Способы получения рекомбинантных гликопротеинов с модифицированным гликозилированием

Изобретение относится к области биохимии, в частности к генетически модифицированной клетке-хозяину млекопитающего, которая содержит первую нуклеиновую кислоту, кодирующую экзогенную фукозидазу, и вторую нуклеиновую кислоту, кодирующую эндогликозидазу, а также способ ее получения. При этом модифицированная клетка-хозяин млекопитающего продуцирует гликопротеины с модифицированным гликозилированием. Также раскрыт способ получения дефукозилированного гликопротеина, предусматривающий использование вышеуказанной клетки. Изобретение позволяет эффективно получать дефукозилированный гликопротеин. 3 н. и 17 з.п. ф-лы, 4 ил.

 

ПЕРЕКРЕСТНАЯ ССЫЛКА НА РОДСТВЕННУЮ ЗАЯВКУ

Данная заявка испрашивает приоритет по предварительной заявке на патент США 61/954337, поданной 17 марта 2014 года, которая полностью приведена здесь в качестве ссылки.

УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

Гликозилирование является важным в плане структур и функций гликопротеинов. Например, предполагается, что гликозилирование оказывает влияние на фолдинг белков (и, таким образом, на стабильность) и/или различные виды биоактивности гликопротеинов. Потребность в терапевтических рекомбинантных гликопротеинах, в частности в моноклональных антителах, сильно повысилась за два последних десятилетия. В рамках предшествующих исследований было обнаружено, что небольшие изменения в плане полисахаридных структур рекомбинантных гликопротеинов могут влиять на биологическую активность и фармакокинетические свойства гликопротеинов. Например, дарбэпоэтин альфа представляет собой гипергликозилированный аналог рекомбинантного эритропоэтина человека (ЕРО) с двумя дополнительными N-связанными сайтами гликозилирования. Дополнительное N-гликозилирование повышает процентную долю углеводов в составе общей молекулярной массы и значительно увеличивает время полужизни дарбэпоэтина альфа в сыворотке по сравнению с эндогенным и рекомбинантным ЕРО. Кроме того, для терапевтического антитела, чья эффективность в основном зависит от антитело-зависимой клеточной цитотоксичности (ADCC), были разработаны как хемоферментативные, так и генетические подходы для удаления корового фукозного остатка в Fc части для повышения эффективности действия ADCC, индуцируемого данным антителом.

Тем не менее, доступные в настоящее время способы ремоделирования гликозилирования зачастую требуют применения нескольких ферментов и/или множества этапов, что приводит к высокой стоимости производства рекомбинантных белков с модифицированным гликозилированием.

Настоящая заявка основана на разработке генетически модифицированных клеток- хозяев животного происхождения, способных продуцировать гликопротеины, такие как антитела с модифицированным гликозилированием, включая дефукозилирование и моногликозилирование. Данные клетки-хозяева животного происхождения были модифицированы для сверхэкспрессии одной или нескольких фукозидаз, эндогликозидаз или их обеих. Неожиданным образом изменения в плане клеточного механизма гликозилирования в клетках-хозяевах животного происхождения не приводили к появлению нежелательных эффектов в отношении синтеза гликопротеинов и развития клеток-хозяев.

Соответственно, настоящее изобретение относится к генетически модифицированной клетке-хозяину животного происхождения (например, клетке млекопитающего), которая сверхэкспрессирует фукозидазу, эндогликозидазу или их обе, при этом клетка-хозяин животного происхождения продуцирует гликопротеины с модифицированным гликозилированием в отличие от своего аналога дикого типа. В некоторых примерах фукозидаза может представлять собой фукозидазу млекопитающего или бактериальную фукозидазу, например FUCA1 человека, FUCA2 человека, фукозидазу Cricetulus griseus, альфа-L-1 α1,6-фукозидазу Chryseobacterium meningosepticum или бактериальную фукозидазу BF3242. Альтернативно или дополнительно, эндогликозидаза может представлять собой Эндо S-фермент, например фермент, включающий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 11. В некоторых вариантах осуществления генетически модифицированная клетка-хозяин животного происхождения экспрессирует (i) FUCA1 человека, FUCA2 человека, фукозидазу Cricetulus griseus, альфа-L-1 α1,6-фукозидазу Chryseobacterium meningosepticum или бактериальную фукозидазу BF3242, и (и) Эндо S (такую как SEQ ID NO: 11).

Описанная здесь генетически модифицированная клетка-хозяин животного происхождения также может экспрессировать гликопротеин, который может являться экзогенным (то есть не экспрессируемым нативной клеткой животного происхождения того же типа). Примеры включают, без исключения, антитело, Fc-слитый белок, цитокин, гормон, фактор роста или фермент.

В некоторых примерах генетически модифицированная клетка-хозяин животного происхождения представляет собой клетку млекопитающего, например, клетку яичника китайского хомячка (CHO), клетку миеломы крысы, клетку почки детеныша хомяка (ВНК), гибридомную клетку, клетку Namalwa, эмбриональную стволовую клетку или оплодотворенное яйцо.

Изобретение также относится к способам получения гликопротеинов с модифицированными паттернами гликозилирования (например, дефукозилированным или моногликозилированным) с применением любых описанных здесь генетически модифицированных клеток-хозяев животного происхождения. Способ может включать (i) получение клетки-хозяина животного происхождения, экспрессирующей (а) гликопротеин и (b) фукозидазу, эндогликозидазу или их обе;

культивирование клетки-хозяина животного происхождения при условиях, обеспечивающих получение гликопротеина и фукозидазы, эндогликозидазы или их обеих; (ii) сбор клеток-хозяев животного происхождения или культурального супернатанта для выделения гликопротеина, и необязательно (iii) выделение гликопротеина. Способ может также включать (iv) анализ паттерна гликозилирования гликопротеина.

Также, настоящее изобретение относится к способу получения любых из описанных здесь генетически модифицированных клеток-хозяев животного происхождения. Способ может включать (i) введение в клетку животного происхождения одного или нескольких векторов экспрессии, которые совместно кодируют фукозидазу, эндогликозидазу или их обе, и необязательно (ii) введение в клетку животного происхождения вектора экспрессии, кодирующего гликопротеин. Способ может также включать отбор трансформированных клеток, экспрессирующих фукозидазу, эндогликозидазу и гликопротеин.

Подробности одного или нескольких вариантов осуществления изобретения приведены ниже. Другие особенности или преимущества настоящего изобретения будут очевидны из нижеследующих фигур и подробного описания нескольких вариантов осуществления, а также прилагаемой формулы изобретения.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ

Фиг. 1 представляет собой схематическое изображение, на котором показаны структуры различных N-гликанов. А: стандартные N-связанные гликаны гликопротеинов. В: дефукозилированные N-гликаны. С: N-гликаны с моно-N-ацетилглюкозаминовым редуцирующим сахаром (моногликозилированные).

Фиг. 2 представляет собой схематическое изображение примера вектора экспрессии для получения фукозидазы. А: схема примера плазмиды, которая несет ген фукозидазы. В: пример экспрессионной кассеты для экспрессии фукозидазы или эндогликозидазы S.

Фиг. 3 включает диаграммы, на которых показано получение гомогенного афукозилированного антитела h4B12 с моносахаридом (GlcNAc) путем транзиентной экспрессии антитела в клетках-хозяевах, модифицированных для экспрессии фукозидазы и/или эндогликозидазы. А: а схематическое изображение получения гомогенных афукозилированных антител с моносахаридом (GlcNAc). В: диаграмма, показывающая гликозилирование антитела 4 В12, продуцируемого в клетках-хозяевах, модифицированных для экспрессии FUCA1 человека, FUCA2 человека, фукозидазы С.griseus, α1,6-фукозидазы альфа-L-1 или С.meningosepticum как определено с помощью ЖХ/МС/МС.С: диаграмма, показывающая транзиентную экспрессию фукозидазы или эндогликозидазы в СНО клетках, детектируемую с помощью Вестерн-блота. D: диаграмма, показывающая антитело h4B12, продуцируемое в СНО клетках, экспрессирующих фукозидазу или эндогликозидазу, как указано, при этом антитело имеет гомогенную гликоформу на основе моносахарида без фукозы (GlcNAc) как определено с помощью ЖХ/МС/МС. Термин "гомогенный N-гликан" означает отношение данного N-гликана (например, афукозилированного N-гликана) ко всем N-гликанам в гликопротеине, таком как антитело.

Фиг. 4 включает диаграммы, на которых показано получение гомогенного афукозилированного антитела ритуксимаб с моносахаридом (GlcNAc) путем транзиентной экспрессии антитела в клетках-хозяевах, модифицированных для экспрессии фукозидазы и/или эндогликозидазы. А: диаграмма, показывающая гликозилирование антитела ритуксимаб, полученного в клетках-хозяевах, модифицированных для экспрессии различных фукозидаз или эндогликозидаз, как указано. В: диаграмма, показывающая транзиентную экспрессию фукозидазы (левая дорожка) или эндогликозидазы (правая дорожка), как указано, в СНО клетках, как определено с помощью Вестерн-блота.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Здесь описаны генетически модифицированные клетки-хозяева животного происхождения, такие как клетки млекопитающих, способные продуцировать гликопротеины (например, экзогенные гликопротеины, такие как антитела) с модифицированными паттернами гликозилирования (например, с модифицированными паттернами N-гликозилирования, такие как дефукозилированные N-гликаны или моносахаридные гликаны). Данные клетки-хозяева животного происхождения могут быть модифицированы для сверхэкспрессии фукозидазы, эндогликозидазы или их обеих. Необязательно, клетка-хозяин животного происхождения также модифицирована для экспрессии экзогенного гликопротеина, такого как антитело.

Структура стандартного комплексного N-гликана гликопротеинов, продуцируемых в клетках млекопитающих дикого типа, показана на Фиг. 1, пункт А. Такой комплексный N-гликан содержит N-ацетилглюкозаминовый остаток (GlcNAc), присоединенный к сайту гликозилирования, аспарагиновый остаток (Asn) гликопротеина, а фукозный остаток присоединен к данному Asn остатку через альфа 1,6-связь. Генетически модифицированные клетки-хозяева животного происхождения способны продуцировать гликопротеины (например, эндогенные или экзогенные), имеющие модифицированные N-гликаны, такие как дефукозилированные N-гликаны, пример которых приведен на Фиг. 1, пункт В, и моносахаридные N-гликаны, в которых только GlcNAc остаток присоединен с сайту гликозилирования Asn (Фиг. 1, пункт С). Термин "гликопротеин с модифицированным гликозилированием" означает гликопротеин, несущий, по меньшей мере, один гликан, такой как N-гликан, который является структурно отличным от гликанов гликопротеина, продуцируемого в его аналоге дикого типа генетически модифицированной клетки-хозяина животного происхождения. Термин "дефукозилированный гликан" означает любой гликан, который не содержит альфа1,6- фукозный остаток или любой иной фукозный остаток.

А. Фукозидаза

Фукозидаза представляет собой фермент, который отщепляет фукозу. Данный фермент отщепляет фукозные остатки от содержащего их гликана. Фукозидаза для применения при получении указанных генетически модифицированных клеток-хозяев животного происхождения может представлять собой фукозидазу млекопитающего или бактериальную фукозидазу. В некоторых вариантах осуществления фукозидаза представляет собой фермент дикого типа, например бактериальный фермент дикого типа или фермент млекопитающего дикого типа, такой как фермент человека. Аминокислотные последовательности и кодирующие нуклеотидные последовательности ряда примеров фукозидаз указаны ниже (включая His-метку на С-конце).

Фукозидаза человека FUCA1:

Аминокислотная последовательность (SEQ ID NO:1)

Нуклеотидная последовательность (SEQ ID NO: 2; кодон-оптимизированная)

Фукозидаза человека FUCA2:

Аминокислотная последовательность (SEQ ID NO: 3)

Нуклеотидная последовательность (SEQ ID NO: 4; кодон-оптимизированная)

Фукозидаза FUCA2 Cricetulus griseus (китайского хомячка)

Аминокислотная последовательность (SEQ ID NO: 5)

Нуклеотидная последовательность (SEQ ID NO: 6; кодон-оптимизированная)

α1,6-фукозидаза chryseobacterium meningosepticum

Аминокислотная последовательность (SEQ ID NO: 7)

Нуклеотидная последовательность (SEQ ID NO: 8; кодон-оптимизированная)

Бактериальная фукозидаза BF3242 Аминокислотная последовательность (SEQ ID NO: 9)

Нуклеотидная последовательность (SEQ ID NO: 10; кодон-оптимизированная)

В некоторых вариантах осуществления фукозидаза может представлять собой фермент (например, фермент дикого типа), который обладает, по меньшей мере, 85% (например, 90%, 93%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99%) идентичностью последовательности относительно любого из указанных выше примеров фукозидаз (например, SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7 или SEQ ID NO: 9, а также других описанных здесь фукозидаз).

"Процентная доля идентичности" двух аминокислотных последовательностей определяется с применением алгоритма Карлина и Альтшула (Karlin и Altschul) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87: 2264-68, 1990, модифицированного в соответствии с Karlin and Altschul Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 5873-77, 1993. Такой алгоритм включают в программы NBLAST и XBLAST (версия 2.0) Altschul, et al. J. Mol. Biol. 215: 403-10, 1990. Поиски белков BLAST могут быть проведены с помощью программы XBLAST, оценка = 50, длина слова = 3, для получения аминокислотных последовательностей, являющихся гомологичными по отношению к молекулам антител по изобретению. При наличии гэпов между двумя последовательностями можно применять программу Gapped BLAST, как описано в Altschul et al., Nucleic Acids Res. 25(17): 3389-3402, 1997. При использовании программ BLAST и Gapped BLAST могут применяться параметры по умолчанию соответствующих программ (например, XBLAST и NBLAST).

Фукозидазы млекопитающих, которые могут применяться при конструировании генетически модифицированных клеток-хозяев животного происхождения, включают, без ограничения, описанные под каталожными номерами GenBank NP_114409.2, ХР_003811598.1, ААН03060.1, ЕНН53333.1, ХР_001127152.1, ХР_010360962.1, ХР_006084558.1, ХР_004263802.1, ХР_007171384.1, ХР_006075254.1, ХР_010982011.1, NP_001004218.1 и ХР_010964137.1.

Бактериальные фукозидазы, которые могут применяться при конструировании генетически модифицированных клеток-хозяев животного происхождения, включают, без ограничения, описанные под каталожными номерами GenBank WP_008769537.1, WP_032568292.1, EYA08300.1, WP_005780841.1, EXY26528.1, WP_044654435.1, WP_029425671.1, WP_022470316.1, CDA84816.1, WP_004307183.1 и WP_008025871.1.

В. Эндогликозидаза

Эндогликозидаза представляет собой фермент, который разрушает гликозидные связи между двумя сахаридными мономерами в гликане, таким образом высвобождая олигосахариды из гликопротеинов или гликолипидов. Эндогликозидаза для применения в рамках настоящего изобретения (например, фермент дикого типа) включает эндогликозидазу D, эндогликозидазу F, эндогликозидазу F1, эндогликозидазу F2, эндогликозидазу Н и эндогликозидазу S. Примеры эндогликозидазных ферментов каждого вида указаны в таблице ниже:

Другие подходящие эндогликозидазные ферменты включают ферменты, имеющие, по меньшей мере, 85% (например, 90%, 95%, 98% или 99%) идентичность последовательности относительно описанных здесь ферментов. Ожидается, что ферменты с высокой гомологией последовательности (например, по меньшей мере, 85% идентичностью последовательности) относительно любой из перечисленных выше эндогликозидаз будут обладать такой же биологической активностью. Такие ферменты (например, ферменты дикого типа) могут быть получены из коллекции генов, такой как GenBank, с применением одного из перечисленных выше ферментов в качестве объекта поиска.

В некоторых вариантах осуществления описанная здесь эндогликозидаза представляет собой Эндо S фермент. Эндо S представляет собой эндогликозидазу, которая специфично расщепляет N-гликаны в первых GlcNAc остатках, присоединенных к сайтам гликозилирования Asn Fc доменов в нативных IgG молекулах, что приводит к получению моногликозилированных IgG молекул, то есть IgG молекулы с одним GlcNAc, присоединенным к сайту гликозилирования Asn. Аминокислотная последовательность и кодирующая нуклеотидная последовательность указаны ниже:

Аминокислотная последовательность Эндо S (SEQ ID NO: 11):

Нуклеотидная последовательность Эндо S (SEQ ID NO: 12; кодон-оптимизированная)

В некоторых вариантах осуществления описанный здесь Эндо S фермент может представлять собой фермент (например, фермент дикого типа), который имеет, по меньшей мере, 85% (например, 90%, 93%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99%) идентичность последовательности относительно SEQ ID NO: 11. Примеры включают, без ограничения, описанные под каталожными номерами GenBank EQB24254.1, WP_037584019.1, WP_012679043.1 и ADC53484.1.

С. Генетически модифицированные клетки-хозяева животного происхождения

Описанные здесь клетки-хозяева животного происхождения являются генетически модифицированными для сверхэкспрессии одного или нескольких ферментов со специфичными видами гликанмодифицирующей активности (например, гликозидазной или гликол-трансферазной). Генетически модифицированная клетка-хозяин животного происхождения представляет собой клетку животного происхождения, которая несет экзогенные (не нативные) генетические материалы, такие как экзогенные гены, кодирующие одну или несколько описанных здесь фукозидаз и эндогликозидаз. Термин "клетка-хозяин, которая сверхэкспрессирует фермент" означает генетически модифицированную клетку-хозяин, которая экспрессирует фермент на уровне, превышающем (например, на 20%, 50%, 80%, 100%, 2-кратно, 5-кратно, 10-кратно, 50-кратно, 100-кратно, 1000-кратно, 104-кратно или 105-кратно) уровень экспрессии данного фермента в аналоге данной клетки-хозяина дикого типа, то есть в таком же типе клетки, которая не содержит той же генетической модификации, что и генетически модифицированная клетка-хозяин. В некоторых вариантах осуществления ген, кодирующий экзогенный фермент, как описано здесь, может быть введен в подходящую исходную клетку животного происхождения для получения описанной здесь генетически модифицированной клетки-хозяина животного происхождения. Термин "экзогенный фермент" означает фермент, который не существует в исходной клетке, применяемой для получения модифицированной клетки-хозяина животного происхождения.

Генетически модифицированные клетки-хозяева животного происхождения как описано здесь, которые способны продуцировать гликопротеины с модифицированным гликозилированием в отличие от их аналога дикого типа, могут быть получены с помощью традиционной рекомбинантной технологии. В некоторых случаях сильный промотор может быть инсертирован апстрим в эндогенный ген фукозидазы и/или эндогликозидазы для повышения его экспрессии. В других случаях экзогенные генетические материалы, кодирующие одну или несколько фукозидаз и/или эндогликозидаз, могут быть введены в исходную клетку-хозяин для получения генетически модифицированных клеток-хозяев животного происхождения, как описано здесь.

Ген, кодирующий фукозидазу или эндогликозидазу, как описано здесь, может быть инсертирован в подходящий вектор экспрессии (например, вирусный вектор или невирусный вектор) с применением способов, которые хорошо известны в данной области. Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Mannual, 3-е изд., Cold Spring Harbor Laboratory Press. Например, ген и вектор могут быть подвергнуты взаимодействию при подходящих условиях с рестрикционным ферментом для создания комплементарных концов на каждой молекуле, которые могут соединяться друг с другом и быть соединены с помощью лигазы. Альтернативно, линкеры в виде синтетической нуклеиновой кислоты могут быть лигированы с концами гена. Данные синтетические линкеры содержат нуклеотидные последовательности, которые соответствуют определенному сайту рестрикции в векторе. В некоторых вариантах осуществления ген фукозидазы или эндогликозидазы содержится в экспрессионной кассете, включающей один или несколько следующих элементов: последовательность Козак и последовательность сигнального пептида, которые расположены на N-конце фермента, и белковую метку (например, FLAG, His-метку, включая связывающий хитин белок (СВР), связывающий мальтозу белок (МВР) и глутатион-S-трансферазу (GST)). Белковая метка может быть расположена либо на N-конце, либо на С-конце фермента. См., например, Фиг. 2, пункт В.

Дополнительно, вектор экспрессии может содержать, например, некоторые или все из следующих: селектируемый маркерный ген, такой как ген неомицина для отбора стабильных или транзиентных трансфектантов в клетках млекопитающих; энхансерные/промоторные последовательности из предраннего гена CMV человека для высоких уровней транскрипции; сигналы терминации транскрипции и процессинга РНК из SV40 для стабильности мРНК; ориджины репликации полиомы SV40 и ColE1 для правильной эписомальной репликации; универсальные множественные сайты клонирования; и промоторы Т7 и SP6 РНК полимераз для in vitro транскрипции смысловой и антисмысловой РНК. Подходящие векторы и способы получения векторов, содержащих трансгены, хорошо известны в данной области. Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Mannual, 3-е изд., Cold Spring Harbor Laboratory Press.

Если при конструировании описанных здесь клеток-хозяев млекопитающих применяются два или более фермента, например, две или более фукозидазы, две или более эндогликозидазы, или комбинация из фукозидазы и эндогликозидазы, то гены, кодирующие указанные два или более фермента, могут быть инсертированы в отдельные векторы экспрессии или инсертированы в общий вектор экспрессии, предназначенный для получения нескольких белков.

Векторы экспрессии для получения фукозидазы и/или эндогликозидазы могут быть введены в подходящие исходные клетки-хозяева, включая, без ограничения, клетки миеломы мыши (например, NSO клетки), клетки яичника китайского хомячка (СНО), клетки почки эмбриона человека (например, HEK293), и клетки ретинобластомы человека (например, PER.C6). Отбор подходящей линии клеток-хозяев, который находится в рамках области знаний специалистов в данной области, будет зависеть от баланса между потребностью в высокой продуктивности и потребностью в получении продукта, обладающего требуемыми свойствами.

В некоторых случаях могут быть сконструированы векторы экспрессии таким образом, что они могут быть встроены в геном клеток путем гомологичной или негомологичной рекомбинации с помощью способов, известных в данной области. Способы переноса векторов экспрессии в исходные клетки-хозяева включают, без ограничения, опосредуемый вирусами перенос генов, опосредуемый липосомами перенос, трансформацию, трансфекцию и трансдукцию, например, опосредуемый вирусами перенос генов, такой как применение векторов, основанных на ДНК-содержащих вирусах, таких как аденовирус, адено-ассоциированный вирус и вирус герпеса, а также векторы на основе ретровирусов. Примеры видов переноса генов включают, например, депротеинизированную ДНК, осаждение CaPO4, ДЭАЭ-декстран, электропорацию, слияние протопластов, липофекцию, клеточную микроинъекцию, и вирусные векторы, адьювант-ассоциированную ДНК, генную пушку, катетеры. В одном примере применяют вирусный вектор. Для повышения степени доставки невирусных векторов в клетку нуклеиновая кислота или белок могут быть конъюгированы с антителами или с их связывающими фрагментами, которые связывают антигены на поверхности клеток. В рамках описанных здесь способов могут применяться липосомы, которые также включают антитело, направленное против мишени, или его фрагмент.

Термин "вирусный вектор" в соответствии с используемым здесь значением означает вирус или вирусную частицу, полученную с помощью рекомбинантного способа, которая включает полинуклеотид для доставки в клетку-хозяин in vivo, ex vivo, или in vitro. Примеры вирусных векторов включают ретровирусные векторы, такие как лентивирусные векторы, аденовирусные векторы, адено-ассоциированные вирусные векторы и им подобные. В рамках тех аспектов, где перенос генов опосредуется ретровирусным вектором, термин "векторный конструкт" означает полинуклеотид, включающий ретровирусный геном или его часть и терапевтический ген.

Генетически модифицированные клетки-хозяева животного происхождения могут включать применение экспрессионной кассеты, созданной для конститутивной или индуцируемой экспрессии введенного гена (генов). Такая экспрессионная кассета может включать регуляторные элементы, такие как промотор, кодон инициации, кодон терминации и сигнал полиаденилирования. Данные элементы могут быть функционально присоединены к гену, кодирующему представляющий интерес поверхностный белок, так что данный ген будет являться функциональным (например, подвергаться экспрессии) в клетках-хозяевах.

Для экспрессии фукозидазы и/или эндогликозидазы (а также любых экзогенных гликопротеинов, как описано здесь) может применяться множество промоторов. Промоторы, которые могут применяться для экспрессии белка, хорошо известны в данной области, включая, без ограничения, промежуточный ранний промотор цитомегаловируса (ЦМВ), вирусный LTR, такой как LTR вируса саркомы Рауса, LTR ВИЧ, LTR ТЛВЧ-1, ранний промотор вакуолизирующего вируса обезьян (SV40), lacUV5 промотор Е. coli и промотор тимидинкиназы вируса простого герпеса.

Также могут применяться промоторы, способные подвергаться регулированию. Такие способные подвергаться регулированию промоторы включают промоторы, в которых применяется репрессор тетрациклина (tetR) [Gossen, М., and Bujard, Н., Proc.Natl. Acad. Sci. USA 89: 5547-5551 (1992); Yao, F. et al., Human Gene Therapy, 9:1939-1950 (1998); Shockelt, P., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 92: 6522-6526 (1995)]. Другие системы включают FK506 димер, VP16 или р65 с применением астрадиола, RU486, дифенолмурислерона или рапамицина. Индуцируемые системы доступны от компаний Invitrogen, Clontech, и Ariad.

Эффективность некоторых индуцируемых промоторов может быть повышена с течением времени. В таких случаях является возможным увеличить эффективность таких систем путем инсертирования множества репрессоров в виде тандема, например TetR, соединенного с TetR с помощью участка внутренней посадки рибосомы (IRES). Альтернативно, является возможным подождать в течение, по меньшей мере, 3 дней перед проведением скрининга на предмет требуемой функции. В то время как возможно возникновение некоторого сайлесинга, он может быть минимизирован с применением подходящего количества клеток, предпочтительно, по меньшей мере, 1×104, более предпочтительно, по меньшей мере, 1×105, более предпочтительно, по меньшей мере, 1×106, и еще более предпочтительно, по меньшей мере, 1×107. Является возможным увеличить экспрессию требуемых белков с помощью известных способов для повышения эффективности данной системы. Например, с применением постранскрипционного регуляторного элемента вируса гепатита сурка (WPRE). См. Loeb, V.Е., et al., Human Gene Therapy 10: 2295-2305 (1999); Zufferey, R., et al., J. of Virol. 73: 2886-2892 (1999); Donello, J. E., et al., J. of Virol. 72: 5085-5092 (1998).

Примеры сигналов полиаденилирования, которые могут применяться при реализации на практике описанных здесь способов, включают, без ограничения, сигнал полиаденилирования коллагена I человека, сигнал полиаденилирования коллагена II человека, и сигнал полиаденилирования SV40.

Экзогенный генетический материал, который включает ген фукозидазы и/или ген эндогликозидазы (а также ген гликопротеина, как описано здесь), являющийся функционально связанным с регуляторными элементами, может оставаться в клетке в виде функционирующей цитоплазматической молекулы, функционирующей эписомной молекулы или может встраиваться в хромосомную ДНК клетки. Экзогенный генетический материал может быть введен в клетки, где он остается в виде отдельного генетического материала в форме плазмиды. Альтернативно, в клетку может быть введена линейная ДНК, которая может встраиваться в хромосому. При введении ДНК в клетку могут быть добавлены реагенты, которые промотируют встраивание ДНК в хромосомы. Последовательности ДНК, которые могут применяться для промотирования встраивания, также могут быть включены в молекулу ДНК. Альтернативно, в клетку может быть введена РНК.

Для отслеживания поступления требуемого трансгена в описанные здесь клетки- хозяева животного происхождения могут применяться селектируемые маркеры. Данные маркерные гены могут контролироваться любым промотором или индуцируемым промотором. Они известны в данной области и включают гены, которые изменяют чувствительность клетки к стимулу, такому как питательное вещество, антибиотик, и так далее. Данные гены включают гены neo, puro, tk, множественной лекарственной устойчивости (МЛУ), и так далее. Другие гены экспрессируют белки, которые могут быть легко подвергнуты скринингу, например зеленый флуоресцентный белок (ЗФБ), синий флуоресцентный белок (СФБ), люциферазу и LacZ.

D. Получение гликопротеинов с модифицированным гликозилированием

Генетически модифицированные клетки-хозяева животного происхождения могут применяться для получения гликопротеинов (например, эндогенных или экзогенных) с модифицированными паттернами гликозилирования. В некоторых вариантах осуществления исходная клетка-хозяин, предназначенная для применения с целью получения описанных выше модифицированных клеток-хозяев животного происхождения, уже несет ген (гены), кодирующие экзогенный гликопротеин. В других вариантах осуществления ген или множество генов, кодирующих представляющий интерес гликопротеин, могут быть введены в генетически модифицированные клетки- хозяева животного происхождения, которые экспрессируют одну или несколько фукозидаз и/или эндогликозидаз, с помощью способов, которые известны в данной области или описаны здесь.

Генетически модифицированные клетки-хозяева животного происхождения, способные продуцировать представляющий интерес гликопротеин и одну или несколько фукозидаз и/или эндогликозидаз, могут культивироваться при подходящих условиях, обеспечивающих возможность экспрессии данных белков. Данные клетки и/или питательная среда могут быть собраны, при этом представляющий интерес гликопротеин может быть выделен и очищен из клеток и/или питательной среды с помощью стандартного подхода. Паттерн гликозилирования полученного таким образом гликопротеина может быть определен с помощью стандартного подхода, например ЖХ/МС/МС, для подтверждения модификации гликозилирования.

В некоторых примерах представляющий интерес гликопротеин представляет собой антитело. Примеры антител включают, без ограничения, абциксимаб (гликопротеин IIb/IIIa; сердечно-сосудистое заболевание), адалимумаб (TNF-α, различные аутоиммунные заболевания, например ревматоидный артрит), алемтузумаб (CD52; хроническая лимфоцитарная лейкемия), басиликсимаб (рецептор IL-2Rα (CD25); отторжение трансплантатов), бевацизумаб (фактор роста эндотелия сосудов А; различные виды рака, например рак прямой кишки, немелкоклеточный рак легкого, глиобластома, рак почки; влажная форма возрастной макулярной дегенерации), катумаксомаб, цетуксимаб (рецептор EGF, различные виды рака, например рак прямой кишки, рак головы и шеи), цертолизумаб (например, цертолизумаб пегол) (TNF-альфа; болезнь Крона, ревматоидный артрит), Даклизумаб (рецептор IL-2Rα (CD25); отторжение трансплантатов), экулизумаб (комплементный белок С5; ночная пароксизмальная гемоглобинурия), эфализумаб (CD11a; псориаз), гемтузумаб (CD33; острая миелогенная лейкемия (например, с калихеамицином)), ибритумомаб тиуксетан (CD20; неходжкинская лимфома (например, с иттрием-90 или индием-111)), инфликсимаб (TNF-альфа; различные аутоиммунные заболевания, например ревматоидный артрит), Муромонаб-CD3 (Т-клеточный рецептор CD3; отторжение трансплантатов), натализумаб (интегрин альфа-4 (α4); рассеянный склероз, болезнь Крона), омализумаб (IgG; связанная с аллергией астма), паливизумаб (эпитоп F-белка РСВ; респираторно-синцитиальная вирусная инфекция), панитумумаб (рецептор EGF; рак, например рак прямой кишки), ранибизумаб (фактор роста эндотелия сосудов А; влажная форма возрастной макулярной дегенерации), ритуксимаб (CD20; неходжкинская лимфома), тоситумомаб (CD20; неходжкинская лимфома), трастузумаб (ErbB2; рак молочной железы).

В некоторых примерах представляющий интерес гликопротеин представляет собой цитокин. Примеры включают, без ограничения, интерфероны (например, IFN-α, INF-β или INF-γ), интерлейкины (например, IL-2, IL -3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-12) и колониестимулирующие факторы (например G-CSF, GM-CSF, M-CSF). Интерферон может представлять собой, например, интерферон альфа-2а или интерферон альфа-2b. См., например, Mott HR and Campbell ID. "Four-helix bundle growth factors and their receptors: protein-protein interactions." Curr Opin Struct Biol. 1995 Feb; 5(l): 114-21; Chaiken IM, Williams WV. "Identifying structure-function relationships in four-helix bundle cytokines: towards de novo mimetics design." Trends Biotechnol. 1996 Oct;14(10): 369-75; Klaus W, et al., "The three-dimensional high resolution structure of human interferon alpha-2a determined by heteronuclear NMR spectroscopy in solution". J. Mol Biol, 274(4): 661-75, 1997, для дальнейшего обзора некоторых из данных цитокинов.

Представляющий интерес белок также может являться белком в виде цитокина, который обладает структурой, которая аналогична одному или нескольким вышеупомянутым цитокинам. Например, данный цитокин может представлять собой цитокин класса IL-6, такой как фактор ингибирования лейкемии (ФИЛ) или онкостатин М. В некоторых вариантах осуществления данный цитокин представляет собой цитокин, который в природе связывается с рецептором, который включает субъединицу сигнальной трансдукции GP130. Другие представляющие интерес белки со структурой в виде четырехспирального пучка включают гормон роста (GH), пролактин (PRL) и плацентарный лактоген. В некоторых вариантах осуществления белок-мишень представляет собой стимулирующий эритропоэз агент, например (ЕРО), который также представляет собой цитокин со структурой в виде четырехспирального пучка. В некоторых вариантах осуществления стимулирующий эритропоэз агент представляет собой вариант ЕРО, например дарбэпоэтин альфа, также называемый новым стимулирующим эритропоэз белком (NESP), который подвергается модификации для включения пяти N-связанных углеводных цепей (на две больше, чем в рекомбинантном HuEPO). В некоторых вариантах осуществления данный белок включает пять спиралей. Например, данный белок может представлять собой интерферон бета, например интерферон бета-1а или интерферон бета-1b, который (как будет очевидно) зачастую классифицируется как цитокин со структурой в виде четырехспирального пучка. В некоторых вариантах осуществления белок-мишень представляет собой IL-9, IL-10, IL-11, IL-13 или IL-15. См., например, Hunter, СА, Nature Reviews Immunology 5, 521-531, 2005 для обзора некоторых цитокинов. Также см. Paul, WE (ed.), Fundamental Immunology, Lippincott Williams & Wilkins; 6-е изд., 2008.

Кроме того, представляющий интерес белок может являться белком, который одобрен Управлением по санитарному надзору за качеством пищевых продуктов и медикаментов США (US Food & Drug Administration) (или эквивалентным регуляторным органом, таким как Европейское агентство лекарственных средств) для применения при лечении заболевания или расстройства у людей. Такие белки могут являться или не являться теми белками, для которых в рамках клинических испытаний была протестирована ПЭГилированная версия и/или которые были одобрены для коммерческой реализации. В некоторых случаях представляющий интерес белок является Fc-слитым белком, включая, без ограничения, абатацепт, этанерцепт, IL-2-Рс-слитый белок, CD80-Fc- слитый белок и PDLl-Fc-слитый белок.

Также данный представляющий интерес белок может являться нейротрофическим фактором, то есть фактором, который промотирует выживаемость, развитие и/или функционирование клеток нейтральной линии (данный термин в соответствии с используемым здесь значением включает нейтральные клетки-предшественники, нейроны и глиальные клетки, например астроциты, олигодендроциты, микроглию). Например, в некоторых вариантах осуществления белок-мишень представляет собой фактор, который промотирует чрезмерный рост нейритов. В некоторых вариантах осуществления данный белок представляет собой мерцательный нейротрофический фактор (МНТФ; белок со структурой в виде четырехспирального пучка) или его аналог, такой как аксокин, который представляет собой модифицированную версию мерцательного нейротрофического фактора человека с усечением С-конца в размере 15 аминокислот и двумя аминокислотными замещениями, который является в 3-5 раз более эффективным, чем МНТФ в рамках in vitro и in vivo анализов и имеет свойства в виде повышенной стабильности.

Альтернативно, представляющий интерес белок может представлять собой фермент, например фермент, который является важным в плане метаболизма или других физиологических процессов. Как известно в данной области, недостаток ферментов или других белков может вести к возникновению различных заболеваний. Такие заболевания включают заболевания, связанные с нарушениями в углеводном метаболизме, аминокислотном метаболизме, метаболизме органических кислот, метаболизме порфирина, метаболизме пурина или пиримидина, лизосомные болезни накопления, болезни, связанные со свертываемостью крови, и так далее. Примеры включают болезнь Фабри, болезнь Гоше, болезнь Помпе, недостаток аденозиндезаминазы, недостаток аспарагиназы, порфирию, гемофилию и наследственный ангионевротический отек. В некоторых вариантах осуществления белок представляет собой фактор свертывания или коагуляции (например, фактор VII, VIIa, VIII или IX). В других вариантах осуществления белок представляет собой фермент, которые играет роль в плане углеводного метаболизма, аминокислотного метаболизма, метаболизма органических кислот, метаболизма порфирина, метаболизма пурина или пиримидина, и/или накопления лизосом, при этом экзогенное введение данного фермента, по меньшей мере, частично облегчает тяжесть заболевания.

Также, представляющий интерес белок может являться гормоном, таким как инсулин, гормон роста, лютеинизирующий гормон, фолликулостимулирующий гормон и тиреостимулирующий гормон. Представляющий интерес белок также может являться фактором роста, включая, без ограничения, адреномедуллин (AM), ангиопоэтин (Ang), аутокринный фактор подвижности, костные морфогенетические белки (BMP), нейротрофический фактор головного мозга (BDNF), эпидермальный фактор роста (EGF), эритропоэтин (ЕРО), фактор роста фибробластов (FGF), нейротрофический фактор линии глиальных клеток (GDNF), гранулоцитарный колониестимулирующий фактор (G-CSF), гранулоцитарно-макрофагальный колониестимулирующий фактор (GM-CSF), фактор дифференциации роста-9 (GDF9), лечебный фактор, фактор роста гепатоцитов (HGF), фактор роста гепатомы (HDGF), инсулиноподобный фактор роста (IGF), фактор роста кератиноцитов (KGF), миграционно-стимулирующий фактор (MSF), миостатин (GDF-8), фактор роста нервов (NGF) и другие нейротрофины, тромбоцитарный фактор роста (PDGF), тромбопоэтин (ТРО), трансформирующий фактор роста альфа (TGF-α), трансформирующий фактор роста бета (TGF-β), фактор некроза опухоли-альфа (TNF-α), фактор роста эндотелия сосудов (VEGF), и плацентарный фактор роста (PGF).

Без дальнейшего уточнения считается, что специалист в данной области может применять настоящее изобретение в его наиболее полном виде на основе вышеприведенного описания. Нижеследующие конкретные варианты осуществления, таким образом, следует понимать в качестве исключительно иллюстративных и не ограничивающих остальную часть описания каким-либо образом. Все упомянутые здесь публикации приведены в качестве ссылки для указанных здесь целей или предметов обсуждения.

ПРИМЕРЫ

СПОСОБЫ

i. Конструирование векторов экспрессии для получения фукозидазы или эндогл икозидазы.

В целях конструирования векторов экспрессии для фукозидазы или эндогликозидазы, ген фукозидазы или эндогликозидазы был выделен с помощью стандартного подхода и подвергнут оптимизации кодонов на основе применения клеток хомяка. Синтетические гены были подготовлены GeneArt Corp. и подвергались клонированию в pcDNA3.1 В(-) Myc-His вектор (Invitrogen, US) в сайтах рестрикции Bgl II/EcoR I. (Фиг. 2, пункт А). Экспрессионная кассета альфа-фукозидазы включает, от 5' до 3', последовательность Козак, Igk лидерную последовательность, кодирующую последовательность фукозидазы и последовательность, кодирующую His-метку. Фиг. 2, пункт В. Экспрессионная кассета эндогликозидазы включает, от 5' до 3', последовательность Козак, Igk лидерную последовательность, кодирующую последовательность эндогликозидазы и последовательность, кодирующую Flag-метку. Фиг. 2, пункт В.

ii. Получение дефукозилированного антител

Клеточную линию, продуцирующую антитела, культивировали в количестве 0,3~3,0 × 106 живых клеток/мл в полной среде, среде CD FortiCHO™ с добавлением 8 мМ L-глутамина и антислеживающего агента при разведении 1:100 (Life Technologies, USA). Клетки культивировали с применением встряхивающей платформы при 130-150 об/мин в инкубаторе с 8% СО2.

Для получения дефукозилированных антител указанные выше продуцирующие антитела клетки трансфицировали вектором экспрессии, кодирующим описанную выше альфа-фукозидазу с помощью реагента FreeStyleMAX (Life Technologies, USA) в соответствии с протоколом производителя. Трансфицированные клетки культивировали в питательной среде, включающей 4 г/л глюкозы, при этом среду меняли через день. Клетки собирали, когда жизнеспособность клеток снижалась ниже 70%. Очищенный культуральный супернатант собирали очищали с помощью хроматографии с применением белка А.

iii. Анализ гликозилирования антител

Рекомбинантные антитела, полученные в соответствии с описанными здесь способами, восстанавливали, алкилировали и расщепляли в течение ночи трипсином в присутствии буфера на основе 25 мМ бикарбоната аммония (рН~8) при 37°C. Раствор PNGазы F (3 мкл, Roche) добавляли в 200 мкл расщепленного образца и культивировали смесь в течение дополнительных 16 часов при 37°С. Высвобожденные гликаны отщепляли от пептидов с применением картриджа Sep-Pak® С18 (Waters). Sep-Pak С18 промывали ацетонитрилом и далее водой. Расщепленный ПНГазой F образец наносили на картридж и элюировали гликаны 1% этанолом, в то время как оставшиеся пептиды связывались с Sep-Pak С18. Высвобожденные белковые олигосахариды были сначала очищены с применением колонки на основе пористого графитоподобного адсорбента (PhyNexus) и затем перметилированы. Все эксперименты на основе масс-спектрометрии проводили с применением масс-спектрометра Orbitrap Fusion Tribrid путем прямой инфузии в источник наноэлектроспрея.

РЕЗУЛЬТАТЫ

1. Получение антител h4B12, ретуксимаба и омализумаба с моносахаридной (GlcNAc) гликоформой

Моносахаридный гликовариант может быть получен из вышеупомянутого дисахаридного варианта с помощью реакции расщепления фукозидазы. Поиск среди ряда доступных ферментов и гликоль-пептидный анализ с применением ЖХ/МС/МС показал, что при наличии оптимизированных условий реакции расщепления эффективное дефукозилирование может быть достигнуто с применением α-1,6-фукозидазы и что более высокая эффективность расщепления связана с более низким соотношением NF/N. Альтернативно, моносахаридный гликовариант может быть получен с двумя реакционными ферментами, объединенными в виде последовательности, включая эндогликозидазу (Эндо S) и α-1,6-фукозидазу. Полученный моно-GlcNAc гликовариант показан на Фиг. 3, пункт А.

Результаты показывают, что Эндо S обеспечил удаление >90% N-связанных гликанов тяжелой цепи h4B12, ритуксимаба и омализумаба, полученных в описанных здесь модифицированных СНО клетках. Способность пяти различных типов фукозидаз обеспечивать дефукозилирование: FUCA1, FUCA2, фукозидаза Cricetulus griseus, альфа-L-1 α1,6-фукозидаза Chryseobacterium meningosepticum и BF3242 - 5,8%, 9,1%, 17,7%, 11,5 и 68%, соответственно, относительно h4B12 антител, продуцируемых в СНО клетках, экспрессирующих каждую из данных фукозидаз. Фиг. 3, пункт В. Экспрессию ферментов детектировали с помощью Вестерн-блота, как показано на Фиг. 3, пункт С.

2-деокси-2-фтор-L-фукоза представляет собой фторированный аналог фукозы. Она может усваиваться внутри клеток-хозяев для получения основанного на субстрате ингибитора фукозилтрансфераз. При культивировании продуцирующих антитела СНО клеток, транзиентно экспрессирующих фукозидазу BF3242 и Эндо S, 99,89% N-гликанов, присоединенных к антителу, продуцируемому в СНО клетках, являются моногликозилированными (GlcNAc-Ig-Fc). Фиг. 3, пункт D.

CHO-35D6 клетки, которые продуцируют ритуксимаб, были стабильно трансфицированы вектором экспрессии для продуцирования BF3242 и Эндо S. Клетки культивировали в присутствии 100-400 мкг/мл G418. Полученное таким образом антитело содержит 17-19% GlcNAc-Ig-Fc. Фиг. 4, пункт А.

Экспрессию ферментов детектировали с помощью Вестерн-блота, как показано на Фиг. 4, пункт В.

Аналогичные результаты наблюдались в случае омализумаба, продуцируемого в СНО клетках, модифицированных для экспрессии как фукозидазы, так и Эндо S.

Подобная эффективность отражает важный этап в плане трансгликозилирования при получении антител с гомогенной гликанной формой.

ДРУГИЕ ВАРИАНТЫ ОСУЩЕСТВЛЕНИЯ

Все раскрытые в данном описании признаки могут быть объединены в форме любой комбинации. Каждый раскрытый в данном описании признак может быть замещен любым альтернативным признаком, служащим той же, эквивалентной или аналогичной цели. Таким образом, если явно не указано иное, каждый раскрытый признак представляет собой лишь пример общей серии эквивалентных или аналогичных признаков.

На основе вышеприведенного описания специалист в данной области может легко определить основные характеристики настоящего изобретения и может осуществить различные изменения и модификации изобретения для адаптации к различным вариантам применения и условиям без выхода за его рамки и объем. Таким образом, другие варианты осуществления также входят в объем формулы изобретения.

1. Генетически модифицированная клетка-хозяин млекопитающего, которая содержит первую нуклеиновую кислоту, кодирующую экзогенную фукозидазу, и вторую нуклеиновую кислоту, кодирующую эндогликозидазу, при этом модифицированная клетка-хозяин млекопитающего продуцирует гликопротеины с модифицированным гликозилированием по сравнению с гликопротеинами, продуцируемыми аналогичной клеткой-хозяином млекопитающего дикого типа, где клетка млекопитающего представляет собой клетку яичника китайского хомячка (СНО), клетку миеломы крысы, клетку почки детеныша хомяка (BHK), гибридомную клетку или клетку Namalwa, и где эндогликозидаза представляет собой Эндо S фермент, эндогликозидазу F2 или эндогликозидазу F3.

2. Генетически модифицированная клетка-хозяин млекопитающего по п. 1, отличающаяся тем, что фукозидаза представляет собой фукозидазу млекопитающего или бактериальную фукозидазу.

3. Генетически модифицированная клетка-хозяин млекопитающего по п. 1 или 2, отличающаяся тем, что эндогликозидаза представляет собой фермент Эндо S.

4. Генетически модифицированная клетка-хозяин млекопитающего по любому из пп. 1-3, которая дополнительно содержит третью нуклеиновую кислоту, кодирующую гликопротеин.

5. Генетически модифицированная клетка-хозяин млекопитающего по п. 4, отличающаяся тем, что гликопротеин является экзогенным.

6. Генетически модифицированная клетка-хозяин млекопитающего по п. 4, отличающаяся тем, что гликопротеин представляет собой антитело, Fc-слитый белок, цитокин, гормон, фактор роста или фермент.

7. Генетически модифицированная клетка-хозяин млекопитающего по п. 6, отличающаяся тем, что гликопротеин представляет собой антитело.

8. Генетически модифицированная клетка-хозяин млекопитающего по любому из пп. 1-3 и 5-7, отличающаяся тем, что клетка млекопитающего представляет собой клетку яичника китайского хомячка.

9. Генетически модифицированная клетка-хозяин млекопитающего по любому из пп. 1-3, 5-7 и 9, где первая нуклеиновая кислота кодирует (i) FUCA1 человека, FUCA2 человека, фукозидазу Cricetulus griseus, альфа-L-1 α1,6-фукозидазу Chryseobacterium meningosepticum или бактериальную фукозидазу BF3242, и (ii) вторая нуклеиновая кислота кодирует Эндо S.

10. Способ получения дефукозилированного гликопротеина, включающий:

получение генетически модифицированной клетки-хозяина млекопитающего, которая содержит (а) первую нуклеиновую кислоту, кодирующую гликопротеин; (b) вторую нуклеиновую кислоту, кодирующую экзогенную фукозидазу, и (с) третью нуклеиновую кислоту, кодирующую эндогликозидазу;

культивирование клетки-хозяина млекопитающего при условиях, обеспечивающих возможность получения гликопротеина и как фукозидазы, так и эндогликозидазы; и

сбор клетки-хозяина млекопитающего или культурального супернатанта для выделения гликопротеина,

где клетка млекопитающего представляет собой клетку яичника китайского хомячка (СНО), клетку миеломы крысы, клетку почки детеныша хомяка (BHK), гибридомную клетку или клетку Namalwa, и где эндогликозидаза представляет собой Эндо S фермент, эндогликозидазу F2 или эндогликозидазу F3.

11. Способ по п. 10, отличающийся тем, что фукозидаза представляет собой фукозидазу млекопитающего или бактериальную фукозидазу.

12. Способ по п. 10 или 11, отличающийся тем, что эндогликозидаза представляет собой фермент Эндо S.

13. Способ по любому из пп. 10 и 11, отличающийся тем, что гликопротеин является экзогенным.

14. Способ по п. 13, отличающийся тем, что гликопротеин представляет собой антитело, Fc-слитый белок, цитокин, гормон, фактор роста или фермент.

15. Способ по п. 14, отличающийся тем, что гликопротеин представляет собой антитело.

16. Способ по любому из пп. 10, 11 и 14, 15, отличающийся тем, что генетически модифицированная клетка-хозяин млекопитающего представляет собой клетку яичника китайского хомячка (СНО).

17. Способ по любому из пп. 10, 11 и 14, 15, дополнительно включающий выделение гликопротеина.

18. Способ по любому из пп. 10, 11 и 14, 15, дополнительно включающий анализ паттерна гликозилирования гликопротеина.

19. Способ получения генетически модифицированной клетки-хозяина млекопитающего по п. 1, включающий введение в клетку млекопитающего одного или нескольких векторов экспрессии, которые совместно кодируют экзогенную фукозидазу и эндогликозидазу, где клетка млекопитающего представляет собой клетку яичника китайского хомячка (СНО), клетку миеломы крысы, клетку почки детеныша хомяка (BHK), гибридомную клетку или клетку Namalwa, и где эндогликозидаза представляет собой Эндо S фермент, эндогликозидазу F2 или эндогликозидазу F3.

20. Способ по п. 19, дополнительно включающий введение в клетку млекопитающего вектора экспрессии, кодирующего гликопротеин.



 

Похожие патенты:

Изобретение относится к области биохимии, в частности к способу лечения рака, экспрессирующего мутантную EZH2. Изобретение позволяет эффективно лечить рак, ассоциированный с экспрессией мутантной EZH2.

Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано для получения глутаматоксалоацетаттрансаминазы человека. Предложен рекомбинантный штамм бактерий Escherichia coli rhGOT1-His ВКПМ № В-12963, продуцирующий глутаматоксалоацетаттрансаминазу человека с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:2, полученный трансформацией штамма BL21(DE3)Rosetta2pLysS плазмидой рЕТ22b, содержащей клонированную последовательностью GOT1 с десятью C-концевыми гистидинами.
Изобретение относится к производству фармацевтических субстанций ферментов, а именно к способу получения гиалуронидазы из животного сырья - семенников крупного рогатого скота (КРС).

Группа изобретений относится к области биотехнологии. Предложена аланиндегидрогеназа, отличающаяся тем, что указанный фермент имеет последовательность, которая по меньшей мере на 85% идентична последовательности под SEQ ID NO: 72.

Изобретение относится к микробиологии и биотехнологии. Предложен рекомбинантный штамм дрожжей Pichia pastoris ВКПМ Y-4394, продуцирующий ксиланазу.

Изобретение относится к микробиологии и биотехнологии. Предложен рекомбинантный дрожжей Komagataella kurtzmanii ВКПМ Y-4464, продуцирующий β-глюканазу.

Изобретение относится к микробиологии и биотехнологии. Предложен рекомбинантный штамм дрожжей Pichia pastoris ВКПМ Y-4463, продуцирующий β-глюканазу.

Изобретение относится к молекулярной биологии, биотехнологии, генной инженерии и медицине и может быть использовано для купирования проявлений состояний человеческого организма, связанных с уменьшением экспрессии гена Р4НА2 и/или уменьшением количества белка пролил 4-гидрокислаза альфа 2.

Настоящее изобретение относится к области биотехнологии, конкретно к новым пептидам, ингибирующим НАДФН-оксидазу 1 (Nox1), и может быть использовано в медицине для профилактики или лечения патологических состояний и заболеваний, связанных с повышенной продукцией Nox1 активных форм кислорода (ROS), в том числе рака, атеросклероза, ангиогенеза и преждевременного старения.

Изобретение относится к области биотехнологии, конкретно к вакцине против пропротеиновой конвертазы субтилизин-кексинового типа 9 (PCSK9), и может быть использовано в медицине для лечения или предотвращения заболеваний, связанных с PCSK9, выбранных из гиперлипидемии, гиперхолестеринемии, атеросклероза или неопластических болезней.
Изобретение относится к производству фармацевтических субстанций ферментов, а именно к способу получения гиалуронидазы из животного сырья - семенников крупного рогатого скота (КРС).

Изобретение относится к микробиологии и биотехнологии. Предложен рекомбинантный штамм дрожжей Pichia pastoris ВКПМ Y-4394, продуцирующий ксиланазу.

Изобретение относится к микробиологии и биотехнологии. Предложен рекомбинантный дрожжей Komagataella kurtzmanii ВКПМ Y-4464, продуцирующий β-глюканазу.

Изобретение относится к микробиологии и биотехнологии. Предложен рекомбинантный штамм дрожжей Pichia pastoris ВКПМ Y-4463, продуцирующий β-глюканазу.

Изобретение относится к области биотехнологии и решает задачу получения в промышленных объемах высокоочищенной ферментативно активной рекомбинантной β-1,4-галактозидазы BgaA, пригодной для использования на стадии ремоделирования для получения терапевтически функциональных препаратов гликопротеинов с заданными свойствами, для разработки инструментов для высокочувствительного анализа гликановых цепей гликопротеинов тканей растений, животных и микроорганизмов.

Изобретение относится к области биотехнологии. Предложены штамм Trichoderma reesei ВКМ F-4789D, способ получения кормового комплексного ферментного препарата и способ повышения кормовой ценности зерновых и зернобобовых смесей.

Изобретение относится к области биотехнологии. Предложены штамм Trichoderma reesei ВКМ F-4789D, способ получения кормового комплексного ферментного препарата и способ повышения кормовой ценности зерновых и зернобобовых смесей.

Группа изобретений относится к области биотехнологии. Предложен рекомбинантный штамм мицелиального гриба Penicillium verruculosum EЕ-105, депонированный во Всероссийской коллекции микроорганизмов под номером ВКМ F-4812D, продуцент эндо1,4-β-глюканазы II Penicillium verruculosum и эндо1,4-β-глюканазы I Trichoderma reesei.

Изобретение относится к технологиям производства и использования сорбентов, применяемых в том числе для медицинских целей, а именно для экстракорпоральной терапии больных с сепсисом с использованием сорбции биологических жидкостей.

Изобретение относится к технологиям использования сорбентов, применяемых в том числе для медицинских целей, а именно для экстракорпоральной терапии больных с сепсисом с использованием сорбции биологических жидкостей.

Изобретение относится к области биотехнологии. Заявлен штамм гибридных культивируемых клеток животных Mus musculus 1F11PAL – продуцент мышиных моноклональных антител, специфичных к пептидогликан-ассоциированному липопротеину (PAL) Legionella pneumophila.

Изобретение относится к области биохимии, в частности к генетически модифицированной клетке-хозяину млекопитающего, которая содержит первую нуклеиновую кислоту, кодирующую экзогенную фукозидазу, и вторую нуклеиновую кислоту, кодирующую эндогликозидазу, а также способ ее получения. При этом модифицированная клетка-хозяин млекопитающего продуцирует гликопротеины с модифицированным гликозилированием. Также раскрыт способ получения дефукозилированного гликопротеина, предусматривающий использование вышеуказанной клетки. Изобретение позволяет эффективно получать дефукозилированный гликопротеин. 3 н. и 17 з.п. ф-лы, 4 ил.

Наверх