Способ и устройство для обнаружения бактерий

Группа изобретений относится к ускоренному и высокочувствительному способу обнаружения бактериальных патогенов. Раскрыт способ обнаружения бактерий, включающий обеспечение одной или более чем одной суспензии, причем каждая содержит по меньшей мере один вид меченых тестируемых бактериофагов, которые специфично связываются с видом бактерий, подлежащим обнаружению; добавление образца, подлежащего проверке на наличие по меньшей мере одного вида бактерий; фильтрацию полученной реакционной смеси; обнаружение комплексов бактерии-бактериофаги в концентрате; обнаружение несвязанных бактериофагов в фильтрате; обработку полученных сигналов, сгенерированных в результате обнаружения, и вывод результатов обнаружения пользователю. При этом одна или более чем одна суспензия дополнительно содержит меченый эталонный бактериофаг, который не связывается ни с каким видом бактерий, подлежащим обнаружению, или меченые микро- или наночастицы, которые не связываются ни с каким видом бактерий, подлежащим обнаружению; причем определяют соотношение суммарной интенсивности сигнала эталонного бактериофага в концентрате и суммарной интенсивности сигнала эталонного бактериофага в фильтрате и сравнивают с соотношением суммарной интенсивности сигнала тестируемого бактериофага в концентрате и суммарной интенсивности сигнала тестируемого бактериофага в фильтрате. Также раскрыты реакционный сосуд, картридж и измерительное устройство для обнаружения бактерий в соответствии с описанным способом. Группа изобретений обеспечивает быструю и надежную идентификацию бактериальных патогенов, упрощенное осуществление и высокую чувствительность. 4 н. и 14 з.п. ф-лы, 19 ил., 2 пр.

 

Настоящее изобретение относится к способу обнаружения бактерий, в частности, ускоренному и высокочувствительному способу обнаружения бактериальных патогенов, который основан на образовании специфичных комплексов бактерии-бактериофаги. Кроме того, описан реакционный сосуд и измерительное устройство для осуществления способа по изобретению.

Бактерии часто характеризуются как патогены, вызывающие серьезные заболевания. В частности, штаммы полирезистентных бактерий, также известных как «больничные патогены», обуславливают большое количество бактериальных инфекций в больницах. С учетом демографического изменения и возможностей современной интенсивной терапии, в отделениях интенсивной терапии наблюдается растущее число пациентов пожилого возраста, которые являются особенно чувствительными к бактериальным инфекциям. Одним из центральных структурных элементов интенсивной терапии является микробиологическая диагностика. Быстрая и правильная идентификация патогенов инфекции не только очень значительно влияет на уровень смертности пациентов, но также позволяет использовать бактериологические специфичные антибиотики, таким образом инфляционное применение антибиотиков широкого спектра действия и сопутствующего этому отбора полирезистентньгх бактериальных штаммов можно избежать. Однако способы, существующие в настоящее время, обычно являются времязатратными и также дорогостоящими.

Например, анализ культур крови на сегодняшний день является одним из основных направлений в диагностике инфекций кровотока. При этом инкубация протекает в культуральных флаконах в аэробных и анаэробных условиях. Помимо крови, для данной цели подходят стерильные жидкости, такие как пунктаты или водные растворы. В большинстве случаев, для диагностики при комнатной температуре используют примерно 3-4 культуральных флакона, каждый из которых содержит 10 мл цельной крови. Гемокультуральные флаконы инкубируют в полуавтоматической системе, в которой усиливающийся рост бактерий измеряют по возрастающему выделению СО₂ или увеличению давления в колбе. Стандартная инкубация в большинстве случаев составляет от 48 до 72 часа. Таким образом, медленнорастущие бактерии, которым требуется инкубация от 5 до 21 суток и которые, вследствие этого, могут быть легко не обнаружены стандартными способами, представляют особую проблему. Аналогично, специальные культуральные среды или процессы окрашивания усложняют и замедляют надежную и быструю диагностику. Если результат обнаружения бактерии в гемокультуральном флаконе положительный, то флакон отбирают из системы. Из этой колбы отбирают образец, и аэробные и анаэробные субкультуры снова получают на разных культуральных средах. После дополнительных восьми часов может быть проведено приблизительное определение резистентности с сопутствующим тестом на чувствительность к антибиотикам.

Более быструю идентификацию патогенов проводят непосредственно из гемокультурного флакона с положительным результатом в течение 1-2 часов, используя реакцию латекс-агглютинации для обнаружения антигенов Streptococcus pneumoniae, Streptococcus agalactiae, Haemophilus influenzae, Neisseria meningitis, E.coli и Salmonella typhi. Способы обнаружения нуклеиновых кислот, такие как ДНК-гибридизация, флуоресцентная гибридизация in situ (FISH) и методы специфичной амплификации нуклеиновых кислот (NAT), в последнее время используются для диагностики бактериемии и сепсиса, но доступны эти способы только в очень немногих лабораториях. Таким образом, патоген может быть определен в течение 1-3 часов из гемокультурного флакона с положительным результатом. Кроме того, в последние годы некоторые клинические лаборатории были усовершенствованы с помощью MALDI-TOF масс-спектрометров (времяпролетная масс-спектрометрия с матрично-активированной лазерной десорбцией/ионизацией), которые позволяют идентифицировать бактерии в течение лишь нескольких минут. Однако эти современные способы обнаружения, описанные выше, все еще требуют наличие гемокультурного флакона с положительным результатом. Таким образом, обнаружение бактериальных патогенов с использованием положительного результата анализа культур крови можно обычно провести только в течение временного окна от 24 до 36 часов после взятия образца.

В некоторых случаях методы ПЦР-диагностики позволяют провести обнаружение бактерий из образцов крови в течение 4-6 часов после отбора проб без промежуточной стадии инкубации гемокультуры, например, для Staphylococcus aureus. Наиболее современные способы представляют собой способы мультиплексной амплификации, которые обнаруживают наиболее распространенные патогены. Данные способы включают LightCycler, SeptiFast и SepsiTest. Однако эти тесты являются довольно чувствительными к загрязнениям, из-за которых дают ложные или ложноположительные результаты. Другим недостатком данных способов является количество работы и структура расходов, так как ПЦР-диагностика требует не только материальных средств, но также соответствующий квалифицированный персонал и подходящую инфраструктуру.

Кроме того, следует отметить, что в 2-3% всех случаев положительный результат обнаружения гемокультуры также возникает в результате загрязнения образца или ошибок при обработке данных после отбора образцов. Последствиями являются неправильные антибиотикотерапии с необязательными и иногда значительными затратами, и поэтому быстрый, легкий в использовании и высокочувствительный способ обнаружения бактериальных патогенов был бы предпочтительным.

В отношении требований высокой чувствительности и специфичности, бактериофаги (или просто фаги) представляют собой перспективную отправную точку. Бактериофаги представляют собой вирусы, которые специфично нацелены на бактериальные клетки, распознают их через структуры поверхностных рецепторов, связывают их путем типа «ключ-замок» и используют генетические и ферментативные средства бактерий для их собственного размножения на последующих этапах. Инфицированные бактериальные клетки разрушаются и высвобождают множество новых фагов. Данная последовательность биологических процессов продолжается до тех пор, пока все бактериальные клетки-хозяева, доступные для свободного фага, не будут удалены. Фаги почти всегда воздействуют только на штаммы в пределах одного вида бактерий, то есть они высокоспецифичны в отношении определенного вида бактерий. Так как многие виды бактерий могут быть обнаружены повсеместно во множестве мест обитания, то в соответствии с биологическим принципом, можно ожидать, что их комплементарные фаги также там обнаруживаются. В целом, число фагов, по оценке экспертов, в десять раз превышает число бактерий (С. Rohde & J. Sikorski: Bakteriophagen - Vielfalt, Anwendung und ihre Bedeutung die Wissenschaft vom Leben. Naturwiss. Rundschau (2011), 64, 5-14). Необходимые бактериофаги часто могут быть выделены из всех возможных водных мест обитания посредством простого отбора образцов и их последующей проверки с целью обнаружения бактерий-мишеней.

Ввиду своей высочайшей специфичности в отношении хозяев и литических свойств, фаги уже используют различным образом в клиническом исследовании и анализе, например, в фаговой терапии против бактериальных инфекций. Кроме того, Thanki, Malik, Clokie описывают разработку биолюминесцентного репортерного фага для идентификации Clostridium difficile, в которой генные кассеты luxA и LuxB, кодирующие фермент люцифераза, клонируют в плазмиду для конъюгации в Clostridium difficile-специфичный фаг и для гомологичной вставки в геном фага (A. Thanki, D. Malik, М. Clokie, The Development of a Reporter Phage for the Identification of Clostridium difficile, Bacteriophages (2015), Abstract, 25). В научной публикации Mosier-Boss et al. дополнительно описано специфичное обнаружение Salmonella typhimurium LT2 с использованием флуоресцентно-меченных фагов Р22. Метка фага полностью ограничивается ДНК фага (10-минутная инкубация Р22 с красителем SYBR gold), который вводят в бактерию-хозяина при инфицировании. Обнаружение специфичных комплексов Salmonella typhimurium-Р22-фаги проводят после выделения комплексов посредством флуоресцентной микроскопии (P.A. Mosier-Boss et al. Use of Fluorescently Labeled Phage in the Detection and Identification of Bacterial Species, Applied Spectroscopy (2003), 57, 1138-1144).

Простое и надежное обнаружение бактерий также важно в пищевой промышленности и питьевом водоснабжении. Штаммы Легионеллы могут распространяться в питьевой воде при температуре от 20 до 45°С, так что регулярное тестирование питьевой воды необходимо и также предусмотрено законом во многих странах. Например, в Германии контроль питьевой воды предусматривает регулярное тестирование на наличие Легионеллы. Следует ожидать, что законоположения будут дополнительно ужесточаться. Институты и органы власти, например, лаборатории контроля качества питьевой воды или органы здравоохранения, вследствие этого, стремятся к проведению быстрого, простого, чувствительного и безопасного обнаружения бактерий штаммов Легионеллы. В настоящее время существует недостаток способов обнаружения и необходимость их усовершенствования.

С другой стороны, пищевые бактериальные отравления и пищевые токсикоинфекции являются глобальной проблемой и вызывают массовый экономический ущерб. Длительный период, предшествующий надежному обнаружению патогенов, подразумевает значительные экономические потери, так как либо период хранения продуктов до перепродажи увеличивается, либо соответствующий продукт может быть даже изъят.Более быстрый и безопасный способ обнаружения может значительно способствовать увеличению безопасности пищевых продуктов и минимизации экономических потерь. К опасным патогенам в пищевой отрасли относят Cronobacter spp, Salmonella spp, Shigella spp, Escherichia coli, Yersinia enterocolitica, Vibrio spp, Aeromonas spp, Plesiomonas spp, Listeria monocytogenes, Campylobacter jejuni или Bacillus cereus. Быстрое исключение или обнаружение патогенов в пищевых продуктах, вследствие этого, является существенным для их сертификации.

Другие области, где необходимо быстрое и простое обнаружение бактерий, включают сельскохозяйственную промышленность, ветеринарную медицину, военные применения или ликвидацию последствий стихийных бедствий и катастроф.

Ввиду недостатков клинических способов обнаружения бактерий современного уровня техники, особенно касающихся временных затрат, сложности и стоимости этих способов, существует потребность в новой, более быстрой и специфичной диагностике необходимой для своевременного и селективного обнаружения бактерий, будь оно для клинических, медицинских или ветеринарных, сельскохозяйственных или военных применений, или для анализа питьевой воды, и это лишь несколько конкретных применений. Таким образом, цель настоящего изобретения заключается в предоставлении улучшенного способа обнаружения бактерий, который обеспечивает более быструю и более надежную идентификацию бактериальных патогенов, упрощенное осуществление и высокую чувствительность наряду с меньшими затратами. Аналогично, предоставлен реакционный сосуд и измерительное устройство для реализации способа по изобретению.

Решение по изобретению цели упомянутой выше основано на эволюционно консервативном, высокоспецифичном взаимодействии бактерий и бактериофагов.

Таким образом, в настоящем изобретении описан способ обнаружения бактерий, включающий следующие стадии:

A) обеспечение одной или более чем одной суспензии, причем каждая содержит по меньшей мере один вид меченных тестируемых бактериофагов, которые специфично связываются с видом бактерий, подлежащим обнаружению;

B) добавление образца, подлежащего проверке на наличие по меньшей мере одного вида бактерий, подлежащего обнаружению, в одну или более чем одну суспензию;

C) фильтрация полученной реакционной смеси;

D) обнаружение комплексов бактерии-бактериофаги в концентрате, при условии, что присутствует по меньшей мере один вид бактерий, подлежащий обнаружению, где комплексы состоят из бактерий по меньшей мере одного вида бактерий, подлежащего обнаружению, и тестируемых бактериофагов по меньшей мере одного вида тестируемых бактериофагов, связанных с ними;

E) обнаружение несвязанных тестируемых бактериофагов в данном фильтрате;

F) опосредованная процессором обработка полученных сигналов, генерируемых в результате обнаружения на стадиях D) и Е), и вывод результатов обнаружения пользователю.

Кроме того, настоящее изобретение относится к реакционному сосуду для реализации способа обнаружения бактерий по изобретению, содержащему

по меньшей мере два отсека, отделенных друг от друга фильтром, где один отсек представляет собой резервуар для фагов, содержащий суспензию, которая содержит по меньшей мере один вид меченных тестируемых бактериофагов, которые специфично связываются с видом бактерии, подлежащим обнаружению, и другой отсек представляет собой сборный резервуар для приема фильтрата после добавления образца к суспензии и фильтрации через фильтр;

средство идентификации реакционного сосуда; и

по меньшей мере два измерительных окна, где одно измерительное окно расположено в области поверхности фильтра, обращенной к резервуару для фагов, и другое измерительное окно расположено в области сборного резервуара.

Кроме того, настоящее изобретение относится к картриджу, содержащему два или более чем два реакционных сосуда согласно изобретению, которые расположены параллельно и/или последовательно друг за другом,

где каждый параллельный реакционный сосуд содержит разные виды меченных тестируемых бактериофагов в суспензии резервуара для фагов, причем каждый специфично связывается с разными видами бактерий, подлежащими обнаружению.

Кроме того, настоящее изобретение относится к измерительному устройству для реализации способа обнаружения бактерий по изобретению, содержащему

разъем, в который вставлен реакционный сосуд согласно изобретению или картридж согласно изобретению;

по меньшей мере два оптических устройства для обнаружения, каждое из которых расположено в области измерительных окон вставленного реакционного сосуда или картриджа, где каждое оптическое устройство для обнаружения содержит систему линз для фокусирования света, излучаемого меткой бактериофагов, на по меньшей мере один сенсор, причем по меньшей мере один сенсор обнаруживает излучаемый свет;

процессор, который связан с по меньшей мере одним сенсором оптического устройства для обнаружения, соответственно, и который обрабатывает полученные сигналы обнаружения; и блок вывода, соединенный с процессором, который выводит результаты обнаружения для пользователя.

С одной стороны, полезный эффект настоящего изобретения заключается в быстрой и высокочувствительной идентификации бактериальных патогенов. Таким образом, анализ культур крови не является обязательным для способа по изобретению. Наоборот, образец, который подлежит проверке на наличие специфичных видов бактерий, можно использовать сразу после отбора. Таким образом, в идеале бактерии могут быть обнаружены менее чем за 1 час без необходимости транспортировки и хранения образца. Это делает возможным более быстрое и более специфичное в отношении бактерий применение антибиотиков, избегая, таким образом, профилактического применения антибиотиков широкого спектра действия. Кроме того, с помощью способа по изобретению бактерии могут быть обнаружены при концентрациях меньше чем 100 бактерий на миллилитр. С другой стороны, настоящий способ отличается непосредственным применением образца после его изъятия и легкостью осуществления, это делает способ менее чувствительным к ошибкам при обработке данных. Кроме того, осуществление способа с использованием реакционного сосуда по изобретению и измерительного инструмента по изобретению не требует признанного квалифицированного персонала или специальной инфраструктуры, что значительно снижает издержки.

Фиг. 1: Схематическое представление предпочтительного варианта осуществления способа обнаружения бактерий по изобретению.

Фиг. 2: Схематическое представление другого предпочтительного варианта осуществления способа обнаружения бактерий по изобретению.

Фиг. 3А: Схематическое представление предпочтительного варианта осуществления реакционного сосуда по изобретению для обнаружения бактерий.

Фиг. 3Б: Теоретический ход измерения флуоресценции с временным разрешением в предпочтительном варианте осуществления способа по изобретению с использованием реакционного сосуда по изобретению, изображенного на Фиг. 3А.

Фиг. 4А: Схематическое представление предпочтительного варианта осуществления картриджа по изобретению для обнаружения бактерий, а) вид спереди, б) вид сверху и в) вид сбоку.

Фиг. 4Б: Теоретические ходы измерений флуоресценции с временным разрешением в предпочтительном варианте осуществления способа по изобретению с использованием картриджа по изобретению, изображенного на Фиг. 4А.

Фиг. 5: Схематическое представление сборки реакционного сосуда по изобретению и измерительного устройства в одном варианте осуществления.

Фиг. 6: Чип RFID (чип радиочастотной идентификации) как средство идентификации реакционного сосуда по изобретению.

Фиг. 7: Мечение бактериофага ТВ54 сложными NHS-эфирами флуоресцеина.

Фиг. 8: Спектр возбуждения и излучения бактериофагов ТВ54, меченных флуоресцеином.

Фиг. 9А: Изображение, полученное с помощью флуоресцентного микроскопа, взаимодействия бактерий и бактериофагов.

Фиг. 9Б: Изображение, полученное методом светлого поля, взаимодействия бактерий и бактериофагов.

Фиг. 10А: Изображения оптических срезов бактерий Escherichia coli, инфицированных бактериофагами ТВ54, меченными флуоресцеином, в проходящем свете и в представлении флуоресцентного микроскопа.

Фиг. 10Б: Трехмерные реконструкции бактерий Escherichia coli, инфицированных бактериофагами ТВ54, меченными флуоресцеином.

Фиг. 11А: Спектры флуоресценции бактериофагов ТВ54, меченных флуоресцеином, при разных концентрациях бактериофагов.

Фиг. 11Б: Представление интегралов в пределах от 520 до 530 нм спектров флуоресценции, изображенных на Фиг. 10А, при разных концентрациях бактериофагов.

Фиг. 12А-В: Измерение оптической плотности серийно разведенной бактериальной суспензии, представление обнаруженных сигналов флуоресценции комплексов Е. coli С600 - фаги ТВ54 на поверхности фильтра в концентрате и представление обнаруженных сигналов флуоресценции несвязанных фагов ТВ54 в фильтрате, каждое при разных концентрациях бактерий.

Способ согласно изобретению на стадии А) включает обеспечение одной или более чем одной суспензии, каждая из которых содержит по меньшей мере один вид меченных тестируемых бактериофагов, которые специфично связываются с видом бактерий, подлежащим обнаружению. Предпочтительно, метка характерна для соответствующего вида меченных тестируемых бактериофагов. Это означает, что метки, которые связаны с разными видами тестируемых бактериофагов, разобщены. В качестве альтернативы, метки могут также являться частично перекрывающимися, в результате чего сигналы отдельных меток и разных видов тестируемых бактериофагов,, соответственно, могут быть спектрально разделены посредством метода спектроскопического анализа и, таким образом, могут быть со всей очевидностью соотнесены. В этом случае, перекрывающиеся метки можно также обнаружить последовательно.

Предпочтительно объем суспензии составляет от 0,5 до 5,0 мл.

Концентрация бактериофагов в суспензии, также называемая титром фага, предпочтительно составляет от 10³ до 10¹² БОЕ/мл (БОЕ означает «бляшкообразующая единица»), еще более предпочтительно от 10⁴ до 10¹⁰ БОЕ/мл. Наиболее предпочтительно титр фага в суспензии составляет от 10⁵ до 10⁷ БОЕ/мл.

В зависимости от вида бактерий, подлежащего обнаружению, для получения суспензии выбирают вид тестируемых бактериофагов, который специфично связывается с данным видом бактерий, то есть специфично инфицирует данный вид бактерий. Вследствие эволюционно консервативной невероятно высокой специфичности бактериофагов в отношении хозяев, существует возможность специфически обнаруживать даже отдельные штаммы в пределах вида бактерий. В данном случае, для получения суспензии выбирают вид тестируемых бактериофагов, который специфично связывается с конкретным штаммом в пределах вида бактерий. Таким образом, связывание выбранного вида тестируемых бактериофагов с видом бактерий, отличным от вида бактерий, подлежащего обнаружению, или со штаммом, отличным от штамма, подлежащего обнаружению, является почти невозможным. В результате этого, возможность получения ложноположительного результата обнаружения посредством способа по изобретению минимальна, и результат способа обнаружения по изобретению является в высшей степени надежным. При предоставлении нескольких суспензий разные виды тестируемых бактериофагов, каждый из которых специфично связывается с разными видами бактерий, подлежащими обнаружению, могут быть выбраны соответственно так, чтобы каждая суспензия содержала один конкретный вид тестируемых бактериофагов. Это позволяет обнаружить несколько видов бактерий в пределах одного образца. Для того, чтобы сделать возможным обнаружение тестируемых бактериофагов по меньшей мере одного вида и полученных комплексов бактерии-бактериофаги в дальнейшей процедуре, тестируемые бактериофаги обладают меткой. Предпочтительно, метка характерна для соответствующего вида тестируемых бактериофагов, то есть все тестируемые бактериофаги одного вида несут одну и ту же метку, которая является отличимой от меток других видов.

Для получения суспензии меченные тестируемые бактериофаги соответствующего, по меньшей мере одного, вида предпочтительно суспендируют в воде или подходящем буферном растворе, или другом водном растворе. Подходящие буферные растворы предпочтительно представляют собой 0,01-0,3 М фосфатный буфер со значением рН от 6,5 до 9,5; 0,01-0,3 М карбонатный буфер со значением рН от 6,5 до 9,5; фосфатно-солевой буферный раствор (PBS) или их смеси. Еще более предпочтительно вода и подходящие буферные растворы содержат MgCl₂, MgSO₄ и/или CaCl₂. Концентрация MgCl₂, MgSO₄ и CaCl₂ предпочтительно составляет от 1 до 15 мМ для каждой соли.

На стадии В) способа по изобретению образец, подлежащий проверке на наличие по меньшей мере одного вида бактерий, подлежащего обнаружению, добавляют в одну или в более чем одну суспензию. Предпочтительно, образец состоит из биологической жидкости человека или животного, такой как кровь, моча, слюна или другая биологическая жидкость, мазка, взятого у человека или животного, воды из системы питьевой воды или пищевого продукта, или ингредиентов пищевого продукта, приготовленных в водном растворе. После отбора проб образец можно добавлять непосредственно в суспензию или суспензии без дополнительной предварительной обработки. Пищевой продукт или ингредиенты пищевого продукта помещают в водный раствор. Это значительно уменьшает время, требуемое для обнаружения бактерий, и минимизирует риск загрязнения во время транспортировки и/или хранения. Кроме того, способ по изобретению также позволяет обнаружить бактерии в образце, отобранном из полученной бактериальной культуры.

Перед добавлением образец предпочтительно фильтруют через фильтр грубой очистки, имеющий размер пор от 0,5 до 10,0 мкм, для удаления любого загрязнения частицами (больше 0,5 мкм), что позволяет избежать возможного забивания фильтра на последующей стадии В). В качестве альтернативы, можно также использовать многокаскадный фильтр грубой очистки, имеющий уменьшающиеся размеры пор от 0,5 до 10 мкм.

Объем образца предпочтительно составляет от 0,05 до 2,5 мл, еще более предпочтительно от 0,1 до 2,0 мл и наиболее предпочтительно от 0,5 до 2,0 мл. Комбинации указанных диапазонов объема также возможны.

Предпочтительно образец смешивают с суспензией на стадии G) после стадии В), и полученную реакционную смесь инкубируют. Смешивание предпочтительно проводят посредством повторяющегося вращения или умеренного перемешивания. Полученную реакционную смесь предпочтительно инкубируют в течение 2-30 мин, еще более предпочтительно в течение 5-15 мин и даже более предпочтительно в течение 5-10 мин. Температура во время инкубации составляет предпочтительно от 4 до 60°С, еще более предпочтительно от 10 до 30°С. Инкубация реакционной смеси при комнатной температуре (КТ, 20-25°С) является наиболее предпочтительной. При условии, что присутствует по меньшей мере один вид бактерий, подлежащий обнаружению, считается, что смешивание и инкубация обеспечивают то, что каждая бактерия, подлежащая обнаружению, была связана или инфицирована меченными тестируемыми бактериофагами соответствующего по меньшей мере одного вида перед последующей фильтрацией на стадии С).

Предпочтительно, фильтр, имеющий размер пор от 0,1 до 0,5 мкм, используют для фильтрации реакционной смеси на стадии С). Размер пор используемого фильтра еще более предпочтительно составляет от 0,2 до 0,5 мкм, в то время как размер пор от 0,3 до 0,5 мкм является особенно предпочтительным, и размер пор от 0,2 до 0,4 мкм является наиболее предпочтительным. Размер пор используемого фильтра выбирают таким образом, чтобы по меньшей мере один вид бактерий, подлежащий обнаружению, и комплексы бактерии-бактериофаги, которые состоят из бактерий по меньшей мере одного вида бактерий, подлежащего обнаружению, и тестируемых бактериофагов по меньшей мере одного вида тестируемых бактериофагов, связанных с ними, поддерживались и иммобилизовались на поверхности фильтра, в то время как несвязанные бактериофаги могут проходить через данный фильтр. Таким образом, достигается отделение комплексов бактерии-бактериофаги вида бактерий, подлежащего обнаружению, и других возможно присутствующих бактерий от несвязанных бактериофагов. Размер пор используемого фильтра, таким образом, выбирают в соответствии с размером и морфологией соответствующего вида бактерий, подлежащего обнаружению.

Фильтр предпочтительно состоит из мембраны, пленки или матрицы, такой как набивка на основе шариков или нано-, или микроструктурированная поверхность волокнистого или трубчатого материала (например, волокно/полое волокно).

Предпочтительно, материал фильтра состоит из синтетических или природных полимеров, таких как поливинилхлорид (ПВХ), поливинилиденфторид (ПВДФ), полипропилен (ПП), полиэфирсульфон (ПЭС), полиэтиленгликоль (ПЭГ), полиакриламид (ПАА), политетрафторэтилен (ПТФЭ), нейлон, полидиметилсилоксан (ПДМС), крахмал, углеводные соединения, латекс или силикон; металла или металлических сплавов, которые могут представлять собой магнетик, парамагнетик, суперпарамагнетик и немагнитный материал; стекла, такого как боросиликатное стекло; целлюлозы, например, метилцеллюлозы или регенерированной целлюлозы, или других соединений углерода, таких как активированный уголь.

Фильтрацию предпочтительно проводят гравиметрически, посредством применения вакуума или избыточного давления.

Обнаружение комплексов бактерии-бактериофаги на поверхности фильтра в концентрате на стадии D), а также обнаружение несвязанных тестируемых бактериофагов в фильтрате на стадии Е) основано на обнаружении метки, с которой предоставлены бактериофаги, соответственно. Например, метка может состоять из репортерной молекулы с флуоресцентными свойствами. После подходящего возбуждения репортерной молекулы сигнал излучаемой флуоресценции может затем быть выявлен с помощью сенсора. Сигналы флуоресценции либо могут быть обнаружены при мгновенной интеграции с помощью фильтра оптического излучения, либо могут быть измерены спектрофотометрически в виде длины волны спектра. Кроме того, обе стратегии обнаружения можно также объединять. Преимуществом первой стратегии обнаружения является более высокое соотношение сигнала и шума и более быстрое измерение. Недостатком первой стратегии обнаружения является возможное ограничение для разобщения флуоресцентных меток, если используются несколько разных тестируемых бактериофагов. Преимущество стратегии спектрофотометрического обнаружения заключается в том, что даже частично перекрывающиеся метки могут быть использованы для нескольких разных тестируемых бактериофагов, так как данные метки могут быть спектрально разделены и, таким образом, однозначно определены в последующем способе обработки.

Сигналы, полученные на стадиях D) и Е), подобно, например, соответствующим выявленным сигналам флуоресценции и/или спектрам флуоресценции, обрабатывают с помощью процессора на стадии F) и результаты обнаружения в конечном итоге выводят пользователю.

Вывод предпочтительно осуществляют через оптический дисплей, соединенный с процессором. В качестве альтернативы, результаты обнаружения можно беспроводным способом передавать от процессора на планшет или удаленный терминал вычислительной машины.

Если по меньшей мере один вид бактерий, подлежащий обнаружению, присутствует в образце, то меченные тестируемые бактериофаги по меньшей мере одного вида специфично связываются с по меньшей мере одним видом бактерий, подлежащим обнаружению, и, таким образом, образуют соответствующие комплексы бактерии-бактериофаги. Фильтрация отделяет данные комплексы вместе с другими бактериями от несвязанных бактериофагов. Таким образом, комплексы, иммобилизованные на поверхности фильтра, могут быть обнаружены благодаря метке связанных тестируемых бактериофагов. Избыток несвязанных тестируемых бактериофагов можно пропускать через фильтр и обнаруживать в фильтрате благодаря их мечению. Если образец не содержит никаких видов бактерий, подлежащих обнаружению, то комплексы не образуются, и в фильтрате выявляют только несвязанные тестируемые бактериофаги. Избыток несвязанных тестируемых бактериофагов можно также выявлять в концентрате во время процедуры, особенно если фильтр (частично) забит.Таким образом, измерительный сигнал несвязанных тестируемых бактериофагов в концентрате может быть также включен в процесс обнаружения в дополнение к сигналу измерения в фильтрате.

Дополнительное обнаружение несвязанных используемых в тестировании бактериофагов на стадии Е) снижает риск получения ложноположительного сигнала в случаях, когда фильтр забивается. Если образец не содержит видов бактерий, подлежащих обнаружению, и фильтр забивается, например, необнаруживаемыми видами бактерий или другими частицами в реакционной смеси, то несвязанные тестируемые бактериофаги не могут проходить через фильтр и остаются в концентрате. Это приводит к их обнаружению в концентрате, несмотря на то, что специфичные комплексы бактерий и бактериофагов не могут быть образованы. Результатом является ложноположительный результат обнаружения видов бактерий, подлежащих обнаружению. Если обнаружение несвязанного тестируемого бактериофага в фильтрате на стадии Е) не является возможным, это указывает на то, что фильтр забит.Следовательно, дополнительное обнаружение несвязанных тестируемых бактериофагов на стадии Е) повышает надежность способа обнаружения согласно изобретению.

Отсутствие результатов обнаружения несвязанных тестируемых бактериофагов в фильтрате на стадии Е) может, в качестве альтернативы, быть обусловлено тем фактом, что все тестируемые бактериофаги связались с по меньшей мере одним видом бактерий, подлежащим обнаружению. Хотя эта возможность является маловероятной ввиду высокого титра фага, суспензия предпочтительно дополнительно содержит меченный эталонный бактериофаг, который не связывается ни с каким видом бактерий, подлежащим обнаружению, и имеет метку, разобщенную с тестируемыми бактериофагами, для того чтобы дополнительно повысить надежность способа обнаружения согласно изобретению. Благодаря мечению эталонный бактериофаг также можно обнаружить. Метка эталонного бактериофага разобщена с метками тестируемых бактериофагов, так что эталонный бактериофаг может быть обнаружен однозначно и независимо от соответствующих тестируемых бактериофагов. Так как эталонный бактериофаг не связывается ни с каким видом бактерий, подлежащим обнаружению, то есть он не образует никаких комплексов с бактериями, он идеально может быть обнаружен исключительно в фильтрате после фильтрации. Однако если эталонный бактериофаг не обнаруживается в фильтрате, это указывает на то, что фильтр полностью забит.

Даже если фильтр частично или полностью забивается во время данной процедуры, применение эталонного бактериофага обеспечивает очень надежный результат обнаружения. В этом случае определяют соотношение суммарной интенсивности сигнала эталонного бактериофага в концентрате и суммарной интенсивности сигнала эталонного бактериофага в фильтрате и сравнивают с соотношением суммарной интенсивности сигнала по меньшей мере одного тестируемого бактериофага в концентрате и суммарной интенсивности сигнала по меньшей мере одного тестируемого бактериофага в фильтрате. Если соотношение, определенное для по меньшей мере одного тестируемого бактериофага, значительно выше, чем соотношение, определенное для эталонного бактериофага, это явно доказывает наличие в используемом образце по меньшей мере одного вида бактерий, подлежащего обнаружению. Однако если сигналы по меньшей мере одного тестируемого бактериофага обнаруживают как в концентрате, так и в фильтрате, но оно сопоставимо с соотношением для эталонного бактериофага, то можно предположить неспецифичное забивание фильтра во время данной процедуры.

В качестве альтернативы меченному эталонному бактериофагу, можно использовать меченые микро- или наночастицы. Данные частицы не связываются ни с каким видом бактерий, подлежащим обнаружению, и могут проходить через фильтр благодаря небольшому размеру.

Другим преимуществом способа по изобретению является то, что он не ограничивается определенным видом бактерий, подлежащим обнаружению, а является универсальным. Единственным требованием является существование бактериофага, который комплементарен виду бактерий, подлежащему обнаружению. Следуя биологическому принципу, согласно которому предполагают, что комплементарные фаги также присутствуют в многочисленных местах обитания видов бактерий, следует предположить, что существует по меньшей мере один бактериофаг для каждого вида бактерий, который специфично инфицирует данный вид бактерии.

Однако, виды бактерий, подлежащие обнаружению, предпочтительно выбраны из группы, содержащей Staphylococcus aureus, метициллин-резистентный Staphylococcus aureus (MRSA), Staphylocossus epidermidis, Streptococcus pneumoniae, Streptococcus pyogenes, Haemophilus influenzae, Haemophilus parainfluenzae, Klebsiella pneumoniae, Escherichia coli, Escherichia hermannii, EHEC, Enterobacter cloacae, Enterococcus faecalis, Enterococcus faecum, Pseudomonas aeruginosa, Proteus mirabilis, Proteus vulgaris, Staphylococcus saprophyticus, Bacteroides fragilis, Entercoccus faecium, Enterobacter aerogenes, Serratia marcescens, B-Streptococcus (agalactiae), Chlamydia trachomatis, Chlamydia psittaci, Ureaplasma urealyticum, Mycoplasma hominis, Mycoplasma pneumoniae, Neisseria gonorrhoeae, Neisseria meningitidis, Citrobacter freundii, Moraxella catarrhalis, Stenotrophomonas maltophilia, Pasteurella multocida, Acinetobacter baumannii, Providencia rettgeri, Bordetella pertussis, Bacillus anthracis, Bacillus cereus, Brucella abortus, Brucella melitensis, Clostridium butolinum, Clostridium difficile, Clostridium tetani, Clostridium perfringens, Clamydia trachomatis, Corynebacterium diphtheriae, Francisella tularensis, Gardenella vaginalis, Listeria monocytogenes, Morganella morganii, Mycobacterium leprae, Mycobacterium tuberculosis, Nocardia asteriodes, Salmonella bongori, Salmonella enterica, Shigella spp., Vibrio cholerae, Borrelia burgdorferi, Yersinia pestis, Yersinia enterocolitica, Coxiella burnettii, Aeromonas spp., Plesiomonas spp., Xanthomonas maltophilia, Treponema pallidum, Eikenella corrodens, Spirillum minus, Rickettsia prowazeki, Rickettsia rickettsii, Rickettsia conorii, Cronobacter spp., Campylobacter spp.и Legionella pneumophilia.

Особенно предпочтительно, виды бактерий, подлежащие обнаружению, могут быть выбраны из группы, содержащей Staphylococcus aureus, метициллин-резистентный Staphylococcus aureus (MRSA), в частности, haMRSA, представляющий собой внутрибольничный MRSA, caMRSA, представляющий собой внебольничный MRSA, laMRSA, представляющий собой ассоциированный с животноводством MRSA, VRSA, представляющий собой ванкомицин-резистентный Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermidis, Staphylococcus saprophyticus subsp.saprophyticus, Streptococcus pneumoniae, Streptococcus pyogenes, Streptococcus agalactiae, Streptococcus dysgalactiae, Enterococcus faecalis, Enterococcus faecium, Listeria monocytogenes, Clostridium difficile, Clostridium perfringens, Escherichia coli, Enterobacter cloacae, Enterobacter aerogenes, Haemophilus influenzae, Haemophilus parainfluenzae, Moraxella catarrhalis, Klebsiella pneumoniae, Klebsiella oxytoca, Serratia marcescens, Acinetobacter baumannii, Citrobacter freundii, Pseudomonas aeruginosa, Stenotrophomonas maltophilia, Proteus mirabilis, Proteus vulgaris, Morganella morganii, Providencia rettgeri, Providencia stuartii, Bacteroides fragilis, Chlamydia trachomatis, Ureaplasma urealyticum, Mycoplasma hominis, Neisseria gonorrhoeae, Treponema pallidum ssp. pallidum, Salmonella Typhi, Salmonella typhimurium, Pasteurella multocida, Shigella sonnei, Shigella flexneri, Campylobacter jejuni, Vibrio cholera, Francisella tularensis, Bordetella pertussis и Legionella pneumophilas.

В одном варианте осуществления способа по изобретению одна или более чем одна суспензия, предпочтительно каждая, содержит два или более чем два вида меченных тестируемых бактериофагов. Виды специфично связываются с разными видами бактерий, подлежащими обнаружению. Предпочтительно, метки видов являются разобщенными или частично перекрывающимися и таким образом характерны для соответствующих видов тестируемых бактериофагов. Это делает возможным обнаружение присутствия одновременно двух или более чем двух видов бактерий в образце в одной партии. Предпочтительно, одна или более чем одна суспензия содержит вплоть до 6 разных видов меченных тестируемых бактериофагов каждая, еще более предпочтительно вплоть до 5 разных видов, даже более предпочтительно вплоть до 4 разных видов и наиболее предпочтительно вплоть до 3 разных видов.

В еще одном варианте осуществления способ по изобретению осуществляют параллельно с двумя или более чем двумя суспензиями, каждая из которых содержит разные виды меченных тестируемых бактериофагов, где метки видов предпочтительно являются разобщенными или частично перекрывающимися. Тестируемый образец распределяют на две или более чем две суспензии.

Предпочтительно, образец, подлежащий тестированию, распределяют с помощью микрофлюидной системы, так что нет необходимости добавлять образец отдельно в суспензии, его добавляют одновременно через микрофлюидные каналы микрофлюидной системы. Предпочтительно 6 параллельных суспензий, еще более предпочтительно 5 параллельных суспензий, даже более предпочтительно 4 параллельные суспензии и наиболее предпочтительно вплоть до 3 параллельных суспензий используют в данном варианте осуществления. Это также делает возможным одновременное обнаружение присутствия двух или более чем двух видов бактерий в пределах одного образца.

В другом варианте осуществления способ дополнительно включает стадию после стадии А), в которой меченые бактериофаги обнаруживают в суспензии перед добавлением образца. Данная стадия служит для получения всей совокупности сигналов, полученных для меток несвязанных бактериофагов, в качестве исходного стандарта. Если метка представляет собой, например, репортерную молекулу с флуоресцентными свойствами, суммарную флуоресценцию несвязанных бактериофагов обнаруживают после соответствующего возбуждения в качестве исходного стандарта перед тем, как добавляют образец, или их спектр флуоресценции записывают с использованием спектрофотометра.

Предпочтительно, способ также включает обнаружение реакционной смеси, полученной на стадии В) или на возможной стадии G) перед фильтрацией.

Мечение бактериофагов предпочтительно включает по меньшей мере одну репортерную молекулу, обладающую флуоресцентными или

хемилюминесцентными свойствами, или по меньшей мере одну репортерную молекулу, которая излучает свет в результате взаимодействия со вторичной молекулой. Еще более предпочтительной является по меньшей мере одна репортерная молекула, обладающая флуоресцентными или хемилюминесцентными свойствами. По меньшей мере одна репортерная молекула, обладающая флуоресцентными свойствами, является особенно предпочтительной.

Репортерные молекулы, обладающие флуоресцентными свойствами, включают:

- органические флуорофоры, такие как ксантены, родамины, кумарины, акридиновые производные, производным флуоресцеина и производные Alexa Fluor, SUBR Green и SYBR Gold;

- неорганические флуорофоры и их смеси, такие как квантовые точки (КТ);

- флуоресцентные магнитные частицы; и

- флуоресцентные белки, такие как зеленый флуоресцентный белок (GFP), желтый флуоресцентный белок (YFP) или их производные. Репортерные молекулы, которые излучают свет в результате взаимодействия

со вторичной молекулой, включают:

- ферменты, такие как щелочная фосфатаза или пероксидаза хрена, которые излучают свет в результате превращения соответствующих маркерных субстратов; и

- биотин, который излучает свет в результате связывания стрептавидина в качестве партнера взаимодействия, который в свою очередь несет флуоресцентную или хемилюминесцентную метку.

Органические флуорофоры наиболее предпочтительны для мечения бактериофагов.

Бактериофаги могут быть мечены посредством связывания по меньшей мере одной репортерной молекулы с ДНК фага, с белками в капсидной области (белки оболочки головки) или с белками в области хвоста фага (белки волокон хвоста). Связывание по меньшей мере одной репортерной молекулы с белками в капсидной области бактериофагов является предпочтительным.

Предпочтительно связывание проводят посредством образования ковалентной связи между по меньшей мере одной репортерной молекулой и бактериофагом. С данной целью используют:

- активные сложные эфиры по меньшей мере одной репортерной молекулы, такие как сложные N-гидроксисукцинимидные эфиры (сложные NHS-эфиры) или сложные сульфотетрафторфениловые эфиры (сложные STFP-эфиры), для связывания с аминогруппами;

- изотиоцианаты по меньшей мере одной репортерной молекулы для связывания с аминогруппами;

- малеимиды по меньшей мере одной репортерной молекулы для связывания с тиольными группами;

- азиды по меньшей мере одной репортерной молекулы для связывания с алкинами с помощью двухстадийной реакции азид-алкинового циклоприсоединения; и

- фотореактивные группы в по меньшей мере одной репортерной молекуле для неспецифичного связывания.

Примерами являются 5(6)-карбоксифлуоресцеин-NHS-эфиры в качестве активного сложного эфира, флуоресцеин изотиоцианат (FITC) в качестве изотиоцианата, Alexa Fluor 488-малеимид в качестве малеимида, 5-азидо-тетраметилродамин (5-TAMRA-азид) в качестве азида и фотобиотин в качестве фотореактивной группы.

В предпочтительном варианте осуществления способа по изобретению мечение бактериофагов состоит из по меньшей мере одной флуоресцентной репортерной молекулы. Возбуждение осуществляют посредством осветительного блока, соответственно, который предпочтительно содержит один или более чем один лазер или один или более чем один светоизлучающий диод (LED). Кроме того, возбуждение проводят в диапазоне длин волн от 200 до 1000 нм, еще более предпочтительно в диапазоне длин волн от 350 до 700 нм. Обнаружение комплексов бактерии-бактериофаги на поверхности фильтра в концентрате и несвязанных бактериофагов в фильтрате проводят посредством измерения флуоресценции, интегрированного посредством оптического эмиссионного фильтра с использованием оптического сенсора, и/или посредством измерения спектра интенсивности флуоресценции. Флуоресценцию предпочтительно измеряют с использованием флуоресцентной микроскопии и/или оптического сенсора, и/или спектрофотометра. Оптический сенсор еще более предпочтительно выбран из группы, состоящей из фотоумножителя (ФЭУ), сенсора ПЗС (прибор с зарядовой связью) и сенсора КМОП (комплементарная структура металл-оксид-полупроводник). Спектрофотометр делает возможным сканирование интенсивности флуоресценции в предварительно заданных интервалах длин волн предпочтительно с шагом 20 нм, еще более предпочтительно с шагом 10 нм, особенно предпочтительно с шагом 2-5 нм.

В другом предпочтительном варианте осуществления обнаружение проводят посредством измерения излучения света с временным разрешением, то есть свет, излучаемый репортерными молекулами, непрерывно определяют в течение определенного времени. Когда мечение бактериофагов представляет собой по меньшей мере одну флуоресцентную репортерную молекулу, то возбуждение и обнаружение проводят, как описано в предыдущем варианте осуществления, при условии что флуоресценцию измеряют с временным разрешением.

Предпочтительно способ обнаружения бактерий по изобретению дополнительно включает стадию предварительного разделения комплексов бактерии-бактериофаги и несвязанных бактериофагов, где предварительное разделение следует за стадией В) или возможной стадией G). Предварительное разделение реакционной смеси предпочтительно проводят в соответствии с принципом гель-фильтрации (гель-проникающая хроматография или эксклюзионная хроматография) с использованием гелевой матрицы. Это означает, что комплексы бактерии-бактериофаги и несвязанные бактериофаги отделяют друг от друга благодаря их разнице в размере, на основании чего большие по размеру комплексы покидают гелевую матрицу раньше меньших по размеру несвязанных бактериофагов. Гелевая матрица предпочтительно состоит из синтетических или природных полимеров, таких как поливинилхлорид (ПВХ), поливинилиденфторид (ПВДФ), полипропилен (ПП), полиэфирсульфон (ПЭС), полиэтиленгликоль (ПЭС), полиакриламид (ПАА), политетрафторэтилен (ПТФЭ), нейлон, полидиметилсилоксан (ПДМС), крахмал, углеводные соединения, латекс или силикон; металла или металлических сплавов, которые могут представлять собой магнетик, парамагнетик, суперпарамагнетик и немагнитный материал; стекла, такого как боросиликатное стекло; целлюлозы, например, метилцеллюлозы или регенерированной целлюлозы, или других соединений углерода.

Гелевая матрица предпочтительно имеет размер пор от 0,01 до 5 мкм. Выбор материала и размера пор гелевой матрицы зависит от размера и морфологии по меньшей мере одного вида бактерий, подлежащего обнаружению, так что достигается оптимальное предварительное отделение комплексов бактерии-бактериофаги от несвязанных бактериофагов.

В еще одном варианте осуществления способ по изобретению кроме того включает стадию концентрирования комплексов бактерии-бактериофаги и несвязанных бактериофагов перед фильтрацией на стадии С).

Концентрирование можно проводить механически или электромагнитным способом.

Еще более предпочтительно тестируемые бактериофаги по меньшей мере одного вида и возможный эталонный фаг покрывают магнитными шариками. В данном случае, концентрирование может быть достигнуто электромагнитным способом посредством наложения внешнего магнитного поля, например, посредством обеспечения электромагнита.

Возможные стадии предварительного разделения и концентрирования можно осуществлять по отдельности или в комбинации в способе по изобретению.

В еще одном варианте осуществления способ по изобретению может включать стадию промывания после фильтрации реакционной смеси на стадии С).

На данной стадии промывания фильтр предпочтительно промывают нейтральным раствором. Нейтральный раствор предпочтительно состоит из воды, буферного раствора или любого другого водного раствора, или образца, предварительно прошедшего стерилизующую фильтрацию.

В другом аспекте в настоящем изобретении описан реакционный сосуд для реализации способа обнаружения бактерий по изобретению.

Предпочтительно реакционный сосуд по изобретению обладает длиной от 5 до 20 мм, шириной от 5 до 20 мм и высотой от 50 до 100 мм.

Реакционный сосуд по изобретению содержит по меньшей мере два отсека, которые отделены друг от друга фильтром. Фильтр предпочтительно имеет размер пор от 0,1 мкм до 0,5 мкм, и более предпочтительно от 0,2 до 0,5 мкм. Размер пор от 0,3 до 0,5 мкм является особенно предпочтительным, и наиболее предпочтительный размер пор составляет от 0,2 до 0,4 мкм. Как ранее описано для данного способа, размер пор используемого фильтра выбирают в соответствии с размером и морфологией соответствующего вида бактерий, подлежащего обнаружению, для достижения эффективного отделения комплексов бактерии-бактериофаги и других возможно присутствующих бактерий от несвязанных бактериофагов.

Фильтр предпочтительно состоит из мембраны, пленки или матрицы, такой как набивка на основе шариков или нано-, или микроструктурированная поверхность волокнистого или трубчатого материала (например, волокно/полое волокно).

Предпочтительно, материал фильтра состоит из синтетических или природных полимеров, таких как поливинилхлорид (ПВХ), поливинилиденфторид (ПВДФ), полипропилен (ПП), полиэфирсульфон (ПЭС), полиэтиленгликоль (ПЭГ), полиакриламид (ПАА), политетрафторэтилен (ПТФЭ), нейлон, полидиметилсилоксан (ПДМС), крахмал, углеводные соединения, латекс или силикон; металла или металлических сплавов, которые могут представлять собой магнетик, парамагнетик, суперпарамагнетик и немагнитный материал; стекла, такого как боросиликатное стекло; целлюлозы, например, метилцеллюлозы или регенерированной целлюлозы, или других соединений углерода, таких как активированный уголь.

Один отсек реакционного сосуда представляет собой резервуар для фагов, содержащий суспензию, которая содержит по меньшей мере один вид меченных тестируемых бактериофагов, которые специфично связываются с видом бактерий, подлежащим обнаружению. Предпочтительно, метка характерна для соответствующего вида тестируемых бактериофагов.

В еще одном варианте осуществления суспензия в резервуаре для фагов содержит два или более чем два вида меченных тестируемых бактериофагов, каждый из которых специфично связывается с разными видами бактерий, подлежащими обнаружению, где метки данных видов являются разобщенными или частично перекрывающимися, так что метка характерна для соответствующего вида тестируемых бактериофагов.

Концентрация бактериофагов в суспензии, объем суспензии и другие характеристики суспензии соответствуют общей информации, описанной в отношении способа по изобретению.

Аналогично, общая информация о способе относительно меченных тестируемых бактериофагов и их мечения с соответствующими поправками применима к реакционному сосуду по изобретению.

Предпочтительно, суспензия в резервуаре для фагов дополнительно содержит меченный эталонный бактериофаг, который не связывается ни с каким видом бактерий, подлежащим обнаружению, и который имеет метку, разобщенную с тестируемыми бактериофагами. Полезные эффекты данного варианта осуществления подробно описаны в отношении способа по изобретению.

В одном варианте осуществления реакционного сосуда согласно изобретению резервуар для фагов запечатан с помощью сжимаемых мембран, так что суспензия не находится в непосредственном контакте с фильтром. Только в результате сдавливания в сжимаемых мембранах при добавлении образца, который подлежит проверке на наличие по меньшей мере одного вида бактерий, подлежащего обнаружению, полученная реакционная смесь протекает на фильтр.

Один отсек реакционного сосуда по изобретению представляет собой сборный резервуар, который предназначен для приема фильтрата реакционной смеси после добавления образца к суспензии и последующей фильтрации.

Кроме того, реакционный сосуд содержит средство для его идентификации.

Данное средство предпочтительно представляет собой чип RFID (радиочастотная идентификация) или штрих-код. Еще боле предпочтительно чип RFID или штрих-код содержат данные, касающиеся серийного номера, даты изготовления, даты окончания срока действия, титра фага в суспензии и/или видов или штаммов бактерий, подлежащих обнаружению. Средства идентификации делают возможной простую и однозначную идентификацию реакционного сосуда, что минимизирует риск путаницы с реакционными сосудами и таким образом повышает надежность способа обнаружения, осуществляемого с указанным реакционным сосудом.

Кроме того, реакционный сосуд по изобретению содержит по меньшей мере два измерительных окна, где одно измерительное окно расположено в области поверхности фильтра, которая обращена к резервуару для фагов, и где другое измерительное окно расположено в области сборного резервуара. Это делает возможным обнаружение комплексов бактерии-бактериофаги на поверхности фильтра в концентрате и несвязанных бактериофагов в фильтрате при осуществлении способа обнаружения согласно изобретению с использованием реакционного сосуда по изобретению. Реакционный сосуд по изобретению может дополнительно содержать окна возбуждения в области измерительных окон, которые делают возможным возбуждение репортерных молекул с флуоресцентными свойствами. В качестве альтернативы, возбуждение можно проводить с помощью измерительных окон.

В предпочтительном варианте осуществления реакционный сосуд содержит еще один отсек между резервуаром для фагов и фильтром, который содержит по меньшей мере один префильтр. По меньшей мере один префильтр делает возможным предварительное отделение комплексов бактерии-бактериофаги от несвязанных бактериофагов в реакционной смеси перед фильтрацией.

Префильтр еще более предпочтительно представляет собой гелевую матрицу, которая предварительно отделяет реакционную смесь в соответствии с принципом гель-фильтрации. Гелевая матрица предпочтительно состоит из синтетических или природных полимеров, таких как поливинилхлорид (ПВХ), поливинилиденфторид (ПВДФ), полипропилен (ПП), полиэфирсульфон (ПЭС), полиэтиленгликоль (ПЭГ), полиакриламид (ПАА), политетрафторэтилен (ПТФЭ), нейлон, полидиметилсилоксан (ПДМС), крахмал, углеводные соединения, латекс или силикон; металла или металлических сплавов, которые могут представлять собой магнетик, парамагнетик, суперпарамагнетик и немагнитный материал; стекла, такого как боросиликатное стекло; целлюлозы, например, метилцеллюлозы или регенерированной целлюлозы, или других соединений углерода. Кроме того, гелевая матрица предпочтительно имеет размер пор от 0,01 до 5 мкм. Выбор материала и размера пор гелевой матрицы зависит от размера и морфологии по меньшей мере одного вида бактерий, подлежащего обнаружению, так что достигается оптимальное предварительное отделение комплексов бактерии-бактериофаги от несвязанных бактериофагов.

В данном варианте осуществления реакционный сосуд дополнительно содержит одно или более чем одно измерительное окно, которое расположено непосредственно под отсеком, содержащим по меньшей мере один префильтр.

Предпочтительно реакционный сосуд сужается в направлении от резервуара для фагов к фильтру, так что делается возможным концентрирование комплексов бактерии-бактериофаги и несвязанных бактериофагов перед фильтрацией.

Кроме того, реакционный сосуд предпочтительно запечатан с помощью перегородки в области резервуара для фагов.

Реакционный сосуд предпочтительно содержит еще одно измерительное окно, которое расположено в области резервуара для фагов. Это позволяет обнаружить всю совокупность сигналов, происходящих от меток несвязанных бактериофагов, в качестве исходного стандарта. Когда метка представляет собой, например, репортерную молекулу с флуоресцентными свойствами, суммарную флуоресценцию несвязанных бактериофагов обнаруживают как исходный стандарт после соответствующего возбуждения и перед тем, как добавляют образец, или записывают их спектр флуоресценции с использованием спектрофотометра.

Кроме того, реакционный сосуд предпочтительно содержит один или более чем один отсек, который соединен со сборным резервуаром и называется последующим концентрирующим резервуаром. Последний из данных отсеков называют резервуаром для отходов. Еще более предпочтительно один или более последующих концентрирующих резервуаров отделены от сборного резервуара или друг от друга следующими за ними фильтрами с размером пор от 0,1 мкм до 0,5 мкм, предпочтительно от 0,2 до 0,5 мкм, еще более предпочтительно от 0,3 до 0,5 мкм и наиболее предпочтительно от 0,2 до 0,4 мкм. Последующие концентрирующие резервуары могут быть также оборудованы своими собственными измерительными окнами и окнами возбуждения. Кроме того, размер пор последующих фильтров может уменьшаться в направлении от сборного резервуара до резервуара для отходов, что делает возможным последовательное разделение разных бактерий и комплексов бактерии-бактериофаги в соответствии с размером и морфологией соответствующих видов бактерий, подлежащих обнаружению. Резервуар для отходов отделен конечным фильтром с размером пор меньше или равным 0,05 мкм от сборного резервуара или, при наличии, от одного или более чем одного последующего концентрирующего резервуара. Все бактериофаги удаляют посредством конечного фильтра, так что остающийся фильтрат можно удалять безопасно и при низких затратах. В качестве альтернативы, резервуар для отходов содержит поглотитель, который поглощает фильтрат из сборного резервуара или, при наличии, из одного или более чем одного последующего концентрирующего резервуара.

В другом варианте осуществления реакционный сосуд содержит другой отсек между фильтром и резервуаром для фагов, который предпочтительно отделен от других отсеков перегородкой. Еще более предпочтительно данный отсек содержит индикаторный раствор с мечеными микро- или наночастицами, которые не связываются ни с какими видами бактерий, подлежащими обнаружению, и которые могут проходить через фильтр благодаря их небольшому размеру. Вследствие этого, индикаторный раствор с мечеными микро- или наночастицами можно использовать в качестве альтернативы эталонному бактериофагу и добавлять посредством прокалывания мембраны.

Разные варианты осуществления реакционного сосуда по изобретению не являются взаимоисключающими и, следовательно, могут быть реализованы отдельно или в сочетании.

В еще одном аспекте настоящее изобретение относится к картриджу, содержащему два или более чем два реакционных сосуда по изобретению, расположенных параллельно и/или последовательно друг за другом, где каждый параллельный реакционный сосуд содержит разные виды меченных тестируемых бактериофагов в суспензии резервуара для фагов, каждый из которых специфично связывается с разными видами бактерий, подлежащими обнаружению. Это делает возможным обнаружение одновременного присутствия двух или более чем двух видов бактерий в пределах одного образца. Метки разных видов меченных тестируемых бактериофагов предпочтительно являются разобщенными или частично перекрывающимися. Последовательное расположение реакционных сосудов делает возможным разделение разных бактерий и комплексов бактерии-бактериофаги согласно размеру и морфологии соответствующих видов бактерий, подлежащих обнаружению. В данном случае, размер пор фильтра последующего реакционного сосуда или реакционных сосудов меньше, чем размер пор фильтра в предшествующем реакционном сосуде.

Картридж предпочтительно содержит вплоть до 6 параллельно расположенных реакционных сосудов, еще более предпочтительно вплоть до 5 параллельно расположенных реакционных сосудов, даже еще более предпочтительно вплоть до 4 параллельно расположенных реакционных сосудов и наиболее предпочтительно вплоть до 3 параллельно расположенных реакционных сосудов.

Кроме того, картридж предпочтительно содержит микрофлюидную систему, в которую вводят образец, подлежащий тестированию, и которая направляет образец через микрофлюидные каналы в резервуары для фагов параллельно расположенных реакционных сосудов, так что нет необходимости в добавлении образца в суспензии по отдельности.

Настоящее изобретение также относится к измерительному устройству для реализации способа обнаружения бактерий по изобретению.

Измерительное устройство содержит разъем, в который вставлен реакционный сосуд по изобретению или картридж по изобретению.

Кроме того, измерительное устройство содержит по меньшей мере два оптических устройства для обнаружения, каждое из которых расположено в области измерительных окон вставляемого реакционного сосуда или картриджа, и процессор.

Когда измерительное устройство содержит разъем для реакционного сосуда, оно может содержать три, четыре или более оптических устройства для обнаружения в зависимости от варианта осуществления реакционного сосуда, то есть в соответствии с количеством измерительных окон.

С другой стороны, когда измерительное устройство содержит разъем для картриджа, количество оптических устройств для обнаружения зависит от количества реакционных сосудов, расположенных параллельно и/или последовательно в пределах картриджа, при этом измерительное устройство может содержать от двух до четырех или более оптических устройств для обнаружения на каждый реакционный сосуд, расположенный параллельно.

Каждое оптическое устройство для обнаружения содержит систему линз для фокусирования света, излучаемого меткой бактериофагов, на по меньшей мере один сенсор, причем по меньшей мере один сенсор обнаруживает излучаемый свет. По меньшей мере один сенсор оптического устройства для обнаружения предпочтительно содержит один или более чем один оптический сенсор и/или один или более чем один спектрофотометр, которые оборудованы или не оборудованы эмиссионными фильтрами, делая возможным, таким образом, разрешение спектра сигналов флуоресценции. В случае комбинации оптического сенсора и одного или более чем одного спектрофотометра, оптическое устройство для обнаружения можно последовательно контролировать таким образом, чтобы его можно было переключать с режима быстрого обнаружения с высоким отношением сигнал/шум (обнаружение с фокусирующими линзами интенсивности суммарной флуоресценции в оптическом сенсоре) на режим медленного обнаружения с расшифровкой спектра (спектрофотометр). В данном документе, под спектрофотометром не подразумевается оптический сенсор в строгом смысле.

Предпочтительно, оптические сенсоры выбраны из группы, состоящей из фотоумножителя (ФЭУ), сенсора ПЗС и сенсора КМОП.

Кроме того, каждое оптическое устройство для обнаружения предпочтительно содержит осветительный блок, который излучает свет в диапазоне длин волн от 200 до 1000 нм, и дополнительную систему линз для фокусирования света, излучаемого осветительным блоком на область измерения. Таким образом, осветительный блок также соединен с процессором или контролируется им.

Осветительный блок предпочтительно излучает свет в диапазоне длин волн 350-700 нм. Еще более предпочтительно, осветительный блок содержит лазер или один или более чем один светоизлучающий диод (LED).

Процессор соединен с по меньшей мере одним сенсором оптического устройства для обнаружения и обрабатывает полученные сигналы обнаружения.

Кроме того, измерительное устройство содержит блок вывода, соединенный с процессором, который выводит результаты обнаружения пользователю.

Блок вывода предпочтительно содержит оптический дисплей.

Еще более предпочтительно блок вывода включает радиоинтерфейс, посредством которого результаты обнаружения можно передавать беспроводным путем посредством радио от процессора на планшет или удаленный терминал вычислительной машины.

Предпочтительно измерительное устройство дополнительно содержит интегрированное считывающее устройство, которое определяет средства идентификации реакционного сосуда и направляет данные обнаружения на процессор, где процессор обрабатывает данные обнаружения, и результаты идентификации выводятся пользователю через блок вывода.

В предпочтительном варианте осуществления измерительное устройство дополнительно содержит электромагнит, который можно селективно включать и выключать, например, кольцевой трансформатор. Электромагнит еще более предпочтительно расположен в области поверхности фильтра реакционного сосуда, вставленного в разъем, который обращен к резервуару для фагов.

Далее, настоящее изобретение подробно описано со ссылкой на графические материалы, и разные варианты осуществления дополнительно объяснены.

На фиг. 1 показан вариант осуществления способа по изобретению. Образец (3), который подлежит проверке на наличие вида бактерий, подлежащего обнаружению, вводят в суспензию (1), которая обеспечена в продуваемом резервуаре для фагов (8). Образец (3) может содержать другой не обнаруживаемый вид бактерии. В данном варианте осуществления суспензия (1) содержит один вид меченных тестируемых бактериофагов (2), которые специфично связываются с видами бактерий, подлежащими обнаружению. Метка представляет собой репортерную молекулу с флуоресцентными свойствами. После смешивания образца (3) с суспензией (1) и инкубирования реакционной смеси она течет на фильтр (4), имеющий предпочтительный размер пор от 0,1 мкм до 0,5 мкм, и ее фильтруют гравиметрически и/или под действием внешнего ударного давления или вакуума («тупиковая фильтрация»). Таким образом, полученные комплексы бактерии-бактериофаги (5) и другие необнаруживаемые виды бактерий иммобилизуют на поверхности фильтра в концентрате, тогда как остающиеся несвязанные тестируемые бактериофаги (2) проходят через поры фильтра (4) и собирают в виде фильтрата в сборном резервуаре (9). Обнаружение комплексов бактерии-бактериофаги (5) на поверхности фильтра и несвязанных тестируемых бактериофагов (2) в фильтрате проводят посредством специфичного возбуждения используемых флуоресцентных репортерных молекул и посредством измерения полученной флуоресценции. Обычно возбуждение проводят в диапазоне длин волн, где найден максимум поглощения соответствующей флуоресцентной репортерной молекулы. В данном варианте осуществления суспензия (1) дополнительно содержит меченный эталонный бактериофаг (6), который не связывается с видом бактерий, подлежащим обнаружению, и вследствие этого проходит через поры фильтра (4) и который также собирают в виде фильтрата в сборном резервуаре (9). Мечение эталонных бактериофагов (6) также состоит из репортерной молекулы с флуоресцентными свойствами, где репортерные молекулы тестируемых бактериофагов (2) и эталонных бактериофагов (6) предпочтительно разобщены. Это означает, что соответствующие флуоресцентные репортерные молекулы выбраны таким образом, что они могут поглощать свет при одной и той же или разных длинах волн возбуждения, но излучают свет при разных длинах волн. Благодаря этому, излучаемые сигналы флуоресценции соответствующих репортерных молекул и, следовательно, соответствующих бактериофагов можно четко различить.

Соответственно, эталонный бактериофаг (6) также обнаруживают посредством специфичного возбуждения его флуоресцентных репортерных молекул и измерения полученной флуоресценции. Полученные сигналы флуоресценции из концентрата и фильтрата затем обрабатывают посредством процессора, и результаты обнаружения выводят пользователю.

При спектрофотометрическом определении флуоресценции, то есть когда в качестве сенсора используют спектрофотометр, дополнительное обнаружение в регулируемом диапазоне длин волн полосы спектра можно проводить для получения спектра излучения. В данном случае перекрывающиеся флуоресцентные репортерные молекулы можно использовать вместо разобщенных флуоресцентных репортерных молекул, так как данные молекулы можно обнаружить методом мультиплексирования и можно спектрально разделять в дальнейшем посредством процессора.

Вывод результата можно осуществлять посредством оптического дисплея, соединенного с процессором, или беспроводным путем на планшет или удаленный терминал вычислительной машины. На основе соотношений суммарной интенсивности измеренной флуоресценции в концентрате и суммарной интенсивности измеренной флуоресценции в фильтрате, рассчитанных для тестируемого бактериофага (2) и для эталонного бактериофага (6), соответственно, и посредством сравнения данных соотношений, может быть достигнут надежный результат способа обнаружения. Если соотношение, определенное для тестируемого бактериофага (2), значительно выше, чем соотношение, определенное для эталонного бактериофага (6), то это является явным доказательством наличия в образце вида бактерий, подлежащего обнаружению. Однако, если сигналы флуоресценции тестируемого бактериофага (2) обнаружены как в концентрате, так и в фильтрате, но соотношение сравнимо с соотношением для эталонного бактериофага (6), то можно предположить, что фильтр (4) закупорился во время процедуры неопределенным образом, например, бактериями, которые не должны быть обнаружены.

Другой вариант осуществления способа по изобретению показан на Фиг. 2. В этом варианте, отдельные стадии способа осуществляют таким же образом, как и в описанном выше варианте осуществления Фиг. 1, с той разницей, что параллельно используют три разные суспензии (1). Каждая из указанных суспензий (1) содержит отличающийся вид меченных тестируемых бактериофагов (2), которые специфично связываются с отличающимся видом бактерий, подлежащим обнаружению, и эталонный бактериофаг (6). Метки представляют собой флуоресцентные репортерные молекулы, соответственно, которые предпочтительно являются разобщенными или могут также частично перекрываться в случаях, когда возможно спектрофотометрическое обнаружение с последующим разделением. В данном предпочтительном варианте осуществления образец (3), подлежащий тестированию, распределяют по трем суспензиям (1) посредством микрофлюидных каналов (25) микрофлюидной системы (24), так что добавление происходит одновременно. Благодаря предпочтительно разобщенным или частично перекрывающимся меткам, одновременное специфичное обнаружение трех видов бактерий, подлежащих обнаружению, в пределах одного образца (3), таким образом, делается возможным.

На Фиг. 3А показан предпочтительный вариант осуществления реакционного сосуда (7) согласно изобретению. Он содержит четыре отсека (а)-(г). Отсек (а) представляет собой резервуар для фагов (8), содержащий суспензию (1), которая содержит по меньшей мере один вид меченных тестируемых бактериофагов, который специфично связывается с видом бактерий, подлежащим обнаружению, причем метка предпочтительно характерна для соответствующего вида тестируемых бактериофагов. Кроме того, суспензия (1) в резервуаре с фагами (8) может содержать меченный эталонный бактериофаг, который не связывается ни с каким видом бактерий, подлежащим обнаружению, и который имеет метку, которая разобщена с тестируемыми бактериофагами. Резервуар для фагов (8) запечатан с помощью перегородки (23). Отсек (б) содержит гелевую матрицу (24), имеющую размер пор от 0,01 до 5 мкм в качестве префильтра, который делает возможным предварительное разделение реакционной смеси в соответствии с принципом гель-фильтрации. Соответственно, комплексы бактерии-бактериофаги и необнаруживаемые бактерии отделяют от несвязанных бактериофагов благодаря их разнице в размере, посредством чего большие по размеру комплексы покидают гелевую матрицу (24) раньше меньших по размеру несвязанных бактериофагов. Отсек (в) представляет собой сборный резервуар (9), который сконструирован для приема фильтрата реакционной смеси после добавления образца к суспензии (1) и последующей фильтрации. Отсек (г) представляет собой резервуар для отходов (25), содержащий поглотитель (26), который поглощает фильтрат из сборного резервуара (9). Отсеки (а) и (б) отделены от отсеков (в) и (г) фильтром (4), имеющим размер пор от 0,1 до 0,5 мкм. В показанном варианте осуществления реакционный сосуд дополнительно демонстрирует чип RFID (10) для идентификации и дополнительный отсек, отделенный от других отсеков перегородкой (27), который содержит индикаторный раствор (28) с мечеными микро- или наночастицами. Данные частицы не связываются ни с какими видами бактерий, подлежащими обнаружению, и проходят через фильтр (4) благодаря их небольшому размеру. Вследствие этого, индикаторный раствор (28), содержащий меченые микро- или наночастицы, может быть использован в качестве альтернативы эталонному бактериофагу, и его можно добавлять в реакционный раствор посредством прокалывания мембраны (27). В данном варианте осуществления реакционный сосуд сужается в направлении фильтра (4) так, что концентрирование комплексов бактерии-бактериофаги и несвязанных бактериофагов делается возможным перед фильтрацией. Кроме того, показанный реакционный сосуд (7) содержит всего четыре измерительных окна (11-14). Одно измерительное окно (11) расположено в области поверхности фильтра, обращенной к резервуару для фагов. Другое измерительное окно (12) расположено в области сборного резервуара. Это делает возможным обнаружение комплексов бактерии-бактериофаги, иммобилизованных на поверхности фильтра в концентрате, и несвязанных бактериофагов в фильтрате. Другое измерительное окно (13) расположено в области резервуара для фагов, так что всю совокупность сигналов, происходящих от меток бактериофагов, обнаруживают как исходный стандарт перед добавлением образца, подлежащего тестированию. Кроме того, четвертое измерительное окно (14) расположено ниже гелевой матрицы для обнаружения комплексов бактерии-бактериофаги и несвязанных бактериофагов в реакционной смеси, когда они элюируются из гелевой матрицы (24) перед фильтрацией. В показанном варианте осуществления реакционный сосуд (7) дополнительно имеет интегрированный механизм аэрации (29) в области резервуара с отходами (25), состоящий из иглы для аэрации (30) и перегородки (31). Когда перегородку (31) прокалывают, реакционный сосуд аэрируется, и начинается гравиметрическая фильтрация.

На Фиг. 3Б показан теоретический ход измерения флуоресценции с временным разрешением в предпочтительном варианте осуществления способа по изобретению с использованием реакционного сосуда по изобретению (7) Фиг. 3А. В данном документе, образец, который проверяют на наличие вида бактерий, подлежащего обнаружению, вводят через перегородку (23) в суспензию (1) в резервуар для фагов (8), смешивают с суспензией (1) посредством повторного (3-5х) вращения, инкубируют в течение 5-10 мин при комнатной температуре (КТ). По меньшей мере один вид тестируемых бактериофагов в суспензии (1) демонстрирует флуоресцентные репортерные молекулы в качестве меток. Посредством прокалывания перегородки (31) в интегрированном механизме аэрации (29) измерение интенсивности флуоресценции с временным разрешением на уровне четырех измерительных окон (11-14) реакционного сосуда (7) начинается одновременно. В результате аэрации реакционная смесь протекает через отсеки (б) и (в) один за другим, так что флуоресценция на уровне измерительного окна (13) в отсеке (а) уменьшается непрерывно со временем до тех пор, пока ее нельзя будет обнаружить. В гелевой матрице (24) в отсеке (б) несвязанные фаги отделяют от больших по размеру комплексов бактерии-бактериофаги благодаря их разнице в размере. Большие по размеру комплексы бактерии-бактериофаги элюируются из гелевой матрицы (24) раньше меньших по размеру несвязанных бактериофагов. Таким образом, флуоресценция на уровне измерительного окна (14) исходно возрастает до тех пор, пока все комплексы бактерии-бактериофаги не пройдут данную область измерений. Затем флуоресценция слегка уменьшается до тех пор, пока несвязанные бактериофаги, наконец, не покинут гелевую матрицу, что характеризуется новым возрастанием флуоресценции на уровне измерительного окна (14). Комплексы бактерии-бактериофаги иммобилизованы на фильтре (4), так что их сигнал флуоресценции возрастает на уровне измерительного окна (11) до тех пор, пока все комплексы бактерии-бактериофаги и виды бактерий, не подлежащие обнаружению, соответственно, не будут иммобилизованы на фильтре (4). Несвязанные бактериофаги проходят через фильтр (4) и обнаруживаются в виде возрастающего сигнала флуоресценции в измерительном окне (12) в сборном резервуаре (9). Избыточная реакционная смесь, которая полностью прошла через реакционный сосуд, собирается в отсеке (г) и связывается поглотителем (26).

Кроме того, на Фиг. 4А показано схематическое представление предпочтительного варианта осуществления картриджа по изобретению (36) для обнаружения бактерий на а) (вид спереди), б) (вид сверху) и в) (вид сбоку). Картридж (36) согласно изобретению содержит два реакционных сосуда (I, II), расположенных параллельно, каждый из которых по существу соответствует варианту осуществления реакционного сосуда по изобретению (7), показанного на Фиг. 3А. Каждый из параллельных реакционных сосудов (I, II) содержит четыре измерительных окна (11-14). Одно измерительное окно (11) расположено в области поверхности фильтра, обращенной к резервуару для фагов. Другое измерительное окно (12) расположено в области сборного резервуара. Это делает возможным обнаружение комплексов бактерии-бактериофаги, иммобилизованных на поверхности фильтра, в концентрате и несвязанных бактериофагов в фильтрате.

Другое измерительное окно (13) расположено в области резервуара для фагов, так что всю совокупность сигналов, происходящих от меток бактериофагов, можно обнаружить как исходный стандарт перед добавлением образца, подлежащего обнаружению. Кроме того, четвертое измерительное окно (14) расположено ниже гелевой матрицы для обнаружения комплексов бактерии-бактериофаги и несвязанных бактериофагов в реакционной смеси при элюировании из гелевой матрицы (24) и перед фильтрацией. В показанном варианте осуществления каждый из параллельных реакционных сосудов (I, II) дополнительно демонстрирует четыре окна возбуждения (11а-14а) в области измерительных окон (11-14), которые служат для возбуждения репортерных молекул с флуоресцентными свойствами.

На Фиг. 4Б показаны теоретические ходы измерения флуоресценции с временным разрешением в предпочтительном варианте осуществления способа по изобретению с использованием картриджа по изобретению (7), представленного на Фиг. 4А. Данный способ включает введение образца, который проверяют на наличие вида бактерий, подлежащего обнаружению, в реакционный сосуд (I). Нейтральный раствор без бактерий, подлежащих обнаружению, вводят в реакционный сосуд (II) так, что не могут образовываться комплексы бактерии-бактериофаги. Оба реакционных сосуда (I и II) промывают нейтральным раствором. Как уже подробно описано для хода на Фиг. 3Б, флуоресценция на уровне измерительного окна (13) непрерывно уменьшается во время фильтрации со временем в обоих реакционных сосудах (I и II) до тех пор, пока она больше не может быть обнаружена. В случае реакционного сосуда (I) большие по размеру комплексы бактерии-бактериофаги элюируются из гелевой матрицы раньше меньших по размеру несвязанных бактериофагов благодаря предварительному разделению посредством гель-фильтрации. Вследствие этого, флуоресценция на уровне измерительного окна (14) исходно увеличивается до тех пор, пока все комплексы бактерии-бактериофаги не пройдут данную область измерения. Затем флуоресценция слегка уменьшается до тех пор, пока несвязанные бактериофаги, наконец, не покинут гелевую матрицу, что характеризуется возобновленным увеличением флуоресценции на уровне измерительного окна (14). Так как комплексы бактерии-бактериофаги не могут образовываться в реакционном сосуде (II) вследствие отсутствия стадии добавления образца, увеличение флуоресценции на уровне измерительного окна (14) обусловлено исключительно несвязанными тестируемыми бактериофагами; «плеча» в интенсивности флуоресценции на уровне измерительного окна (14), вследствие этого, не наблюдается. В ходе промывания нейтральным раствором несвязанные бактериофаги (в случае реакционного сосуда (I) также любые оставшиеся комплексы бактерии-бактериофаги) постепенно удаляют из данной области измерения (14). Комплексы бактерии-бактериофаги, образованные в реакционном сосуде (I), иммобилизованы на фильтре так, что сигнал флуоресценции на уровне измерительного окна (11) увеличивается до тех пор, пока все комплексы бактерии-бактериофаги не будут иммобилизованы на фильтре. Затем, дальнейшее увеличение флуоресценции на уровне измерительного окна (11) реакционного сосуда не может наблюдаться. Наоборот, флуоресценция в данной области измерения остается постоянной даже во время промывания нейтральным раствором. Напротив, сигнал флуоресценции на уровне измерительного окна (11) реакционного сосуда (II) также исходно увеличивается, что, однако, обусловлено временной аккумуляцией тестируемых бактериофагов в области фильтра. Посредством промывания нейтральным раствором, однако, все тестируемые бактериофаги проходят через фильтр, так что флуоресценция в данной области измерения уменьшается, в то время как интенсивность флуоресценции на уровне измерительного окна (12) в области последующего сборного резервуара (II) повышается. Посредством промывания нейтральным раствором тестируемые бактериофаги, наконец, переносят в резервуар для отходов. Таким образом, сигнал флуоресценции на уровне измерительного окна (12) реакционного сосуда (II) опять уменьшается. Похожий ход сигнала флуоресценции на уровне измерительного окна (12) также можно наблюдать в отношении реакционного сосуда (I). Однако данная флуоресценция происходит только от оставшихся, несвязанных бактериофагов.

Схематическое представление сборки реакционного сосуда по изобретению (7) и измерительного устройства (15) в другом предпочтительном варианте осуществления показано на Фиг. 5. Проиллюстрированный реакционный сосуд (7) содержит резервуар для фагов (8) с разрушаемыми мембранами, который в свою очередь содержит суспензию (1), содержащую по меньшей мере один вид меченных тестируемых бактериофагов (2), который специфично связывается с видом бактерий, подлежащим обнаружению, причем метка предпочтительно характерна для соответствующего вида тестируемых бактериофагов (2). Кроме того, суспензия (1) может содержать меченный эталонный бактериофаг (6) в продуваемом резервуаре для фагов (8), который не связывается ни с каким видом бактерий, подлежащим обнаружению, и имеет метку, которая разобщена с тестируемыми бактериофагами (2). Реакционный сосуд (7) запечатан сверху посредством перегородки (23) с последующим фильтром грубой очистки (32), имеющим размер пор от 0,5 до 10,0 мкм для удаления более крупных суспендированных частиц и каких-либо примесей. Можно также использовать многокаскадный фильтр грубой очистки (32), имеющий уменьшающиеся размеры пор от 0,5 до 10 мкм. Посредством введения образца (3), подлежащего тестированию, в суспензию (1) в резервуаре для фагов (8) мембраны резервуара для фагов (8) разрушаются. Под действием силы тяжести полученная реакционная смесь начинает течь в направлении фильтра (4), который имеет размер пор 0,2 мкм. В проиллюстрированном варианте осуществления реакционный сосуд (7) сужается в нисходящем направлении, так что становится возможным концентрирование комплексов бактерии-бактериофаги (5) и несвязанных бактериофагов (2, 6) перед фильтрацией. Кроме того, концентрирования достигают электромагнитом посредством выборочного включения и выключения однородного магнитного поля. С данной целью, измерительное устройство (15) содержит кольцевой трансформатор (33) в качестве электромагнита, который расположен в области поверхности фильтра (4). Кроме того, тестируемые бактериофаги (2) по меньшей мере одного вида, а также возможный эталонный фаг (6) покрывают магнитными шариками. Сборный резервуар (9) следует за фильтром (4) для приема фильтрата после фильтрации. За сборным резервуаром (9) следует другой отсек, который называется резервуаром для отходов (25) и который отделен от сборного резервуара (9) конечным фильтром (34), имеющим размер пор равный или меньше 0,05 мкм. Все бактериофаги удаляют посредством конечного фильтра (34), так что остаточный фильтрат можно удалять безопасно и при низких затратах. В данном варианте осуществления мечение бактериофагов (2, 6) также состоит из по меньшей мере одной репортерной молекулы с флуоресцентными свойствами. Соответственно, измерительное устройство (15) содержит два оптических устройства для обнаружения (16) помимо вала, в который вставлен реакционный сосуд (7), каждое из которых расположено в области измерительных окон (11, 12) вставленного реакционного сосуда (7). В настоящем изобретении это означает, что одно оптическое устройство для обнаружения (16) расположено в области измерения на поверхности фильтра (4) для обнаружения комплексов бактерии-бактериофаги (5), в то время как второе оптическое устройство для обнаружения (16) расположено в области измерения на поверхности конечного фильтра (34) для обнаружения несвязанных бактериофагов (2, 6). Каждое оптическое устройство для обнаружения (16) содержит LED (19) в качестве осветительного блока, который излучает свет в диапазоне длин волн от 200 до 1000 нм, предпочтительно от 350 до 700 нм, в зависимости от свойств поглощения используемых флуоресцентных репортерных молекул. По возможности, максимальное поглощение будет достигаться для генерации равного по силе сигнала флуоресценции. Кроме того, каждое оптическое устройство для обнаружения (16) содержит систему линз (20) для фокусирования света, излучаемого LED, на области измерения, описанную выше, вместе с еще одной системой линз (17) для фокусирования света, излучаемого флуоресцентными репортерными молекулами, на по меньшей мере один сенсор (18), например, фотоумножитель, сенсор ПЗС или сенсор КМОП в качестве оптического сенсора. В качестве альтернативы или дополнительно, можно применять спектрофотометр (18) в качестве сенсора для записи спектра излучения. В данном документе, под спектрофотометром не подразумевается оптический сенсор в строгом смысле. Каждый из сенсоров (18) данных двух оптических устройств для обнаружения (16) определяет падающий свет и направляет полученные сигналы обнаружения на процессор, который с ним связан. Процессор, в конечном итоге, обрабатывает полученные сигналы обнаружения и направляет результаты обнаружения на дисплей, соединенный с процессором, который выводит их оптически пользователю (не показано). Кроме того, одно или оба оптических устройства для обнаружения (16) могут содержать светоделитель (35) для спектрального разделения нескольких цветных каналов.

На Фиг. 6 чип RFID проиллюстрирован как вариант осуществления средств идентификации реакционного сосуда согласно изобретению. Чип RFID содержит данные, касающиеся серийного номера, даты производства, даты дата окончания срока действия, титра фага в суспензии и/или вида(ов) или штаммов бактерий, подлежащих обнаружению. Чип RFID делает возможной простую и однозначную идентификацию реакционного сосуда, которая минимизирует риск путаницы с реакционными сосудами и, таким образом, повышает надежность процедуры обнаружения, проводимой с таким реакционным сосудом.

Экспериментальная часть 1. Выделение бактериофагов

Так как бактериофаги не имеют своего собственного метаболизма, они могут только культивироваться и распространяться на подходящей бактерии-хозяине. Бактерии-хозяева нуждаются в культуральной среде, в которой они могут оптимально расти. Чем лучше рост бактерий, тем больше выход бактериофагов. На первой стадии, порошкообразную культуральную среду растворяют в воде и стерилизуют в автоклаве. Стерильную культуральную среду затем закачивают прямо из автоклава в ферментер и предварительно нагревают до оптимальной температуры для роста бактерий-хозяев (например, 30°С). Как только культуральная среда достигает рабочей температуры, бактерии-хозяева добавляют в ферментер из прекультуры бактерий. Данные бактерии в это время начинают делиться. После короткого периода адаптации бактерии-хозяева растут экспоненциально, то есть с наивысшей возможной скоростью роста, характерной для данного типа бактерий.

За ростом бактериальных клеток наблюдают посредством измерения оптической плотности на длине волны 600 нм (OD₆₀₀) в фотометре. Когда достигают плотности клеток, которая была оптимизирована в предварительных экспериментах, например, 5×10⁸ бактерий на миллилитр культуральной среды, то в ферментер добавляют бактериофаги из прекультуры бактериофага. Концентрацию бактериофагов в прекультуре определяют заранее с использованием классического метода титрования, являющегося методом определения биологической активности (см. например, Martha R. J. Clokie, Andrew M. Kropinski (eds.), Bacteriophages: Methods and Protocols, Volume 1: Isolation, Characterization, and Interactions, vol. 501, С 2009 Humana Press, a part of Springer Science + Business Media). Концентрацию регулируют так, чтобы в идеале каждая бактерия в ферментере распознавалась и инфицировалась по меньшей мере одним бактериофагом. После успешного инфицирования бактерии-хозяева теперь продуцируют новые бактериофаги вместо новых бактерий, как раньше. Распространение бактериофагов занимает примерно один час. За это время на бактериальную клетку образуется примерно 100 новых бактериофагов.

В завершении данного процесса бактерии разрушаются и высвобождают новые бактериофаги в культуральную среду. Раствор, образующийся в ферментере, обладает высокой вязкостью, так как содержит не только новые бактериофаги, но также все компоненты разрушенной бактериальной клетки (фрагменты клеточной стенки, липиды, рибосомы, бактериальный генетический материал и т.д.), а также исходные компоненты культуральной среды (сахар, соли и белки). По этой причине бактериофаги должны быть сначала очищены посредством многостадийного процесса фильтрации перед тем, как их можно использовать в реакции мечения. После очистки проводят стерильную фильтрацию, например, с использованием 0,2 мкм фильтрующих картриджей Sartobran® из Sartorius Stedim Biotech в сочетании с заполнением контейнеров для хранения (чаны).

В данной форме бактериофаги стабильны, могут быть легко транспортированы и храниться месяцами без потери активности.

2. Мечение бактериофагов репортерными молекулами

Для того чтобы избежать побочных реакций во время связывания с репортерными молекулами и низкой эффективности связывания, очищают фаги и регулируют буфер перед стадией мечения активированными репортерными молекулами. В процессе выделения белков замену буфера надо проводить во многих случаях, например, если нужно последовательно использовать несколько хроматографических способов с разными буферами.

Фаги, используемые для экспериментов по мечению, очищают и, при необходимости, концентрируют с использованием следующих стандартных способов:

- ультрафильтрации, при которой граница отсечки по молекулярному весу задерживаемых компонентов (MWCO) должна представлять собой больше 100 кДа

- осаждения полиэтиленгликолем/хлоридом натрия

- эксклюзионной хроматографии (гель-фильтрация)

- ионообменной хроматографии

- диализа

Выделение небольших избыточных молекул, таких как соли, красители или биотин, из растворов с фагами проводят посредством осаждения полиэтиленгликолем и хлоридом натрия и последующего центрифугирования (Jaye, D.L., Edens, Н.А., Mazzucchelli, L., Parkos, С.A., 2001. Novel G protein-coupled responses in leukocytes elicited by a chemotactic bacteriophage displaying a cell type-selective binding peptide. J. Immunol. 166, 7250).

После проведения инкубации реакции связывания, конъюгаты фагов осаждают по меньшей мере дважды полиэтиленгликолем 8000 (ПЭГ 8000) и раствором NaCl. Это минимизирует количество свободных репортерных молекул в растворе конъюгатов. Наконец, осадок конъюгатов ресуспендируют в подходящем буфере. Также можно использовать колонки для гель-фильтрации на основе декстрана, имеющего MWCO больше 25 кДа,. Очистка на основе ионообменной хроматографии также делает возможным быстрое отделение конъюгатов от небольших молекул, где наиболее подходящий градиент и тип, а также прочность ионообменного материала зависит от применяемых маркерных молекул и от природы конкретных фагов. Предварительная оптимизация параметров является необходимой.

Пример 1:

1×10¹¹ БОЕ ранее очищенных и концентрированных бактериофагов ТВ54 (см. выше) ресуспендируют в 10 мл PBS с 0,1 М NaHCO₃ (рН составляет 8,5). Затем, добавляют 100 нмоль 5(6)-карбоксифлуоресцеин-NHS-эфир на 1×10¹⁰ БОЕ. Реакция связывания протекает при комнатной температуре в темноте в течение одного часа. Как показано схематически на Фиг. 7, NHS-эфир 5(6)-карбоксифлуоресцеина (2) взаимодействует с первичными аминогруппами белков на поверхности фагов ТВ54 (1), образуя стабильные амидные связи.

Конъюгаты очищают либо посредством осаждения, либо посредством хроматографических методов, как описано выше. Впоследствии, конъюгат характеризуют фотофизически с помощью спектроскопии в УФ (ультрафиолет)/видимой области спектра и флуоресцентной спектроскопии.

На Фиг. 8 проиллюстрированы спектр возбуждения и спектр излучения бактериофагов ТВ54, меченных 5(6)-карбоксифлуоресцеином. Спектры демонстрируют максимум возбуждения и максимум излучения 5(6)-карбоксифлуоресцеина при длине волны 495 нм и в диапазоне от 520 до 530 нм, соответственно. Данные длины волн также используют далее для флуоресцентно-микроскопических исследований взаимодействия бактерии-бактериофаги.

Пример 2:

Получают раствор флуоресцеин изотиоцианата (ФИТЦ) в 0,1 М карбонатном буфере, рН составляет 9,0. Соответствующую аликвоту добавляют в раствор с фагами, полученный в примере 1, и аккуратно перемешивают. Суспензию с фагами инкубируют в течение одного часа при комнатной температуре в темноте. Очистку и характеристику конъюгата проводят так, как описано в примере 1.

3. Специфичность взаимодействия бактерий и бактериофагов Для демонстрации чрезвычайно высокой специфичности меченого вида тестируемого бактериофага по отношению к хозяину ночные культуры бактерий Escherichia coli штаммов С600 (РТС Phage Technology Center GmbH), ECOR34 (PTC Phage Technology Center GmbH) и XL10-Gold (Agilent) получают в 10 мл TSB (триптиказо-соевый бульон) (Sigma-Aldrich) в стандартных условиях при 37°С на подготовительной стадии. Ночные культуры разводят на следующий день (1:10 в TSB) и инкубируют при 37°С в течение еще двух часов. Бактериальные суспензии, полученные данным путем, затем смешивают в равных долях (1:1:1). Для флуоресцентно-микроскопического обнаружения взаимодействия бактериофаг-хозяин 10 мкл смешанной культуры бактерий Е. coli (С600, ECOR34, XL10-Gold) добавляют к 990 мкл суспензии 5(6)-карбоксифлуоресцеин-меченных бактериофагов ТВ54 в PBS, рН составляет 7,4 (титр бактерий: приблизительно 1×10⁶ клеток/мл; титр фагов: приблизительно 1×10⁸ БОЕ/мл) и инкубируют в течение 5 мин при комнатной температуре. Затем 20 мкл переносят из реакционной смеси на предметное стекло и изучают посредством флуоресцентной микроскопии (Eclipse Ti, 100х линза объектива, Nikon).

На Фиг. 9А показано изображение флуоресцентной микроскопии, полученное после инкубации бактериальных штаммов Е. coli С600, ECOR34 и XL10-Gold с 5(6)-карбоксифлуоресцеин-меченными бактериофагами ТВ54. Фрагмент изображения в нижнем левом углу демонстрирует увеличенное представление области изображения, определенной белой рамкой.

На Фиг. 9Б проиллюстрировано соответствующее изображение в ярком поле после инкубации бактериальных штаммов Е. coli С600, ECOR34 и XL10-Gold с 5(6)-карбоксифлуоресцеин-меченными бактериофагами ТВ54. Фрагмент изображения в нижнем левом углу демонстрирует увеличенное представление области изображения, определенной белой рамкой. Белые стрелки указывают на немеченые бактерии, которые отличаются морфологически от бактериальных клеток Е. coli С600, инфицированных мечеными фагами ТВ54. Данные немеченые бактерии могут быть отнесены к штаммам ECOR34 или XL10-Gold (масштабная линейка: 10 мкм).

Результаты тестирования доказывают чрезвычайно высокую специфичность бактериофагов ТВ54, меченных 5(6)-карбоксифлуоресцеином. Данные бактериофаги исключительно связываются с бактериальным штаммом Е. coli С600, тогда как штаммы ECOR34 и XL10-Gold не инфицируются. Таким образом, только бактерии Е. coli штамма С600 демонстрируют сигналы флуоресценции в реакционной смеси вследствие образования комплексов. Таким образом, ввиду невероятно высокой специфичности бактериофагов по отношению к хозяину, согласно способу по изобретению предложено четкое и надежное обнаружение видов бактерий. Возможно даже обнаружить отдельные штаммы в пределах вида бактерий.

На Фиг. 10А также показаны оптические поперечные срезы комплексов Е. coli С600-бактериофаг ТВ54, полученных в данном эксперименте. Оптические срезы получают на расстоянии 0,3 мкм (масштабная линейка: 2 мкм). В верхнем ряду комплексы показаны в проходящем свете, тогда как в нижнем ряду показаны те же комплексы в флуоресцентно-микроскопическом виде.

Распространение точечных сигналов флуоресценции указывает на локализацию флуоресцентных репортерных молекул (5(6)-карбоксифлуоресцеин) на поверхности бактерий.

На Фиг. 10Б показаны трехмерные реконструкции полученных комплексов Е. coli С600-бактериофаг ТВ54 в разных ракурсах, которые подтверждают поверхностную локализацию флуоресцентных репортерных молекул.

4. Чувствительность способа

Для определения чувствительности способа обнаружения бактерий серию разведений получают посредством серийного разведения исходной суспензии 5(6)-карбоксифлуоресцеин-меченных бактериофагов ТВ54 (PBS, рН составляет 7,4, титр фагов: приблизительно 1×10⁸ БОЕ/мл) с использованием PBS, рН составляет 7,4. На соответствующих стадиях разведения с приблизительно 1×10⁷ БОЕ/мл, приблизительно 1×10⁶ БОЕ/мл, приблизительно 1×10⁵ БОЕ/мл, приблизительно 1×10⁴ БОЕ/мл и приблизительно 1×10³ БОЕ/мл, 1 мл каждого разведения переносят в кювету для измерения и исследуют посредством флуоресцентной спектроскопии (компактный спектрометр USB Qwave, лазерная система RGB). В качестве стандарта используют 1 мл буфера PBS без меченых бактериофагов ТВ54.

Полученные спектры флуоресценции проиллюстрированы на Фиг. 11А. Для всех стадий разведения может быть определен различимый максимум излучения в диапазоне длин волн от 520 до 530 нм, который соответствует максимуму излучения 5(6)-карбоксифлуоресцеина. Следовательно, на Фиг. 11Б показан интеграл флуоресценции в диапазоне длин волн от 520 до 530 нм для разных титров фагов. Таким образом, полученный интеграл флуоресценции только для количества фагов равном приблизительно 1×10³ БОЕ можно все еще четко отличить от стандарта, то есть специфичное обнаружение возможно, только начиная с приблизительно 1×10³ бактериофагов.

Исходя из среднего количества связанных бактериофагов, составляющего приблизительно 1×10² на инфицированную бактерию, следует, что способ по изобретению может обеспечивать специфичное обнаружение, начиная с концентрации бактерий только приблизительно 10 клеток бактерий/мл. Способ по изобретению, вследствие этого, является не только очень высокоспецифичным, но также высокочувствительным.

5. Специфичное обнаружение вида бактерии или штамма вида бактерии Далее, специфичное обнаружение бактериального штамма Escherichia coli С600 при разных концентрациях бактерий описано с использованием способа по изобретению.

С данной целью, ночную культуру данного бактериального штамма Escherichia coli С600 (РТС Phage Technology Center GmbH) сначала получают в стандартных условиях при 37°С в 10 мл TSB (Sigma-Aldrich). Ночную культуру разводят на следующий день (1:10 в TSB) и инкубируют при 37°С в течение еще 2 часов. Затем получают серию разведений из полученной культуры посредством серийного разведения TSB. Для определения концентрации бактерий в серийно разведенных бактериальных суспензиях оптическую плотность измеряют при 600 нм (OD₆₀₀). На Фиг. 12А показаны данные титра бактерий для разных стадий разведения.

Исходную интенсивность флуоресценции в суспензии фагов перед добавлением образца, подлежащего тестированию, определяют посредством смешивания 900 мкл суспензии 5(6)-карбоксифлуоресцеин-меченных бактериофагов ТВ54 и А1еха532-меченных бактериофагов ТВ99 (приблизительно 10⁸ БОЕ/мл в PBS, смешанном с 10 мМ MgCl₂) с 100 мкл среды TSB и инкубирования в течение 5-10 мин при комнатной температуре. А1еха532-меченный бактериофаг ТВ99 служит в качестве эталонного бактериофага с разобщенным мечением. Сигналы флуоресценции тестируемого бактериофага (5(6)-карбоксифлуоресцеин-ТВ54) и эталонного бактериофага (А1еха532-ТВ99) затем измеряют с использованием планшет-ридера (Perkin Elmer). Полученные данные определяют как исходную интенсивность или 100% интенсивность сигнала суспензии фагов до добавления образца, подлежащего тестированию, исходная интенсивность показана на графике на Фиг. 12Б в виде пунктирной линии.

Кроме того, 900 мкл каждой указанной выше суспензии смешивают с 100 мкл соответствующей серийно разведенной суспензии бактерий Е. coli С600 (приблизительно от 10⁴ до 10⁷ клеток/мл в TSB) и реакционные смеси инкубируют в течение 5-10 мин при комнатной температуре. Затем реакционные смеси фильтруют через фильтр с размером пор 0,4 мкм (микропористая мембрана, милипористая), соответственно.

Флуоресценцию в полученных фильтратах измеряют с помощью планшет-ридера (Perkin Elmer), соответственно. На Фиг. 12Б показаны интенсивности флуоресценции несвязанных 5(6)-карбоксифлуоресцеин-меченных бактериофагов ТВ54 (показано квадратами) и А1еха532-меченных бактериофагов ТВ99 (показано треугольниками) в фильтрате. Каждую из указанных интенсивностей флуоресценции получают в результате нормирования по определенной величине исходной интенсивности, то есть каждую из измеренных интенсивностей флуоресценции относят к исходной интенсивности. Видно, что интенсивность флуоресценции тестируемого бактериофага (5(6)-карбоксифлуоресцеин-ТВ54, показано квадратами) значимо снижается. Это показывает, что тестируемые бактериофаги специфично инфицируют бактериальный штамм Е. coli С600 и образуют соответствующие комплексы бактерии-бактериофаги, которые удаляют посредством фильтрации. В результате, количество несвязанных тестируемых бактериофагов в фильтрате меньше, чем в исходной суспензии фагов, что отражается в снижении в интенсивности флуоресценции в фильтрате.

Интенсивности флуоресценции в концентрате показаны на Фиг 12В. Все указанные данные определяют с помощью флуоресцентной микроскопии посредством фотокопирования поверхностей фильтра со стандартной линзой объектива (20х, Nikon) и расчета средней интенсивности изображений трех изображений на поверхность фильтров (среднее значение плюс/минус стандартное отклонение, N равно 3). Данные показывают, что интенсивность флуоресценции тестируемого бактериофага (5(6)-карбоксифлуоресцеин-ТВ54) возрастает вместе с повышением концентрации бактерий в добавляемом образце, тогда как интенсивность флуоресценции эталонного бактериофага (А1еха532-ТВ99) едва ли меняется. Следовательно, можно сделать вывод о том, что тестируемый бактериофаг специфично связывается с бактериями, подлежащими обнаружению, и что концентрация образованных комплексов бактерии-бактериофаги, которые в конечном итоге иммобилизованы на поверхности фильтра в результате фильтрации, повышается, когда повышается концентрация бактерий. Напротив, эталонный бактериофаг не связывается с видом или штаммом бактерий, подлежащим обнаружению, так что концентрация бактерий не влияет на интенсивность флуоресценции, измеряемую для эталонного бактериофага в концентрате.

Как показано, способ по изобретению делает возможным высокоспецифичное и высокочувствительное обнаружение бактерий. Способ легко реализовать, и он обеспечивает очень надежные результаты. Кроме того, время, требуемое для данного способа, мало, так что обнаружение доступно в течение менее одного часа с момента добавления образца.

1. Способ обнаружения бактерий, включающий следующие стадии:

A) обеспечение одной или более чем одной суспензии, причем каждая содержит по меньшей мере один вид меченых тестируемых бактериофагов, которые специфично связываются с видом бактерий, подлежащим обнаружению;

B) добавление образца, подлежащего проверке на наличие по меньшей мере одного вида бактерий, подлежащего обнаружению, в одну или более чем одну суспензию;

C) фильтрация полученной реакционной смеси, где используют фильтр с размером пор от 0,1 до 0,5 мкм;

D) обнаружение комплексов бактерии-бактериофаги в концентрате, при условии, что присутствует по меньшей мере один вид бактерий, подлежащий обнаружению, где комплексы состоят из бактерий по меньшей мере одного вида бактерий, подлежащего обнаружению, и тестируемых бактериофагов по меньшей мере одного вида тестируемых бактериофагов, связанных с ними;

E) обнаружение несвязанных бактериофагов в фильтрате;

F) опосредованная процессором обработка полученных сигналов, сгенерированных в результате обнаружения на стадиях D) и E), и вывод результатов обнаружения пользователю,

где одна или более чем одна суспензия дополнительно содержит меченый эталонный бактериофаг, который не связывается ни с каким видом бактерий, подлежащим обнаружению, и имеет метку, разобщенную с тестируемыми бактериофагами, так что меченый эталонный бактериофаг также выявляют на стадии E); или где меченые микро- или наночастицы используют в качестве альтернативы меченому эталонному бактериофагу, которые не связываются ни с каким видом бактерий, подлежащим обнаружению, и могут проходить через фильтр благодаря их небольшому размеру;

причем определяют соотношение суммарной интенсивности сигнала эталонного бактериофага в концентрате и суммарной интенсивности сигнала эталонного бактериофага в фильтрате и сравнивают с соотношением суммарной интенсивности сигнала по меньшей мере одного тестируемого бактериофага в концентрате и суммарной интенсивности сигнала по меньшей мере одного тестируемого бактериофага в фильтрате.

2. Способ обнаружения бактерий по п. 1, где виды бактерий, подлежащие обнаружению, выбраны из группы, содержащей Staphylococcus aureus, метициллин-резистентный Staphylococcus aureus (MRSA), Staphylocossus epidermidis, Streptococcus pneumoniae, Streptococcus pyogenes, Haemophilus influenzae, Haemophilus parainfluenzae, Klebsiella pneumoniae, Escherichia coli, Escherichia hermannii, EHEC, Enterobacter cloacae, Enterococcus faecalis, Enterococcus faecum, Pseudomonas aeruginosa, Proteus mirabilis, Proteus vulgaris, Staphylococcus saprophyticus, Bacteroides fragilis, Entercoccus faecium, Enterobacter aerogenes, Serratia marcescens, B-Streptococcus (agalactiae), Chlamydia trachomatis, Chlamydia psittaci, Ureaplasma urealyticum, Mycoplasma hominis, Mycoplasma pneumoniae, Neisseria gonorrhoeae, Neisseria meningitidis, Citrobacter freundii, Moraxella catarrhalis, Stenotrophomonas maltophilia, Pasteurella multocida, Acinetobacter baumannii, Providencia rettgeri, Bordetella pertussis, Bacillus anthracis, Bacillus cereus, Brucella abortus, Brucella melitensis, Clostridium butolinum, Clostridium difficile, Clostridium tetani, Clostridium perfringens, Clamydia trachomatis, Corynebacterium diphtheriae, Francisella tularensis, Gardenella vaginalis, Listeria monocytogenes, Morganella morganii, Mycobacterium leprae, Mycobacterium tuberculosis, Nocardia asteriodes, Salmonella bongori, Salmonella enterica, Shigella spp., Vibrio cholerae, Borrelia burgdorferi, Yersinia pestis, Yersinia enterocolitica, Coxiella burnettii, Aeromonas spp., Plesiomonas spp., Xanthomonas maltophilia, Treponema pallidum, Eikenella corrodens, Spirillum minus, Rickettsia prowazeki, Rickettsia rickettsii, Rickettsia conorii, Cronobacter spp., Campylobacter spp. и Legionella pneumophilia.

3. Способ обнаружения бактерий по п. 1 или 2, где каждая из одной или более чем одной суспензии содержит два или более чем два вида меченых тестируемых бактериофагов, каждый из которых специфично связывается с разными видами бактерий, подлежащими обнаружению, и где метки указанных видов являются разобщенными или частично перекрывающимися и где метка характерна для соответствующего вида тестируемых бактериофагов.

4. Способ обнаружения бактерий по любому из пп. 1-3, где метка содержит по меньшей мере одну репортерную молекулу, обладающую флуоресцентными или хемилюминесцентными свойствами, или по меньшей мере одну репортерную молекулу, которая излучает свет в результате взаимодействия с вторичной молекулой.

5. Способ обнаружения бактерий по п. 4, где метка состоит из по меньшей мере одной флуоресцентной репортерной молекулы соответственно, и обнаружение проводят посредством измерения флуоресценции, где возбуждение по меньшей мере одной флуоресцентной репортерной молекулы проводят в диапазоне длин волн от 200 до 1000 нм.

6. Способ обнаружения бактерий по п. 4 или 5, где по меньшей мере одна репортерная молекула связана с белками в капсидной области бактериофагов.

7. Способ обнаружения бактерий по любому из пп. 4-6, где обнаружение проводят посредством измерения излучения света с временным разрешением.

8. Способ обнаружения бактерий по любому из пп. 1-7, дополнительно включающий стадию G) смешивания образца с одной или более чем одной суспензией и инкубирования полученной реакционной смеси, где стадия G) следует за стадией B).

9. Способ обнаружения бактерий по любому из пп. 1-8, дополнительно включающий стадию предварительного разделения комплексов бактерии-бактериофаги и несвязанных бактериофагов, которое следует за стадией B) или G), причем предварительное разделение проводят в соответствии с принципом гель-фильтрации с использованием гелевой матрицы.

10. Реакционный сосуд для осуществления способа обнаружения бактерий по п. 1, содержащий:

по меньшей мере два отсека, отделенных друг от друга фильтром,

где фильтр имеет размер пор от 0,1 до 0,5 мкм,

где один отсек представляет собой резервуар для фагов, содержащий суспензию, которая содержит по меньшей мере один вид меченых тестируемых бактериофагов, специфично связывающихся с видом бактерий, подлежащим обнаружению, и

другой отсек представляет собой сборный резервуар для приема фильтрата после добавления образца в суспензию и фильтрации через фильтр;

средства идентификации реакционного сосуда; и

по меньшей мере два измерительных окна,

где одно измерительное окно расположено в области поверхности фильтра, обращенной к резервуару для фагов, и

другое измерительное окно расположено в области сборного резервуара,

где суспензия дополнительно содержит меченый эталонный бактериофаг, который не связывается ни с каким видом бактерий, подлежащим обнаружению, и который имеет метку, разобщенную с тестируемыми бактериофагами; или где реакционный сосуд содержит дополнительный отсек, содержащий индикаторный раствор с мечеными микро- или наночастицами, которые не связываются ни с каким видом бактерий, подлежащим обнаружению, и могут проходить через фильтр ввиду их небольшого размера.

11. Реакционный сосуд по п. 10, где суспензия содержит два или более чем два вида меченых тестируемых бактериофагов, каждый из которых специфично связывается с разным видом бактерий, подлежащим обнаружению, и где метки указанных видов являются разобщенными или частично перекрывающимися, и где метка характерна для соответствующего вида тестируемых бактериофагов.

12. Реакционный сосуд по п. 10 или 11, дополнительно содержащий отсек между резервуаром для фагов и фильтром, который содержит по меньшей мере один префильтр.

13. Картридж для осуществления способа обнаружения бактерий по п. 1, содержащий:

два или более чем два реакционных сосуда по любому из пп. 10-12, которые расположены параллельно и/или последовательно друг за другом,

где каждый параллельный реакционный сосуд содержит разный вид меченых тестируемых бактериофагов в суспензии резервуара для фагов, причем каждый специфично связывается с разными видами бактерий, подлежащими обнаружению.

14. Картридж по п. 13, где метки разных видов меченых тестируемых бактериофагов являются разобщенными или частично перекрывающимися.

15. Измерительное устройство для обнаружения бактерий, содержащее

разъем, в который вставляют реакционный сосуд по любому из пп. 10-12 или картридж по п. 13 или 14;

по меньшей мере два оптических устройства для обнаружения, каждое из которых расположено в области измерительных окон вставленного реакционного сосуда или картриджа,

где каждое из оптических устройств для обнаружения содержит систему линз для фокусирования света, излучаемого меткой бактериофагов, на по меньшей мере один сенсор, обнаруживающий излучаемый свет;

процессор, который соединен с по меньшей мере одним сенсором оптического устройства для обнаружения соответственно, и обрабатывает полученные сигналы обнаружения; и

блок вывода, соединенный с процессором, который выводит результаты обнаружения пользователю.

16. Измерительное устройство по п. 15, где каждое из оптических устройств для обнаружения дополнительно содержит осветительный блок, который излучает свет в диапазоне длин волн от 200 до 1000 нм, и систему линз для фокусирования света, излучаемого осветительным блоком, на область измерения, где осветительный блок также соединен с процессором и контролируется им.

17. Измерительное устройство по п. 15 или 16, дополнительно содержащее интегрированное считывающее устройство, которое обнаруживает средства идентификации реакционного сосуда и направляет данные обнаружения на процессор, который обрабатывает данные обнаружения и выводит результаты идентификации пользователю через блок вывода.

18. Измерительное устройство по любому из пп. 15-17, где по меньшей мере один сенсор содержит один или более чем один оптический сенсор и/или один или более чем один спектрофотометр, необязательно оборудованный эмиссионным фильтром.