Способ определения фибриногена при рекальцификации цитратной плазмы и оценка его функциональности

Изобретение относится к медицине, а именно к лабораторной диагностике и может быть использовано для определения фибриногена при рекальцификации цитратной плазмы и оценки его функциональности. Суть способа заключается в рекальцификации плазмы крови хлоридом кальция с последующей регистрацией степени коагуляции на фотометре для иммуноферментного анализа. С целью повышения точности теста используют в качестве активатора фибринстабилизирующего фактора полиэтиленгликоль с молекулярной массой 3350. Запускают реакцию в параллельных 2 сериях добавлением 0,25 М раствора хлорида кальция к пробе, содержащей цитратную плазму, ПЭГ-3350 и буфер VBS с рН 7,4, тщательно перемешивают, измеряют оптическую плотность проб, далее инкубируют в течение 60 мин при 37°С, в первой серии опыта определяют содержание белка в фибриновом сгустке стандартным способом с использованием биуретового реактива, во второй серии опыта определение коагуляции плазмы проводят фотометрически по изменению мутности проб при длине волны 450 нм с интервалами измерения 0 и 60 мин, расчет содержания фибриногена проводят по формуле: ФГ (г/л) = ΔА₄₅₀ × 5,12, где: ΔА₄₅₀ - изменение оптической плотности пробы во второй серии, при коагуляции плазмы; 5,12 - коэффициент для перевода изменений оптической плотности пробы при коагуляции плазмы в г/л, представляющий собой отношение белка в фибриновом сгустке к изменению оптической плотности в пробе при коагуляции плазмы, рассчитывают функциональность фибриногена как разность между количествами фибриногена, определенными данным способом и по методу Клаусса, рассчитывают разницу в % к белку в фибриновом сгустке и при разнице более 10% определяют как нарушенную функциональность фибриногена. Использование данного способа позволяет определить количество фибриногена и его функциональность, что дает возможность проводить широкий скрининг и выявлять людей, склонных к тромбозу. 5 табл., 1 ил.

 

Изобретение относится к лабораторной диагностике и может быть использовано для определения фибриногена при рекальцификации цитратной плазмы и оценка его функциональности.

Фибриноген - это основной протеин плазмы крови, который необходим для надлежащего свертывания крови. Количество фибриногена, присутствующего в крови, прямо пропорционально способности крови образовывать тромбы. Фибриноген в крови трансформируется в фибрин в процессе образования тромба, таким образом, дефицит фибриногена будет выражаться в неадекватном образовании фибрина и неадекватном свертывании.

Недостаток содержания фибриногена в крови плазмы может быть вызван снижением образования фибриногена, которое может быть результатом печеночной недостаточности или вызвано врожденной гипофибриногенемией. Диссеминированная внутрисосудистая коагуляция крови, являющаяся патологическим случаем, может также создать большее, чем нормальное потребление фибриногена, пригодного для использования в процессе образования тромба. Очевидно, что недостаток фибриногена может привести к избыточному кровотечению.

Избыточное содержание фибриногена в крови также представляет патологическое состояние, которое, как правило, связано с воспалительными процессами. Высокое содержание фибриногена в крови может способствовать возникновению гиперкоагуляции, что нежелательно. Значительное повышение содержания фибриногена также обнаружено у беременных женщин.

Установлено, что увеличение концентрации фибриногена в крови также представляет фактор риска для сердечно-сосудистых заболеваний. Из вышеуказанного очевидно, что мониторинг содержания фибриногена в крови является полезным тестом в определении состояния здоровья человека, и может быть полезен как инструмент, позволяющий заранее определять предтромботическое состояние в организме человека.

Существует в настоящее время ряд методов количественного определения фибриногена плазмы крови. Используемые в настоящее время методы требуют, чтобы плазма была полностью отделена от красных кровяных клеток и более того, согласно этим методам необходимо, чтобы произошло превращение фибриногена в фибрин в отделенной плазме. Затем фибрин определяют количественно либо гравиметрическим способом, либо используя нефелометрию или химические методы анализа.

В клинической практике наиболее широко используется определение фибриногена по Клауссу, основанное на исследовании времени образования сгустка при добавлении избыточной концентрации тромбина к разбавленной в 10-20 раз цитратной плазме. Тест выполняется на коагулометрах, при этом логарифм времени образования сгустка обратно пропорционален логарифму концентрации фибриногена. Калибровочная кривая показывает укорочение времени свертывания при увеличении концентрации фибриногена [Долгов В.В., Свиридов П.В. Лабораторная диагностика нарушений гемостаза. - М. -Тверь: ООО «Издательство «Триада» 2005: 227 с]. Основными недостатками метода определения фибриногена по Клауссу является чувствительность результатов к гипо-, дис- и гиперфибриногенемии, а также к продуктам деградации фибрина, которые влияют на процесс полимеризации фибрин-мономеров и могут быть причиной как ложно низких, так и ложно повышенных результатов. Метод выполняется только в лабораторных условиях на специальном оборудовании (центрифуга, коагулометр [Полевода О.А., Галстян Г.М., Берковский А.Л., Сергеева Е.В. Способ определения функционального фибриногена // Патент РФ №2669796. Опубл. 16.10.2018. Бюл. №29].

Известен также способ определения фибриногена с помощью тромбоэластографии (ТЭГ). Метод ТЭГ не требует центрифугирования крови, является прикроватным, широко используется в интенсивной терапии. Определение уровня фибриногена с помощью ТЭГ заключается в регистрации максимальной амплитуды тромбоэластограммы после добавления к цитратной крови ингибитора тромбоцитарного гликопротеина IIb/IIa (абциксимаба) и активатора внешнего пути свертывания, лиофилизированного тканевого фактора. Максимальная амплитуда, регистрируемая при этом на тромбоэластограмме, отражает уровень ФГ [Rossaint R., Bouillon В., Cerny V., Coats T.J., Duranteau J., Fernandez-Mondejar E., et al. The European guideline on management of major bleeding and coagulopathy following trauma: fourth edition. Critical Care; 2016; 20: 100]. Определенный таким образом фибриноген коррелирует с концентрацией фибриногена, определенной по Клауссу. В то же время известно, что фибриноген, определенный с помощью ТЭГ, может переоценивать (завышать) концентрацию фибриногена [Agren A., Wikman А.Т., Ostlund A., Edgren G. TEG® functional fibrinogen analisis may overestimate fibrinogen levels // Anasthesia and analgesia. 2014; 118: 933-935]. Возможной причиной ложно повышенного уровня фибиногена является то, что при этом методе не всегда удается полностью ингибировать тромбоциты, что показано при сравнении его с методом ТЭГ, использующим другой ингибитор тромбоцитов. Существенным недостатком ТЭГ является также высокая стоимость и низкая производительность, ограничивающая его широкое использование, а присутствие в пробе гепарина, который может получать пациент в качестве антикоагулянта, требует выполнения теста с гепариназой.

В настоящее время накоплены многочисленные данные о важной патогенетической роли перекисного окисления липидов, являющегося неотъемлемой составляющей окислительного стресса, в инициации и развитии многих острых и хронических заболеваний. Однако активные кислородные метаболиты (АКМ), наряду с окислительной модификацией липидов, вызывают также и одновременную окислительную модификацию белков, приводящую к патологическим изменениям их свойств и функций, к фрагменации и агрегации. Применительно к процессам окислительной модификации белков при патологии сердечно-сосудистой системы атеросклеротического генеза большой интерес представляет на сегодняшний день окисление гликопротеина фибриногена крови. Поскольку повышенный уровень фибриногена является диагностически и прогностически значимым маркером не только атеросклероза, но многих других хронических воспалительных заболеваний, и его окислительная модификация еще более значительно потенцирует нарушения системы гемостаза, сопряженные с эндотелиальной дисфункцией, что в конечном итоге приводит к нарушению агрегации тромбоцитов и эритроцитов и к повышенной секреции цитокинов [Ройтман Е.В., Азизова О.А., Морозов Ю.А., Асейчев А.В. Влияние окисленного фибриногена на свертывающую систему крови // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины, 2004,138, 5: 467-469.].

Известны также способы определения окислительной модификации фибриногена плазмы крови [Рагино Ю.И., Баум В.А., Полонская Я.В. Патент РФ №2298189. Опубликовано 27.04.2007. Бюл, №12; Швачко А.Г., Пирязев А.П., Азизова О.А., Сергиенко В.И., Быкова А.А. Способ определения окислительной модификации фибриногена плазмы крови по содержанию карбонильных групп в фибриновом сгустке // Патент РФ №2595806. Опубликовано 27.08.2016. Бюл. №24]. Суть обоих методов заключается в предварительном приготовлении фибринового сгустка по Рутбергу, определении его массы. Затем к сгустку добавляют равные объемы физраствора и 20% раствора трихлоруксусной кислоты (ТХУ) для денатурации и осаждения фибриногена. Далее определяют окислительную модификацию фибрина сгустка с 2,4-динитрофенилгидразином (2,4-ДНФГ), как описано в работе Дубининой и соавт., 1995 [Дубинина Е.Е., Бурмистров C.O., Ходов Д.А., Поротов Г.Е. Окислительная модификация белков сыворотки крови человека, метод ее определения // Вопросы медицинской химии, 1995, 41,1:24-26.].

Недостатком описанных методов является необходимость выделения фибринового сгустка, причем инкубация в течение 10 мин не достаточна для коагуляции окисленного фибриногена. Метод трудно выполним в условиях рутинных исследований.

Известен способ определения функциональности фибриногена, включающий исследование цельной крови с помощью ТЭГ. Гепаринизированную кровь и батроксобин вносят в кювету для ТЭГ, после чего выполняют ТЭГ, определяя параметр максимальной амплитуды (МА_{Батрокс}) на тромбоэластограмме, а концентрацию функционального фибриногена (ФФ_{Батрокс}) рассчитывают по формуле: ФФ_{Батрокс} = 0.1153 × МА_{батрокс} + 0.5903, где ФФ_{Батрокс} - концентрация функционального фибриногена (г/л), МА_{Батрокс} - максимальная амплитуда на тромбоэластограмме с гепаринизированной кровью и батроксобином (мм), 0.1153 и 0.5903 - коэффициенты пересчета. [Полеводова О.А., Галстян Г.М., Берковский А.Л., Сергеева Е.В. Способ определения функционального фибриногена // Патент РФ №2669796. Опубл. 16.10.2018 Бюл. №29].

Основным недостатком определения функциональности фибриногена является использование специального фермента, выделенного из яда гремучей змеи Boothrops atrox, батроксобина, который является нефизиологическим ферментом для человеческого фибриногена, а также низкая производительность и высокая себестоимость анализа с использованием специального прибора. Перечисленные недостатки не позволят широко использовать данный метод оценки функциональности фибриногена.

Наиболее близким техническим решением к заявляемому способу является способ гравиметрического определения концентрации фибриногена по Рутбергу [Рутберг Р.А. Простой и быстрый метод определения содержания фибриногена плазмы // Лабораторное дело, 1961, 6: 6-7], при котором сначала оценивается содержание в плазме крови фибрина, образовавшегося в результате реакции полимеризации после отщепления от фибриногена двух фибринопептидов и, далее, с использованием стандартного коэффициента перерасчета пересчитывается на содержание фибриногена в плазме (в мг/мл или г/л). Метод широко использовался в клинических лабораториях, и не требует наличия специального оборудования.

Недостатком данного метода является трудоемкость, необходимость выделения фибринового сгустка (многократный контакт персонала с биоматериалом), высушивания (отжимания белков из фибринового сгустка), а также инкубация в течение 10 мин, которая не всегда достаточна для полной коагуляции фибриногена.

Задачей настоящего изобретения является расширение арсенала лабораторных тестов для определения фибриногена и его функциональности.

Технический результат заявленного изобретения заключается в повышении производительности, доступности теста для рутинных исследований, повышении точности за счет полной коагуляции плазменного фибриногена при рекальцификации цитратной плазмы крови человека.

Технический результат достигается тем, что для повышения производительности определение фибриногена анализ проводят в 96-ти луночных плоскодонных иммунологических планшетах и турбидиметрически определяют коагуляцию с использованием фотометра для иммуноферментного анализа. Высокая точность определения фибриногена обеспечивается использованием 0,6% полиэтиленгликоля с молекулярной массой 3350 (ПЭГ-3350) в пробе в качестве активатора коагуляции при рекальцификации цитратной плазмы.

Способ поясняется фигурой 1, на которой представлен корреляционный анализ фибриногена по Клауссу и предлагаемому методу, где обозначения: по оси X - фибриноген по Клауссу; по оси Y - фибриноген по разработанному методу.

Способ осуществляют следующим образом: проводят стандартный забор крови в раствор 3,8% цитрата натрия в соотношении 9:1, готовят тромбоцит-обедненную плазму путем центрифугирования при 3000 об/мин в течение 10 мин. Затем для запуска контактного пути активации плазменного гемостаза цитратной плазмы в лунки иммунологических планшет с плоским дном добавляют оптимальные концентрации растворов хлорида кальция и 10% раствора полиэтиленгликоля с молекулярной массой 3350 (ПЭГ-3350), объем пробы доводят до 0,2 мл вероналовым буфером без солей (VBS), рН 7,4. Тщательно перемешивают пробы и измеряют поглощение при 450 нм на фотометре для иммуноферментного анализа (бланк А₄₅₀), далее пробы инкубируют в течение 60 мин при 37°С и измеряют степень коагуляции при 450 нм. (Опыт А₄₅₀). Расчет содержания фибриногена (ФГ) проводят по формуле:

ФГ, г/л=ΔА₄₅₀×5,12

где:

ΔА₄₅₀ - изменение оптической плотности пробы при коагуляции плазмы - (А_{450(опыт)} - А_{450(бланк)});

5,12 - коэффициент для перевода изменений оптической плотности пробы при коагуляции плазмы в г/л.

Определение оптимальной концентрации хлорида кальция для запуска контактного пути коагуляции. С этой целью предварительно в 96-ти луночных плоскодонных планшетах 50 мкл 0,25 М раствор хлорида кальция прогрессивно раститровывают. После добавляют 100 мкл буфера VBS, рН 7,4 и 50 мкл пулированной цитратной плазмы относительно здоровых доноров. Тщательно перемешивают и сразу измеряют поглощение в пробах при 450 нм на фотометре для иммуноферментного анализа (0 мин - бланк), инкубируют при 37°С в течение 30 мин. После инкубации определяют степень коагуляции цитратной плазмы по изменению оптической плотности при рекальцификации. Полученные данные представлены в таблице 1.

Как видно из данных, представленных в таблице 1, максимальная коагуляция цитратной плазмы наблюдается при добавлении 25 мкл 0,25 М CaCl₂ к 25% пулированной цитратной плазме крови здоровых доноров.

Подбор оптимальной концентрации 10% полиэтиленгликоля с мол. массой 3350 (ПЭГ-3350) для активации коагуляции фибриногена тромбином. К 50 мкл пулированной цитратной плазмы в лунках 96-ти луночных иммунологических планшет с плоским дном добавляют возрастающие концентрации 10% раствора ПЭГ-3350 (конечная концентрация ПЭГ-3350 в пробах от 1,5% до 2,5%), объем проб доводят буфером VBS до 150 мкл. Измеряют оптическую плотность проб при длине волны 450 нм и затем добавляют 10 мкл препарата тромбина с активностью 3 NIH, инкубируют 0, 5, 10, 20 и 30 мин при 37°С и измеряют оптическую плотность проб при длине волны 450 нм для определения степени коагуляции фибриногена под действием тромбина. Контрольная проба не содержит препарата ПЭГ-3350. Полученные результаты представлены в таблице 2.

Как видно из данных, представленных в таблице 2, коагуляция фибриногена под действием тромбина усиливается в присутствии возрастающих концентрации ПЭГ-3350. Максимальная коагуляция фибриногена наблюдается при концентрации ПЭГ-3350 равной 2,25%. При дальнейшем увеличении концентрации ПЭГ-3350 наблюдается резкое снижение коагуляции фибриногена. Полученные результаты свидетельствуют о том, что в среде 2,25% ПЭГ-3350 увеличивается либо активность тромбина, либо конформационные изменения в молекуле фибриногена с присутствии ПЭГ-3350 делают его более чувствительным к протеолизу, либо активируется фактор XIII (фибрин-стабилизирующий фактор). Для дальнейшего исследования данного эффекта (эффекта усиления коагуляции плазмы) были проведены исследования влияния ПЭГ-3350 на коагуляцию цитратной плазмы при рекальцификации.

Влияние ПЭГ-3350 на коагуляцию цитратной плазмы при рекальцификации.

Предварительно в лунках 96-ти луночной плоскодонной планшеты прогрессивно разводят 10% раствор ПЭГ-3350 по 64 мкл, затем добавляют в лунки по 36 мкл буфера VBS и 50 мкл пулированной цитратной плазмы крови здоровых доноров. Активацию контактного пути коагуляции в полистироловых 96-ти луночных иммунологических планшетах запускают добавлением 50 мкл 0,25 М хлорида кальция (рекальцификация), тщательно

перемешивают, сразу измеряют поглощение проб при 450 нм на фотометре для иммуноферментного анализа (0 мин - бланк). Далее инкубируют в течение 60 мин при 37°С, измеряют изменение мутности проб через 30 и 60 мин для оценки степени коагуляции цитратной плазмы. В качестве контроля ставят контроль плазмы (без ПЭГ-3350) и контроль бланка плазмы (без хлорида кальция и ПЭГ-3350). Полученные результаты представлены в таблице 3.

Как видно из данных, представленных в таблице 3, при концентрации ПЭГ-3350 равной 0,6% в пробе наблюдается максимальная коагуляция пулированной цитратной плазмы в течение 60 мин. Концентрация ПЭГ-3350 более 0,6% вызывает незначительное снижение степени коагуляции плазмы по сравнению с контрольными пробами. Эффект усиления коагуляции плавно снижается при уменьшении концентрации ПЭГ-3350 ниже 0,6%.

Таким образом, для дальнейших исследований нами выбрана концентрация 0,6% ПЭГ-3350 в пробе для усиления коагуляции цитратной плазмы при рекальцификации.

Определение фибриногена в фибриновом сгустке, приготовленном при рекальцификации цитратной плазмы в присутствии 0,6% ПЭГ-3350 в пробе и в контрольных пробах без ПЭГ-3350. В лунки 96-ти луночных плоскодонных иммунологических планшет (опытные пробы) вносят последовательно 50 мкл цитратной плазмы, 84 мкл буфера VBS с рН 7,4, 16 мкл 10% раствора ПЭГ-3350 (таким образом, что бы в пробе присутствовало 0,6% ПЭГ-3350) и 50 мкл мкл 0,25 М Са²⁺. В контрольные пробы вместо ПЭГ-3350 вносят 16 мкл буфера VBS с рН 7,4 и в пробы бланка к 50 мкл цитратной плазмы добавляют 150 мкл буфера VBS с рН 7,4. Пробы тщательно перемешивают и инкубируют в течение 60 мин при 37°С. Определяют степень коагуляции плазмы турбидиметрически по изменению поглощения в пробах при длине волны 450 нм через 30 и 60 мин инкубации. Далее аккуратно снимают фибриновые сгустки с опытных и контрольных проб, максимально удаляют сыворотку крови «отжиманием» на фильтровальную бумагу, фибриновый сгусток помещают в пробирки типа «эппендорф» и добавляют 1 мл дистиллированной воды для отмывки фибринового сгустка от сыворотки крови. После центрифугируют в течение 10 мин при 8000 об/мин для осаждения фибриновых сгустков, тщательно декантируют и преципитат, фибриновый сгусток, растворяют в исходного объема плазмы в 1,0 N NaOH (в 25 мкл) путем инкубации в течение 10 мин при 56°С. Содержание белка в растворенном фибриновом сгустке определяют стандартным способом с использованием биуретового реактива. Параллельно в исходных цитратных плазмах определяют фибриноген по Клауссу с использованием коммерческих наборов «Фибриноген» (Hemosil, Италия) на автоматическом гематологическом анализаторе ACL 8/9/1000 System, (Instrum. Lab. Company, США). Полученные результаты представлены в таблице 4.

Как видно из данных, представленных в таблице 4, содержание ФГ по Клауссу в 13 пробах (54%) существенно было ниже, чем содержание белка (фибрина) в опытных и контрольных пробах. Совпадение между содержанием белка в фибриновых сгустках опытных проб и фибриногена, определенного по методу Клаусса составило 42% (10 проб).

В то время как совпадение содержания фибриногена по Клауссу и с белком в фибриновых сгустках контрольных проб составило 29% (7 проб). Совпадение содержания белка в фибриновых сгустках опытных и контрольных пробах было максимальным и составило 79% (19 проб). Следует отметить, что фибриновый сгусток, формирующийся при рекальцификации цитратных плазм, в контрольных пробах характеризовался рыхлостью, плохо «отжимался» и при добавлении воды для промывки существенно разрыхлялся. В опытных же пробах фибриновый сгусток был плотным, хорошо ужатым и при промывании не менял свою структуру.

Таким образом можно сделать вывод о том, что в присутствии 0,6% в пробе ПЭГ-3350 коагуляция цитратной плазмы при рекальцификации характеризуется высокой активностью фибрин-стабилизирующего фактора, о чем свидетельствует более высокая плотность сгустка при турбидиметрии. В то время как фибриновый сгусток в контрольных пробах при визуальной оценке был рыхлым, менее плотным.

Расчет коэффициента для перевода изменений оптической плотности при коагуляции цитратной плазмы в количество фибриногена в г/л.

В 96-ти луночные плоскодонные планшеты, в лунки опытных проб последовательно вносят по 50 мкл цитратной плазмы, 84 мкл буфера VBS, 16 мкл 10% ПЭГ-3350 и 50 мкл 0,25 М Са²⁺. В лунки контрольных проб (бланк плазмы) вносят 50 мкл цитратной плазмы и 150 мкл буфера VBS. Пробы тщательно перемешивают и инкубируют в течение 60 мин. Определяют степень коагуляции плазмы турбидиметрически по изменению поглощения в пробах при длине волны 450 нм. Далее аккуратно снимают фибриновые сгустки с опытных проб наконечником, максимально удаляют сыворотку крови «отжиманием» на фильтровальную бумагу, помещают в пробирки типа «эппендорф» и добавляют 1 мл дистиллированной воды для отмывки фибринового сгустка. После этого центрифугируют в течение 10 мин при 8000 об/мин для осаждения фибриновых сгустков, тщательно декантируют и преципитат, фибриновый сгусток, растворяют в исходного объема плазмы в 25 мкл 1,0 N NaOH путем инкубации в течение 10 мин при 56°С. Содержание белка в растворенном фибриновом сгустке определяют стандартным способом с использованием биуретового реактива. Параллельно в исходных пробах цитратной плазмы определяют фибриноген по Клауссу с использованием коммерческих наборов «Фибриноген» (Hemosil, Италия) на автоматическом гематологическом анализаторе ACL8/9/1000 System (Instrum. Lab. Соmр., США). Полученные результаты представлены в таблице 5.

Как видно из данных, представленных в таблице 5, фактор для перевода изменений оптической плотности плазмы при коагуляции (при рекальцификации), который рассчитывали как отношение содержания белка в фибриновом сгустке к изменению оптической плотности, в среднем составил 5,12±0,54. Следовательно, ошибка

эксперимента (определения белка) составила примерно 10%, что при переводе на фибриноген колебания коэффициента составили примерно 0,2 г/л по фибриногену. Как было показано ранее [Долгов В.В. и Свирин П.В. Лабораторная диагностика нарушений гемостаза. - М. - Тверь: ООО «Издательство «Триада» 2005. - 227 с], определение содержания ФГ по методу Клаусса является чувствительным к гипо-, дис- и гиперфибриногенемии, а также к продуктам деградации фибрина, которые влияют на процесс полимеризации фибрин-мономеров и могут быть причиной ложно низких результатов, а также тромбиновая активность зависит от функциональности самого фибриногена (от степени окисленности молекул фибриногена). Учитывая этот факт нами содержание белка в фибриновом сгустке принято, как более точное отражение уровня фибриногена. Ниже приводятся сравнительный анализ данных по определению фибриногена тремя разными методами, представленных в таблице 4.

I. Сравнительные данные фибриногена, определенного по методу Клаусса и белка в фибриновом сгустке:

1. Повышенный уровень ФГ по Клауссу определяется только в 1 пробе, в то время как в фибриновом сгустке определяется в трех пробах повышенный уровень ФГ;

2. В 8 пробах цитратной плазмы (33%) ФГ по Клауссу и в фибриновом сгустке совпали по величине (разница ФГ на уровне (±0,2 г/л) была нами принята за ошибку метода, который в процентах составляет 10%;

3. В 14 пробах (58%) ФГ по методу Клаусса значительно ниже, чем был определен белок в фибриновом сгустке (разница больше 10%), что может свидетельствовать о сниженной протеолитической активности тромбина при окислении фибриногена;

4. В 2 пробах (8%) ФГ по Клауссу определялся выше, чем белок в фибриновом сгустке. Данный факт может свидетельствовать об ограниченном (незначительном) окислении фибриногена, который делает такой фибриноген более чувствительным к протеолизу под действием тромбина;

II. Сравнительные данные белка в фибриновом сгустке с данными ФГ по Клауссу и предлагаемым методов:

1. В 14 пробах (58%) Белок в фибриновом сгустке значительно больше, чем ФГ по Клауссу;

2. В 19 пробах (79%) Белок в фибриновом сгустке примерно равен с содержанием ФГ, рассчитанным с использованием F (фактора) для перевода изменений оптической плотности при коагуляции плазмы (ΔА₄₅₀) в г/л (предлагаемый метод);

3. В 2 пробах (8%) Белок в фибриновом сгустке больше ФГ, рассчитанного по данному методу;

4. В 3 пробах плазмы (13%) Белок в фибриновом сгустке меньше расчетного ФГ по данному методу;

III. Сравнительный анализ ФГ (предлагаемый метод) и ФГ по Клауссу:

1. В 3 пробах (13%) выявляется повышенный уровень ФГ, в то время как по Клауссу ФГ только в 1 пробе повышен (>4 г/л);

2. В 14 пробах (42%) ФГ (предлагаемый метод) больше, чем ФГ по Клауссу;

3. В 10 пробах (38%) ФГ (предлагаемый метод) равен ФГ, определенному по методу Клаусса.

Полученные результаты позволяют определять содержание фибриногена фотометрически по изменению мутности проб при коагуляции цитратной плазмы при рекальцификации при длине волны 450 нм с интервалами измерения 0 и 60 мин. Для расчета содержания фибриногена проводят по формуле: ФГ (г/л)=ΔА₄₅₀×5,12, где: ΔА₄₅₀ - изменение оптической плотности при коагуляции плазмы; 5,12 - расчетный коэффициент для перевода изменений оптической плотности пробы при коагуляции плазмы в г/л, представляющий собой отношение белка в фибриновом сгустке к изменению оптической плотности в пробе прми коагуляции плазмы. Рассчитывают функциональность фибриногена как разность между количествами фибриногена, определенными данным способом и по методу Клаусса и при разнице более 10% определяют как нарушенную функциональность фибриногена.

Таким образом, определение ФГ тремя разными методами (по Клауссу, белок в фибриновом сгустке и предлагаемый способ) расширяют арсенал как для количественной оценки уровня ФГ, так и функциональности (окисленности) молекул ФГ. Как отмечалось выше с увеличением степени окисления фибриногена снижается скорость превращения в фибрин под действием тромбина. Данный эффект в методе определения ФГ по Клауссу должен давать заниженный результат, что нами и показано двумя независимыми способами, модифицированным методом по Рутбергу с использованием активатора коагуляции плазмы при рекальцификации и без этого активатора. Дальнейшие исследования содержания ФГ по Клауссу и предлагаемым методом должны на большем материале подтвердить причину расхождения уровня ФГ за счет изменения функциональности (окисленности) фибриногена (заниженные результаты по Клауссу), с одной стороны, и наличие образования комплексов окисленного фибриногена с окисленными липопротеинами низкой плотности, активированными белками системы комплемента C3b и C4b и с другими белками крови (завышенный результат по белку в фибриновом сгустке). Предлагаемый способ, таким образом, позволяет более углубленно, количественно оценивать уровень фибриногена и его функциональность. Далее нами был проведен корреляционный анализ данных определения ФГ тремя способами. На фигуре 1 представлен график корреляционного анализа фибриногена, определенному методом Клаусса и по предлагаемому методу. Получен высокий коэффициент корреляции при высокой степени достоверности (r=0.9; р=0.000000006). Корреляционный анализ фибриногена по Клауссу и белок в фибриновом сгустке дал следующие значения (r=0.75; р=0.00005). И чуть более высокой был коэффициент корреляции между белком в фибриновом сгустке и фибриногеном, полученным предлагаемым способом (r=0.84; р=0.0000004). Статистический анализ показывает, что разработанный способ определения фибриногена является корректным для рутинных исследований фибриногена и может быть внедрен в лабораторную практику для исследований не только количества фибриногена, но и его функциональности в дополнение к методу определения фибриногена по Клауссу.

Способ определения фибриногена при рекальцификации цитратной плазмы и характеристика его функциональности, включающий активацию контактного пути коагуляции в полистироловых 96-луночных плоскодонных иммунологических планшетах путем смешивания цитратной плазмы крови с хлоридом кальция с последующей фотометрической регистрацией свертывания, отличающийся тем, что в качестве активатора плазменной коагуляции используют полиэтиленгликоль с молекулярной массой 3350 (ПЭГ-3350), запускают реакцию в параллельных 2 сериях добавлением 50 мкл 0,25 М раствора хлорида кальция к пробе, содержащей 50 мкл цитратной плазмы, 16 мкл 10% раствора ПЭГ-3350, 84 мкл буфера VBS с рН 7,4, тщательно перемешивают, измеряют оптическую плотность проб, далее инкубируют в течение 60 мин при 37°С, в первой серии опыта определяют содержание белка в фибриновом сгустке стандартным способом с использованием биуретового реактива, во второй серии опыта определение коагуляции плазмы проводят фотометрически по изменению мутности проб при длине волны 450 нм с интервалами измерения 0 и 60 мин, расчет содержания фибриногена проводят по формуле: ФГ (г/л) = ΔА₄₅₀ × 5,12, где: ΔА₄₅₀ - изменение оптической плотности пробы во второй серии, при коагуляции плазмы; 5,12 - коэффициент для перевода изменений оптической плотности пробы при коагуляции плазмы в г/л, представляющий собой отношение белка в фибриновом сгустке к изменению оптической плотности в пробе при коагуляции плазмы, рассчитывают функциональность фибриногена как разность между количествами фибриногена, определенными данным способом и по методу Клаусса, рассчитывают разницу в % к белку в фибриновом сгустке и при разнице более 10% определяют как нарушенную функциональность фибриногена.