Дифференциально-элективная питательная среда для выделения клебсиелл

Изобретение относится к клинической и санитарной микробиологии. Питательная среда для выделения клебсиелл содержит панкреатический гидролизат рыбной муки, пептон мясной, дрожжевой экстракт, мезо-инозит, натрий хлористый, соли желчных кислот, кристаллический фиолетовый, нейтральный красный, натрий углекислый, карбенициллин, агар микробиологический и дистиллированную воду при заданном соотношении компонентов. Изобретение позволяет сократить сроки дифференциации клебсиелл. 3 табл., 5 пр.

 

Изобретение относится к клинической и санитарной микробиологии и может быть использовано для обнаружения и количественного учета бактерий рода Klebsiellа при исследовании различного биологического материала, а также объектов окружающей среды при подозрении на клебсиеллез.

Представители рода Klebsiellа достаточно широко распространены в природе и могут вызывать инфекционные заболевания, характеризующиеся тяжелым течением, а нередко и летальным исходом.

Алгоритм бактериологического исследования клебсиеллезов соответствует той же схеме, что и при заболеваниях, вызванных другими видами энтеробактерий. Посев материала производят в МПБ, на МПА и на селективные дифференциально-диагностические питательные среды - Эндо, Плоски-рева, Левина, МакКонки, К-2 (МПА с мочевиной, раффинозой и бромтимо-ловым синим). Однако отличить лактозоположительныеклебсиеллы на этих средах от других бактерий группы кишечной палочки (БГКП) весьма затруднительно.

Известны питательные среды для выделения клебсиелл, принцип действия которых основан на утилизации преимущественно клебсиеллами инозита или рамнозы с одновременным добавлением антибиотиков или других ингибиторов сопутствующей микрофлоры (желчные соли, кристаллический фиолетовый и др.).Среды для выделения клебсиелл по признаку расщепления инозита поддерживают рост не только K. pneumoniae, но и Serratiaspp. Дифференциация клебсиелл от серраций по морфологии колоний на этих средах весьма затруднительна.

Использование большинства питательных сред в бактериологической практике диагностики клебсиеллезовмалоинформативно ввиду слабой дифференциации клебсиелл от энтеробактерий (по цвету и морфологии) и слабой селективности, так как не обеспечивается значительное подавление роста всех сопутствующих БГКП.

Выделение на питательной среде чистых культур микроорганизмов с характерными для клебсиеллкультуральными, морфологическими и тинкто-риальными свойствами требует постановки целого ряда подтверждающих тестов, а, следовательно, значительного времени и материальных затрат.

Быстрота получения результатов при микробиологических исследованиях в значительной степени влияет на диагностику, проведение терапевтических и противоэпидемических мероприятий.

В отечественной практике для выделения клебсиелл рекомендована дифференциально-элективная среда К-2 (с мочевиной, раффинозой и бром-тимоловым синим)лабораторного приготовления, кроме того выпускается коммерческий набор питательной среды "Клебсиелла 5-АСК 20"предназначенный для одноэтапного выделения и одновременной идентификации бактерий рода Klebsiella (виды К. pneumoniae, К. oxytoca, К. mobilis). Метод основан на выявлении 5-аминосалицилатдекарбоксилазы -уникального фермента бактерий рода Klebsiella. Этот фермент расщепляет 5-аминосалициловую кислоту (5-АСК) с образованием пара-аминофенола, который под действием кислорода воздуха образует полимер черно-коричневого цвета. В результате хромогенной реакции вокруг колоний патогенных клебсиелл образуется широкая зона черно-коричневой окраски среды, непатогенные виды клебсиелл не дают хромогенную реакцию.

Наиболее близким прототипом предлагаемой питательной среды является АгарМакКонки (модифицированный) по ААЗ MacConkeyAgar, Modified (asperAPHA) фирмы HIMEDIAHa основе пептона,протеазного пептона, и инозита. Селективность среды обусловлена наличием желчных солей, кристаллического фиолетового и карбенициллина, а дифференцирующие свойства наличием индикатора - нейтрального красного.

Пептоны являются белковой основой среды и источниками азотистых питательных веществ для роста микроорганизмов, мезоинозит в присутствии индикатора нейтрального красного - дифференцирующим агентом, а кристаллический фиолетовый, желчные соли и карбенициллин ингибируют рост сопутствующих бактерий.

Среда стерилизуется кипячением до полного расплавления агара. Затем, после охлаждения до температуры 50°С, добавляют 50,0 мг/лкарбенициллина и тщательно перемешивают.

Биохимические характеристики коммерческой сухой питательной среды MacConkeyAgar, Мо(Modified представлен в таблице 2.

По результатам определения аминного азота (Nам) методом формольного титрования в соответствии с МУК 4.2.2316-08 «Методы контроля бактериологических питательных сред» экспериментально установлено, что содержание в среде составляет 0,8%. Исходя из данных о содержании Nам пептонах производства HIMEDIA, используемых в качестве белковой основы составляющих по 3,5% соответственно, расчетный Nам среды должен быть порядка 1,5%.

Недостатками MacConkeyAgar, Modified фирмы НIМЕDIA являются:

высокая стоимость;

несоответствие расчетного содержания Nамистинному в готовой среде;

низкая чувствительность при элективном росте некоторых представителей рода Klebsiella;

слабые дифференцирующие свойства среды клебсиелл от эшерихий (в случае большой посевной дозы);

Техническим результатом предлагаемого изобретения является создание отечественной сухой дифференциально-элективной питательной среды для выделения клебсиелл, обладающей стабильностью результатов по ростовым, дифференцирующим и ингибирующим свойствам с целью обеспечения доступности и получения объективных результатов бактериологического контроля в возможно более короткие сроки.

Технический результат достигается тем, что предложена питательная среда, содержащая в качестве источника азотистого питания пептон мясной, натрий хлористый, мезо-инозит, соли желчных кислот (СЖК), кристаллический фиолетовый, нейтральный красный и агар микробиологический, причем в качестве белковой основы она дополнительно содержит панкреатический гидролизат рыбной муки, дрожжевой экстракт - источник витаминов и натрий углекислый в качестве стабилизатора рН среды при следующем содержании компонентов г/л:

Панкреатический гидролизат рыбной муки 9,0-11,0
Пептон мясной 9,0-11,0
Дрожжевой экстракт 0,8-1,2
Мезо-инозит 9,0-11,0
Натрий хлористый 4,0-6,0
Соли желчных кислот (СЖК) 1,3-1,7
Кристаллический фиолетовый 0,0008-0,0012
Нейтральный красный 0,04-0,06
Натрий углекислый 0,1-0,3
Агар бактериологический 8,0-14,0

Состав СД, г/л:

Карбенициллин 0,02

Отличием предлагаемой среды от прототипа является использование сырья отечественного производства - панкреатического гидролизата рыбной муки в качестве белковой основы и отечественных сухих солей желчных кислот (СЖК), полученных из нативной желчи крупного рогатого скота. СЖК получают путем адсорбции примесей активированным углем, с последующей фильтрацией. Затем проводят щелочной гидролиз осветленной желчи 50%-ным раствором натрия гидроокиси с последующим освобождением от непрогидролизованных белков и высокомолекулярных пептидов методом фильтрации, обработку гидролизата 20%-ным хлористым барием, и отстаивание осажденных примесей с последующей фильтрацией. Осаждение желчных кислот в изоэлектрической точке с рН 6,4-6,6 растворение осадка после удаления надосадочной жидкости раствором натрия гидроокиси при рН 7,2-7,4. Заключительный этап подготовки состоит из адсорбции в растворе СЖК примесей активированным углем, фильтрации и высушивания на сушильной установке в виброкипящем слое А1-ФМУ.

Технический результат достигается также сбалансированностью компонентного состава среды в экспериментально установленных концентрациях с использованием СЖК, полученных из отечественного сырья по разработанной промышленной технологии.

Доказана возможность использования панкреатического гидролизата рыбной муки (ПГРМ), в качестве белковой питательной основы в комбинации с пептоном для селективного роста клебсиелл.

Панкреатический гидролизат рыбной муки и пептон мясной обеспечивают ростовые потребности клебсиелл в азотистом питании. СЖК, кристаллический фиолетовый и карбенициллин обеспечивают ингибирующие свойства в отношении нежелательной сопутствующей бактериальной флоры, а мезо-инозит в присутствии нейтрального красного - дифференциацию клебсиелл.

Количественное соотношение компонентов питательной среды, рН, обеспечивают сохранение хороших ростовых и дифференцирующих свойств, ингибирующий эффект в отношении сопутствующей микрофлоры. Готовая среда сохраняет стерильность не менее 10 суток

Пример 1. Способ получения питательной среды предусматривает смешивание сухих компонентов. Для приготовления среды берут навески следующих ингредиентов, г/л:

Панкреатический гидролизат рыбной муки 9,0
Пептон мясной 9,0
Дрожжевой экстракт 0,8
Мезо-инозит 9,0
Натрий хлористый 4,0
Соли желчных кислот (СЖК) 1,3
Кристаллический фиолетовый 0,0008
Нейтральный красный 0,04
Натрий углекислый 0,1
Агар бактериологический 8,0

Состав СД, г/л:

Карбенициллин 0,02

Навески размешивают в 1 л дистиллированной воды, стерилизуют кипячением в течение не более 2 мин. до полного расплавления агара. В стерильную, охлажденную до температуры 50-55°С питательную среду для выделения клебсиелл вносят содержимое флакона с селективной добавкой, растворенного в 5 мл дистиллированной воды, из расчета 5 мл на 1 л среды.

Используемые для контроля среды тест-штаммы микроорганизмов получены из Государственной коллекции патогенных микроорганизмов и клеточных культур «ГКПМ-Оболенск» ФБУН ГНЦ ПМБ.

Готовили стандартную взвесь культуры каждого тест-штамма, соответствующую 10 единицам по стандартному образцу мутностиОСО 42-28-85 П, с использованием стерильного 0,9% раствора натрия хлористого. Полученные взвеси культур десятикратными разведениями (4,5 мл 0,9% раствора натрия хлорида с 0,5 мл микробной взвеси) доводили до необходимых разведений: 10-6,10-4 и 10-1 использовали для контроля среды.

Посевы инкубировали при температуре (37±1)°С в течение 20-24 ч.

Предлагаемая среда, обеспечивает рост следующих тест-штаммов при посеве по 0,1 мл микробной взвеси из разведения 10-6 Klebsiellapneumoniae 3534/51, Klebsiellapneumoniae 418, Klebsiellaoxytoca, ингибициюпри посеве по 0,1 мл микробной взвеси каждого из тест-штаммов: EscherichiacoliATCC 25922 и StaphylococcusaureusATCC 6538 Риз разведения 10-4 через 48 часов инкубации посевов при температуре (37±1)°С и дифференциацию при посеве 0,1 мл микробной смеси тест-штамшов Klebsiellapneumoniae 3534/51 изразведения 10-6 с EscherichiacoliATCC 25922 изразведения 10-1.

Результаты биологического контроля представлены в табл. 3.

Пример 2. Среду готовят в соответствии с примером 1.

Панкреатический гидролизат рыбной муки 10,0
Пептон мясной 10,0
Дрожжевой экстракт 1,0
Мезо-инозит 10,0
Натрий хлористый 5,0
Соли желчных кислот (СЖК) 1,5
Кристаллический фиолетовый 0,001
Нейтральный красный 0,05
Натрий углекислый 0,2
Агар бактериологический 11,0

Состав СД, г/л:

Карбенициллин 0,02

Результаты биологического контроля представлены в таблице 3 и аналогичны результатам проверки по примеру 1.

Пример 3. Среду готовят в соответствии с примером 1.

Панкреатический гидролизат рыбной муки 11,0
Пептон мясной 11,0
Дрожжевой экстракт 1,2
Мезо-инозит 11,0
Натрий хлористый 6,0
Соли желчных кислот (СЖК) 1,7
Кристаллический фиолетовый 0,0012
Нейтральный красный 0,06
Натрий углекислый 0,3
Агар бактериологический 14,0

Состав СД, г/л:

Карбенициллин 0,02

Результаты биологического контроля представлены в таблице 3 и аналогичны результатам проверки по примеру 1.

Пример 4. Среду готовят в соответствии с примером 1.

Панкреатический гидролизат рыбной муки 8,0
Пептон мясной 8,0
Дрожжевой экстракт 0,6
Мезо-инозит 8,0
Натрий хлористый 3,0
Соли желчных кислот (СЖК) 1,1
Кристаллический фиолетовый 0,0006
Нейтральный красный 0,03
Натрий углекислый -
Агар бактериологический 5,0

Состав СД, г/л:

Карбенициллин 0,02

Нарушение количественного соотношения ингредиентов среды ведет к ухудшению ростовых свойств в отношении клебсиелл и ингибирующих свойств к микробам ассоциантам.

Результаты биологического контроля представлены в таблице 3.

Пример 5. Среду готовят в соответствии с примером 1.

Панкреатический гидролизат рыбной муки 12,0
Пептон мясной 12,0
Дрожжевой экстракт 1,4
Мезо-инозит 12,0
Натрий хлористый 7,0
Соли желчных кислот (СЖК) 1,9
Кристаллический фиолетовый 0,0014
Нейтральный красный 0,07
Натрий углекислый 0,4
Агар бактериологический 17,0

Состав СД, г/л:

Карбенициллин 0,02

Результаты биологического контроля представлены в таблице 3 и показывают ухудшение ростовых дифференциально-элективной среды для выделения клебсиелл.

Из таблиц видно, что предлагаемая питательная среда в соответствии с примерами 1, 2, 3 обладает высокой чувствительностью, стабильностью ростовых свойств в отношении клебсиелл, подавляет рост сопутствующих микроорганизмов и обеспечивает четкую дифференциацию клебсиелл от эшерихий.

Изменение количественного соотношения компонентов среды ведет к нарушению биологических показателей качества предлагаемой дифференциально-элективной среды для выделения клебсиелл Так, в случае приготовления среды в соответствии с примером 4 наблюдается снижение чувствительности и изменение диаметра колоний контрольных тест-штаммов клебсиелл, а в случае приготовления среды в соответствии с примером 5 - изменение диаметра колоний и морфологии контрольных тест-штаммов клебсиелл.

Таким образом, по сравнению со средой прототипом предлагаемая питательная среда является сухой отечественной, конкурентоспособной средой для селективного выделения клебсиелл, обладает большей чувствительностью в отношении клебсиелл, обеспечивает четкую дифференциацию клебсиелл от эшерихий, в случае высокой концентрации последних.

Дифференциально-элективная питательная среда для выделения клебсиелл, содержащая в качестве источника азотистого питания пептон мясной, натрий хлористый, мезо-инозит, соли желчных кислот, кристаллический фиолетовый, нейтральный красный и агар микробиологический, отличающаяся тем, что в качестве белковой основы она дополнительно содержит панкреатический гидролизат рыбной муки, дрожжевой экстракт - источник витаминов и натрий углекислый в качестве стабилизатора рН среды при следующем содержании компонентов:

Панкреатический гидролизат рыбной муки 9,0-11,0 г
Пептон мясной 9,0-11,0 г
Дрожжевой экстракт 0,8-1,2 г
Мезо-инозит 9,0-11,0 г
Натрий хлористый 4,0-6,0 г
Соли желчных кислот 1,3-1,7 г
Кристаллический фиолетовый 0,0008-0,0012 г
Нейтральный красный 0,04-0,06 г
Натрий углекислый 0,1-0,3 г
Агар микробиологический 8,0-14,0 г
Дистиллированная вода 1 л
Карбенициллин 0,02 г



 

Похожие патенты:

Изобретение относится к медицинской микробиологии и может быть использовано для изготовления вакцинных препаратов. Предложен способ получения вакцины гемофильной тип b конъюгированной.

Изобретение относится к сельскому хозяйству и может быть использовано для переработки органических отходов птицеводческих предприятий. Способ переработки птичьего помета предусматривает послойную укладку птичьего помета с добавлением до 20% влагопоглощающего органического материала, например опилок или соломы.

Изобретение относится к микробиологии и биотехнологии. Предложен штамм бактерий Bifidobacterium longum ICIS-505, который является продуцентом биологически активных веществ, обладающих антиперсистентной активностью в отношении условно-патогенных и патогенных бактерий и дрожжевых грибов.

Изобретение относится к биотехнологии. Штамм Emericellopsis alkalina депонирован во Всероссийской Коллекции Промышленных Микроорганизмов под регистрационным номером ВКПМ F-1428.

Изобретение относится к лабораторной микологии. Питательная среда для получения дрожжевых клеток диморфного микроскопического гриба Histoplasma capsulatum содержит сернокислотный гидролизат рыбной муки, ферментированную кровь как стимулятор роста гемофильных микроорганизмов, дрожжевой экстракт, сульфит натрия, L-цистеин, сернокислый магний, агар микробиологический, ферментативный пептон, хлористый натрий, дефибринированную кровь животного, L-цистин, D-глюкозу, RPMI 1640 - концентрат раствора витаминов и дистиллированную воду при заданном содержании компонентов.

Группа изобретений относится к очистке грунтов, воды от нефти и нефтепродуктов с помощью биотехнологии. Предложены нефтеокисляющий биопрепарат, биосорбент на его основе и способ его приготовления.

Изобретение относится к области биотехнологии. Предлагается штамм микроводорослей Chlorella vulgaris Beijer.
Изобретение относится к области биотехнологии. Предложен штамм бактерий Streptococcus equi для изготовления вакцины против мыта лошадей.

Изобретение относится к биотехнологии и касается штамма микроводоросли Coelastrella sp. K1.

Изобретение относится к медицине, а именно к экспериментальной медицине, и может быть использовано для моделирования туберкулезной инфекции in vitro. Гранулемоподобные структуры получают из мононуклеарных клеток венозной крови в присутствии микобактерий туберкулеза, культивируемых в трехмерном матриксе.

Группа изобретений относится к ускоренному и высокочувствительному способу обнаружения бактериальных патогенов. Раскрыт способ обнаружения бактерий, включающий обеспечение одной или более чем одной суспензии, причем каждая содержит по меньшей мере один вид меченых тестируемых бактериофагов, которые специфично связываются с видом бактерий, подлежащим обнаружению; добавление образца, подлежащего проверке на наличие по меньшей мере одного вида бактерий; фильтрацию полученной реакционной смеси; обнаружение комплексов бактерии-бактериофаги в концентрате; обнаружение несвязанных бактериофагов в фильтрате; обработку полученных сигналов, сгенерированных в результате обнаружения, и вывод результатов обнаружения пользователю.

Изобретение относится к области молекулярной биологии. Предложен способ культивирования микроорганизма, выбранного из родов Saccharomyces sensu stricto, Kazachstania, Naumovozyma, Nakaseomyces и Vanderwaltozyma, в присутствии гуанидинобутирата в качестве единственного источника азота, включающий встраивание в указанный микроорганизм молекулы нуклеиновой кислоты, содержащей нуклеотидную последовательность, кодирующую гуанидинобутиразу c номером EC 3.5.3.7 и функционально связанную с последовательностями промотора и терминатора, последующее культивирование указанного микроорганизма таким образом, что молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая гуанидинобутиразу, экспрессируется в указанном микроорганизме, и культивирование указанного микроорганизма в присутствии гуанидинобутирата в качестве единственного источника азота.
Изобретение относится к медицине, а именно к хирургии, и может быть использовано для определения показаний к операции программированной санационной релапаротомии при перитоните.

Группа изобретений относится к области биотехнологии. Предложен способ получения зоны характеризации аналитической пластины для проведения характеризации популяции микроорганизма в присутствии антимикробного агента методом MALDI, способ характеризации популяции микроорганизма (варианты), аналитическая пластина и средство для характеризации популяции микроорганизма, представляющее собой указанную пластину.

Изобретение относится к биотехнологии. Предлагается способ выделения и идентификации бактерий групп Pseudomonas putida и Pseudomonas fluorescens.

Изобретение относится к области биотехнологии. Предложен способ герметизации вещества в выполненном на субстрате множестве ячеек.

Группа изобретений относится к области биотехнологии. Предложены способ и система для очистки кокцидиальных ооцист, а также композиция очищенных кокцидиальных ооцист.
Изобретение относится к биотехнологии и микробиологии. Плотная питательная среда для культивирования возбудителя инфекционного эпидидимита баранов содержит мясную воду, печеночный отвар, пептон сухой ферментативный, натрий хлористый, 10%-ный раствор натрия углекислого кислого, глюкозу, глицерин, метабисульфит натрия, сыворотку крови крупного рогатого скота, агар микробиологический и питьевую воду при заданном содержании компонентов.

Изобретение относится к медицинской микробиологии и может быть использовано как в научно-исследовательской, так и в практической работе для бактериологической диагностики ряда патогенных микроорганизмов (бактерий рода Listeria, Staphylococcus aureus и др.).

Изобретение относится к вариантам штамма молочнокислых бактерий рода Lactobacillus и применению указанных штаммов. Предложен штамм молочнокислых бактерий рода Lactobacillus DSM 25906, штамм молочнокислых бактерий рода Lactobacillus DSM 25907, штамм молочнокислых бактерий рода Lactobacillus DSM 25908, штамм молочнокислых бактерий рода Lactobacillus DSM 25914, штамм молочнокислых бактерий рода Lactobacillus DSM 25915.

Изобретение относится к медицинской микробиологии и может быть использовано для изготовления вакцинных препаратов. Предложен способ получения вакцины гемофильной тип b конъюгированной.

Изобретение относится к клинической и санитарной микробиологии. Питательная среда для выделения клебсиелл содержит панкреатический гидролизат рыбной муки, пептон мясной, дрожжевой экстракт, мезо-инозит, натрий хлористый, соли желчных кислот, кристаллический фиолетовый, нейтральный красный, натрий углекислый, карбенициллин, агар микробиологический и дистиллированную воду при заданном соотношении компонентов. Изобретение позволяет сократить сроки дифференциации клебсиелл. 3 табл., 5 пр.

Наверх