Способ оценки состояния кислородно-транспортной функции крови у субъекта и ее отклонений от нормы

Изобретение относится к медицине и может быть использовано для мониторинга возможного стойкого отклонения от нормы энергетического метаболизма эритроцитов и/или нарушения структуры их мембран. Для этого оценивают состояние кислородно-транспортной функции крови у субъекта и ее отклонений от нормы, включающий анализ отклонения скорости насыщения пробы крови кислородом от нормальных значений. Если полученное значение скорости попадает в референтные пределы нормы, то констатируют отсутствие отклонений. При наличии отклонений повторно измеряют скорость насыщения пробы крови кислородом. Для этого в образец венозной крови или отмытых эритроцитов субъекта добавляют вещества, ингибирующие энергетический метаболизм эритроцитов, и проводят сравнение скорости насыщения образца с добавлением ингибитора (V2) со скоростью без его добавления (V1). При различии V2 и V1 по меньшей мере на 10% делают вывод о том, что отклонения кислородно-транспортной функции крови у субъекта от нормы вызваны угнетением метаболизма эритроцитов в организме субъекта или структурных изменений мембраны эритроцитов, являющихся причинами отклонения кислородно-транспортной функции крови у субъекта от нормы. Изобретение обеспечивает способ оценки состояния кислородно-транспортной функции крови субъекта и может быть использовано для оценки эффективности лечебных и восстановительных мероприятий при реабилитации пациента, а также в спорте и военном деле. 7 з.п. ф-лы, 8 ил., 1 пр.

 

Область техники

Изобретение относится к области медицины и может быть использовано также в других областях, где требуется мониторинг возможного стойкого отклонения от нормы энергетического метаболизма эритроцитов и/или нарушения структуры их мембран (спорт, военное дело и др.).

Уровень техники

Известен способ неинвазивного измерения насыщения крови кислородом, основанный на определении коэффициента отражения оптического сигнала (RU2173082 C1, 20.09.2001). С помощью данного способа можно диагностировать патологические нарушения в организме, вызванные развитием заболевания, в частности, диабета. Он позволяет обнаруживать нарушения на тканевом уровне, когда клетки тканей, снабжаемых кислородом, начинают потреблять кислород в объемах, отличных от нормы, как, например, при опухолях - в больших объемах, при диабете - в меньших объемах. При этом такие нарушения надежно обнаруживаются по изменению степени насыщенности крови кислородом только на поздних стадиях развития системных патологий, в случаях их средних и тяжелых форм. В то же время, с помощью этого способа невозможно определить отклонение от нормы скорости насыщения крови кислородом, также как и выявить причины такого отклонения.

Также известен способ диагностики функционального состояния организма, заключающийся в оптических измерениях во времени характеристик крови путем измерения во времени степени насыщения крови кислородом в герметичной термо- и влагостабилизируемой камере с заполненной газовой смесью под атмосферным давлением с фиксированным постоянным составом кислорода, осуществлении непрерывного контакта пробы крови с газовой смесью (RU2218085 С2, 10.12.2003). В этом способе процессы оксигенации (деоксигенации) крови осуществляют многократно, а эффективный газообмен пробы крови с газовой смесью производят посредством периодического изменения площади поверхности крови, контактирующей с газовой средой, и измеряют только степень насыщенности крови кислородом в течение всего времени кислородного обмена крови с газовой смесью. Моделируя различные состояния исследуемой пробы крови путем изменения состава газовой смеси, осуществляют оценку функционального состояния организма, которую производят путем сопоставления данных, полученных при этом моделировании. Данный способ можно использовать для определения функциональных возможностей организма, то есть его энергетического статуса. Однако он не дает достаточных данных для определения и оценки метаболических и структурных изменений в клетках организма и степени таких нарушений в организме вследствие развития патологии.

Близким к предлагаемому изобретению является «Способ диагностики организма, предназначенный для диагностики и исследования степени тяжести диабета, и устройство для его осуществления», известный из патента RU2453272 C2, 05.08.2010. Данный способ позволяет оценить скорость насыщения пробы венозной крови кислородом и по отклонениям этой скорости от нормальных значений судить о степени тяжести сахарного диабета. В то же время, данный способ имеет слишком узкую специализацию и малую точность и надежность оценки степени тяжести заболевания, а также не позволяет определить наличие структурных или метаболических нарушений в эритроцитах крови.

Известны также способы диагностики функционального состояния организма по состоянию мембраны эритроцитов, например, такой как способ определения функционального состояния организма по степени резистентности крови к кислотному гемолизу (RU2179315C1 10.02.2002). Способ включает разведение пробы крови в 2001 раз, добавление к исследуемому образцу соляной кислоты и наблюдения процесса гемолиза по убыли оптической плотности эритроцитов. По изменению лабильности эритроцитов оценивают функциональное состояние организма. Однако способ достаточно трудоемок и не обеспечивает нативности исследуемого образца.

Как показывает анализ, ни один из известных способов диагностики не позволяет оценить в достаточной мере состояние кислородно-транспортной функции крови, в то же время, во многих областях деятельности, таких как медицина, спорт, военное дело, имеется потребность в точной оценке функционального состояния организма, в том числе в оценке состояния кислородно-транспортной функции крови и ее отклонений от нормы, которая до сих пор так и остается до конца не решенной.

Раскрытие изобретения

Предлагаемое техническое решение основано на регистрации нарушений кислородно-транспортной функции эритроцитов и выявлении вызвавших это нарушение причин: структурных или метаболических. При обнаружении отклонения скорости насыщения пробы крови кислородом от нормальных значений проводится дополнительная операция добавления в исследуемую пробу вещества, прямо или опосредованно влияющего на энергетический метаболизм эритроцитов, повторное измерение скорости насыщения пробы крови кислородом и сравнение ее с начальной скоростью. Если добавление в пробу крови такого вещества не приводит к изменению скорости насыщения эритроцитов кислородом, значит нарушение кислородно-транспортной функции было вызвано ингибированием энергетического метаболизма эритроцитов (в организме). Если же при добавлении ингибиторов происходит изменение скорости, то делается вывод о том, что отклонение скорости насыщения крови кислородом от нормы было вызвано структурными нарушениями в мембране эритроцитов.

Таким образом, технической задачей изобретения является разработка способа оценки состояния кислородно-транспортной функции крови у субъекта и ее отклонений от нормы (независимо от того, чем такое отклонение вызвано: развитием ли заболеваний, хроническим утомлением организма или другими причинами), основанного на получении новой информации о состоянии энергетического метаболизма эритроцитов и структуры их мембран. Еще одной задачей изобретения является на более высоком уровне точности и более надежно осуществлять инструментальный контроль эффективности лечебных и восстановительных мероприятий при реабилитации пациентов.

Исходя из вышеизложенного, поставленная задача решается при осуществлении способа оценки состояния кислородно-транспортной функции крови у субъекта и ее отклонений от нормы, включающего следующие этапы:

- регистрируют зависимость степени насыщения кислородом образца (пробы) венозной крови или отмытых эритроцитов субъекта, ресуспендированных физиологическим раствором до физиологических величин гематокрита, от времени, с построением соответствующей кривой зависимости;

- вычисляют скорость насыщения (V₁) указанного образца кислородом на прямолинейном возрастающем участке кривой и сравнивают полученное значение с референтными значениями нормы этого параметра (V₀) для данного пола и возраста, полученными ранее для образцов крови здоровых доноров,

- при попадании значения скорости в референтные пределы нормы констатируют отсутствие отклонений кислородно-транспортной функции крови у субъекта от нормы;

- в ином случае регистрируют зависимость степени насыщения кислородом образца венозной крови или отмытых эритроцитов субъекта, ресуспендированных физиологическим раствором до физиологических величин гематокрита, от времени при добавлении в образец вещества, ингибирующего энергетический метаболизм эритроцитов, с построением соответствующей кривой зависимости;

- вычисляют скорость насыщения образца кислородом (V₂) на прямолинейном возрастающем участке кривой;

- производят сравнение V₂ с V₁ и

при отсутствии существенной разницы делают вывод о том, что отклонения кислородно-транспортной функции крови у субъекта от нормы вызваны угнетением метаболизма эритроцитов в организме субъекта;

при наличии существенной разницы делают вывод о том, что отклонения кислородно-транспортной функции крови у субъекта от нормы вызваны изменением состава мембраны эритроцитов.

В частных вариантах осуществления способа субъектом является человек.

В частных вариантах в процессе регистрации осуществляют непрерывное перемешивание образца венозной крови или, соответственно, отмытых эритроцитов субъекта, ресуспендированных физиологическим раствором до физиологических величин гематокрита.

Еще в одних частных вариантах регистрацию осуществляют при поддержании постоянного парциального давления кислорода в газовой среде, с которой контактирует образец.

В некоторых вариантах осуществления способа разницу между V₂ и V₁ считают существенной при их различии, по меньшей мере, на 10%.

Еще в одних частных вариантах для измерения V₂ и V₁ используют разные образцы крови или отмытых эритроцитов субъекта, ресуспендированных физиологическим раствором до физиологических величин гематокрита, взятые в одно время.

В частных случаях вещество, ингибирующее энергетический метаболизм эритроцитов, выбирают из цитрата натрия, этилового спирта, бромпировиноградной кислоты, 2-дезокси-D-глюкозы, коктейля ингибиторов протеолитических ферментов и др.

В некоторых частных вариантах вещество, ингибирующее энергетический метаболизм эритроцитов, добавляют в количестве не более 10% от объема образца крови.

В частных вариантах регистрацию зависимостей, а также измерения и вычисления осуществляют (производят) с помощью прибора «КИНОКС-Гамма 4», а именно, осуществляют, по меньшей мере, один следующих этапов способа:

- регистрируют зависимость степени насыщения кислородом образца венозной крови или отмытых эритроцитов субъекта, ресуспендированных физиологическим раствором до физиологических величин гематокрита от времени с построением соответствующей кривой зависимости;

- вычисляют скорость насыщения образца кислородом (V₁) на прямолинейном возрастающем участке кривой и сравнивают полученное значение с референтными значениями нормы для данного пола и возраста (V₀),

- при попадании значения скорости в референтные пределы нормы констатируют отсутствие отклонений кислородно-транспортной функции крови у субъекта от нормы;

- в ином случае регистрируют зависимость степени насыщения кислородом образца от времени при добавлении в образец вещества, ингибирующего энергетический метаболизм эритроцитов, с построением соответствующей кривой зависимости;

- вычисляют скорость насыщения образца кислородом (V₂) на прямолинейном возрастающем участке кривой;

- производят сравнение V₂ с V₁ и

при отсутствии существенной разницы делают вывод о том, что отклонения кислородно-транспортной функции крови у субъекта от нормы вызваны угнетением метаболизма эритроцитов в организме субъекта;

при наличии существенной разницы делают вывод о том, что отклонения кислородно-транспортной функции крови у субъекта от нормы вызваны изменением состава мембраны эритроцитов.

Техническим результатом, достигаемым при осуществлении изобретения, является количественная, инструментальная оценка степени нарушения кислородно-транспортной функции крови и осуществляющих эту функцию эритроцитов, а также выяснение состояния их энергетического метаболизма и мембран. Способ позволяет диагностировать нарушения кислородно-транспортной функции крови на начальном этапе их формирования, на клеточном и субклеточном уровнях, даже в тех случаях, когда клинически и в известных тестах они себя еще не проявляют, а также на более высоком уровне точности и более надежно осуществлять инструментальный контроль эффективности лечебных и восстановительных мероприятий при реабилитации пациентов.

Краткое описание чертежей

Фиг. 1. Типичная кривая, характеризующая кинетику насыщения пробы крови кислородом (получена с помощью прибора «КИНОКС-Гамма 4»). Анализ кинетики производится по трем параметрам: скорости насыщения крови на прямолинейном участке нарастания насыщенности крови кислородом V_нас; начальной степени насыщенности крови кислородом α₀ и времени насыщения t_нас, определяемого как отрезок от начала процесса до абсциссы точки пересечения прямолинейного участка нарастания степени насыщенности и прямолинейного участка, характеризующего завершение процесса.

Фиг. 2. Частотное распределение скоростей насыщения пробы венозной крови доноров кислородом: а) женского пола, б) мужского пола. Сплошной линий показана аппроксимация данных функцией Гаусса.

Фиг. 3. Зависимости скоростей насыщения проб крови кислородом здоровых доноров от возраста, полученные для мужчин и женщин.

Фиг. 4. Кривые насыщения проб крови кислородом, полученные с помощью прибора «КИНОКС-Гамма 4»: кривая 1 - кривая, полученная для пробы крови здорового донора, кривая 2 – кривая, полученная для пробы крови пациента, больного ишемической болезнью сердца; обозначения соответствуют обозначениям на фиг.1.

Фиг. 5. Кривые насыщения проб крови кислородом, полученные для здорового донора (черная кривая) и для двух пациентов с различной длительностью протекания сахарного диабета (СД) 2-го типа (красная кривая – развивающийся СД, черная кривая – длительно протекающий СД с выраженными структурными нарушениями в организме типа «диабетической стопы»).

Фиг. 6. Кривые насыщения проб крови кислородом, полученные для пациента с развивающимся сахарным диабетом без структурных нарушений. Черные кривые – без добавления ингибиторов, красные кривые – с добавлением ингибиторов.

Фиг. 7. Кривые насыщения проб крови кислородом, полученные для пациента с длительно протекающим сахарным диабетом с выраженными структурными нарушениями. Черные кривые – без добавления ингибиторов, красные кривые – с добавлением ингибиторов.

Фиг. 8. Прибор «КИНОКС-Гамма 4».

Подробное описание изобретения

Предлагаемое изобретение относится к медико-биологическим измерениям, а именно к средствам диагностики и исследования степени отклонений от нормы энергетического метаболизма клеток организма по параметрам кинетики оксигенации (насыщения кислородом) крови пробы in vitro в специальных условиях и может найти применение:

- в лабораторной практике для биологических (биофизических) исследований;

- в медицине для диагностических целей и инструментального контроля эффективности лечебных мероприятий при широко распространенных заболеваниях, в том числе системных, таких как сахарный диабет и др.;

- в спорте, военном деле и других областях человеческой деятельности, где требуется инструментальный контроль физической способности индивидуума выполнять трудоемкие, сложные и ответственные задачи.

В качестве маркера нарушений энергетического метаболизма клеток организма выбраны эритроциты крови обследуемого. Они формируются из своих предшественников – ретикулоцитов, которые развиваются в костном мозге в напряженных условиях по обеспечению их питательными и анаболическими веществами и поэтому весьма чувствительны к любым изменениям указанного обеспечения, что проявляется в уменьшении или увеличении их ферментативного пула. Все эти структурные изменения наследуют эритроциты. При стойком нарушении энергетического метаболизма основной массы клеток организма неизбежно изменяется поступление в костный мозг веществ, необходимых для нормального развития ретикулоцитов, что сказывается на структуре и связанной с этими нарушениями кислородно-транспортной функции эритроцитов. Поэтому прямая оценка нарушений структуры эритроцитов и такая оценка, опосредованная через регистрацию нарушений основной функции (транспорта и отдачи кислорода клеткам-потребителям), обладают диагностической ценностью. Количество гемоглобина в эритроцитах, которое определяет кислородную емкость крови, надежно измеряют известными способами по его количеству в литре крови. У здоровых людей кислородная емкость крови может варьироваться в широком диапазоне своих значений и на транспортную функцию (доставку кислорода к клеткам) влияет мало. Соответственно, диагностическая значимость наличия отклонений количества гемоглобина от среднего значения достаточно мала. К наиболее важным для функции эритроцитов структурам относятся ферменты, непосредственно участвующие в их энергетическом метаболизме, и крупные белки, встроенные в липиды эритроцитарных мембран и определяющие их проницаемость. Прямая или, опосредованная через функциональные нарушения, надежная регистрация отклонений от нормы количества этих белков более значима для диагностических целей. Прямые измерения количества основных белков-ферментов, ответственных за энергетический метаболизм эритроцитов, представляют технически сложную задачу, поэтому в диагностической практике применяются редко. В предлагаемом изобретении о степени нарушений энергетического метаболизма эритроцитов и связанного с этим изменением количества белков в мембране или цитоплазме эритроцитов судят по изменениям скорости насыщения пробы крови кислородом. Для этого пробу венозной крови насыщают кислородом (оксигенируют) в стандартных условиях, определяя скорость насыщения – величину, обратно пропорциональную проницаемости мембран эритроцитов. Эта величина – проницаемость мембран эритроцитов для кислорода, определяемая в стандартных условиях по времени насыщения пробы венозной крови кислородом, прямо коррелирует с уровнем энергетического метаболизма эритроцитов. В процессе проведенных нами исследований было обнаружено, что для того, чтобы определить степень угнетения метаболизма эритроцитов, реализованного в организме, в пробу крови обследуемого необходимо добавить вещества, ингибирующие энергетический метаболизм эритроцитов на различных стадиях. Проведенные исследования также показали, что в случае, если добавление ингибиторов не приводит к существенному изменению скорости насыщения, то это означает, что в организме уже существует устойчивое угнетение метаболизма. Если же добавление ингибиторов приводит к изменению скорости насыщения, то это значит, что в организме реализуются структурные нарушения, которые приводят к изменению функционального состояния эритроцитов.

Заявляемый способ оценки состояния кислородно-транспортной функции крови у субъекта и ее отклонений от нормы основан на получении оптическим путем зависимости степени оксигенации эритроцитов от времени в процессе насыщения венозной крови или отмытых эритроцитов субъекта, ресуспендированных физиологическим раствором до физиологических величин гематокрита, кислородом. Принципиальным отличием заявляемого способа от известных является то, что помимо определения отклонения скорости насыщения пробы крови кислородом от нормальных значений также производится оценка степени метаболических и/или структурных нарушений в эритроцитах. Это достигается путем введения дополнительной операции сравнения скорости насыщения эритроцитов проб крови с добавлением вещества, ингибирующего энергетический метаболизм эритроцитов, и без него.

Для оценки состояния кислородно-транспортной функции эритроцитов и определения состояния метаболизма эритроцитов и структуры их мембран проводят in vitro измерения оптических характеристик крови в процессе ее насыщения кислородом в герметичной термо- и влагостабилизируемой камере, заполненной газовой смесью, под атмосферным давлением с постоянным содержанием кислорода. При взятии крови у пациента в пробу крови на первом этапе добавляют вещества, предотвращающие свертывание крови (ЭДТА, гепарин и др.), и сравнивают скорость насыщения пробы крови кислородом (V₁) с нормальными значениями (V₀), полученными для здоровых доноров данного возраста и пола. При выходе величины скорости за референтные пределы нормальных значений в пробу крови (или отмытых эритроцитов субъекта, ресуспендированных физиологическим раствором до физиологических величин гематокрита) добавляют вещества, являющиеся ингибиторами энергетического метаболизма и способные модулировать (изменять) скорости метаболических процессов в эритроцитах. В качестве таких веществ могут быть использованы цитрат натрия, этиловой спирт, бромпировиноградная кислота, 2-дезокси-D-глюкоза, ингибиторы протеолитических ферментов и др.

Для пробы с добавленным ингибитором энергетического метаболизма также получают зависимость степени насыщенности крови кислородом от времени (на графике – кривые α(t), где α – текущие показания прибора - оксиметра, производящего и контролирующего указанный процесс, см. фиг.1). Вычисляют скорости (V₂) – для образца, содержащего эритроциты с ингибированным метаболизмом и (V₁) – для образца того же обследуемого, содержащего эритроциты без ингибирующего воздействия на их энергетический метаболизм – насыщения крови кислородом на линейном участке кривых α (t). Сравнивают вычисленную скорость V₂ с V₁, по результату этого сравнения определяют причину нарушения кислородно-транспортной функции эритроцитов: либо из-за снижения уровня энергетического метаболизма клеток организма, либо структурных нарушений в мембране эритроцитов. По совокупной оценке отклонений от нормы всех вышеупомянутых скоростей оценивают степень отклонения нарушения (его угнетения или, наоборот, интенсификации) энергетического метаболизма большинства клеток организма от нормы.

Вышеуказанные изменения и вычисления производят с помощью устройства для диагностики степени отклонения от нормы энергетического метаболизма клеток организма, содержащего: герметичную термо- и влагостабилизируемую камеру, соединенную с камерой систему подачи газовой смеси под атмосферным давлением с постоянным содержанием кислорода; систему термо- и влагостабилизации; оптический оксиметр; блок регистрации и обработки данных. Устройство имеет регистратор и преобразователь оптических сигналов, блок расчета по полученным данным скоростей насыщения крови кислородом, блок сравнения результатов расчета с нормой, блок совокупной оценки отклонений всех указанных скоростей от нормы и блок отображения информации, работа которых обеспечивается соответствующим программным обеспечением, а герметичная термо- и влагостабилизируемая камера имеет средство для непрерывного перемешивания пробы крови с активным элементом, расположенным в кювете для размещения пробы крови. Блок регистрации соединен с преобразователем оптических сигналов, который в свою очередь соединен с блоком обработки и сравнения полученной информации, подключенным к блоку отображения конечных результатов измерений. В частных вариантах осуществления изобретения изменения и вычисления производят с помощью прибора «КИНОКС-Гамма 4».

Прибор «КИНОКС-Гамма 4» (см. фиг.8) позволяет оценивать кислородно-транспортную функцию эритроцитов и ее изменения, возникающие при патогенезе распространенных сердечно-сосудистых, респираторных и обменных нарушений (атеросклероз, артериальная гипертензия, хронический бронхит, хроническая обструктивная болезнь легких, ожирение, сахарный диабет 2 типа, гиперлипидемия). С помощью прибора «КИНОКС-Гамма 4» регистрируется кинетика насыщения пробы крови кислородом оптическим путем и определяется скорость насыщения крови кислородом, связанная с неспецифической проницаемостью мембраны эритроцитов для кислорода. Проницаемость, в свою очередь, зависит от состояния мембран эритроцитов и уровня их энергетического метаболизма. Патологические состояния, сопровождающиеся угнетением или активацией энергетического метаболизма эритроцитов и/или нарушением структуры мембраны, приводят к нарушению механизма авторегуляции проницаемости мембраны эритроцитов для кислорода, и, следовательно, к нарушению их нормального функционирования. Регистрируемое с помощью прибора отклонение скорости насыщения от ее нормальных значений для конкретной пробы крови свидетельствует о нарушении механизма авторегуляции неспецифической проницаемости мембран эритроцитов для кислорода. Степень метаболических и/или структурных нарушений, вызвавших такие нарушения, определяется при добавлении в пробу крови специальных веществ, угнетающих энергетический метаболизм эритроцитов (на различных стадиях), как это подробно описано выше и далее.

Обработка результатов измерений включает следующие операции: по полученной с помощью оксиметра зависимости степени насыщенности венозной крови кислородом α (α – показания оксиметра) от времени t определяют скорость V_нас=Δα/Δt насыщения ее кислородом на линейном участке кривой α(t), используя, например, величины Δα = α_арт – α₀ и время насыщения Δt = t_нас – t₀, как показано на фиг.1. Величина α₀ соответствует степени насыщенности венозной крови испытуемого α₀=α_вен, α_арт соответствует величине α_max – максимальному значению насыщения кислородом пробы крови в процессе проведения измерений, что соответствует артериальной крови. Время t₀ определяется началом эксперимента и равно нулю или определяется как точка пересечения прямой продолжения линейного участка кривой α(t) с осью времени, а t_нас – как точка пересечения с прямой, параллельной оси времени на уровне α = α_max.

Согласно проведенным исследованиям, добавление вещества, ингибирующего энергетический метаболизм эритроцитов, в пробу крови (или отмытых эритроцитов субъекта, ресуспендированных физиологическим раствором до физиологических величин гематокрита) приводит к снижению концентрации АТФ в эритроцитах, что, в свою очередь, отражается на проницаемости мембраны эритроцитов для кислорода. При этом в пробе крови с изначально сниженным энергетическим метаболизмом добавление ингибиторов не будет приводить к существенному изменению скорости насыщения крови кислородом. Это позволяет сделать вывод о том, что в таком образце крови нарушение функционирования эритроцитов связано именно с метаболическими нарушениями. Если же нарушения функционирования эритроцитов были вызваны нарушениями структуры их мембраны, то добавление ингибиторов энергетического метаболизма будет приводить к существенному изменению скорости насыщения пробы крови кислородом.

Предлагаемый способ оценки кислородно-транспортной функции эритроцитов и ее возрастных и/или патологических нарушений в организме субъекта по кинетике насыщения его пробы крови кислородом осуществляется следующим образом. Кровь забирается из локтевой вены пациента в вакуумные пробирки с веществами, предотвращающими свертывание крови (антикоагулянты, например, гепарин, цитрат натрия, ЭДТА). Для сохранения начальной степени насыщенности крови кислородом α₀, которая наряду со скоростью оксигенации крови является важным диагностическим параметром, необходимые объемы крови помещаются в кюветы достаточно быстро (в течение 1-2 минут), без длительного контакта пробы крови с воздухом до измерения.

При необходимости при проведении исследования в качестве пробы могут быть использованы отмытые эритроциты субъекта, ресуспендированные физиологическим раствором до физиологических величин гематокрита. Отмытые эритроциты - компонент, получаемый из цельной крови центрифугированием и удалением плазмы с последующим отмыванием эритроцитов изотоническим раствором. Отмытые эритроциты представляют собой суспензию эритроцитарной массы, из которой удалена большая часть плазмы, лейкоцитов и тромбоцитов. В процессе отмывания, осуществляемого по методикам, хорошо известным из уровня техники, удаляются белки плазмы, лейкоциты, тромбоциты, микроагрегаты клеток и стромы, разрушенные при хранении клеточных компонентов. При осуществлении изобретения используются отмытые эритроциты, ресуспендированные физиологическим раствором до физиологических величин гематокрита.

Пробу помещают в кювету, расположенную в герметичной термо- и влагостабилизируемой камере, заполненной газовой смесью. В состав газовой смеси входит кислород, поддерживаемый на постоянном и близком к альвеолярному уровне, и биологически неактивные газы. Суммарное давление смеси газов составляет ~1 атмосферу. Для измерений допустимо использовать атмосферный воздух. В герметичной термо- и влагостабилизируемой камере гомеостатируется температура и влажность, близкие к условиям в альвеолах легких.

В кювете с помощью указанных выше опто-механических средств регистрируется временной ход степени насыщенности эритроцитов в пробе крови кислородом от начала до завершения процесса - величина α(t), которую в медицинской практике принято измерять в долях (относительных единицах) - от 0 до 1 или в процентах - от 0% до 100%. Регистрация оптических характеристик отраженного света осуществляется при непрерывном перемешивании пробы крови в кювете, до достижения равномерного насыщения крови кислородом по всему объему. Получают зависимость степени насыщения α пробы крови кислородом от времени наблюдения t (временной ход), как это изображено на фиг.1.

Анализ кинетики производится по трем параметрам:

- скорости насыщения крови на прямолинейном участке нарастания насыщенности крови кислородом V_нас;

- начальной степени насыщенности крови кислородом α₀ и

- времени насыщения t_нас, определяемом как отрезок от начала регистрации процесса до абсциссы точки пересечения прямолинейного участка нарастания степени насыщенности и прямолинейного участка, характеризующего завершение процесса.

Оценка кислородно-транспортной функции и ее возрастных и/или патологических нарушений производится путем сопоставления полученных для данного индивидуума характеристик кинетики насыщения пробы крови (скорость насыщения, начальная степень насыщенности и время насыщения) с полученными референтными значениями этих характеристик для здоровых доноров данного возраста и пола. В свою очередь, уточнения референтных пределов нормальных значений кинетических характеристик стало возможным благодаря использованию новых и современных оптоэлектронных элементов и программ, а также набора достаточного объема данных для статистической обработки. На приборе было исследовано 98 проб венозной крови, из которых 63 пробы – это кровь доноров мужского пола и 35 проб – кровь доноров женского пола.

На фиг.2 представлено частотное распределение скоростей насыщения крови кислородом для доноров женского (а) и мужского пола (б). Видно, что распределения скоростей насыщения для крови мужчин и женщин подчиняется нормальному распределению Гаусса. В среднем скорость насыщения проб крови для доноров женского пола выше, чем для доноров мужского пола.

На фиг.3 представлены возрастно-половые зависимости скоростей насыщения проб крови здоровых доноров. Видно, что для мужчин и женщин максимальные отличия реализуются в юном возрасте (около 20 лет), после 35 лет отличия становятся менее выраженными и величины скоростей могут совпадать в пределах статистических ошибок. Такие отличия в скоростях насыщения связаны с особенностями функционирования организмов мужчин и женщин в различные возрастные периоды.

Данные о начальной степени насыщенности крови кислородом и времени насыщения не представлены в графическом виде. Для здоровых доноров как мужского, так и женского пола, было обнаружено, что начальная степень насыщения приблизительно одинакова и равна (0,75±0,07) отн. ед.

На фиг.4 представлены кривые насыщения проб крови кислородом практически здорового донора и пациента, больного ишемической болезнью сердца перед аортокоронарным шунтированием. Представленные данные получены для людей приблизительно одного возраста и пола (мужчины, 40 лет). Сравнение кинетики насыщения пробы крови больного пациента и здорового донора производится на всех этапах этого процесса: 1) по начальной степени насыщенности α_0,б и α_0,зд; 2) по скорости насыщения на прямолинейном участке нарастания кривой насыщения пробы крови кислородом; 3) по времени насыщения, определяемого как отрезок от начала включения процесса до как абсцисса точки пересечения прямолинейного участка нарастания степени насыщенности и прямолинейного участка, характеризующего завершение процесса. Из фиг.4 видно, что величины этих параметров существенно отличаются для кривых (1) и (2). Для указанного больного может быть констатировано нарушение кислородно-транспортной функции эритроцитов, возникшей в результате протекания ишемической болезни сердца.

Далее изобретение иллюстрируется примерами осуществления предлагаемого способа. Нижеследующие примеры приведены в целях иллюстрирования настоящего изобретения и их не следует рассматривать как каким-либо образом ограничивающие объем изобретения.

Примеры

Для оценки состояния кислородно-транспортной функции крови у субъекта и ее отклонений от нормы предлагаемым способом были выбраны пациенты с заведомо различающимися степенями сахарного диабета. Для первого из них было зарегистрировано отклонение концентрации глюкозы в плазме крови от нормы в течение 3-х месяцев. Для второго же был диагностирован сахарный диабет второго типа с продолжительностью более 5 лет. Кроме того, у этого пациента наблюдались и структурные нарушения в организме типа диабетической стопы.

Кровь забиралась у пациентов натощак из локтевой вены в вакуумные пробирки с ЭДТА (по 2 шт.). Измерения проводили через 15 минут после взятия крови.

Полученные кривые насыщения крови кислородом для образцов крови обоих пациентов представлены на фиг.5. Из рисунка видно, что скорость на линейном участке нарастания величины степени насыщенности обоих пациентов отличается от скорости здорового донора более чем на 20%. Это свидетельствует о нарушении кислородно-транспортной функции эритроцитов обоих доноров.

Во вторую пробирку крови каждого из пациентов добавляли коктейль ингибиторов протеолитических ферментов (Sigma-Aldrich Product Number: P2714 или P8340) в соотношении 1:10, состав которого включает 4-(2-Аминоэтил) бензосульфанил фторид, апротинин, бестатин, Е-64, лейпептин, пепстатин А (при необходимости состав коктейля может корректироваться).

При добавлении ингибиторов протеолитических ферментов, которые опосредованно влияют на энергетический метаболизм эритроцитов, было показано, что для донора с первичными признаками сахарного диабета (фиг.6) не происходило существенного изменения скорости насыщения пробы крови кислородом (величина скорости практически не изменилась) и сам вид кривой не изменялся существенным образом (начальная, конечная степень насыщения и время насыщения остались приблизительно на том же уровне). Это свидетельствует о том, что первоначальные отклонения скорости насыщения от нормальных значений определялись для этого пациента именно нарушениями энергетического метаболизма эритроцитов.

Для второго донора, для которого было зарегистрировано первоначальное отклонение скорости V₁ насыщения от нормы V₀ на 30%, добавление ингибиторов привело к полному изменению кривой насыщения крови кислородом (фиг.7). Из приведенного графика видно, что, во-первых, изменилась скорость насыщения пробы крови кислородом более чем на 10%, во-вторых, полностью изменился вид кривой (сместилась начальная степень насыщенности крови кислородом), а также увеличилось полное время, за которое кривая выходит на насыщение. Такие изменения, происходящие в пробе крови при добавлении ингибиторов, свидетельствуют о том, что первоначальное значительное отклонение скорости насыщения от нормы было вызвано именно наличием структурных нарушений в организме.

Таким образом, применение способа по изобретению позволяет диагностировать и оценить степень нарушения кислородно-транспортной функции крови и осуществляющих ее эритроцитов, выяснить состояние их энергетического метаболизма и мембран, как на позднем, так и на начальном этапе формирования нарушений, на клеточном и субклеточном уровнях.

Несмотря на то, что изобретение описано со ссылкой на раскрываемые варианты воплощения, для специалистов в данной области должно быть очевидно, что конкретные подробно описанные эксперименты приведены лишь в целях иллюстрирования настоящего изобретения, и их не следует рассматривать как каким-либо образом ограничивающие объем изобретения. Должно быть понятно, что возможно осуществление различных модификаций без отступления от сути настоящего изобретения.

1. Способ оценки состояния кислородно-транспортной функции крови у субъекта и ее отклонений от нормы, включающий следующие этапы:

- регистрацию зависимости степени насыщения кислородом образца венозной крови или отмытых эритроцитов субъекта, ресуспендированных физиологическим раствором до физиологических величин гематокрита, от времени, с построением соответствующей кривой зависимости от времени;

- вычисление скорости насыщения кислородом (V1) указанного образца на прямолинейном возрастающем участке кривой и сравнение полученного значения с референтными пределами нормы этого параметра (V0) для данного пола и возраста, полученными ранее для образцов крови здоровых доноров,

- констатацию отсутствия отклонений кислородно-транспортной функции крови у субъекта от нормы в случае, если полученное значение скорости попадает в референтные пределы нормы; или

- констатацию нарушений кислородно-транспортной функции исследуемого образца в случае, если полученные данные выходят за референтные пределы нормальных значений, при этом в этом случае проводят

- уточнение причин обнаруженных отклонений кислородно-транспортной функции крови от нормы путем регистрации зависимости степени насыщения кислородом образца венозной крови или отмытых эритроцитов субъекта, ресуспендированных физиологическим раствором до физиологических величин гематокрита, от времени при добавлении в образец вещества, ингибирующего энергетический метаболизм эритроцитов, с построением соответствующей кривой зависимости от времени, при этом

- вычисляют скорость насыщения образца кислородом (V2) на прямолинейном возрастающем участке кривой;

- производят сравнение скорости насыщения образца с добавлением ингибитора (V2) со скоростью без его добавления (V1) и при отсутствии существенной разницы делают вывод о том, что отклонения кислородно-транспортной функции крови у субъекта от нормы вызваны угнетением метаболизма эритроцитов в организме субъекта;

при наличии существенной разницы делают вывод о том, что отклонения кислородно-транспортной функции крови у субъекта от нормы вызваны структурными изменениями мембраны эритроцитов, при этом разницу между скоростью с добавлением ингибиторов (V2) и без их добавления (V1) считают существенной при их различии по меньшей мере на 10%.

2. Способ по п. 1, в котором субъектом является человек.

3. Способ по п. 1, в котором в процессе регистрации осуществляют непрерывное перемешивание образца венозной крови или отмытых эритроцитов субъекта, ресуспендированных физиологическим раствором до физиологических величин гематокрита.

4. Способ по п. 1, в котором регистрацию осуществляют в условиях поддержания постоянного парциального давления кислорода в газовой среде, с которой контактирует образец.

5. Способ по п. 1, в котором для измерения вышеупомянутых скоростей V2 и V1 используют разные образцы крови или отмытых эритроцитов субъекта, ресуспендированных физиологическим раствором до физиологических величин гематокрита, взятые в одно время.

6. Способ по п. 1, в котором вещество, используемое для ингибирования энергетического метаболизма эритроцитов, выбирают из цитрата натрия, этилового спирта, бромпировиноградной кислоты, 2-дезокси-D-глюкозы, коктейля ингибиторов протеолитических ферментов.

7. Способ по п. 1, в котором вещество, ингибирующее энергетический метаболизм эритроцитов, добавляют в количестве не более 10% от объема образца крови.

8. Способ по любому из пп. 1-7, в котором регистрацию зависимостей, а также измерения и вычисления производят с помощью прибора «КИНОКС-Гамма 4».