Способ получения фармацевтической субстанции гиалуронидазы

Изобретение относится к производству фармацевтических субстанций ферментов, а именно к способу получения гиалуронидазы из животного сырья - семенников крупного рогатого скота (КРС). Предварительно измельченное животное сырье подвергают экстракции водным раствором уксусной кислоты при постоянном перемешивании в соотношении 1 к 2 в течение 4 ч. Затем экстракт центрифугируют и фильтруют. Доводят рН до значения 4,0-4,5, проводят сорбцию и десорбцию элюентом с рН=10-11 на макропористом сульфокатионите, концентрируют элюат в тангенциальном потоке, лиофилизируют. Изобретение позволяет повысить активность гиалуронидазы. 7 з.п. ф-лы, 3 пр.

 

Предполагаемое изобретение относится к производству фармацевтических субстанций ферментов, а именно к способу получения гиалуронидазы из животного сырья - семенников крупного рогатого скота (КРС).

Гиалуронидаза - фермент (точнее, группа ферментов), который вызывает распад гиалуроновой кислоты и тем самым уменьшает ее вязкость, увеличивает проницаемость тканей и облегчает движение жидкостей в межтканевых пространствах. Терапевтическое действие гиалуронидазы, основанное на ее способности вызывать гидролиз гиалуроновой кислоты (основного субстрата соединительной ткани), используется при лечении рубцовых образований - склеродермии, контрактур суставов, ожогов, фиброзных тканей. Применение препаратов гиалуронизады наряду с анестезирующими веществами ускоряет всасывание последних и способствует более глубокому проникновению их в ткани и уменьшению отека. В последние годы интенсивно обсуждается возможность использования препаратов, содержащих гиалуронидазу, в акушерстве и гинекологии [1]

Известны способы получения препаратов на основе гиалуронидазы:

1. Известен способ получения препарата "Лидаза" в соответствии с патентом 111012 (СССР) [2], включающий аутолиз тестикулярной ткани в присутствии уксусной кислоты, обработку 4 объемами охлажденного ацетона, центрифугирование, растворение в дистиллированной воде, центрифугирование, стерильную фильтрацию, ампулирование и лиофилизацию. Недостатком данного способа является использование органического растворителя ацетона, в связи с чем производственный участок должен относится к категории А по взрывопожароопасности, а условия труда являются вредными.

2. Известен способ получения Лидазы в соответствии с патентом 827068 (СССР) [3], включающий экстракцию семенников КРС 0,1 н уксусной кислотой при температуре 5-10°С, осаждение ацетоном, переосаждение, растворение осадка в воде, фильтрацию, диализ и сублимационную сушку. Данный способ имеет недостаток, представленный в пункте 1.

3. Известен способ получения ронидазы в соответствии с патентом СССР 566875 [4], включающий экстракцию уксусной кислотой, концентрирование (сгущение), отделение балластных белков, обработку спиртом, промывку ацетоном, а затем серным эфиром. Данный способ имеет недостаток, представленный в пункте 1. Кроме того экстракцию осуществляют при температуре 2-40°С, в то время как гиалуронидаза является термолабильным ферментом и теряет активность при высоких температурах.

4. Известен способ получения гиалуронидазы в соответствии с патентом РФ 2054943 [5], включающий очистку и измельчение семенников КРС, экстракцию водным раствором уксусной кислоты при рН 4,5-4,7 в течение 6 ч. при температуре 6-10°С, центрифугирование, концентрирование на полых волокнах, охлаждение до 4-8°С, смешивание с охлажденным хлороформом, перемешивание, выдерживание с натрием хлористым в течение 1,5-2 ч, центрифугирование, ультрафильтрацию, стерилизующую фильтрацию, розлив в ампулы и лиофилизацию. Недостатком данного способа является использование в технологии органического растворителя хлороформа, который является ядом и наркотиком.

5. Известен способ получения гиалуронидазы в соответствии с патентом RU 2090207 [6], включающий экстракцию измельченных семенников водным раствором уксусной кислоты, фильтрацию экстракта через сукно, ультрафильтрацию через полисульфоновые или фторопластовые мембраны с пределом пропускания не более 10 кДа, сублимационную сушку. Недостаток данного способа заключается в повышении температуры экстракта до 20-40°С, что приводит к частичной инактивации фермента.

6. Известен способ получения препарата "Лидаза" в соответствии с патентом RU 2150948 [7], включающий измельчение семенников крупного рогатого скота, экстракцию, чистку продукта фильтрацией, стерилизацию и сушку. Недостатки данного способа заключаются в том, что процесс экстракции длится 19-20 ч., что увеличивает производственный цикл, а длительное выдерживание не приводит к увеличению целевого продукта. Другой недостаток заключается в том, что ультрафильтрацию проводят при разбавлении 0,9% раствором хлорида натрия, что приводит к превышению показателя «Хлориды» в готовом продукте.

7. Известен способ получения гиалуронидазы в соответствии с патентом RU 2159284 [8], включающий измельчение и гомогенизацию семенников убойных животных, уксуснокислую экстракцию гомогената, его замораживание при температуре (-5) - (-20)°С с последующим оттаиванием, ультрафильтрацию в тангенциальном потоке на мембранах с селективностью 15-20 кД, сорбцию балластных примесей этакридина лактатом и активированным углем. Недостатком данного способа является стадия замораживания-оттаивания, т.к. она технологически трудно масштабируема в виду больших объемов экстракта и требует затрат на охладитель.

8. Известен способ получения гиалуронидазы в соответствии с патентом RU 2027759 [9], включающий гомогенизацию замороженных семенников убойных животных, экстракцию разбавленной уксусной кислотой, центрифугирование, концентрирование ультрафильтрацией в тангенциальном потоке, осаждение полиэтиленгликолем, катионообменную хроматографию на СМ-целлюлозе. Недостаток данного способа связан с тем, что экстракт сырья животного происхождения представляет собой мутную взвесь с частицами жира, он забивает поры мембраны, что значительно сокращает срок ее эксплуатации и приводет к увеличению требуемой площади поверхности фильтрации.

9. Известен способ получения гиалуронидазы в соответствии с патентом RU 2126044 [10], включающий кислотную экстракцию молок рыб, центрифугирование, сепаририрование, фильтрацию на нутч-фильтре, хроматографию на макропористом катионите, высаливание сернокислым аммонием. Недостатками указанного способа получения гиалуронидазы являются использование в качестве сырья - молок рыб, по которым отсутствуют нормативные документы, необходимые для применения сырья в фармацевтической промышленности, например, технические условия. При использовании данного сырья возможно гелирование экстракта, что предопределяет необходимость дополнительного осветления.

Наиболее близким к предлагаемому изобретению по технической сущности и достигаемому эффекту является способ получения гиалуронидазы в соответствии с патентом RU 2658605 [11]. Способ включает экстракцию измельченного сырья 0,1 н раствором уксусной кислоты в течение 4 ч., центрифугирование / сепарирование, ионообменную сорбцию на макропористом сульфокатионите с последующей элюцией фермента с носителя аммиачным элюентом рН 10.0-11.0. Недостатком данного способа является получение продукта в виде раствора, который имеет короткий срок годности, а также наличие в продукте неорганических ионов, например, сульфата.

Целью предлагаемого изобретения является получение фармацевтической субстанции гиалуронидазы в лиофильной форме, которая обладает повышенным сродством к субстрату и повышенной удельной гиалуронидазной активностью.

Цель достигается использованием способа получения гиалуронидазы, который включает следующие стадии. Семенники КРС измельчают и экстрагируют водным раствором уксусной кислоты в соотношении 1:2 (сырье : экстрагент) при перемешивании и температуре +2…+8°С в течение 24 ч. Гомогенат центрифугируют, фильтруют через бумажный фильтр, доводят рН до значения 4,0-4,5. Прозрачный экстракт подают на ионообменную колонну с сорбентом с определенной скоростью, сорбцию целевого продукта ведут из экстракта на макропористых сульфокатионитах. После завершения сорбции катионит промывают буферным раствором / подкисленной водой с рН=3,5-4,5. Затем осуществляют десорбцию фермента с ионита путем подачи сверху вниз элюента с рН 10.0-11.0 с определенной скоростью. Проводят концентрирование элюата в тангенциальном потоке на ультрафильтрационной кассете с номинальным отсечением пор по молекулярной массе 30-50 кДа, лиофилизацию.

Отличительными признаками предложенного способа от прототипа является наличие стадий концентрирования и лиофилизации.

Положительный эффект от предложенного технического решения состоит в следующем:

1. Введение стадии концентрирования после стадии десорбции позволяет удалить неорганические анионы (сульфаты, ацетаты) и катионы (аммоний), контроль которых предопределен требованиями ГФ 13.

2. Введение стадии концентрирования после стадии десорбции позволяет удалить низкомолекулярные белковые примеси. Так константа Михаэлиса-Мэнтена (K_m) экстракта семенников КРС равна 0,94 мг/мл, а K_m раствора гиалуронидазы после концентрирования равна 0,4 мг/мл. Чем меньше значение константы Михаэлиса-Мэнтена, тем выше скорость ферментативной реакции, что свидетельствует об увеличении степени сродства фермента к субстрату, а, следовательно, и о повышении степени очистки.

3. Введение стадии сушки позволяет получить субстанцию в лиофильной форме, а не в виде раствора. Раствор имеет короткий срок годности, по сравнению с лиофилизатом, в виду потери гиалуронидазной активности.

4. Стадия концентрирования элюата перед лиофилизацией позволяет уменьшить объемы раствора на сушку, что способствует уменьшению затрат на оборудование для лиофилизации.

5. Введение стадии концентрирования приводит к повышению удельной гиалуронидазной активности, т.к. происходит удаление балластных белков. Удельная активность увеличивается на 10-15% и составляет 4500-8500 УЕ/мг белка.

Способ иллюстрируется следующими примерами:

Пример 1

Семенники КРС разрезают на куски и измельчают в мясорубке. К 100 г измельченного сырья добавляют 200 мл экстрагента (водный раствор уксусной кислоты). Экстракция идет в течение 4 ч. при постоянном перемешивании на шейкере. Гомогенат центрифугируют и фильтруют через 2 слоя фильтровальной бумаги для осветления раствора, доводят рН до значения 4,4. Сорбент Nuvia™ S подготавливают в соответствии с инструкцией производителя, перед сорбцией уравновешивают 0,1 н раствором NH₄Cl с рН=4,4. Проводят сорбцию целевого продукта из осветленного экстракта со скоростью 220 мл/см² ч. до проскока целевого продукта. После завершения сорбции катионит Nuvia™ S промывают подкисленной водой с рН=3,5. Элюцию проводят 1 н раствором сульфата аммония с рН=10.5 со скоростью 90 мл/см² ч. Сорбент промывают водой и регенерируют. Проводят концентрирование элюата в 10 раз по объему на ультрафильтрационной кассете с номинальным отсечением по молекулярной массе 30 кДа. Все процессы ведут на холоду (+2…+8°С или в ледяной бане). Концентрат замораживают и лиофилизируют.

Пример 2

Семенники КРС разрезают на куски и измельчают в мясорубке. К 500 г измельченного сырья добавляют 1000 мл экстрагента (водный раствор уксусной кислоты). Экстракция идет в течение 4 ч. при постоянном перемешивании на шейкере. Гомогенат центрифугируют и фильтруют через 2 слоя фильтровальной бумаги и слой бязи, доводят рН до значения 4,5. Сорбент ReliSorb™ SP 400 подготавливают в соответствии с инструкцией производителя, перед сорбцией кондиционируют. Проводят сорбцию целевого продукта из осветленного экстракта со скоростью 200 мл/см² ч. до проскока целевого продукта. После завершения сорбции катионит ReliSorb™ SP 400 промывают ацетатным буфером с рН=4,1. Элюцию проводят водным раствором аммиака с рН=10.8 со скоростью 80 мл/см² ч. Сорбент промывают водой и регенерируют. Проводят концентрирование элюата в 15 раз по объему на ультрафильтрационной кассете с номинальным отсечением по молекулярной массе 50 кДа. Все процессы ведут на холоду (+2…+8°С или в ледяной бане). Концентрат замораживают и лиофилизируют.

Пример 3

Семенники КРС разрезают на куски и измельчают в мясорубке. К 200 г измельченного сырья добавляют 500 мл экстрагента (водный раствор уксусной кислоты). Экстракция идет в течение 4 ч. при постоянном перемешивании на шейкере. Гомогенат центрифугируют и фильтруют через 2 слоя фильтровальной бумаги, доводят рН до значения 4,5. Сорбент КУ-23 подготавливают в соответствии с инструкцией производителя, перед сорбцией уравновешивают 2 М NaCl. Проводят сорбцию целевого продукта из осветленного экстракта со скоростью 190 мл/см² ч. до проскока целевого продукта. После завершения сорбции катионит КУ-23 промывают подкисленной водой с рН=4,0. Элюцию проводят водным раствором аммиака с рН=10.8 со скоростью 90 мл/см² ч. Сорбент промывают водой и регенерируют. Проводят концентрирование элюата в 20 раз по объему на ультрафильтрационной кассете с номинальным отсечением по молекулярной массе 50 кДа. Все процессы ведут на холоду (+2…+8°С или в ледяной бане). Концентрат замораживают и лиофилизируют.

Литература

1. В.Е. Балан, А.С.Журавель Возможности применения препаратов, содержащих гиалуроновую кислоту, в гинекологии // "ЭФФЕКТИВНАЯ ФАРМАКОТЕРАПИЯ. Акушерство и гинекология" №2 | 2014.

2. Патент 111012 СССР Способ получения препарата лидаза / Касавина Б.С., Беленькая Г.М., Катковский С.Б. и др. // Опубл. 01.01.1957.

3. Патент 827068 СССР Способ получения лидазы / Лазарева И.В., Сидорова Н.Д., Чайка О.В. др. // Опубл. 07.05.1981.

4. Патент 566875 СССР Способ получения ронидазы / Стекольников Л.И., Севастьянов Б.А., Шилов Г.Г. и др. // Опубл. 22.08.1977.

5. Патент 2054943 РФ Способ получения гиалуронидазы / Мезин И.А., Сенникова И.Г. Темиров Ю.П. и др. // Опубл. 27.02.1996.

6. Патент 2090207 РФ Способ получения гиалуронидазы / Сазыкин И.С. // Опубл. 20.09.1997.

7. Патент 2150948 РФ Способ получения высококачественного препарата "Лидаза" / Нижечик Ю.С., Пестова И.А., Ананичева Л.Л. И др. // Опубл. 20.06.2000.

8. Патент 2159284 РФ Способ получения гиалуронидазы / Якин О.Г., Мельников Н.В., Козырева М.Х. и др. // Опубл. 20.11.2000.

9. Патент 2027759 РФ Способ получения гиалуронидазы / Пак В.Н., Офицеров В.И. // Опубл. 27.01.1995

10. Патент 2126044 РФ Способ получения гиалуронидазы / Глазова Н.В., Елькин Г.Э., Заинкова Н.В. И др. // Опубл. 10.02.1999.

11. Патент 2658605 РФ Способ получения гиалуронидазы из семенников крупного рогатого скота / Чайка О.В., Элиханов А.М., Глазова Н.В. // Опубл. 21.06.2018.

1. Способ получения гиалуронидазы из семенников крупного рогатого скота, заключающийся в экстракции предварительно измельченного сырья водным раствором уксусной кислоты при постоянном перемешивании в соотношении 1 к 2 в течение 4 ч при температуре +2…+8°C, центрифугировании, фильтрации, доведении pH до значения 4,0-4,5, сорбции на макропористом сульфокатионите со скоростью 180-220 мл/см² ч, промывке сорбента подкисленной водой или буферным раствором с рН=3,5-4,5, десорбции элюентом с рН=10-11 со скоростью 80-120 мл/см² ч, концентрировании элюата в тангенциальном потоке, лиофилизации.

2. Способ по п. 1, при котором в качестве макропористого сульфокатионита используют сорбент марки КУ-23.

3. Способ по п. 1, при котором в качестве макропористого сульфокатионита используют сорбент марки Nuvia S.

4. Способ по п. 1, при котором в качестве макропористого сульфокатионита используют сорбент марки ReliSorb™ SP 400.

5. Способ по любому из пп. 1-4, при котором в качестве элюента используют аммиачный раствор с рН 10,0-11,0.

6. Способ по любому из пп. 1-4, при котором в качестве элюента используют сульфат аммония с рН 10,0-11,0.

7. Способ по любому из пп. 1-6, при котором при концентрировании используют мембрану с номинальным отсечением пор по молекулярной массе 30 кДа.

8. Способ по любому из пп. 1-6, при котором при концентрировании используют мембрану с номинальным отсечением пор по молекулярной массе 50 кДа.