Штамм вируса гриппа a/hk/hk/6:2/2016 (h9n2) для получения инактивированных и живых гриппозных вакцин



Штамм вируса гриппа a/hk/hk/6:2/2016 (h9n2) для получения инактивированных и живых гриппозных вакцин
Штамм вируса гриппа a/hk/hk/6:2/2016 (h9n2) для получения инактивированных и живых гриппозных вакцин
Штамм вируса гриппа a/hk/hk/6:2/2016 (h9n2) для получения инактивированных и живых гриппозных вакцин
Штамм вируса гриппа a/hk/hk/6:2/2016 (h9n2) для получения инактивированных и живых гриппозных вакцин
Штамм вируса гриппа a/hk/hk/6:2/2016 (h9n2) для получения инактивированных и живых гриппозных вакцин
Штамм вируса гриппа a/hk/hk/6:2/2016 (h9n2) для получения инактивированных и живых гриппозных вакцин
Штамм вируса гриппа a/hk/hk/6:2/2016 (h9n2) для получения инактивированных и живых гриппозных вакцин
Штамм вируса гриппа a/hk/hk/6:2/2016 (h9n2) для получения инактивированных и живых гриппозных вакцин
C12N1/00 - Микроорганизмы, например простейшие; их композиции (лекарственные препараты, содержащие материал из микроорганизмов A61K 35/66; приготовление лекарственных составов, содержащих бактериальные антигены или антитела, например бактериальных вакцин A61K 39/00); способы размножения, содержания или консервирования микроорганизмов или их композиций; способы приготовления или выделения композиций, содержащих микроорганизмы; питательные среды

Владельцы патента RU 2702833:

федеральное государственное бюджетное учреждение "Научно-исследовательский институт гриппа имени А.А. Смородинцева" Министерства здравоохранения Российской Федерации (ФГБУ "НИИ гриппа им. А.А. Смородинцева" Минздрава России) (RU)

Изобретение относится к области биотехнологии. Изобретение представляет собой Influenzavirus А, подтип H9N2, штамм А/HK/HK/6:2/2016 (H9N2), депонированный в Государственную коллекцию вирусов ФГБУ «ФНИЦЭМ им. Н.Ф. Гамалеи» Минздрава России под №2884, для производства инактивированных и живых гриппозных вакцин против потенциально пандемического вируса гриппа A/H9N2. Изобретение позволяет усилить защитные действия вакцин против пандемического вируса гриппа А подтипа Н9. 3 ил., 5 табл., 5 пр.

 

Изобретение относится к области медицинской биотехнологии и предназначено для получения моно- или поливалентных инактивированных (ИГВ) и живых (ЖГВ) гриппозных вакцин в целях иммунизации населения против потенциально пандемических вирусов гриппа А подтипа Н9. Полученный вакцинный штамм относится к семейству Orthomyxoviridae, род Influenza virus А.

Вирусы гриппа, циркулирующие среди животных, создают угрозу здоровью человека в случае непосредственного инфицирования и еще большую - при реассортации с вирусами человека, часто приводящей к возникновению особо патогенных вирусов с новыми антигенными свойствами.

Большинство вирусов диких птиц циркулируют и среди домашней птицы, вызывая у них заболевания разной степени тяжести, представляя угрозу для человека. Вирусы подтипа A/H9N2, как правило, являются вирусами с низкой патогенностью, вызывающие легкое и умеренное заболевание. Однако коинфекция с другими патогенами вызывает случаи тяжелых заболеваний и смертельные исходы [Dong G. et al., 2011]. Вирус A/H9N2 впервые был выделен из индейки в Висконсине в 1966 году [Gao Н. et al., 2015]. Начиная с 1990х вирус укоренился в странах Азии, Ближнего Востока и Северной Африки [Gu М., 2017]. На текущий момент вирус был детектирован у множества видов диких и домашних птиц во многих странах по всему миру и считается самым распространенным подтипом вируса гриппа среди домашней птицы [Li X. et al., 2018; Alexander D.J., 2007]. Вирусы подтипа A/H9N2 были обнаружены и у свиней, в организме которых может произойти реассортация с другими подтипами вирусов гриппа, что приведет к появлению потенциально пандемических вариантов вируса.

Также зарегистрированы случаи поражения людей вирусом подтипа A/H9N2 [Xu С. et al., 2018]. Генетический анализ вирусов подтипа A/H9N2, выделенных от домашней птицы, показал, что вирусы способны связываться и с α-2-6 сиалозидами, которые являются рецепторами человеческого типа, а также способны передаваться воздушно-капельным путем между хорьками, что является предпосылкой к передаче вируса от человека к человеку [Li X. et al., 2014]. Кроме того, недавние исследования показали, что вирусы A/H9N2 являются донором сегментов внутренних белков для таких высокопатогенных вирусов как A/H5N1, A/H7N9, A/H5N6 и A/H10N8 [Gu М., 2017; Wei Y., 2016]. Таким образом, распространение низкопатогенного вируса A/H9N2 у разных хозяев способствует появлению новых вариантов высокопатогенных вирусов. По всем этим факторам, а также из-за отсутствия иммунитета у популяции людей к вирусу данного подтипа, вирус A/H9N2 имеет пандемический потенциал [Longping V.Т. et al., 2014]

Необходимость разработки противопандемических мер, в том числе и для борьбы с вирусами птичьего гриппа, отражена в приказе Роспотребнадзора РФ [Приказ №40 от 28.12.2004]. В «Глобальном плане ВОЗ по подготовке к борьбе с гриппом» до начала пандемии национальным органам рекомендуется испытывать и лицензировать пандемические вакцины, а также поддерживать развитие производства и обмена прототипами сезонных и пандемических вакцин, для возможного целевого их применения. В связи с этим актуальными являются исследования по подготовке вакцинных препаратов против вирусов гриппа подтипов A/H9N2, а также испытания этих вакцинных препаратов на животных моделях.

В настоящее время работы по созданию вакцин против пандемических вирусов гриппа подтипа A/H9N2 ведутся во всем мире, ряд вакцин находятся на различных стадиях доклинических [Desheva Y.A., 2015] и клинических испытаний [Karron R.A.,2009; Atmar R.L., 2011; Aichinger G., 2015; Nicholson K.G., 2009]. Это в основном инактивированные вакцины, полученные на основе штаммов, выделенных от человека. (Табл. 1)

В качестве донора генов внутренних белков для получения реассортанта на основе вируса A/H9N2 мы использовали разработанный в ФГБУ «НИИ гриппа» Минздрава России универсальный донор А/Гонконг/1/68/162/35 (H3N2) [Патент №2511431 от 25.07.2011], который ориентирован на получение реассортантных штаммов как для живой, так и для инактивированной гриппозных вакцин.

Задачей, на решение которой направлено заявляемое изобретение, было получение реассортанта на основе вируса гриппа A/H9N2 и донора генов внутренних белков A/Гонконг/1/68/162/35(H3N2) методом классической генетической реассортации, для производства инактивированных и живых гриппозных вакцин.

Получение штамма вируса гриппа RA-52 (A/HK/HK/6:2/2016 (H9N2))

Штамм вируса гриппа RA-52 (A/HK/HK/6:2/2016 (H9N2)) получен методом классической генетической реассортации штамма-донора А/Гонконг/1/68/162/35 (H3N2) и потенциально пандемического вируса A/Hong Kong/1073/99 (H9N2). При получении штамма было проведено 12 пассажей в 10-12 дневных развивающихся куриных эмбрионах. Селективными факторами для отбора необходимых клонов являлись пониженная температура (26°С) и присутствие гипериммунной сыворотки к штамму А/Гонконг/1/68/162/35 (H3N2).

Штамм представляет собой реассортант с формулой генома 6:2. Состав генома: 6 генов внутренних и неструктурных белков (РВ2, РВ1, PA, NP, М и NS) от вируса-донора А/Гонконг/1/68/162/35 (H3N2) и 2 гена (НА и NA) от вируса дикого типа.

Подтверждение состава генома было выполнено с использованием рестрикционного анализа ДНК-копий сегментов РНК, полученных с помощью обратно-транскриптазной полимеразно-цепной реакции (ОТ-ПЦР). Полученные с помощью ОТ-ПЦР ДНК-копии сегментов РВ2, РВ1, PA, NP, М и NS вирусов А/Гонконг/1/68/162/35 и A/Hong Kong/1073/99 (H9N2) (обозначены на фиг. 1 как Н3 и Н9) обрабатывали эндонуклеазами рестрикции Bse3DI, MroNI, Ama87I, PstI, BslFI и BslFI соответственно. Принадлежность NA определяли методом ОТ-ПЦР с типоспецифичными праймерами к различным субтипам. Анализ ДНК-копий сегментов РНК (фиг. 1) показал, что реассортант RA-52 имеет состав генома 6:2.

Антигенное соответствие гемагглютинина родительскому штамму дикого типа у реассортанта RA-52 было подтверждено в реакции торможения гемагглютинации (РТГА) (табл. 2).

Показано, что вакцинный кандидат RA-52 антигенно идентичен родительскому штамму дикого типа.

Полногеномное секвенирование показало отсутствие у реассортанта RA-52 замен в нуклеотидной последовательности, по сравнению с родительскими штаммами. Нуклеотидные последовательности сегментов реассортанта RA-52 опубликованы в базе данных GISAID под номером EPI_ISL_321099.

Характеристика полученного штамма

Пример 1. Репродуктивные свойства штамма A/HK/HK/6:2/2016 (H9N2) (RA-52).

Штамм вируса гриппа RA-52 тестировали на инфекционную активность путем заражения развивающихся куриных эмбрионов 10-дневного возраста в соответствии с Методическими указаниями 3.3.2.1758-03 "Методы определения показателей качества иммунобиологических препаратов для профилактики и диагностики гриппа". Готовили десятикратные падающие разведения вируссодержащей аллантоисной жидкости. Каждым разведением начиная с 10-4 до 10-10 заражали по 3 куриных эмбриона. Инкубировали 48 часов при температуре 32°С. Наличие вируса определяли в РГА, инфекционную активность вируса рассчитывали по методу Рида и Менча.

Штамм вируса гриппа A/HK/HK/6:2/2016 (H9N2) показал высокую репродуктивную активность в РКЭ. Гемагглютинирующая активность реассортанта RA-52 составила 512-1024 ГАЕ/50 мкл с 0,5% взвесью куриных эритроцитов. Инфекционная активность в РКЭ составила - 8,5 lgЭИД50/0,2 мл.

Пример 2. Вакцинный штамм RA-52 обладает свойствами температурной чувствительности и холодоадаптированности.

Донор А/Гонконг/1/68/162/35 является универсальным, то есть обладает как высокой репродуктивностью, так и маркерами аттенуации - имеет температурочувствительный (ts) и холодоадаптированный (ca) фенотип. Реассортанты на основе донора А/Гонконг/1/68/162/35, также наследуют ts-, ca-фенотип.

Полученный реассортант наследовал от штамма-донора А/Гонконг/1/68/162/35 ts-, ca-фенотип - способность хорошо репродуцироваться при пониженной температуре и почти полную потерю способности к репродукции при повышенной температуре (табл. 3).

RCT (Reproductive capacity at different temperatures) - репродуктивная способность при различных температурах

ts - температурочувствительный фенотип (RCT39 более 5 lgЭИД50/0,2 мл)

ca - холодоадаптированный фенотип (RCT26 не более 3 lgЭИД50/0,2 мл)

Стабильность реассортанта проверяли 5-кратным пассированием при температуре 32°C в системе РКЭ. Степень температурочувствительности и холодоадаптированности, а также уровень репродукции реассортантного штамма не изменялись. Таким образом, реассортантный штамм удовлетворяет требованиям температурочувствительности и холодовой адаптации, предъявляемым к вакцинным штаммам для ЖГВ, и требованиям высокой репродуктивности для ИГВ.

Пример 3. Заявляемый вакцинный штамм RA-52 безопасен для мышей.

Тестирование штамма вируса гриппа RA-52 на специфическую безопасность проводили на линейных белых мышах Balb/c, самках, массой 18-20 г (16 шт.). В исследованиях использовали здоровых животных, на которых ранее не проводили какие-либо испытания. Испытания проводили в соответствии с методическими указаниями МУК 4.1/4.2.588-96.

Мышей инфицировали интраназально в дозе 6,5 lgЭИД50 на мышь, в объеме 50 мкл. В течение периода наблюдения (14 суток) у животных не наблюдалось потери массы тела (фиг. 2) и развития клинических симптомов инфекции. На 3-й и 6-е сутки после заражения у трех мышей проводили забор органов (легкие, носовые ходы) с целью индикации антигена и его накопления. Репродукцию вируса определяли по показателям титрования суспензии органов в культуре клеток MDCK. Результаты приведены в табл. 4.

У мышей, инфицированных штаммом дикого типа, наблюдается репродукция вируса в носовых ходах как на 3-й, так и на 6-е сутки. В легких на 3-й сутки наблюдается высокий уровень репликации вируса. У мышей, инфицированных реассортантным штаммом, наблюдалось наличие вируса только в носовых ходах на 3-й и 6-е сутки, при этом уровень репликации вируса к 6-м суткам заметно снижался. В легких вирус не реплицируется, что подтверждает его аттенуированный фенотип. Полученные данные доказывают специфическую безопасность реассортантного штамма RA-52.

Пример 4. Вакцинный штамм RA-52 является иммуногенным для мышей.

На основе реассортантных штаммов были подготовлены кандидатные вакцинные препараты живой и инактивированной гриппозных вакцин (ЖГВ и ИГВ соответственно). Для получения ЖГВ накопленный вирусный материал реассортантного вируса разводили фосфатно-солевым буфером (ФСБ) до концентрации 6,5 lgЭИД50/50 мкл. ЖГВ вводили интраназально, в объеме 50 мкл. Для получения ИГВ вирусный материал инактивировали 0,02% формалином, затем очищали и концентрировали методом изопикнического центрифугирования в градиенте плотности сахарозы. Содержание гемагглютинина в вакцинном препарате оценивали методом электрофореза в полиакриламидном геле с последующей денситометрией. Доза ИГВ (250 мкл) содержала 10 мкг НА. В качестве адъюванта в одной из групп использовали полиоксидоний (ПО) - 200 мкг на дозу. ИГВ вводили внутримышечно (в верхнюю треть бедра задних конечностей).

Препараты ЖГВ и ИГВ использовали для иммунизации мышей и исследования иммуногенности. Иммунизация была проведена двукратно с двухнедельным интервалом. Данные по содержанию антигемагглютинирующих антител к вирусам гриппа в сыворотках крови мышей, иммунизированных препаратами ЖГВ и ИГВ RA-52, демонстрируют достоверное (p<0,05) повышение уровня антигемагглютинирующих антител по сравнению с контрольными животными. Среднегеометрический титр (СГТ) антигемагглютинирующих антител в сыворотках после 2й иммунизации ЖГВ, ИГВ и ИГВ + ПО составил 320,139.3 и 367.6 соответственно (фиг. 3).

Полученные данные показывают, что после иммунизации мышей моновакцинами ЖГВ и ИГВ на основе реассортанта RA-52 формируются гемагглютинирующие антитела в титрах, превышающих защитные титры (защитный титр в РТГА ≥ 1:40). Таким образом, и живая и инактивированная моновакцины на основе полученного реассортанта RA-52, являются высоко иммуногенными.

Пример 5. Вакцинный штамм RA-52 обладает протективным действием для мышей.

Степень защиты, которую дают моновакцина ИГВ и ИГВ + ПО на основе реассортанта RA-52, в сравнении с контрольной группой, оценивали на самках мышей линии Balb/c на модели летального заражения. Мышей (по 5 в группе) через 2 недели после последней иммунизации заражали интраназально вирусом дикого типа A/Hong Kong/1073/99 (H9N2) в дозе 6,5 lgЭДИ50 на мышь. Далее на 3-й сутки после заражения у мышей проводили забор легких с целью индикации антигена и его накопления. Репродукцию вируса определяли по показателям титрования суспензии органов в культуре клеток MDCK. Результаты приведены в табл. 5.

В легких мышей, иммунизированных ИГВ и ИГВ + ПО RA-52, вирус не реплицируется. В противоположность этому, в контрольной группе наблюдается высокий титр вируса в легких мышей. Эти данные свидетельствуют о том, что моновакцина ИГВ на основе реассортанта RA-52 обладает выраженным защитным действием против вируса гриппа A/Hong Kong/1073/99 (H9N2).

Influenzavirus А, подтип H9N2, штамм А/HK/HK/6:2/2016 (H9N2), депонированный в Государственную коллекцию вирусов ФГБУ «ФНИЦЭМ им. Н.Ф. Гамалеи» Минздрава России под №2884, для производства инактивированных и живых гриппозных вакцин против потенциально пандемического вируса гриппа A/H9N2.



 

Похожие патенты:
Изобретение относится к области биотехнологии. Изобретение представляет собой питательную среду плотную для культивирования и сбора биомассы вакцинного штамма чумного микроба Y.

Изобретение относится к биотехнологии. Предложен штамм гриба Stagonospora cirsii, являющийся продуцентом гербарумина I и стагонолида А.

Изобретение относится к микробиологии и биотехнологии. Предложен рекомбинантный штамм дрожжей Pichia pastoris ВКПМ Y-4394, продуцирующий ксиланазу.

Изобретение относится к микробиологии и биотехнологии. Предложен рекомбинантный дрожжей Komagataella kurtzmanii ВКПМ Y-4464, продуцирующий β-глюканазу.

Изобретение относится к микробиологии и биотехнологии. Предложен рекомбинантный штамм дрожжей Pichia pastoris ВКПМ Y-4484, продуцирующий фитазу.

Изобретение относится к микробиологии и биотехнологии. Предложен рекомбинантный штамм дрожжей Pichia pastoris ВКПМ Y-4463, продуцирующий β-глюканазу.

Изобретение относится к оценке вирулентности in vitro штаммов туляремийного микроба подвидов Francisella tularensis subsp. tularensis, subsp.

Изобретение относится к области биотехнологии, а именно к получению высокоочищенного минерального матрикса с остеоиндуктивными свойствами, предназначенного для замещения дефектов костной ткани, из биологического материала, представляющего собой костную ткань млекопитающих, и его применению.

Изобретение относится к области биотехнологии. Изобретение представляет собой холодоадаптированный штамм вируса ветряной оспы «vFiraVax», депонированный в Государственной коллекции вирусов Института вирусологии им.

Изобретение относится к области биотехнологии. Изобретение представляет собой щтамм бактерий p.

Изобретение относится к области биотехнологии. Influenzavirus А, подтип H5N8, штамм A/UNL/HK/2:6/2017 (H5N8), депонированный в Государственную коллекцию вирусов ФГБУ «ФНИЦЭМ им. Н.Ф. Гамалеи» Минздрава России под №2885, для производства инактивированных и живых гриппозных вакцин против потенциально пандемического вируса гриппа A/H5N8. Изобретение позволяет усилить защитные действия вакцин против пандемического вируса гриппа А подтипа Н5. 6 ил., 5 табл., 5 пр.

Изобретение относится к способу использования маркерных белков сапробных групп индикаторных организмов для оценки экологического состояния окружающей среды. Способ предусматривает отбор пробы организмов из оцениваемой среды, проведение анализа аминокислотных последовательностей маркерных белков индикаторных организмов на определение участков аминокислотных последовательностей маркерных белков, уникальных для каждой сапробной группы индикаторных организмов. Для указанного анализа аминокислотных последовательностей маркерных белков создают выборку аминокислотных последовательностей белка для каждой сапробной группы индикаторных организмов, осуществляют множественное выравнивание маркерных белков и проводят определение участков аминокислотных последовательностей маркерных белков, уникальных для каждой сапробной группы индикаторных организмов. Затем получают антитела, специфически распознающие эти участки аминокислотных последовательностей маркерных белков, иммунноферментным анализом определяют количество маркерных белков каждой сапробной группы индикаторных организмов в пробе, к которой - сапробной группе - получены антитела. Определяют суммарное количество маркерных белков всех сапробных групп индикаторных организмов. Рассчитывают частоту встречаемости каждой сапробной группы индикаторных организмов в пробе, для чего количество маркерного белка каждой сапробной группы индикаторных организмов делят на суммарное количество маркерных белков всех сапробных групп индикаторных организмов в пробе. Рассчитывают суммарный индикаторный вес (СИВ) сапробных групп индикаторных организмов в пробе, указывающий на сапробность водоема, для чего частоту встречаемости каждой сапробной группы индикаторных организмов умножают на её – сапробной группы - индикаторный вес, равный 0,1 для ксеносапробной группы, 1,0 для олигосапробной группы, 2,0 для b-мезосапробной группы, 3,0 для а-мезосапробной группы, 4,0 для полисапробной группы. Полученные результаты суммируют. Оценивают экологическое состояние окружающей среды следующим образом: при СИВ менее 0,5 окружающую среду оценивают предельно чистой и благополучной; при СИВ от 0,5 до 1,5 окружающую среду оценивают чистой и благополучной, не нуждающейся в выполнении природоохранных мероприятий; при СИВ от 1,5 до 2,5 окружающую среду оценивают удовлетворительной чистоты, нуждающейся в выполнении природоохранных мероприятий по мере возможности; при СИВ от 2,5 до 3,5 окружающую среду оценивают загрязненной, нуждающейся в выполнении природоохранных мероприятий, направленных на устранение отдельных видов загрязнителей и последствий их действия; при СИВ от 3,5 и более окружающую среду оценивают грязной и неблагополучной, нуждающейся в срочном выполнении комплексных природоохранных мероприятий. Изобретение может быть использовано для оценки экологического состояния окружающей среды. 5 пр., 5 ил.
Наверх