются общими и состоят из аминокислотной последовательности из аминокислот номер 1-122 из SEQ ID NO: 2. Каждая из CDR1, CDR2 и CDR3 вариабельных областей тяжелой цепи состоит из аминокислотной последовательности из аминокислот номер 31-35, 50-66 и 99-111 из SEQ ID NO: 2.

[0124]

Каждая из вариабельных областей легких цепей четырех видов тетравалентного антитела против Tie2 человека, показанных в SEQ ID NO: 4, состоит из аминокислотной последовательности из аминокислот номер 1-113 из SEQ ID NO: 4. CDR1, CDR2 и CDR3 вариабельных областей легкой цепи состоят из аминокислотной последовательности из аминокислот номер 24-39, 55-61 и 94-102 из SEQ ID NO: 4, соответственно.

[0125]

В результате анализа аминокислотных модификаций очищенного TIE-1-Igγ1-LALA, обнаружено, что в большинстве очищенных антител происходила делеция лизина на C-конце тяжелой цепи.

[0126]

Кроме того, с использованием такого же способа, получали тетравалентные антитела против Tie2 человека, в которых в отношении TIE-1-Igγ1-WT и TIE-1-Igγ4-PE, линкер (состоящий из аминокислотной последовательности, показанной в SEQ ID NO: 13), заменяли другими линкерами (четыре вида линкеров, состоящих из аминокислотных последовательностей, показанных в SEQ ID NO: 17-20 в отношении TIE-1-Igγ1-WT, и семь видов линкеров, состоящих из аминокислотных последовательностей, показанных в SEQ ID NO: 14-20 в отношении TIE-1-Igγ4-PE), (всего 11 видов). Исследовали от линкера, имеющего длину 7 аминокислот (линкер, состоящий из аминокислотной последовательности, показанной в SEQ ID NO: 13), до линкера, имеющего длину 64 аминокислоты (линкер, состоящий из аминокислотной последовательности, показанной в SEQ ID NO: 20).

[0127]

В результате исследований TIE-1-Igγ1-WT, TIE-1-Igγ4-PE и 11 видов антител, в которых линкер заменен, обнаружено, что все антитела против Tie2 человека обладали по существу одинаковой антиапоптотической активностью в соответствии со способом из примера 4.

[0128]

(Пример 9: Оценка антиапоптотического действия двухвалентного антитела против Tie2 человека и тетравалентного антитела против Tie2 человека)

По результатам из примера 5, предположили, что тетравалентное или обладающее более высокой валентностью антитело обладает антиапоптотической активностью посредством активации Tie2 человека. Таким образом, эффективность двухвалентного антитела против Tie2 человека сравнивали с эффективностью тетравалентного антитела против Tie2 человека посредством измерения антиапоптотического действия на экспрессирующие Tie2 человека клетки BaF3 в качестве показателя.

[0129]

В соответствии со способом из примера 4, антиапоптотическое действие полностью человеческого 2-16A2, представляющего собой двухвалентное антитело, и TIE-1-Igγ1-WT, представляющего собой тетравалентное антитело, оценивали с использованием экспрессирующих Tie2 человека клеток BaF3. Полностью человеческое 2-16A2 и TIE-1-Igγ1-WT, представляющие собой тестируемые антитела, очищали посредством MabSelect SuRe и фракционировали на мономерные фракции посредством эксклюзионной хроматографии, таким образом, получая чистоту мономеров 99,98% и 99,74%, соответственно. Соответствующие антитела разбавляли раствором фосфатно-солевого буфера (PBS) от 5 нг/мл до 5000 нг/мл с приблизительно 3-кратным знаменателем за семь стадий, и добавляли в количестве 20 мкл на лунку. В качестве контроля, получали PBS или Ang-1, разведенный в PBS (R&D, 923-AN-025/CF, конечная концентрация 1 нг/мл - 1000 нг/мл, разведенный с приблизительно 3-кратным знаменателем за 7 стадий), добавленные вместо тестируемых антител, соответственно. Для расчета антиапоптотической активности при каждой из концентраций тестируемых антител, значение, измеренное в лунке, в которую добавляли PBS вместо тестируемого антитела, устанавливали на 0%, и среднее значение из значений, измеренных в лунках, в которые вместо тестируемого антитела добавляли Ang-1 в концентрации 300 нг/мл и 1000 нг/мл, соответственно, устанавливали на 100%. Значение EC₅₀ тестируемого антитела рассчитывали посредством анализа рассчитанной антиапоптотической активности с использованием нелинейного регрессионного анализа сигмоидной модели Eмакс.

Таблица 1: Антиапоптотическая активность двухвалентного антитела против Tie2 человека и тетравалентного антитела против Tie2 человека

[Таблица 1]

	Значение EC50	Максимум активности для антиапоптотической активности
TIE-1-Igγ1-WT	7,10 нг/мл	104%
Полностью человеческое 2-16A2	37,6 нг/мл	22%

[0130]

В результате обнаружено, что TIE-1-Igγl-WT, представляющее собой тетравалентное антитело, обладает сильным антиапоптотическим действием. Из вышеуказанного, обнаружено, что тетравалентное антитело обладает превосходной антиапоптотической активностью, по сравнению с двухвалентным антителом.

[0131]

(Пример 10: Оценка ингибирующего проницаемость сосудов действия двухвалентного антитела против Tie2 человека и тетравалентного антитела против Tie2 человека у крысы)

Модель индуцированной горчичным маслом проницаемости сосудов представляет собой модель с модификацией, введенной в анализ Майлза (J. Physiol., 1952, Vol. 118, pp. 228-257), которую широко используют в качестве системы оценки просачивания плазмы, и опубликовано, что Ang-1 ингибирует повышенную проницаемость сосудов в настоящей модели (Nature Medicine, 2000, Vol. 6, pp. 15 460-463). Соответственно, для сравнения ингибирующего действия на проницаемость сосудов двухвалентного антитела против Tie2 человека с действием тетравалентного антитела против Tie2 человека, полностью человеческое 2-16A2 и TIE-1-Igγ1-WT оценивали с использованием настоящей модели.

[0132]

Полностью человеческое 2-16A2 или TIE-l-Igγ1-WT, разведенные в PBS, подкожно вводили крысам SD (самцы, в возрасте 4-5 недель, Charles River Laboratories Japan, Inc.). Группы обработки устанавливали следующим образом.

[Группы обработки (6 крыс на группу)]

Группа носителя:

Группа, в которой вводили PBS вместо антитела

Группа введения полностью человеческого 2-16A2:

Группа, в которой вводили полностью человеческое 2-16A2 (0,3 мг/кг)

Группа введения TIE-1-Igγ1-WT:

Группа, в которой вводили TIE-1-Igγl-WT (0,3 мг/кг)

[0133]

Через 48 часов после введения антитела, синий краситель Эванса, разведенный в физиологическом солевом растворе (45 мг/кг, Sigma-Aldrich Corporation, E2129) вводили внутривенно, незамедлительно 5% аллилизотиоцианат (также обозначаемый как горчичное масло, Nacalai Tesque, Inc., 01415-92), разведенный в минеральном масле (Sigma-Aldrich Corporation, M8410), вводили в одно ухо, в то время как минеральное масло вводили в контралатеральное ухо, в количестве 20 мкл. Через 30 минут, отбирали образцы обоих ушей, взвешивали, затем погружали в 1 мл формамида, и инкубировали при 70°C в течение ночи для экстракции синего красителя Эванса из ткани уха. Концентрацию синего красителя Эванса определяли по оптической плотности (при длине волны измерения 620 нм и контрольной длине волны 740 нм) экстракта для расчета количества синего красителя Эванса в экстракте. Затем, посредством деления количества синего красителя Эванса на массу уха, рассчитывали количество просочившегося красителя на массу уха. Значение, полученное посредством вычитания количества просочившегося синего красителя Эванса в ухе, куда вводили минеральное масло, из количества просочившегося синего красителя Эванса в ухе, куда вводили горчичное масло, для одного и того же индивидуума, рассчитывали в качестве конечного количества просочившегося синего красителя Эванса для каждого индивидуума. Количество просочившегося синего красителя Эванса использовали в качестве показателя проницаемости сосудов. Результаты показаны на фиг. 2.

[0134]

Определяли среднее значение и стандартную ошибку для каждой группы. T-критерий Стьюдента использовали для определения значимого отличия между группой носителя и каждой группой, в которой вводили антитело. Случай с p < 0,05 предназначен для обозначения того, что присутствовало значимое отличие.

[0135]

Как показано на фиг. 2, по сравнению с группой носителя, полностью человеческое 2-16A2, представляющее собой двухвалентное антитело, не ингибировало просачивание красителя, в то время как TIE-1-Igγ1-WT, представляющее собой тетравалентное антитело, значимо ингибировало просачивание красителя. Обнаружено, что TIE-1-Igγ1-WT, представляющее собой тетравалентное антитело, ингибировало повышенную проницаемость сосудов. Из вышеуказанного, обнаружено, что тетравалентное антитело обладает превосходным ингибирующим действием на гиперпроницаемость сосудов, по сравнению с двухвалентным антителом.

[0136]

По результатам примеров 9 и 10, обнаружено, что тетравалентное антитело против Tie2 сильно индуцировало действие посредством Tie2.

[0137]

(Пример 11: Оценка антиапоптотического действия тетравалентного антитела против Tie2 человека (2))

Для TIE-1-Igγ1-LALA и TIE-1-Igγ1-1253A, способом из примера 9 оценивали антиапоптотическую активность антитела на экспрессирующих Tie2 человека клетках BaF3. В таком же диапазоне концентраций, как в примере 9, проводили оценку каждого тетравалентного антитела против Tie2 человека. В отношении этого, когда среднее значение из измеренных значений для лунок, в каждую из которых добавляли 100 нг/мл, 300 нг/мл и 1000 нг/мл Ang-1, принимали за 100%, оценивали значение EC₅₀ и максимальную активность из антиапоптотической активности каждого антитела.

Таблица 2: Антиапоптотическая активность каждого тетравалентного антитела против Tie2 человека

[Таблица 2]

	Значение EC50	Максимум активности для антиапоптотической активности
TIE-1-Igγ1-LALA	3,65 нг/мл	88%
TIE-1-Igγ1-I253A	5,06 нг/мл	94%

[0138]

В результате обнаружено, что как TIE-1-Igγ1-LALA, так и TIE-1-Igγ1-1253A обладали антиапоптотической активностью, по существу эквивалентной активности Ang-1.

[0139]

(Эталонный пример 1: Оценка антиапоптотического действия 15B8)

Для 15B8, способом из примера 9 оценивали антиапоптотическую активность экспрессирующих Tie2 человека клеток BaF3. Оценку 15B8 (Патентный документ 1) проводили в таком же диапазоне концентраций антитела, как в примере 9. Оценку Ang-2 (R&D, 623-AN-025) проводили таким же способом, как для Ang-1. В отношении этого, когда среднее значение из значений, измеренных в лунках, в которые добавляли 1000 нг/мл Ang-1, принимали за 100%, оценивали значение EC50 и максимальную активность из антиапоптотической активности.

Таблица 3: Антиапоптотическ активность 15B8

[Таблица 3]

	Значение EC50	Максимальная активность из антиапоптотической активности
15B8	26,6 нг/мл	64%
Ang-2	39,3 нг/мл	67%

[0140]

В результате обнаружено, что антиапоптотическая активность 15B8 составляла приблизительно 64% от активности Ang-1, и оно обладало антиапоптотической активностью, по существу эквивалентной активности Ang-2.

[0141]

В сочетании с результатами из примера 11, обнаружено, что TIE-1-Igγ1-LALA обладало антиапоптотической активностью, по существу эквивалентной активности Ang-1, в то время как 15B8 обладало частичной антиапоптотической активностью, по существу эквивалентной активности Ang-2.

[0142]

(Пример 12: Оценка активности связывания TIE-1-Igγ1-LALA с Tie2)

Для TIE-1-Igγ1-LALA, оценивали активность связывания с белком Tie2 каждого вида. Получали рекомбинантный химерный белок Tie2-Fc человека (R&D, 313-TI-100), рекомбинантный химерный белок Tie2 обезьяны - Fc (Sino Biological Inc., 90292-C02H), рекомбинантный химерный белок Tie2 крысы - Fc (R&D, 3874-T2-100) или рекомбинантный химерный белок Tie2 мыши -Fc (R&D, 762-T2-100) в PBS при 1 мкг/мл, добавляли в белый 384-луночный планшет Maxisorp (Nunc, 460372) в количестве 20 мкл на лунку, и инкубировали при 4°C в течение ночи для проведения иммобилизации. На следующие сутки, раствор для иммобилизации удаляли, и 20% блокирующий реагент Blocking One (Nacalai Tesque Inc., 03953-95) -содержащего Tris-солевой буфер (TBS) - 0,05% Tween (Wako, 310-7375) (далее в настоящем документе обозначенный как раствор TBS-T) добавляли к этому в количестве 50 мкл на лунку, и оставляли стоять при комнатной температуре в течение 1 часа. TIE-1-Igγ1-LALA в качестве тестируемого антитела разбавляли раствором TBS-T, содержащим 5% блокирующий реагент Blocking One, от 0,03 нг/мл до 100 нг/мл с приблизительно 3-кратным знаменателем за 8 стадий, и добавляли в количестве 20 мкл на лунку. В качестве контроля, получали лунку, в которую раствор TBS-T добавляли вместо тестируемого антитела. Полученный планшет инкубировали при комнатной температуре в течение 1,5 часов, и затем промывали раствором TBS-T. В качестве вторичного антитела, меченное биотином антитело против легкой цепи каппа человека (Immuno-Biological Laboratories Co., Ltd., 17249), которое разводили до 0,1 мкг/мл раствором TBS-T, содержащим 5% блокирующий реагент Blocking One, добавляли к этому в количестве 20 мкл на лунку. Полученный планшет инкубировали при комнатной температуре в течение 1 часа и затем промывали раствором TBS-T, и меченный щелочной фосфатазой стрептавидин (Thermo Fisher Scientific Inc., 21324), который разводили до 0,1 мкг/мл содержащим 5% блокирующий реагент Blocking One раствором TBS-T, добавляли к этому в количестве 20 мкл на лунку. Полученный планшет инкубировали при комнатной температуре в течение 1 часа и затем промывали раствором TBS-T, и хемилюминесцентный Ultra Sensitive AP Microwell и/или мембранный субстрат (450 нм) (BioFX, APU4-0100-01), разведенный в 5 раз содержащим 1 мМ MgCl₂ 20 мМ TBS (pH 9,8), в качестве субстрата добавляли к этому в количестве 20 мкл. Полученный планшет инкубировали при комнатной температуре в течение 30 минут, и затем его хемилюминесценцию измеряли посредством счетчика для множества меток EnVision™ (PerkinElmer, Inc.). Значение EC₅₀ тестируемого антитела рассчитывали посредством анализа рассчитанной активности связывания с использованием нелинейного регрессионного анализа сигмоидной модели Eмакс.

Таблица 4: Активность связывания TIE-1-Igγ1-LALA

[Таблица 4]

	Значение EC50 (нг/мл)
	Человек	Обезьяна	Крыса	Мышь
TIE-1-Igγ 1-LALA	0,565	0,545	0,633	0,696

[0143]

В результате обнаружено, что TIE-1-Igγ1-LALA обладает по существу такой же высокой активностью связывания, как с Tie2 человека, с Tie2 обезьяны, Tie2 крысы и Tie2 мыши.

[0144]

(Эталонный пример 2: Оценка активности связывания 15B8 с Tie2)

В соответствии со способом из примера 12, оценивали активность связывания 15B8 с белками Tie2 каждого вида. В отношении этого, оптическую плотность при 450 нм измеряли с использованием меченного HRP антитела против легкой цепи каппа мыши (SouthernBiotech, 1050-05) в качестве вторичного антитела, проявляющего окрашивание реагента TMB в качестве субстрата и считывателя для множества меток ARVO (PerkinElmer Inc.) в качестве устройства для измерения. Кроме того, концентрацию антитела 15B8 доводили от 1000 нг/мл до 0,3 нг/мл с приблизительно 3-кратным знаменателем (с разведением за восемь стадий), в качестве тестируемого антитела. Значение EC₅₀ тестируемого антитела рассчитывали посредством анализа рассчитанной активности связывания с использованием нелинейного регрессионного анализа сигмоидной модели Eмакс (таблица 5). Таблица 5: Активность связывания 15B8

[Таблица 5]

	Значение EC50 (нг/мл)
	Человек	Обезьяна	Крыса	Мышь
15B8	218,7	224,3	> 1000	> 1000

[0145]

В результате наблюдали, что 15B8 обладает активностью связывания с Tie2 человека и Tie2 обезьяны, но обнаружено, что 15B8 обладает низкой активностью связывания с Tie2 крысы и Tie2 мыши.

[0146]

По результатам из примера 12, наблюдали, что TIE-1-Igγ1-LALA обладало высокой активностью связывания с Tie2 человека, Tie2 обезьяны, Tie2 крысы и Tie2 мыши без различий для видов в активности связывания. С другой стороны, наблюдали, что 15B8 обладал различием для видов в активности связывания. Из вышеуказанного, предположили, что эпитоп Tie2 человека для TIE-1-Igγ1-LALA являлся отличным от эпитопа для 15B8.

[0147]

(Пример 13: Оценка ингибирующего проницаемость сосудов действия TIE-1-Igγ1-LALA у крыс)

В соответствии со способом из примера 10, оценивали ингибирующее проницаемость сосудов действие TIE-1-Igγ1-LALA у крыс. В отношении этого, TIE-1-Igγ1-LALA использовали в качестве тестируемого антитела, и дозу антитела доводили до 0,1 мг/кг и 0,3 мг/кг. Результаты показаны на фиг. 3.

[0148]

Определяли среднее значение и стандартную ошибку для каждой группы. Тест множественных сравнений Даннетта применяли для определения значимых отличий между группой носителя и каждой группой, в которой вводили антитело. Случай с p < 0,05 предназначен для обозначения того, что присутствовало значимое отличие.

[0149]

Как показано на фиг. 3, по сравнению с группой носителя, TIE-1-Igγ1-LALA значимо ингибировало просачивание красителя. Их вышеуказанного, обнаружено, что TIE-1-Igγl-LALA ингибировало повышенную проницаемость сосудов.

[0150]

(Пример 14: Ингибирующее действие на отек сетчатки у мышей с потерей перицитов)

В кровеносных сосудах сетчатки пациентов с диабетической ретинопатией, потеря перицитов является одним из характерных поражений (Retina, 2013, Fifth edition, pp. 925-939). Хотя модели на крысах с индуцированным стрептозотоцином диабетом широко используют в исследованиях диабетической ретинопатии, существует ограничение в полезности моделей в следующих аспектах: проходит период несколько месяцев, пока не наблюдают потери перицитов, микроаневризмы сетчатки, которую считают вызываемой потерей перицитов, не наблюдают, отношение перицитов к эндотелиальным клеткам отличается от отношения у человека (Retina, 2013, Fifth edition, pp. 925-939), и очевидного отека сетчатки не наблюдают (Diabetes Metab. J., 2013, Vol. 37, pp.217-224). С другой стороны, у мышей, обладающих кровеносными сосудами сетчатки с потерей перицитов, посредством введения антитела против рецептора β PDGF (PDGFR β), наблюдают поражения, сходные с поражениями, наблюдаемыми при диабетической ретинопатии и диабетическом отеке желтого пятна, такими как расширение кровеносных сосудов сетчатки, отек сетчатки и кровоизлияние, что позволяет предполагать, что кровеносные сосуды ослаблены, как при диабетической ретинопатии и диабетическом отеке желтого пятна из-за потери перицитов, хотя гипергликемии не наблюдают (J. Clin. Invest., 2002, Vol. 110, pp. 1619-1628). Таким образом, оценку ингибирующего действия на отек сетчатки с использованием модели в условиях потери перицитов, которая является характерным поражением у пациента с диабетической ретинопатией, можно использовать для оценки эффективности при диабетической ретинопатии и диабетическом отеке желтого пятна.

[0151]

Отек сетчатки, индуцированный потерей перицитов, получали с небольшой модификации способом, опубликованным в J. Clin. Invest., 2002, Vol. 110, pp. 1619-1628. То есть, моноклональное антитело 1B3 против PDGFR β (WO 2008/130704), разведенное в PBS, вводили подкожно при 25 мг/кг на мышь C57BL/6J (Charles River Laboratories Japan, Inc.) на 2^е сутки после рождения для индукции потери перицитов в кровеносных сосудах сетчатки.

[Группы обработки]

Контрольная группа (также обозначаемая как контр. группа): 17 мышей

Группа, в которой не вводили антитело против PDGFR β и вводили PBS

Группа носителя (также обозначаемая как группа нос.): 24 мыши

Группа, в которой вводили антитело против PDGFR β и вводили PBS вместо TIE-1-Igγ1-LALA

Группа TIE-1-Igγ1-LALA (0,1 мг/кг, 0,3 мг/кг и 1 мг/кг): в каждой 23 мыши, 21 мышь и 21 мышь

Группа, в которой вводили антитело против PDGFR β и вводили каждую дозу TIE-1-Igγ1-LALA

[0152]

За 90 минут до введения антитело против PDGFR β, TIE-1-Igγ1-LALA, разведенный в PBS, вводили подкожно при 0,1 мг/кг, 0,3 мг/кг и 1 мг/кг. Через 1 неделю после введения антитела, оценивали отек сетчатки. Конкретно, глазное яблоко извлекали и фиксировали растворами, содержащими 1% глутаральдегид и 2,5% формалин, и затем получали погруженные в парафин срезы. Окрашенные гематоксилином-эозином образцы сканировали для конвертации данных изображений с использованием сканера виртуальных срезов (NanoZoomer XR, Hamamatsu Photonics К. K.). В этой модели, опубликован отек сетчатки в слое нервных волокон сетчатки (NFL) (J. Clin. Invest., 2002, Vol. 110, pp. 1619-1628), таким образом, количественную оценку отека сетчатки проводили посредством измерения областей NFL и соседнего слоя ганглиозных клеток сетчатки с проекцией NPD 2 (Hamamatsu Photonics К. K.). Результаты показаны на фиг. 4.

[0153]

Определяли среднее значение и стандартную ошибку для каждой группы. Тест множественных сравнений Даннетта применяли для определения значимых отличий между группой носителя и каждой группой, в которой вводили TIE-1-Igγ1-LALA. T-критерий Стьюдента использовали для определения значимого отличия между контр. группой и группой нос.. Случай с p < 0,05 предназначен для обозначения того, что присутствовало значимое отличие в каждом случае.

[0154]

Как показано на фиг. 4, обнаружено, что в группе TIE-1-Igγ1-LALA (1 мг/кг) значимо ингибирован отек сетчатки при наличии кровеносных сосудов сетчатки с потерей перицитов, по сравнению с группой носителя. С той точки зрения, что TIE-1-Igγ1-LALA ингибировало отек сетчатки, обусловленный кровеносными сосудами сетчатки с потерей перицитов, предположили, что TIE-1-Igγ1-LALA является эффективным при диабетическом отеке желтого пятна и диабетической ретинопатии.

[0155]

(Пример 15: Улучшающее кровоток действие при ишемии конечностей у мышей с ишемией задних конечностей)

Модель с ишемией задних конечностей представляет собой модель, обладающую ишемией в тканях задних конечностей, индуцированной посредством лигирования и вырезания кровеносного сосуда в задней конечности на одной стороне, и является также репрезентативной моделью для оценки улучшения симптомов ишемии (J. 35 Vase. Surg., 2012, Vol. 56, pp. 1669-1679).

[0156]

Паховую область бедренной артерии и вены, и подкожную артерию и вену левой задней конечности лигировали у 10-недельных мышей C57BL/6J (CLEA Japan, Inc.). Затем, сосуды после разветвления между ними лигировали, и кровеносный сосуд между точками лигирования вырезали. Хирургическую операцию проводили под анестезией с использованием пентобарбитала натрия (60 мг/кг, Tokyo Chemical Industry Co., Ltd.). Через одну неделю после вырезания сосуда, кровоток в задней конечности измеряли с использованием лазерного доплеровского визуализатора перфузии MoorLDI2 (Moor Instruments Inc.) под анестезией с использованием пентобарбитала. После подтверждения уменьшения кровотока в конечности, подлежащей обработке, группы обработки устанавливали следующим образом.

[Группы обработки (10 мышей на группу)]

Контрольная группа:

Группа, в которой вводили PBS вместо антитела

Группа TIE-1-Igγ1-LALA (1 мг/кг):

Группа, в которой вводили TIE-1-Igγ1-LALA

[0157]

TIE-1-Igγ1-LALA, разведенный в PBS, вводили подкожно при 1 мг/кг, и уровень кровотока в коже нормальной конечности и ишемизированной конечности измеряли через одну неделю после введения антитела. Конкретно, пентобарбитал натрия (60 мг/кг) вводили внутрибрюшинно, с последующим помещением на подогреваемую плиту, чтобы измерять кровоток в коже лапы через 15 минут после введения анестезии. Результаты измерения кровотока посредством принятия нижней части конечности в качестве представляющей интерес области (ROI), показаны на фиг. 5.

[0158]

Определяли среднее значение и стандартную ошибку для каждой группы. T-критерий Стьюдента использовали для определения значимого отличия между контрольной группой и группой TIE-1-Igγ1-LALA. Случай с p < 0,05 предназначен для обозначения того, что присутствовало значимое отличие.

[0159]

Как показано на фиг. 5, обнаружено, что по сравнению с контрольной группой, в группе TIE-1-Igγ1-LALA значимо улучшался уровень кровотока в нормальной конечности и ишемизированной конечности. Соответственно, предположили эффективность TIE-1-Igγ1-LALA при заболеваниях периферических артерий, таких как критическая ишемия конечностей.

[0160]

(Пример 16: Оценка эпитопа для TIE-1-Igγ1-LALA: масс-спектрометрия с обменом водорода на дейтерий)

Для идентификации эпитопа узнавания TIE-1-Igγ1-LALA, получали Fab полностью человеческого 2-16A2 в примере 7 (далее в настоящем документе обозначенного как полностью человеческий 2-16A2-Fab). Поскольку полностью человеческий 2-16A2-Fab обладает такой же вариабельной областью, как TIE-1-Igγ1-LALA, эти антитела узнают один и тот же эпитоп. В качестве антигена, получали белок Tie2 человека, состоящий из аминокислот номер 1-452 из No. доступа NP 000450.2 (далее в настоящем документе обозначено как Tie2 человека (1-452)). Аминокислотная последовательность представляет собой тот же самый участок, использованный, когда идентифицировали участок связывания Tie2 на Ang-2 (Nat. Struct. Mol. Biol., Vol. 13, pp. 524-532).

[0161]

Конкретно, полностью человеческий 2-16A2-Fab получали посредством комбинации вектора GS pEE6.4, в который вставлен ген тяжелой цепи, кодирующий структуру (состоящую из аминокислотной последовательности из аминокислот номер 1-221 из SEQ ID NO: 12), состоящую из вариабельной области тяжелой цепи и области CH1 из полностью человеческого 2-16A2, и вектора GS pEE12.4, в который вставлен ген легкой цепи полностью человеческого 2-16A2, и с использованием такого же способа, как способ экспрессии и способ очистки антитела, описанные в примере 7.

[0162]

Для получения Tie2 человека (1-452), сначала получали Tie2 человека (1-452), полученный посредством слияния Fc человека (состоящего из аминокислотной последовательности, показанной в SEQ ID NO: 23), с последовательностью узнавания тромбина (состоящей из аминокислотной последовательности, показанной в SEQ ID NO: 22) в качестве линкера (далее в настоящем документе обозначенный как химерный белок Tie2 человека (1-452)-Fc). Конкретно, посредством вставки гена, кодирующего химерный белок Tie2 человека (1-452)-Fc, в вектор GS pEE12.4, и с использованием такого же способа экспрессии и способа очистки, как описанные в пример 7, получали химерный белок Tie2 человека (l-452)-Fc. Затем, полученный химерный белок Tie2 человека (1-452)-Fc инкубировали с тромбином (GE Healthcare, 27-0846-01) при 22°C в течение 16 часов для отрезания части Fc, и тромбин и Fc человека удаляли посредством колонок с бензамидинсефарозой 4 Fast Flow (high sub) (GE Healthcare) и MabSelect SuRe, таким образом, получая Tie2 человека (1-452).

[0163]

С целью идентификации эпитопного участка, проводили масс-спектрометрию с обменом водорода/дейтерия (далее в настоящем документе обозначенной как масс-спектрометрия с обменом H/D, Anal. Bioanal. Chem., 2010, Vol. 397, pp. 967-979) посредством использования систем NanoAQUITY UPLC HDX (Waters).

[0164]

Конкретно, смешанные жидкие полностью человеческий 2-16A2-Fab и Tie2 человека (1-452) (конечная концентрация 50 мкМ и 25 мкМ, соответственно) получали с использованием буфера 20 мМ лимонной кислоты (pH 6), содержащего 120 мМ хлорид натрия, и инкубировали при 37°C в течение ночи. В качестве контроля, раствор только Tie2 человека (1-452) получали с использованием буфера 20 мМ лимонной кислоты (pH 6), содержащего 120 мМ хлорид натрия. Затем, раствор добавляли в раствор буфера PBS, полученного с использованием дейтериевой воды (Kanto Chemical Co., Inc.), и инкубировали в течение 20 секунд, 1 минуты, 10 минут, 60 минут и 120 минут, соответственно, и проводили дейтерирование. Затем водный раствор (pH 2,5), содержащий 100 мМ дитиотреитол (Nacalai Tesque) и 4 M гидрохлорид гуанидина (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) добавляли к этому при 0°C, и затем проводили расщепление с использованием колонки с пепcином (Proszyme (зарегистрированное торговое наименование) Immobilized Pepsin Cartridge, Applied Biosystems), и отщепленный пептид связывали с использованием предколонки (ACQUITY UPLC ВЕН CI8 1.7 μm VanGuard Pre-Column, Waters). Затем проводили разделение посредством обращеннофазовой хроматографии с использованием колонки C18 (AQUITY UPLC ВЕН CI 8 1.7 μm, Waters), и молекулярную массу измеряли с помощью масс-спектрометра (SynaptG2-Si, Waters). Рассчитывали центроидное значение изотопного распределения всех детектированных пептидов, и сравнивали с центроидным значением изотопного распределения только Tie2 человека (1-452), подвергнутого дейтериевому обмену, и изменение количества с возникновением дейтериевого обмена рассчитывали в отношении каждого периода дейтерирования.

[0165]

В результате масс-спектрометрии с обменом H/D, демонстрировали, что пептиды с номерами аминокислот 27-37, 29-37, 29-38, 43-60, 82-100, 98-107, 111-124, 116-125, 116-129, 119-129, 189-198 и 190-198 из No. доступа NP 000450.2 обладали ингибированным дейтерированием при совместном присутствии с антителом. Повторяющиеся домены этих пептидов аранжировали, затем к этому добавляли информацию о пептидах с не ингибированным дейтерированием и принимая во внимание то, что две аминокислоты на N-конце легко подвергаются обратному обмену (Proteins, 1993, Vol. 17, 75-86), обнаружили пять областей с ингибированием дейтериевого обмена, то есть, аминокислоты номер 29-38, 84-102, 113-120, 126-129 и 191-198 из No. доступа NP_000450.2 в качестве участков-кандидатов на эпитоп. Затем, в результате масс-спектрометрии с обменом H/D, обнаружили, что в случае, когда TIE-1-Igγ1-LALA взаимодействует с областью, состоящей из этих пяти аминокислотных участков, или когда происходит изменение в пространственной структуре или аллостерический эффект посредством связывания антитела, эти остатки защищены от обмена водорода/дейтерия.

[0166]

(Пример 17: Оценка эпитопа TIE-1-Igγ1-LALA: анализ поверхностного плазмонного резонанса и ELISA)

Эпитопы-кандидаты из Tie2 человека для TIE-1-Igγ1-LALA идентифицировали по масс-спектрометрии с обменом H/D из примера 16. Чтобы подробно предсказать часть эпитопа, получали аминокислотные мутанты химерного белка Tie2 человека (l-452)-Fc, и активность связывания оценивали с использованием анализа поверхностного плазмонного резонанса (анализа SPR) и ELISA.

[0167]

На основании результата масс-спектрометрии с обменом H/D и публикации области, в которой Ang-1 и Ang-2 связываются с Tie2 (Nat. Struct. Mol. Biol., 2006, Vol. 13, pp. 524-532. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2013, Vol. 110, 7205-7210), получали 23 белка с мутациями аминокислот, в которых от одной до четырех аминокислот заменяли на аланин (в одном случае, на глутаминовую кислоту) из Tie2 человека (1-452) в химерном белке Tie2 человека (l-452)-Fc в качестве белков Tie2 человека (1-452) с мутациями аминокислот (таблица 6). Различные мутанты получали посредством такого же способа, как для получения химерного белка Tie2 человека (l-452)-Fc в примере 16.

Таблица 6: Мутантные химерные белки Tie2 человека (l-452)-Fc

[Таблица 6]

Наименование мутанта	Участок варианта аминокислоты
Tie2 человека (l-452)r1-Fc	R167A, H168A, E169A
Tie2 человека (l-452)r2-Fc	D172A, I173A
Tie2 человека (l-452)r3-Fc	R167A
Tie2 человека (l-452)r4-Fc	H168A
Tie2 человека (l-452)r5-Fc	E169A
Tie2 человека (l-452)r6-Fc	D172A
Tie2 человека (l-452)r7-Fc	I173A
Tie2 человека (1-452)gl -Fc	I194A, N197A, L198A
Tie2 человека (1-452)g2-Fc	R192A
Tie2 человека (l-452)g3-Fc	I194A
Tie2 человека (l-452)g4-Fc	G195E
Tie2 человека (l-452)g5-Fc	N197A
Tie2 человека (l-452)g6-Fc	L198A
Tie2 человека (l-452) m1-Fc	W82A, K84A
Tie2 человека (l-452)m3-Fc	S94A, K95A
Tie2 человека (l-452)yl-Fc	D37A
Tie2 человека (l-452)cl-Fc	R50A, H52A, E53A, P54A
Tie2 человека (1-452)A1-Fc	E151A
Tie2 человека (1-452)A2-Fc	V154A
Tie2 человека (1-452)A3-Fc	Y156A
Tie2 человека (1-452)A4-Fc	F161A
Tie2 человека (1-452)A5-Fc	S164A
Tie2 человека (1-452)A6-Fc	P166A

[0168]

Анализ SPR проводили для оценки активности связывания химерного белка Tie2 человека (l-452)-Fc и 23 мутантных белков из него с полностью человеческим 2-16A2-Fab.

[0169]

Для анализа SPR, использовали Biacore T200 (GE Healthcare). Антитело против IgG человека (Fc) (Human Antibody Capture Kit, GE Healthcare) фиксировали на сенсорном чипе CM5. Позволяли иммобилизацию каждого из химерного белка Tie2 человека (1-452)-Fc и 23 мутантных белков из него, разведенных в HBS-EP (GE Healthcare) при 5 мкг/мл, и измеряли уровень связывания. Затем, для полностью человеческого 2-16A2-Fab, разведенного в HBS-EP до 50 нМ, измеряли уровень его связывания с химерным белком Tie2 человека (l-452)-Fc и 23 мутантными белками из него. Затем, посредством деления связанного количества на иммобилизованное количество, рассчитывали связанное количество антитела на единицу иммобилизованного антигена (далее в настоящем документе обозначенное как коэффициент связывания). Среднее арифметическое для трех экспериментов и относительное значение коэффициента связывания для каждого из мутантных белков, когда коэффициент связывания химерного белка Tie2 человека (l-452)-Fc принимали за 100%, показаны в таблице 7. Кроме того, репрезентативные данные измерения показаны на фиг. 6. Способ относительного сравнения связанных количеств на Biacore описан, например, в Analytical Biochemistry, 2003, Vol. 312, pp. 113-124.

[0170]

В результате обнаружено, что связывание полностью человеческого 2-16 A2-Fab являлось уменьшенным для Tie2 человека (l-452)gl-Fc, Tie2 человека (l-452)g2-Fc, Tie2 человека (l-452)g3-Fc, Tie2 человека (l-452)g4-Fc, Tie2 человека (l-452)g5-Fc, Tie2 человека (l-452)m3-Fc, Tie2 человека (1-452)A1-Fc, Tie2 человека (1-452)A2-Fc, Tie2 человека (1-452)A3-Fc и Tie2 человека (1-452)A4-Fc, по сравнению с химерным белком Tie2 человека (1-452)-Fc.

Таблица 7: Результаты анализа SPR

[Таблица 7]

	Коэффициент связывания	Относительное значение (%)
Химерный белок Tie2 человека (1-452)-Fc	0,29	100
Tie2 человека (1-452)r1-Fc	0,29	102
Tie2 человека (1-452)r2-Fc	0,28	98
Tie2 человека (1-452)r3-Fc	0,34	119
Tie2 человека (1-452)r4-Fc	0,33	113
Tie2 человека (1-452)r5-Fc	0,29	99
Tie2 человека (1-452)r6-Fc	0,29	100
Tie2 человека (1-452)r7-Fc	0,30	106
Tie2 человека (1-452)g1-Fc	0,00	0
Tie2 человека (1-452)g2-Fc	0,03	9
Tie2 человека (1-452)g3-Fc	0,06	23
Tie2 человека (1-452)g4-Fc	0,02	7
Tie2 человека (1-452)g5-Fc	0,03	9
Tie2 человека (1-452)g6-Fc	0,38	131
Tie2 человека (1-452)m1-Fc	0,31	107
Tie2 человека (1-452)m3-Fc	0,04	12
Tie2 человека (1-452)y1-Fc	0,25	87
Tie2 человека (1-452)c1-Fc	0,54	189
Tie2 человека (1-452)A1-Fc	0,10	34
Tie2 человека (1-452)A2-Fc	0,08	29
Tie2 человека (1-452)A3-Fc	0,17	59
Tie2 человека (1-452)A4-Fc	0,13	44
Tie2 человека (1-452)A5-Fc	0,39	135
Tie2 человека (1-452)A6-Fc	0,31	109

[0171]

ELSA проводили способом, как в примере 12, чтобы оценить активность связывания TIE-1-Igγ1-LALA с химерным белком Tie2 человека (l-452)-Fc и 23 мутантными белками из него.

[0172]

Химерный белок Tie2 человека (1-452)-Fc и 23 мутантных белка из него, разбавленные в PBS до 1 мкг/мл, добавляли в белый 384-луночный планшет Maxisorp в количестве 20 мкл на лунку, и инкубировали при 4°C в течение ночи для проведения иммобилизации. На следующие сутки, раствор для иммобилизации удаляли, и планшет промывали раствором TBS-T и инкубировали в течение 60 минут при добавлении 50 мкл блокирующего реагента Blocker™ с казеином в TBS (Thermo Fisher Scientific Inc., 37532) для проведения блокирования. Полученный планшет промывали раствором TBS-T, и TIE-1-Igγ1-LALA, разведенное в содержащем 0,05% Tween 20 (Nacalai Tesque Inc., 28353-85) блокирующем реагенте Blocker™ с казеином в TBS от 0,03 нг/мл до 100 нг/мл за восемь стадий, добавляли к этому в количестве 20 мкл на лунку. Полученный планшет инкубировали при комнатной температуре в течение 90 минут и затем промывали раствором TBS-T три раза, и к этому добавляли 20 мкл меченного биотином антитела против легкой цепи каппа человека, разведенного до 0,1 мкг/мл в содержащем 0,05% Tween 20 блокирующем реагенте Blocker™ с казеином в TBS. Полученный планшет инкубировали при комнатной температуре в течение 60 минут и затем промывали раствором TBS-T три раза, и к этому добавляли 20 мкл меченного щелочной фосфатазой стрептавидина, разведенного до 0,1 мкг/мл в содержащем 0,05% Tween 20 блокирующем реагенте Blocker™ с казеином в TBS. Полученный планшет инкубировали при комнатной температуре в течение 60 минут и затем промывали раствором TBS-T три раза, и к этому добавляли 50 мкл хемилюминесцентного Ultra Sensitive AP Microwell и/или мембранного субстрата (450 нм), разведенных в 5 раз в содержащем 1 мМ MgCl₂ 20 мМ TBS (pH 9,8), в качестве субстрата. Полученный планшет инкубировали при комнатной температуре с защитой от света в течение 40 минут, и затем интенсивность люминесценции измеряли с помощью счетчика для множества меток EnVision™. Рассчитывали значение EC₅₀ TIE-1-Igγ1-LALA в отношении химерного белка Tie2 человека (l-452)-Fc и 23 мутантных белков из него. Рассчитывали относительное значение интенсивности люминесценции для 100 нг/мл TIE-1-Igγ1-LALA в качестве максимальной точки концентрации в отношении химерного белка Tie2 человека (l-452)-Fc и 23 мутантных белков из него, когда значение сходимости сигмоидной кривой связывания TIE-1-Igγl-LALA с химерным белком Tie2 человека (1-452)-Fc принимали за 100% (таблица 8 и таблица 9). Кроме того, значение EC₅₀ и значение сходимости рассчитывали посредством нелинейного регрессионного анализа сигмоидной модели Eмакс. Результаты ELISA показаны на фиг. 7.

[0173]

В результате обнаружено, что по сравнению с химерным белком Tie2 человека (l-452)-Fc, TIE-1-Igγ1-LALA обладал значимо уменьшенным относительным значением по отношению к Tie2 (l-452)gl-Fc, Tie2 (l-452)g2-Fc и Tie2 (l-452)g4-Fc, представляющим собой мутантные белки. Кроме того, обнаружено, что по сравнению с химерным белком Tie2 человека (1-452)-Fc, TIE-1-Igγ1-LALA обладали уменьшенным относительным значением и увеличенным значением EC₅₀ в отношении Tie2 (l-452)g5-Fc, представляющего собой мутантный белок. В результате обнаружено, что TIE-1-Igγl-LALA обладал уменьшенной активностью связывания с Tie2 (l-452)gl-Fc, 35 Tie2 (l-452)g2-Fc, Tie2 (l-452)g4-Fc, и Tie2 (l-452)g5-Fc, в отличие от химерного белка Tie2 человека (1-452)-Fc. Поскольку TIE-1-Igγ1-LALA обладал уменьшенным относительным значением и сходным значением EC₅₀ в отношении Tie2 (1-452)A1-Fc, определили, что TIE-1-Igγ1-LALA не имел изменений в активности связывания с Tie2 (1-452)A1-Fc.

Таблица 8: Результаты ELISA

[Таблица 8]

	Относительное значение (%) интенсивности люминесценции	Значение EC50 (нг/мл)
Химерный белок Tie2 человека (1-452)-Fc	97	1,1
Tie2 человека (1-452)r1-Fc	97	1,1
Tie2 человека (1-452)r2-Fc	96	0,9
Tie2 человека (1-452)r3-Fc	102	1,0
Tie2 человека (1-452)r4-Fc	101	1,0
Tie2 человека (1-452)r5-Fc	102	1,0
Tie2 человека (1-452)r6-Fc	100	1,0
Tie2 человека (1-452)r7-Fc	100	1,1
Tie2 человека (1-452)g1-Fc	3	12,3
Tie2 человека (1-452)g2-Fc	72	5,5
Tie2 человека (1-452)g3-Fc	96	1,1
Tie2 человека (1-452)g4-Fc	53	18
Tie2 человека (1-452)g5-Fc	91	2,2
Tie2 человека (1-452)g6-Fc	105	1,3
Tie2 человека (1-452)m1-Fc	104	1,0
Tie2 человека (1-452)m3-Fc	103	1,0
Tie2 человека (1-452)y1-Fc	109	1,0
Tie2 человека (1-452)c1-Fc	104	1,0

Таблица 9: Результаты ELISA

[Таблица 9]

	Относительное значение (%) интенсивности люминесценции	Значение EC50 (нг/мл)
Химерный белок Tie2 человека (1-452)-Fc	98	1,0
Tie2 человека (1-452)A1-Fc	90	1,3
Tie2 человека (1-452)A2-Fc	95	1,3
Tie2 человека (1-452)A3-Fc	98	1,0
Tie2 человека (1-452)A4-Fc	100	1,0
Tie2 человека (1-452)A5-Fc	98	0,9
Tie2 человека (1-452)A6-Fc	99	1,1

[0174]

По результатам двух независимых экспериментов, ELISA и анализа SPR, Tie2 (l-452)gl-Fc, Tie2 (l-452)g2-Fc, Tie2 (l-452)g4-Fc и Tie2 (l-452)g5-Fc идентифицированы как мутантные белки, активность связывания с которыми TIE-1-Igγ1-LALA или полностью человеческого 2-16A2-Fab являлась уменьшенной в обоих экспериментах. Обнаружено, что аминокислоты номер 192, 194, 195, 197 и 198 в четырех мутантных белках являются очень важными эпитопами-кандидатами для связывания TIE-1-Igγ1-LALA с Tie2 человека. В настоящем документе, активность связывания Tie2 (l-452)g1-Fc, обладающего вариантами аминокислот I194A, N197A и L198A, являлась уменьшенной в анализе ELISA, в то время как активность связывания Tie2 (1-452)g3-Fc, обладающего вариантом аминокислоты I194A, с TIE-1-Igγ1-LALA не изменялась в анализе ELISA. Активность связывания Tie2 (1-452)g6-Fc, представляющего собой аминокислотный вариант L198A, не изменялась ни в анализе ELISA, ни в анализе SPR. Эти результаты показывают, что мутация аминокислоты номер 197 в Tie2 (l-452)g1-Fc являлась наиболее критической аминокислотой в качестве эпитопа. Наконец, обнаружено, что TIE-1-Igγ1-LALA связывается с аминокислотами номер 192, 195 и 197 из No. доступа NP 000450.2 в качестве эпитопов.

Промышленная применимость

[0175]

Антитело против Tie2 человека по настоящему изобретению можно применять для предотвращения или лечения различных относящихся к кровеносным сосудам заболеваний. Кроме того, полинуклеотид, экспрессирующие векторы, трансформированную клетку-хозяин и способы получения антитела по настоящему изобретению можно применять для получения антитела против Tie2 человека.

Текст списка последовательностей произвольного формата

[0176]

В пункте, озаглавленном номером <223> списка последовательностей ниже, приведено описание «Искусственная последовательность». Конкретно, последовательность оснований, показанная в SEQ ID NO: 1 в списке последовательностей, представляет собой последовательность оснований тяжелой цепи из TIE-1-Igγ1-LALA, и аминокислотная последовательность, показанная в SEQ ID NO: 2, представляет собой аминокислотную последовательность тяжелой цепи, кодируемую SEQ ID NO: 1. Последовательность оснований, показанная в SEQ ID NO: 3 в списке последовательностей, представляет собой последовательность оснований легкой цепи из TIE-1-Igγ1-LALA, TIE-1-Igγ1-1253A, TIE-1-Igγ1-WT, TIE-1-Igγ4-PE и полностью человеческого 2-16A2, и аминокислотная последовательность, показанная в SEQ ID NO: 4, представляет собой аминокислотную последовательность легкой цепи, кодируемой SEQ ID NO: 3. Последовательность оснований, показанная в SEQ ID NO: 5 в списке последовательностей, представляет собой последовательность оснований тяжелой цепи из TIE-l-Igγ1-1253A, и аминокислотная последовательность, показанная в SEQ ID NO: 6, представляет собой аминокислотную последовательность тяжелой цепи, кодируемой SEQ ID NO: 5. Последовательность оснований, показанная в SEQ ID NO: 7 в списке последовательностей, представляет собой последовательность оснований тяжелой цепи из TIE-1-Igγ1-WT, и аминокислотная последовательность, показанная в SEQ ID NO: 8, представляет собой аминокислотную последовательность тяжелой цепи, кодируемой SEQ ID NO: 7. Последовательность оснований, показанная в SEQ ID NO: 9 в списке последовательностей, представляет собой последовательность оснований тяжелой цепи из TIE-1-Igγ4-PE, и аминокислотная последовательность, показанная в SEQ ID NO: 10, представляет собой аминокислотную последовательность тяжелой цепи, кодируемой SEQ ID NO: 9. Последовательность оснований, показанная в SEQ ID NO: 11 в списке последовательностей, представляет собой последовательность оснований тяжелой цепи из полностью человеческого 2-16A2, и аминокислотная последовательность, показанная в SEQ ID NO: 12, представляет собой аминокислотную последовательность тяжелой цепи, кодируемой SEQ ID NO: 11. Аминокислотные последовательности, показанные в SEQ ID NO: 13-20 в списке последовательностей, представляют собой аминокислотные последовательности линкера. Аминокислотная последовательность, показанная в SEQ ID NO: 22 в списке последовательностей, представляет собой участок узнавания тромбина.

1. Антитело против Tie2 человека, содержащее

четыре вариабельные области тяжелой цепи и четыре вариабельные области легкой цепи,

две тяжелые цепи и четыре легкие цепи;

каждая тяжелая цепь содержит две структуры, состоящие из вариабельной области тяжелой цепи, содержащей CDR1, состоящую из аминокислот 31-35 аминокислотной последовательности SEQ ID NO:2, CDR2, состоящую из аминокислот 50-66 аминокислотной последовательности SEQ ID NO:2, и CDR3, состоящую из аминокислот 99-111 аминокислотной последовательности SEQ ID NO:2, и области CH1, области CH2 и области CH3, причем карбокси-конец (C-конец) одной структуры связан с амино-концом (N-концом) другой структуры посредством линкера; и

каждая легкая цепь содержит вариабельную область легкой цепи, содержащую CDR1, состоящую из аминокислот 24-39 аминокислотной последовательности SEQ ID NO:4, CDR2, состоящую из аминокислот 55-61 аминокислотной последовательности SEQ ID NO:4, и СDR3, состоящую из аминокислот 94-102 аминокислотной последовательности SEQ ID NO:4, и константную область легкой цепи.

2. Антитело против Tie2 человека по п.1, выбранное из (1) или (2) ниже:

(1) антитела против Tie2 человека, содержащего

две тяжелые цепи и четыре легкие цепи, в которых

каждая тяжелая цепь содержит две структуры, состоящие из вариабельной области тяжелой цепи, состоящей из аминокислот 1-122 аминокислотной последовательности SEQ ID NO:2, и области CH1, области CH2 и области CH3, причем C-конец одной структуры связан с N-концом другой структуры посредством линкера; и

каждая легкая цепь содержит вариабельную область легкой цепи, состоящую из аминокислот 1-113 аминокислотной последовательности SEQ ID NO:4, и константную область легкой цепи; и

(2) антитела против Tie2 человека, которое пироглутамилировано на N-конце вариабельной области тяжелой цепи антитела против Tie2 человека из (1).

3. Антитело против Tie2 человека по п.2, выбранное из (1) или (2) ниже:

(1) антитела против Tie2 человека, содержащего

две тяжелые цепи, состоящие из аминокислот 1-122 аминокислотной последовательности SEQ ID NO:2, и

четыре легкие цепи, состоящие из аминокислотной последовательности SEQ ID NO:4; или

(2) антитела против Tie2 человека, содержащего

две тяжелые цепи, состоящие из аминокислотной последовательности SEQ ID NO:2, в которой глуматаминовая кислота в положении 1 модифицирована на пироглутаминовую кислоту и/или лизин в положении 679 делетирован, и

четыре легкие цепи, состоящие из аминокислотной последовательности SEQ ID NO:4.

4. Антитело против Tie2 человека по п.3, содержащее

две тяжелые цепи, состоящие из аминокислотной последовательности SEQ ID NO:2, и

четыре легкие цепи, состоящие из аминокислотной последовательности SEQ ID NO:4.

5. Антитело против Tie2 человека по п.3, содержащее

две тяжелые цепи, состоящие из аминокислот 1-678 аминокислотной последовательности SEQ ID NO:2, и

четыре легкие цепи, состоящие из аминокислотной последовательности SEQ ID NO:4.

6. Фармацевтическая композиция для профилактики или лечения диабетического отека желтого пятна, содержащая эффективное количество антитела против Tie2 человека по п.4 и/или антитела против Tie2 человека по п.5 и фармацевтически приемлемое вспомогательное вещество.

7. Фармацевтическая композиция для профилактики или лечения диабетической ретинопатии, содержащая эффективное количество антитела против Tie2 человека по п.4 и/или антитела против Tie2 человека по п.5 и фармацевтически приемлемое вспомогательное вещество.

8. Фармацевтическая композиция для профилактики или лечения критической ишемии конечностей, содержащая эффективное количество антитела против Tie2 человека по п.4 и/или антитела против Tie2 человека по п.5 и фармацевтически приемлемое вспомогательное вещество.

9. Применение антитела против Tie2 человека по п.3 для профилактики или лечения диабетического отека желтого пятна.

10. Применение антитела против Tie2 человека по п.3 для профилактики или лечения диабетической ретинопатии.

11. Применение антитела против Tie2 человека по п.3 для профилактики или лечения критической ишемии конечностей.

12. Применение антитела против Tie2 человека по п.3 для изготовления фармацевтической композиции для профилактики или лечения диабетического отека желтого пятна.

13. Применение антитела против Tie2 человека по п.3 для изготовления фармацевтической композиции для профилактики или лечения диабетической ретинопатии.

14. Применение антитела против Tie2 человека по п.3 для изготовления фармацевтической композиции для профилактики или лечения критической ишемии конечностей.