Набор синтетических олигонуклеотидов для определения последовательности генов hla-a, hla-b, hla-c, hla-dqb1, hla-drb1 главного комплекса гистосовместимости



Набор синтетических олигонуклеотидов для определения последовательности генов hla-a, hla-b, hla-c, hla-dqb1, hla-drb1 главного комплекса гистосовместимости
Набор синтетических олигонуклеотидов для определения последовательности генов hla-a, hla-b, hla-c, hla-dqb1, hla-drb1 главного комплекса гистосовместимости
Набор синтетических олигонуклеотидов для определения последовательности генов hla-a, hla-b, hla-c, hla-dqb1, hla-drb1 главного комплекса гистосовместимости
Набор синтетических олигонуклеотидов для определения последовательности генов hla-a, hla-b, hla-c, hla-dqb1, hla-drb1 главного комплекса гистосовместимости
G01N33/50 - химический анализ биологических материалов, например крови, мочи; испытания, основанные на способах связывания биоспецифических лигандов; иммунологические испытания (способы измерения или испытания с использованием ферментов или микроорганизмов иные, чем иммунологические, составы или индикаторная бумага для них, способы образования подобных составов, управление режимами микробиологических и ферментативных процессов C12Q)

Владельцы патента RU 2703545:

Общество с ограниченной ответственностью "ПАРСЕК ЛАБ" (RU)

Изобретение относится к области биохимии и молекулярной биологии. Предложен набор синтетических олигонуклеотидов для определения последовательности генов главного комплекса гистосовместимости HLA-A, HLA-B, HLA-C, HLA-DQB1, HLA-DRB1 в ходе ПЦР с дальнейшей визуализацией продуктов реакции методом электрофореза в агарозном геле. Изобретение обеспечивает создание новой системы типирования HLA. 4 ил., 7 табл., 2 пр.

 

Изобретение относится к области биохимии и молекулярной биологии, в частности к набору синтетических олигонуклеотидов. Набор предназначен для определения последовательности генов главного комплекса гистосовместимости – HLA-A, HLA-B, HLA-C, HLA-DQB1, HLA-DRB1 методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) и состоит из следующих праймеров:

HLA-A-F: AGAGAAGCCAATCAGTGTCGTCGCGGTC

HLA-A-R: CTCAGCCCCACCTCTCTGGAACAGG

HLA-B-F: CACCTCCATTCCCAGGGCGAGCTCACT

HLA-B-R: TTCTTTTACTTCAGTGGTGTTCCCCAGATG

HLA-C-F: CTAGAGAAGCCAATCAGCGTCT

HLA-C-R: ACGCAGACACATTCAGGTGCCTTTGC

HLA-DQB1-F1: TTCACCTCAGATGTTCATCCAGTA

HLA-DQB1-F2: TTCACCTCAGATGTTCATCCAGTG

HLA-DQB1-F3: TTCACCTCAAATGTTCATCCAGTG

HLA-DQB1-R: AGTCTTGATCCTCATAGCAGCAAATA

HLA-DRB1-F1: CGCTTTCACTGCTCTTTAAGCT

HLA-DRB1-F2: CACTTTCACTGCTCTTTAAGCT

HLA-DRB1-F3: CACTTTCGCTGCTCTTTAAGCT

HLA-DRB1-R1: CGTCTCTGCAGGCCACAAGCTAT

HLA-DRB1-R2: CGTCTCTGTAGGCCACAAGCTAT.

Цель изобретения – разработка набора синтетических олигонуклеотидов для определения последовательности генов HLA-A, HLA-B, HLA-C, HLA-DQB1, HLA-DRB1 главного комплекса гистосовместимости.

Трансплантация гемопоэтических стволовых клеток – метод клеточной терапии, применяющийся для лечения гематологических, онкологических, генетических и ряда других заболеваний путем пересадки гемопоэтических стволовых клеток (ГСК), способных полностью восстановить систему гемопоэза и иммунитета в организме после высокодозной химиотерапии [1, 2, 3].

Риски отторжения трансплантата и возникновения реакции «трансплантат против хозяина» зависят от качества подбора донора ГСК, совместимого по HLA-системе, характеризующейся высокой вариабельностью [4].

По состоянию на 07 февраля 2019 г., число потенциальных доноров ГСК, зарегистрированных в объединенной базе данных о российских донорах BMDS (Bone Marrow Donor Search), составляет 94 204 человека, в неё включены 15 регистров из 11 регионов Российской Федерации [5]. Такое количество безвозмездных доноров на сегодняшний день обеспечило 282 трансплантации ГСК для пациентов российских клиник [6].

В последние пять лет наметился явный прогресс во взаимодействии трансплантационных клиник с BMDS, однако многие российские пациенты по-прежнему зависят от донорского материала, получаемого из-за рубежа, либо вообще остаются без совместимого неродственного донора [6].

Сложившаяся ситуация требует увеличения числа потенциальных доноров ГСК в короткие сроки, а трансплантационные центры диктуют необходимость HLA-типирования доноров молекулярно-генетическими методами как минимум по пяти HLA-локусам. Прогресс в расширении донорской базы ограничивается прежде всего высокой стоимостью реагентов, используемых для проведения массового HLA-типирования доноров и низкой производительностью анализа.

В настоящее время наибольшее распространение в практике получили четыре технологии HLA-типирования: SSP (Sequence Specific Primers), SSO (Sequence Specific Oligonucleotides), SBT (Sequence Based Typing) и NGS (Next Generation Sequence). Метод SSP характеризуется низкой производительностью, SSO – невозможностью определения отдельных точечных вариаций, что особенно актуально в условиях малоизученных популяций, к которым следует отнести и большинство популяций, проживающих на территории РФ [7]. Технология SBT признана «золотым стандартом» HLA-типирования, с точки зрения идентификации новых аллелей, а при использовании современных многокапиллярных секвенаторов обладает и высокой производительностью. Однако даже существенное масштабирование исследований, выполняемых методом SBT, практически не снижает стоимости типирования. При необходимости изучения дополнительных экзонов/интронов затраты на SBT-типирование возрастают. Наиболее перспективным, с точки зрения увеличения производительности и существенного снижения стоимости HLA-типирования, представляется применение технологии массового параллельного секвенирования (MPS - massive parallel sequencing).

Стандартный протокол проведения таргетного MPS исследования включает в себя следующие этапы: таргетное обогащение генов, приготовление библиотек, секвенирование, анализ данных.

Отдаленным аналогом предлагаемого изобретения является набор синтетических олигонуклеотидов для определения последовательности 1 интрона, примыкающего ко 2 экзону, генов системы HLA I и II классов (HLA-A и HLA-DRB1) [8].

Техническим результатом заявляемого изобретения является изучение последовательностей генов HLA-A, HLA-B, HLA-C, HLA-DQB1, HLA-DRB1 главного комплекса гистосовместимости с целью создания системы типирования HLA. Использование предлагаемого набора синтетических олигонуклеотидов позволит проводить таргетную амплификацию при HLA-типировании потенциальных доноров ГСК в высоком разрешении, с возможностью выявления ранее незарегистрированных аллелей.

Для достижения указанного результата проводят ПЦР длинных фрагментов образца ДНК. В отличие от отдалённого аналога, позволяющего получать только последовательность первого интрона генов HLA-A и HLA-DRB1, предлагаемый набор праймеров позволяет определять последовательности всего гена локусов HLA-A, HLA-B, HLA-C (за исключением участка 3’-UTR), участка гена с первого по пятый экзон локуса HLA-DQB1, участка гена со второго по четвертый экзон локуса HLA-DRB1, что сводит число возможных неоднозначностей типирования к минимуму.

В процессе проведения патентно-информационного поиска не выявлено источников, порочащих новизну предполагаемого изобретения.

Заявляемое изобретение разработано в ООО «ПАРСЕК ЛАБ».

Осуществление изобретения:

Материалом для исследования является геномная ДНК человека. Исследуемый препарат ДНК не должен содержать посторонних примесей, соотношение А260/A280 должно составлять 1,7-1,9. Для анализа одного образца требуется 300 нг ДНК (30 мкл ДНК с концентрацией 10нг/мкл для анализа 5 локусов), концентрация геномной ДНК должна быть оценена флуоресцентным методом.

Использование изобретения возможно в двух форматах моноплексный и мультиплексный:

1. Формат – моноплексный.

Для получения последовательностей генов HLA-A, HLA-B, HLA-C, HLA-DQB1, HLA-DRB1 главного комплекса гистосовместимости используется постановка ПЦР длинных фрагментов с помощью набора специфичных праймеров. Дополнительно в реакционную смесь добавляют следующие компоненты: смесь дезоксирибонуклеотидтрифосфатов четырех типов в конечной концентрации каждого 200 мкМ, Taq-полимеразу (AccuPrime или Encyclo), реакционный буфер (600 мМ Tris-SO4, рН=8,9; 180 мМ (NH4)2SO4, 20 мМ Mg2+, 10% глицерол).

В подготовленную реакционную смесь добавляют образец ДНК и проводят ПЦР длинных фрагментов по следующим профилям:

- для локуса HLA-A

Температура Время Количество циклов
94оС 2 мин 1
98оС 10 сек 35
67оС 15 сек
68оС 3 мин
68оС 10 мин 1
4оС не ограничено

- для локуса HLA-B

Температура Время Количество циклов
94оС 2 мин 1
98оС 10 сек 35
60оС 15 сек
68оС 5 мин
68оС 10 мин 1
4оС не ограничено

- для локуса HLA-C

Температура Время Количество циклов
94оС 2 мин 1
98оС 10 сек 35
65оС 15 сек
68оС 5 мин
68оС 10 мин 1
4оС не ограничено

- для локуса HLA-DQB1

Температура Время Количество циклов
94оС 2 мин 1
98оС 10 сек 35
60оС 15 сек
68оС 6 мин
68оС 10 мин 1
4оС не ограничено

- для локуса HLA-DRB1

Температура Время Количество циклов
94оС 2 мин 1
98оС 10 сек 30
62оС 30 сек
68оС 7 мин
68оС 10 мин 1
4оС не ограничено

2. Формат – мультиплексный.

Для получения последовательностей генов HLA-A, HLA-B, HLA-C, HLA-DQB1, HLA-DRB1 главного комплекса гистосовместимости используется постановка ПЦР длинных фрагментов с помощью набора специфичных праймеров. Дополнительно в реакционную смесь добавляют следующие компоненты: смесь дезоксирибонуклеотидтрифосфатов четырех типов в конечной концентрации каждого 200 мкМ, Taq-полимеразу (AccuPrime или Encyclo), реакционный буфер (600 мМ Tris-SO4, рН=8,9; 180 мМ (NH4)2SO4, 20 мМ Mg2+, 10% глицерол).

В подготовленную реакционную смесь добавляют образец ДНК и проводят ПЦР длинных фрагментов по следующему профилю:

Температура Время Количество циклов
94оС 2 мин 1
98оС 10 сек 2
70оС 15 сек
68оС 5,5 мин
98оС 10 сек 2
69оС 15 сек
68оС 5,5 мин
98оС 10 сек 2
68оС 15 сек
68оС 5,5 мин
98оС 10 сек 2
67оС 15 сек
68оС 5,5 мин
98оС 10 сек 2
66оС 15 сек
68оС 5,5 мин
98оС 10 сек 3
65оС 15 сек
68оС 5,5 мин
98оС 10 сек 3
64оС 15 сек
68оС 5,5 мин
98оС 10 сек 3
63оС 15 сек
68оС 5,5 мин
98оС 10 сек 3
62оС 15 сек
68оС 5,5 мин
98оС 10 сек 3
61оС 15 сек
68оС 5,5 мин
98оС 10 сек 3
60оС 15 сек
68оС 5,5 мин
98оС 10 сек 3
59оС 15 сек
68оС 5,5 мин
98оС 10 сек 2
58оС 15 сек
68оС 5,5 мин
98оС 10 сек 2
57оС 15 сек
68оС 5,5 мин
68оС 10 мин 1
4оС не ограничено

Оценку наличия продукта реакции ПЦР длинных фрагментов осуществляют электрофорезом в агарозном геле. Размер ампликона должен соответствовать указанному в таблице:

HLA-локус Размер продукта ПЦР, п.н
HLA-A 3 200
HLA-B 4 609
HLA-C 3 000
HLA-DQB1 6 100
HLA-DRB1 4 300

Примеры визуализации продуктов реакции ПЦР длинных фрагментов с использованием набора синтетических олигонуклеотидов для определения последовательности генов главного комплекса гистосовместимости – HLA-A, HLA-B, HLA-C, HLA-DQB1, HLA-DRB1.

Моноплексный формат:

Мультиплексный формат:

Список литературы:

1. Passweg J.R., Baldomero H., Bader P.et al.; European Society for Blood and Marrow Transplantation (EBMT). Hematopoietic SCT in Europe 2013: recent trends in the use of alternative donors showing more haploidentical donors but fewer cord blood transplants. Bone Marrow Transplant. – 2015. – 50 (4). P. 476–82.

2. Syed A. Abutalib, Parameswaran Hari. Clinical Manual of Blood and Bone Marrow Transplantation. – Chichester: Wiley-Blackwell, 2017. – 424 с.

3. Кокорев О.В., Чердынцева Н.В., Зайцев К.В., Волгушев С.В. Теоретические и практические аспекты трансплантации стволовых клеток в онкологии // Сибирский онкологический журнал. – 2005. – № 4 (16). – С. 53–61.

4. Афанасьев Б.В., Зубаровская Л.С., Алянский А.Л. и др. Выбор донора при аллогенной трансплантации гемопоэтических стволовых клеток // Российский журнал детской гематологии и онкологии. – 2016. – Т.3. – С. 30-36.

5. Счетчик регистра (2018). Доступен: http://www.rdkm.rusfond.ru/registr_stat/001 (обновление 10.08.2018).

6. Макаренко О.А., Алянский А.Л., Иванова Н.Е. и др. Эффективность поиска неродственного донора гемопоэтических стволовых клеток с помощью российской поисковой системы Bone Marrow Donor Search: опыт НИИ детской онкологии, гематологии и трансплантологии им. Р.М. Горбачевой // Клиническая онкогематология. – 2017. -№ 10. – С. 39-44.

7. Логинова М.А., Парамонов И.В. Новые HLA-аллели в российских популяциях // Трансфузиология. – 2016. - №3. Т.17. – С.13-20.

8. Патент Набор синтетических олигонуклеотидов для определения последовательности 1 интрона, примыкающей ко 2 экзону, генов системы HLA I и II классов (HLA-A и HLA-DRB1). RU 2649064.

Набор синтетических олигонуклеотидов для определения последовательности генов главного комплекса гистосовместимости - HLA-A, HLA-B, HLA-C, HLA-DQB1, HLA-DRB1 в ходе ПЦР длинных фрагментов (моноплексный и мультиплексный форматы):

HLA-A-F: AGAGAAGCCAATCAGTGTCGTCGCGGTC

HLA-A-R: CTCAGCCCCACCTCTCTGGAACAGG

HLA-B-F: CACCTCCATTCCCAGGGCGAGCTCACT

HLA-B-R: TTCTTTTACTTCAGTGGTGTTCCCCAGATG

HLA-C-F: CTAGAGAAGCCAATCAGCGTCT

HLA-C-R: ACGCAGACACATTCAGGTGCCTTTGC

HLA-DQB1-F1: TTCACCTCAGATGTTCATCCAGTA

HLA-DQB1-F2: TTCACCTCAGATGTTCATCCAGTG

HLA-DQB1-F3: TTCACCTCAAATGTTCATCCAGTG

HLA-DQB1-R: AGTCTTGATCCTCATAGCAGCAAATA

HLA-DRB1-F1: CGCTTTCACTGCTCTTTAAGCT

HLA-DRB1-F2: CACTTTCACTGCTCTTTAAGCT

HLA-DRB1-F3: CACTTTCGCTGCTCTTTAAGCT

HLA-DRB1-R1: CGTCTCTGCAGGCCACAAGCTAT

HLA-DRB1-R2: CGTCTCTGTAGGCCACAAGCTAT

с дальнейшей визуализацией продуктов реакции определенного размера методом электрофореза в агарозном геле, отличающийся возможностью определения последовательности всего гена локусов HLA-A, HLA-B, HLA-C (за исключением участка 3’-UTR), участка гена с первого по пятый экзон локуса HLA-DQB1, участка гена со второго по четвертый экзон локуса HLA-DRB1 в моноплексном и мультиплексном форматах.



 

Похожие патенты:

Изобретение относится к медицине и может быть использовано для мониторинга возможного стойкого отклонения от нормы энергетического метаболизма эритроцитов и/или нарушения структуры их мембран.

Изобретение относится к области медицины, а именно дерматовенерологии и онкологии, в частности к способу дифференциальной диагностики актинического кератоза и плоскоклеточного рака.
Изобретение относится к области медицины, в частности к гематологии, и предназначено для лечения иммунной тромбоцитопении (ИТП). Проводят идентификацию аллельного полиморфизма генов гликопротеинов GpIIb T2622G и GpIa A1648G, ответственных за формирование систем НРА-3 и -5 соответственно.

Изобретение относится к области медицины, а именно гастроэнтерологии и анестезиологии-реаниматологии, и может быть использовано для прогнозирования течения механической желтухи неопухолевого генеза (доброкачественного происхождения).
Изобретение относится к медицине, а именно к эндокринологии, и может быть использовано для оценки риска развития структурно-метаболических нарушений костной ткани у женщин, больных сахарным диабетом 2 типа.

Изобретение относится к онкогематологии. Способ прогнозирования эфективности лечения больного ОМЛ характеризуется тем, что у больного берут пробу крови или костного мозга, выделяют опухолевые клетки, культивируют их с дуанорубицином и цитозин-арабинозидом в отдельности, добавляют раствор WST-1, определяют относительную плотность живых клеток в лунках планшета и IC50 для каждого цитостатического препарата, при значении IC50 для даунорубицина, попадающем в области 0,014-0,25 мкМ/л; от более 0,25 до 0,5, включая 0,5 мкМ/л; более 0,5 мкМ/л, а значении IC50 для цитарабина, попадающем в области 0,3-1,5 мкМ/л, от более 1,5 до 8, включая 8 мкМ/л; более 8 мкМ/л, устанавливают соответственно высокую, среднюю или низкую чувствительность опухолевых клеток пациента in vitro к даунорубицину и цитарабину соответственно; и по данным о чувствительности опухолевых клеток пациента к даунорубицину и цитарабину судят об эффективности лечения больного ОМЛ данными препаратами.

Изобретение относится к медицине, а именно к онкологии, и может быть использовано для диагностики острого повреждения почек после органосохраняющего хирургического лечения локализованного рака почки.

Изобретение относится к медицине, в частности к онкологии и патологической анатомии, а именно к дифференциальной диагностике зубчатых новообразований толстой кишки.
Изобретение относится к области молекулярной биологии, лабораторной диагностики, вирусологии и эпидемиологии и предназначено для генотипирования энтеровирусов методом секвенирования 1A-1B участка генома.

Изобретение относится к области биотехнологии, конкретно к иммуногенным эпитопам URLC10, и может быть использовано в медицине для лечения пациента, страдающего раком.

Предложенная группа изобретений относится к области медицины. Предложены способ и система для оценки эффективности воздействия лекарственных кандидатов, выбранных из группы лекарственных кандидатов, на физиологический процесс.

Предложенная группа изобретений относится к области медицинской микробиологии. Предложены способ и набор для генодиагностики коклюша, содержащие реакционный буфер qPCRmix-HS, 25 mM MgCl2 и 9 праймеров: hIS1001F, hIS1001R, hIS1001P, IS481F, IS481R, IS481P, IS1001F, IS1001R, IS1001P.

Изобретение относится к области биотехнологии, молекулярной биологии и генетики. Предложен способ определения генотипа человека по мутации с.496A>G в 6 экзоне гена DPYD, включающий проведение ПЦР в режиме реального времени с детекцией результатов с помощью метода анализа кривых плавления (HRM) и оптимизацией ПЦР с помощью применения адаптированного буфера для Taq-полимеразы состава Трис-HCl 67 mM, (NH4)2SO4 166 mM, tween-20 0,1%, глицерин 1%, рН 8,7.

Изобретение относится к области медицины, в частности к педиатрии и эндокринологии, и предназначено для определения предрасположенности к развитию ожирения у детей в условиях избыточной контаминации алюминием.

Группа изобретений относится к способам скрининга рака, такого как рак шейки матки, рак яичников, рак толстой кишки, рак эндометрия, саркома, рак молочной железы. Способы включают следующие этапы: предоставление образца для детектирования; детектирование статуса метилирования последовательности CpG в целевом гене POU4F3 в геномной ДНК образца, где статус метелирования детектируют парой праймеров, имеющих последовательность нуклеотидов SEQ ID NO: 20-21, и необязательно детектирование статуса метилирования последовательности CpG в по крайней мере одном гене, выбранном из ADRA1D, AJAP1, HS3ST2, MAGI2, POU4F2, PTGDR, SOX17 и SYT9, в геномной ДНК образца; определение наличия в образце рака или предопухолевых изменений по гиперметилированию целевого гена.

Изобретение относится к области медицины, биологии и биотехнологии и предназначено для определения генотипа человека по полиморфизму в гене матриксной металлопротеиназы 3 (ММР3) -1171>5А/6А.

Изобретение относится к области медицины, в частности к молекулярной биологии, онкологии, и предназначено для прогнозирования развития метастазов у больных раком тела матки.

Изобретение относится к области медицины, в частности к медицинской генетике и онкогематологии, и предназначено для количественного определения мутаций F317L и F359V/C киназного домена BCR-ABL у больных хроническим миелоидным лейкозом, резистентных к терапии ингибиторами тирозинкиназ.
Изобретение относится к области медицины, в частности к медицинской генетике и кардиологии, и предназначено для выявления предрасположенности пациента к атеросклерозу или наличия доклинических признаков этой патологии.

Изобретение относится к области медицины и молекулярной биологии. Предложен экспресс-тест на основе ПЦР для прогнозирования чувствительности образца опухоли головного мозга конкретного пациента к онколитическим вирусам.

Предложенная группа изобретений относится к области медицины. Предложены способ и система для оценки эффективности воздействия лекарственных кандидатов, выбранных из группы лекарственных кандидатов, на физиологический процесс.
Наверх