Штамм бактерий bifidobacterium longum icis-505 - продуцент биологически активных веществ, обладающих антиперсистентной активностью в отношении условно-патогенных и патогенных бактерий и дрожжевых грибов

Изобретение относится к микробиологии и биотехнологии. Предложен штамм бактерий Bifidobacterium longum ICIS-505, который является продуцентом биологически активных веществ, обладающих антиперсистентной активностью в отношении условно-патогенных и патогенных бактерий и дрожжевых грибов. Штамм бактерий Bifidobacterium longum депонирован в Государственной коллекции микроорганизмов нормальной микрофлоры ФБУН «МНИИЭМ им. Г.Н. Габричевского Роспотребнадзора» под коллекционным номером 1260 и может быть использован для получения пробиотических препаратов. Штамм позволяет нормализовать микрофлору кишечника при профилактике и лечении острых кишечных инфекций. 2 табл.

 

Изобретение относится к микробиологии и биотехнологии и может быть использовано для получения пробиотических препаратов, оказывающих антиперсистентное влияние на условно-патогенные и патогенные бактерии и дрожжевые грибы.

Аналогов изобретения в патентной и научно-технической литературе не обнаружено.

Известно, что среди ключевых механизмов защитного действия нормофлоры выделяют способность бифидобактерий потенцировать чувствительность патогенов к антибактериальным факторам хозяина, точнее подавлять их персистентные свойства [Бухарин, О.В. Ассоциативный симбиоз / О.В. Бухарин [и др.]. - Екатеринбург: УрО РАН, 2007 а. - 264 с.].

Персистентные свойства микроорганизмов определяются как основная «мишень» для отбора наиболее эффективных препаратов в борьбе с патогенной флорой, в том числе и с антибиотикорезистентными штаммами. Подавление персистентных свойств возбудителя «отменяет» его паразитирование в организме человека и тем самым повышает эффективность лекарственных воздействий. Этот принцип применим для выбора действия химических средств и отбора биологически активных препаратов [Бухарин О.В., Перунова Н.Б. Микросимбиоценоз. Екатеринбург: УрО РАН. 2014. 260 с].

Все это обусловливает использование бифидобактерий в качестве бактерийных препаратов как при лечении и профилактике острых кишечных инфекций, санации бактерионосительства и преодолении негативных последствий антибиотикотерапии, так и при производстве кисломолочных продуктов.

Технический результат, на достижение которого направлено изобретение, заключается в получении сырья, являющегося источником биологически активных веществ, подавляющих персистентные свойства условно-патогенных и патогенных бактерий и дрожжевых грибов.

Указанный технический результат достигнут получением нового штамма бактерий Bifidobacterium longum ICIS-505.

Штамм Bifidobacterium longum ICIS-505 выделен из испражнений пациента при обследовании микробиоценоза дистального отдела толстого кишечника в 2014 году в лаборатории биомониторинга и молекулярно-генетических исследований Института клеточного и внутриклеточного симбиоза Уральского отделения Российской академии наук г. Оренбурга.

Полученный штамм Bifidobacterium longum ICIS-505 депонирован в Государственной коллекции микроорганизмов нормальной микрофлоры ФБУН «МНИИЭМ им. Г.Н. Габричевского Роспотребнадзора» под коллекционным номером 1260.

Штамм Bifidobacterium longum ICIS-505 характеризуется следующими культурально-морфологическими и физиолого-биохимическими признаками.

Культурально-морфологические признаки:

Клетки представляют собой грамположительные, неподвижные полиморфные палочки с раздвоениями или булавовидными утолщениями на одном или двух концах длиной от 4,0 до 5,0 мкм, располагающиеся в виде отдельных клеток или скоплений.

В анаэробных условиях на поверхности Schaedler-агар и МРС-5 (38±1°С, 48 часов) образуют круглые мелкие белые колонии.

В полужидких средах (печеночная среда Блаурокка, казеиново-дрожжевой (КД-5), гидролизатно-молочный (ГМ) при 38±1°С, 48 часов бактерии вырастают в виде рыхлой массы, оставляя прозрачной верхнюю часть среды (зона аэробиоза). Отдельные колонии бифидобактерий при росте на печеночной среде Блаурокка имеют шаровидную форму белого цвета и образуют при встряхивании крошковатую массу.

Физиолого-биохимические признаки:

Строгий анаэроб.

Температурный диапазон роста 38±1°С, фаза максимального накопления микробных клеток заканчивается к 24-48 ч.

Оптимум рН 7,2-7,6.

Не ферментируют индол, уреазу, салицин, трегалозу, маннотол, рамнозу, N-ацетил-β-D-глюкозаминидазу, эскулин, целлобиозуарабинозу и сорбитол. Ферментируют мальтозу, глюкозу, фруктозу, галактозу, лактозу, мелезитозу, нитраты, сукрозу, β-глюкозидазу, маннозу, раффинозу, ксилозу и арабинозу.

Условия хранения лиофильно высушенной культуры: в герметичной упаковке при температуре 4±2°С в защищенном от прямых солнечных лучей месте при относительной влажности воздуха не более 70% - срок хранения не более 12 месяцев.

Условия и среды для размножения:

1. плотные среды: МРС-5, Schaedler-агар (48 часов, 38±1°С, анаэробные условия);

2. полужидкие среды: печеночная среда Блаурокка, казеиново-дрожжевая (КД-5), гидролизатно-молочная (ГМ) (48 часов, 38±1°С, анаэробные условия);

3. жидкие среды: Schaedler-бульон (24-48 часов, 38±1°С, анаэробные условия).

При проведении полногеномного секвенирования, включая 16rRNA-типирование штамм В. longum ICIS-505 идентифицирован как штамм вида Bifidobacterium longum. Анализ генома В. longum ICIS-505 не выявил генетических детерминант вирулентности и токсигенности, что позволяет говорить о том что данный штамм безвреден, не токсичен и авирулентен.

С целью изучения специфической антиперсистентной активности биологически активных веществ, продуцируемых штаммом В. longum ICIS-505, было изучено их влияние на антилизоцимную активность (АЛА) и биопленкообразование (БПО) условно-патогенных и патогенных бактерий и дрожжевых грибов.

Антилизоцимная активность и биопленкообразование являются базовыми и универсальными характеристиками патогенных и условно-патогенных микроорганизмов [Бухарин О.В., Перунова Н.Б. Микросимбиоценоз. Екатеринбург: УрО РАН. 2014. 260 с.].

Для определения антилизоцимной активности условно-патогенных и патогенных бактерий и дрожжевых грибов использовали известный способ определения антилизоцимной активности микроорганизмов [патент РФ 2126051, C12Q 1/02, 1999].

Биопленкообразование условно-патогенных и патогенных бактерий и дрожжевых грибов проводили фотометрическим методом по интенсивности поглощения красителя (кристалл-виолета) микробной биопленкой, адгезированной к поверхности лунки полистиролового планшета G.А., Kolter R. Flagellar and twitching motility are necessary for Pseudomonas aeruginosa biofilm development. Mol Microbiol 1998, 30, P. 295-304; G.A., Pratt L.A., Watnick P.I., Newman D.K., Weaver V.В., Kolter R. Genetic approaches to the study of biofilms. Methods Enzymol 1999, 310, P. 91-109].

Уровень антиперсистентной активности биологически активных веществ, продуцируемых штаммом В. longum ICIS-505, выражают в процентах (%) подавления персистентных свойств условно-патогенных и патогенных бактерий и дрожжевых грибов в опыте по сравнению с контролем.

Пример осуществления изобретения.

С целью изучения антиперсистентных свойств биологически активных веществ, продуцируемых предлагаемым штаммом, проведено культивирование В. longum ICIS-505 на жидкой питательной среде следующего состава: гидролизат казеина - 5,67 г.; протеозопептон - 5,00 г.; папаиновый перевар соевой муки - 1,00 г.; дрожжевой экстракт - 5,00 г.; глюкоза - 5,83 г.; NaCl -1,67 г.; калия гидрофосфат - 0,83 г.; трис - 3,00 г.; L-цистин - 0,40 г.; гемин -0,01 г. рН=7,6±0,2. Температура 38±1°С, время инкубации 24-48 часа в анаэробных условиях.

Далее получали культуральную жидкость путем центрифугирования бульонной культуры В. longum ICIS-505 (при 3000 оборотах в минуту в течение 15 минут) и отделения ее от бактериальных клеток стеклянной стерильной пипеткой в отдельную емкость.

Данная культуральная жидкость В. longum ICIS-505 представляет собой неочищенный продукт, продуцируемый штаммом, - биологически активные вещества, оказывающие антиперсистентное влияние на условно-патогенные и патогенные бактерии и дрожжевые грибы.

Параллельно из выросших 24 часовых культур условно-патогенных и патогенных бактерий (Sh. zonnei 177б, Sh. flexneri 337, Sh. flexneri 170, E. coli 157, P. mirabilis 50/10, P. vulgaris 401, K. pneumoniae 278, S. aureus 209 и S. aureus 19) и дрожжевых грибов (С. albicans 24433 АТСС, С. albicans 14, С. albicans 38, С. albicans 85, С. albicans 102) готовили одномиллиардную взвесь по стандарту мутности (1×109 КОЕ/мл, 3 McF).

Для определения специфической активности биологически активных веществ, продуцируемых штаммом В. longum ICIS-505, исследовали антиперсистентную активность культуральной жидкости в отношении антилизоцимной активности и биопленкообразования условно-патогенных и патогенных бактерий и дрожжевых грибов. Исследование осуществляли путем добавления культуральной жидкости штамма (в соотношении 1:9) в питательный бульон со взвесью условно-патогенных и патогенных бактерий и дрожжевых грибов (1×109 КОЕ/мл, 3 McF). В качестве контроля на каждом этапе исследований вместо культуральной жидкости Bifidobacterium longum ICIS-505 использовали эквивалентное количество питательного бульона.

Для определения антилизоцимной активности условно-патогенных и патогенных бактерий и дрожжевых грибов использовали известный способ определения антилизоцимной активности микроорганизмов [патент РФ 2126051, C12Q 1/02, 1999]. Согласно способу для определения АЛА в качестве тест-культуры использовали суточную агаровую культуру Micrococcus lysodeikticus (штамм №2665 ГИСК им. Л.А. Тарасевича). Культуру растворяли в физиологическом растворе, доводили оптическую плотность (ОП) тест-штамма до 0,300 (0,28-0,32). На 1/15М фосфатном буфере (рН=6,2) готовили раствор лизоцима с концентрацией 20 мкг/мл.

Для определение специфической активности биологически активных веществ, продуцируемых штаммом Bifidobacterium longum ICIS-505, в отношений антилизоцимной активности условно-патогенных и патогенных бактерий и дрожжевых грибов одномоментно вносилось по 2800 мкл питательного бульона, 100 мкл суспензии суточной агаровой культуры патогенных и условно-патогенных микроорганизмов (в концентрации 1×109 КОЕ/мл) и 100 мкл супернатанта В. longum ICIS-505 (опыт) или 100 мкл питательного бульона (контроль). Все пробы инкубировались 24 часов статически при 37°С.

Контрольные и опытные пробы отделяли от микробных клеток центрифугированием при 3000 об/мин в течение 15 минут и получали супернатант. Супернатант объемом 0,9 мл смешивали с 0,1 мл приготовленного раствора лизоцима и инкубировали 60-120 мин при 37°С. Затем смесь супернатанта с лизоцимом помещали в полистеролловый планшет и вносили суспензию микрококка. Замер оптической плотности проводили через 30 с и 150 с после внесения в лунки микрококка.

Антилизоцимную активность исследуемого штамма рассчитывали по формуле:

где

А - антилизоцимная активность в микрограммах инактивированного лизоцима/мл супернатанта * ед. оптической плотности бульонной культуры, мкг/мл*OD:

V1 - объем (0,1 мл) раствора лизоцима исходной концентрации (20 мкг/мл);

V2 - объем (0,9 мл) супернатанта бульонной культуры исследуемого штамма;

С - исходная концентрация лизоцима (20 мкг/мл);

Y - оптическая плотность бульонной культуры исследуемого штамма, ед. оптической плотности;

ΔD0 - изменение оптической плотности суспензии тест-культуры в опыте между 30 и 150 секунд [D0(30'')-D0(150'')];

ΔDk - изменение оптической плотности суспензии тест-культуры в контроле между 30 и 150 секунд [Dк(30'')-Dк(150'')].

Антилизоцимную активность опытных и контрольных проб выражали в мкг/мл*OD.

Биопленкообразование условно-патогенных и патогенных бактерий и дрожжевых грибов проводили фотометрическим методом по интенсивности поглощения красителя (кристалл-виолета) микробной биопленкой, адгезированной к поверхности лунки полистиролового планшета G.А., Kolter R. Flagellar and twitching motility are necessary for Pseudomonas aeruginosa biofilm development. Mol Microbiol 1998, 30, P. 295-304; G.A., Pratt L.A., Watnick P.I., Newman D.K., Weaver V.В., Kolter R. Genetic approaches to the study of biofilms. Methods Enzymol 1999, 310, P. 91-109].

В лунки 96-луночных стерильных плоскодонных планшетов одномоментно вносилось по 100 мкл питательного бульона, 135 мкл суспензии суточной агаровой культуры патогенных и условно-патогенных микроорганизмов (в концентрации 1×109 КОЕ/мл, 3 McF) и 15 мкл супернатанта В. longum ICIS-505 (опыт) или 15 мкл питательного бульона (контроль). Все пробы инкубировались 24 часа при 37°С. Для учета биопленкообразования после удаления планктонных (свободноплавающих) клеток микроорганизмов трехкратной промывкой лунок дистиллированной водой (200 мкл) и подсушивания планшетов на воздухе (30 мин), осуществлялось окрашивание сформированных биопленок внесением в лунки 1% раствора кристалл-виолета (45 мин при комнатной температуре). Отмывание свободного красителя выполняли трехкратной обработкой лунок дистиллированной водой, а экстракцию фиксированного в биопленках красителя проводили добавлением к пробам 200 мкл 96% этанола. Интенсивность окрашивания последнего, соответствующая значению показателя биопленкообразования условно-патогенных и патогенных бактерий и дрожжевых грибов, определяли на спектрофотометре (BioTek, США) при длине волны 630 нм. Показатель биопленкообразования опытных и контрольных проб выражали в условных единицах оптической плотности (ОП630).

Далее вычисляли уровень антиперсистентной активности биологически активных веществ, продуцируемых штаммом В. longum ICIS-505 в процентах (%) подавления АЛА И БПО условно-патогенных и патогенных бактерией дрожжевых грибов в опыте по сравнению с контролем.

Суммированные результаты на основании 3 кратного повторения опытов приведены в таблице 1, 2.

В таблице 1 приведены результаты исследований по определению уровня антиперсистентной активности биологически активных веществ, продуцируемых штаммом Bifidobacterium longum ICIS-505, в отношении условно-патогенных и патогенных бактерий.

В таблице 2 приведены результаты исследований по определению уровня антиперсистентной активности биологически активных веществ, продуцируемых штаммом Bifidobacterium longum ICIS-505, в отношении дрожжевых грибов.

Как видно из таблиц уровень антиперсистентной активности биологически активных веществ, продуцируемых штаммом Bifidobacterium longum ICIS-505 в отношении условно-патогенных и патогенных бактерий и дрожжевых грибов составляет от 60% до 100%, что свидетельствует о его способности ингибировать персистентные свойства условно-патогенных и патогенных бактерий и дрожжевых грибов в 2 и более раза.

Таким образом, заявляемый штамм бактерий Bifidobacterium longum ICIS-505 перспективен для целей получения пробиотических препаратов, оказывающих антиперсистентное влияние на условно-патогенные и патогенные бактерии и дрожжевые грибы.

Штамм бактерий Bifidobacterium longum ICIS-505 - продуцент биологически активных веществ, обладающих антиперсистентной активностью в отношении условно-патогенных и патогенных бактерий и дрожжевых грибов, депонированный в Государственной коллекции микроорганизмов нормальной микрофлоры ФБУН «МНИИЭМ им. Г.Н. Габричевского Роспотребнадзора» под коллекционным номером 1260.



 

Похожие патенты:

Изобретение относится к биотехнологии. Штамм Emericellopsis alkalina депонирован во Всероссийской Коллекции Промышленных Микроорганизмов под регистрационным номером ВКПМ F-1428.

Изобретение относится к лабораторной микологии. Питательная среда для получения дрожжевых клеток диморфного микроскопического гриба Histoplasma capsulatum содержит сернокислотный гидролизат рыбной муки, ферментированную кровь как стимулятор роста гемофильных микроорганизмов, дрожжевой экстракт, сульфит натрия, L-цистеин, сернокислый магний, агар микробиологический, ферментативный пептон, хлористый натрий, дефибринированную кровь животного, L-цистин, D-глюкозу, RPMI 1640 - концентрат раствора витаминов и дистиллированную воду при заданном содержании компонентов.

Группа изобретений относится к очистке грунтов, воды от нефти и нефтепродуктов с помощью биотехнологии. Предложены нефтеокисляющий биопрепарат, биосорбент на его основе и способ его приготовления.

Изобретение относится к области биотехнологии. Предлагается штамм микроводорослей Chlorella vulgaris Beijer.
Изобретение относится к области биотехнологии. Предложен штамм бактерий Streptococcus equi для изготовления вакцины против мыта лошадей.

Изобретение относится к биотехнологии и касается штамма микроводоросли Coelastrella sp. K1.

Изобретение относится к медицине, а именно к экспериментальной медицине, и может быть использовано для моделирования туберкулезной инфекции in vitro. Гранулемоподобные структуры получают из мононуклеарных клеток венозной крови в присутствии микобактерий туберкулеза, культивируемых в трехмерном матриксе.
Изобретение относится к микробиологической промышленности, в частности к штамму дрожжей Metschnikowia pulcherrima ВКПМ Y-4339 - продуценту микробного белка и этанола. Предложенный штамм Metschnikowia pulcherrima ВКПМ Y-4339 неприхотливый к культивированию и хранению, обладает невысокой температурой размножения, обеспечивает высокий прирост биомассы при получении микробного белка, а также высокий выход этанола..

Изобретение относится к биотехнологии. Пробиотический препарат для интенсивного откорма сельскохозяйственных животных и птицы получен путем смешивания лиофилизированных культур штаммов Enterococcus hirae ВКПМ В-12670 и Enterococcus mundtii ВКПМ В-12675 в соотношении 1:1.

Изобретение относится к микробиологии. Штамм гриба Alternaria sonchi S-102-15, депонированный в Государственной коллекции микроорганизмов ВИЗР под номером Г-52 ВИЗР, обладает гербицидной активностью в отношении осота полевого (Sonchus arvensis L.).

Изобретение относится к областям биотехнологии, молекулярной биологии и медицинской микробиологии. Разработан набор олигонуклеотидных праймеров для реакции петлевой изотермической амплификации (LAMP), который позволяет амплифицировать специфические для бактерий вида Francisella tularensis фрагменты ДНК из целевого гена, имеющего нуклеотидную последовательность SEQ ID №:1.
Изобретение относится к области биотехнологии. Предложен штамм бактерий Streptococcus equi для изготовления вакцины против мыта лошадей.
Изобретение относится к области биотехнологии. Предложен обладающий способностью к деструкции нефти и нефтепродуктов штамм Pseudoalteromonas arctica.

Группа изобретений относится к области биотехнологии. Предложена аланиндегидрогеназа, отличающаяся тем, что указанный фермент имеет последовательность, которая по меньшей мере на 85% идентична последовательности под SEQ ID NO: 72.

Изобретение относится к биотехнологии. Пробиотический препарат для интенсивного откорма сельскохозяйственных животных и птицы получен путем смешивания лиофилизированных культур штаммов Enterococcus hirae ВКПМ В-12670 и Enterococcus mundtii ВКПМ В-12675 в соотношении 1:1.

Группа изобретений относится к получению тагатозы из фруктозы. Предложен белок для получения тагатозы из фруктозы, имеющий аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO:1-7.

Изобретение относится к биотехнологии. Питательная среда для культивирования бруцеллезного микроба содержит пептон, натрия хлорид, мясную воду, стерильную сыворотку крупного рогатого скота, декстрозу, агар-агар и геотермальную воду при заданном соотношении компонентов.

Группа изобретений относится к биотехнологии и включает кристаллообразующий штамм бактерий Brevibacillus laterosporus ВКПМ В-13186 и варианты его применения. Предлагаемый штамм является спорообразующим и обладает широким спектром антагонистической активности против различных видов организмов, что позволяет использовать его как эффективный биоцид.

Группа изобретений относится к биотехнологии и производству биологических средств защиты растений. Группа изобретений включает спорообразующий штамм бактерий Bacillus amyloliquefaciens ВКПМ В-11443 и биопрепарат на его основе.

Предложен способ отбора молочнокислого бактериального штамма, эффективного для лечения нарушения моторики кишечника. Указанный способ включает: a) стадию пространственно-временного (ST) картирования, которую осуществляют на желудочно-кишечном сегменте для того, чтобы анализировать эффект указанного молочнокислого бактериального штамма, оказываемый на моторику желудка и кишечника; b) стадию регистрации нервного пучка ex vivo, которую осуществляют на желудочно-кишечном сегменте для того, чтобы анализировать эффект указанного молочнокислого бактериального штамма, оказываемый на прохождение импульсов по брыжеечным афферентным нервам; и с) стадию выбора бактериального штамма, эффективного для лечения нарушения моторики кишечника, в соответствии с критериями отбора на основе эффектов указанного средства на моторику желудка и кишечника и на прохождение импульсов по брыжеечным афферентным нервам, проанализированных на стадии (а) и стадии (b), где критерии отбора варьируют в зависимости от нарушения моторики, которое желательно подлежит лечению.

Изобретение относится к медицине, а именно к лучевой терапии, и может быть использовано для неоадъювантного термохимиолучевого лечения рака прямой кишки. Проводят лучевую терапию с фракционированием дозы в разовой очаговой дозе (РОД) 2 Гр до суммарной очаговой дозы (СОД) 50 Гр в течение 5 недель.

Изобретение относится к микробиологии и биотехнологии. Предложен штамм бактерий Bifidobacterium longum ICIS-505, который является продуцентом биологически активных веществ, обладающих антиперсистентной активностью в отношении условно-патогенных и патогенных бактерий и дрожжевых грибов. Штамм бактерий Bifidobacterium longum депонирован в Государственной коллекции микроорганизмов нормальной микрофлоры ФБУН «МНИИЭМ им. Г.Н. Габричевского Роспотребнадзора» под коллекционным номером 1260 и может быть использован для получения пробиотических препаратов. Штамм позволяет нормализовать микрофлору кишечника при профилактике и лечении острых кишечных инфекций. 2 табл.

Наверх