Способ получения сахаров и сиропов

Изобретение относится к биотехнологии и пищевой промышленности и представляет собой способ получения декстрозного или фруктозного сиропа, включающий стадию ожижения водной суспензии гранулированного крахмала вариантом альфа-амилазы, содержащим замены K17L+E185P SEQ ID NO:1, с получением ожиженного крахмалсодержащего материала; осахаривания ожиженного крахмалсодержащего материала со стадии a) в присутствии глюкоамилазы, пуллуланазы, полученной из Bacillus deramificans, Bacillus subtilis, Bacillus amyloderamificans или Bacillus acidopullulyticus, с получением декстрозного сиропа, где стадия дополнительно включает добавление варианта альфа-амилазы, содержащего замены K176L+E185P SEQ ID NO:1, и, необязательно, c) изомеризации с получением фруктозного сиропа; где стадию a) осуществляют при pH 4-7. Изобретение позволяет получить декстрозный или фруктозный сироп с высокой степенью эффективности. 8 з.п. ф-лы, 1 ил., 5 табл., 15 пр.

 

Настоящая заявка содержит перечень последовательностей в машиночитаемой форме, который включен в данный документ посредством ссылки.

ОБЛАСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Настоящее изобретение относится к способу получения сахаров и сиропов, в частности, кукурузного сиропа с высоким содержанием фруктозы (HFCS).

ПРЕДПОСЫЛКИ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Было описано большое количество способов превращения крахмала в гидролизаты крахмала, такие как мальтозные, глюкозные или специализированные сиропы для применения либо в качестве подсластителей, либо в качестве предшественников для других сахаридов, таких как фруктоза. Глюкозу также можно ферментировать до этанола или других продуктов ферментации.

Крахмал представляет собой высокомолекулярный полимер, состоящий из цепей глюкозных звеньев. Обычно он состоит из приблизительно 80% амилопектина и 20% амилозы. Амилопектин представляет собой разветвленный полисахарид, в котором линейные цепи из остатков альфа-1,4-D-глюкозы соединены альфа-1,6-гликозидными связями.

Амилоза представляет собой линейный полисахарид, построенный из D-глюкопиранозных звеньев, связанных вместе альфа-1,4-гликозидными связями. В случае превращения крахмала в растворимый гидролизат крахмала происходит деполимеризация крахмала. Обычный способ деполимеризации состоит из стадии желатинизации и двух последовательных технологических стадий, а именно, процесса ожижения и процесса осахаривания. Гранулированный крахмал состоит из микроскопических гранул, которые не растворяются в воде при комнатной температуре. Когда водную суспензию крахмала нагревают, гранулы набухают и, в конечном итоге, разрываются, рассеивая молекулы крахмала в раствор. Во время этого процесса "желатинизации" происходит резкое увеличение вязкости. Поскольку в типичном промышленном процессе уровень твердых частиц составляет 30-40%, крахмал должен быть разбавлен или "ожижен" так, чтобы его можно было обрабатывать. В настоящее время такого снижения вязкости в основном достигают путем ферментативного расщепления.

HFCS изготавливают из сиропов с высоким содержанием DX, где термин DX означает процент по весу декстрозы (D-глюкозы), рассчитанный на основе сухого вещества (DS) сиропа. Полный ферментативный способ, общепринятый для превращения крахмала в сироп с высоким содержанием DX, представляет собой двухстадийный способ. Первая стадия представляет собой ожижение, где длинноцепочечный крахмал расщепляется на более мелкие разветвленные и линейные элементы (мальтодекстрины) с помощью альфа-амилазы. Процесс ожижения как правило выполняют при приблизительно 105-110°C в течение приблизительно 5-10 минут с последующими приблизительно 1-2 часами при приблизительно 95°C. Затем температуру снижают до 60°C, добавляют глюкоамилазу или бета-амилазу и, необязательно, деветвящий фермент, такой как изоамилаза или пуллуланаза, и процесс осахаривания продолжается в течение приблизительно 24-72 часов.

В WO 2013/057141 и WO 2013/057143 описаны варианты альфа-амилазы и их применения, например, в переработке крахмала, получении продуктов ферментации, способах получения продуктов ферментации из нежелатинизированного крахмалсодержащего материала и способах получения продуктов ферментации из желатинизированного крахмалсодержащего материала. Эти варианты описаны как характеризующиеся, например, повышенной стабильности при инкубации при низком рН и/или при высокой температуре, в частности, при низких концентрациях кальция и, в частности, в присутствии по меньшей мере 0,1% крахмала, например, в присутствии 0,9 % или 1% крахмала.

Остается необходимость улучшения способов получения сахаров и сиропов.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

В одном аспекте настоящее изобретение предусматривает способ получения сиропа:

a) ожижение водной суспензии гранулированного крахмала с помощью варианта альфа-амилазы, содержащего изменение в одном или нескольких положениях, соответствующих любому из положений 1, 2, 68, 71, 126, 133, 142, 144, 156, 158, 176, 185, 201, 205, 213, 239, 279, 316, 318, 360, 416, 437 и 450 из SEQ ID NO: 1, с получением ожиженного крахмалсодержащего материала;

b) осахаривание ожиженного крахмалсодержащего материала в присутствии глюкоамилазы и пуллуланазы, полученной из Bacillus deramificans, Bacillus subtilis, Bacillus amyloderamificans или Bacillus acidopullulyticus, с получением декстрозного сиропа и, необязательно,

c) изомеризацию с получением фруктозного сиропа.

В некоторых аспектах комбинация варианта альфа-амилазы, глюкоамилазы и пуллуланазы, полученной из Bacillus deramificans, приводит к усиленному эффекту в отношении конечного сиропа, что наблюдается, в частности, в повышении DX по сравнению с процентом DX, наблюдаемым в отсутствие этих комбинированных ферментов.

Краткое описание графических материалов

На фигуре 1 показано выравнивание аминокислотных последовательностей альфа-амилаз:

SEQ ID NO: 1 представляет собой альфа-амилазу из Bacillus licheniformis.

SEQ ID NO: 2 представляет собой альфа-амилазу из Bacillus stearothermophilus.

SEQ ID NO: 3 представляет собой альфа-амилазу TS-23 из Bacillus, описанную в J. Appl. Microbiology, 1997, 82: 325-334 (SWALL:q59222).

SEQ ID NO: 4 представляет собой альфа-амилазу AMY1048 из Bacillus flavothermus, описанную в WO 2005/001064.

SEQ ID NO: 5 представляет собой альфа-амилазу TS-22 из Bacillus, описанную как SEQ ID NO: 21 в WO 04/113511.

SEQ ID NO: 6 представляет собой альфа-амилазу из Bacillus amyloliquefaciens.

SEQ ID NO: 7 представляет собой щелочную амилазу SP690 из Bacillus sp., описанную как SEQ ID NO 1 в WO 95/26397.

SEQ ID NO: 8 представляет собой альфа-амилазу из Bacillus halmapalus, описанную как SEQ ID NO 2 в WO 95/26397.

SEQ ID NO: 9 представляет собой щелочную амилазу AA560 из Bacillus sp., описанную как SEQ ID NO 4 в WO 00/60060.

SEQ ID NO: 10 представляет собой щелочную амилазу A 7-7 из Bacillus sp., описанную как SEQ ID NO 2 в WO200210356.

SEQ ID NO: 11 представляет собой щелочную амилазу SP707 из Bacillus sp., описанную в Tsukamoto et al., 1988, Biochem. Biophys. Res. Commun. 151: 25-33).

SEQ ID NO: 12 представляет собой щелочную амилазу K-38 из Bacillus, описанную как SEQ ID NO 2 в EP 1022334.

SEQ ID NO: 13 представляет собой альфа-амилазу из Bacillus licheniformis, описанную в Lee et al, 2006, J. Biochem, 139: 997-1005.

SEQ ID NO: 14 представляет собой вариантную альфа-амилазу LE399, раскрытую ранее, например, в WO 2002/010355.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Определения

Термин "гранулированный крахмал" понимают как сырой необработанный крахмал, т.е. крахмал, который не был подвергнут желатинизации. Крахмал образуется в растениях в виде крошечных гранул, не растворимых в воде. Эти гранулы сохраняются в крахмале при температурах ниже начальной температуры желатинизации. При помещении в холодную воду эти крупинки могут поглощать небольшое количество жидкости. Вплоть до 50-70°C набухание является обратимым, степень обратимости зависит от конкретного типа крахмала. При более высоких температурах начинается необратимое набухание, называемое желатинизацией.

Термин “специализированные сиропы” является общепризнанным термином в данной области техники и они характеризуются по "декстрозному эквиваленту" (DE) и спектру углеводов (см. статью “New Speciality Glucose Syrups”, p. 50+, в руководстве “Molecular Structure and Function of Food Carbohydrate”, под ред. G.G. Birch and L.F. Green, Applied Science Publishers LTD., London). Типичные специализированные сиропы имеют DE в диапазоне от 35 до 45.

Альфа-амилаза. Альфа-амилазы (E.C. 3.2.1.1) представляют собой группу ферментов, которые катализируют гидролиз крахмала и других линейных и разветвленных олиго- и полисахаридов с 1,4-гликозидными связями. Специалист будет знать, как определить альфа-амилазную активность. Ее можно определить в соответствии с процедурой, описанной в Примерах, например, с помощью анализа с применением PNP-G7. В одном аспекте варианты по настоящему изобретению характеризуются по меньшей мере 20%, например, по меньшей мере 40%, по меньшей мере 50%, по меньшей мере 60%, по меньшей мере 70%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95% или по меньшей мере 100% альфа-амилазной активностью зрелого полипептида с SEQ ID NO: 1. В другом аспекте вариант по настоящей заявке характеризуется по меньшей мере 20%, например, по меньшей мере 40%, по меньшей мере 50%, по меньшей мере 60%, по меньшей мере 70%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95% или по меньшей мере 100% альфа-амилазной активностью своей исходной формы.

Глюкоамилаза. Глюкоамилазы представляют собой 1,4-альфа-D-глюкан глюкогидролазы (EC 3.2.1.3), которые катализируют высвобождение D-глюкозы с невосстанавливающих концов крахмала или родственных олиго- и полисахаридных молекул. В рамках настоящего изобретения глюкоамилазную активность определяют согласно процедуре, описанной в разделе "Материалы и методы" ниже. Единицу глюкоамилазы Novo (AGU) определяют как количество фермента, которое гидролизует 1 микромоль мальтозы в минуту при стандартных условиях 37°C, pH 4,3, субстрат: мальтоза 23,2 мM, буфер: ацетат 0,1 M, время реакции 5 минут.

Фрагмент. Термин "фрагмент" означает полипептид с отсутствием одной или более (например, нескольких) аминокислот с амино- и/или карбоксильного конца зрелого полипептида; где фрагмент характеризуется альфа-амилазной активностью. В одном аспекте фрагмент содержит по меньшей мере 300 аминокислотных остатков, по меньшей мере 350 аминокислотных остатков, по меньшей мере 400 аминокислотных остатков, по меньшей мере 450 аминокислотных остатков, по меньшей мере 470 аминокислотных остатков или по меньшей мере 480 аминокислотных остатков.

Выделенный. Выражение “выделенный” означает вещество в форме или в окружении, которые не встречаются в естественных условиях. Неограничивающие примеры выделенных веществ включают в себя (1) любое не встречающееся в естественных условиях вещество, (2) любое вещество, в том числе, без ограничения, любой фермент, вариант, нуклеиновую кислоту, белок, пептид или кофактор, которые по меньшей мере частично отделены от одной, или нескольких, или всех встречающихся в естественных условиях составляющих, с которыми они связаны в естественных условиях; (3) любое вещество, модифицированное человеком, по сравнению с таким веществом, встречающимся в природе; или (4) любое вещество, модифицированное путем увеличения количества вещества по сравнению с другими компонентами, с которыми оно связано в естественных условиях (например, несколько копий гена, кодирующего вещество; применение более сильного промотора, чем промотор, связанный в естественных условиях с геном, кодирующим вещество). Выделенное вещество может присутствовать в образце ферментативного бульона.

Зрелый полипептид. Термин “зрелый полипептид” означает полипептид в его конечной форме после трансляции и любых пост-трансляционных модификаций, таких как N-концевой процессинг, C-концевое усечение, гликозилирование, фосфорилирование и т.д. Из уровня техники известно, что клетка-хозяин может производить смесь из двух или более различных зрелых полипептидов (т.e. с другой C-концевой и/или N-концевой аминокислотой), экспрессируемых одним и тем же полинуклеотидом. Зрелая форма некоторых альфа-амилаз, например, некоторых бактериальных альфа-амилаз, включает каталитический домен, содержащий активный центр для гидролиза субстрата и один или несколько углевод-связывающих модулей (CBM) для связывания с углеводным субстратом (крахмалом) и, необязательно, полипептид, связывающий CBM с каталитическим доменом, участок последнего типа, как правило, обозначается как “линкер”.

Исходная форма или исходная альфа-амилаза. Термин "исходная форма" или "исходная альфа-амилаза" означает альфа-амилазу, в отношении которой выполнено изменение с получением вариантов фермента по настоящему изобретению. Исходная форма может представлять собой встречающийся в естественных условиях полипептид (дикого типа) или его вариант или фрагмент.

Пуллуланаза. Пуллуланазы (EC 3.2.1.41) гидролизуют альфа-1,6-D-гликозидные связи в пуллулане (линейный полимер из альфа-1,6-связанных мальтотриозных звеньев) и в амилопектине и гликогене, и альфа- и бета-конечных декстринах амилопектина и гликогена. Другим названием(ями) пуллуланазы являются, например, амилопуллуланаза, амилопектин-6-глюканогидролаза; бактериальный деветвящий фермент; деветвящий фермент; альфа-декстрин эндо-1,6-альфа-глюкозидаза; R-фермент. Систематическим названием является "пуллулан альфа-1,6-глюканогидролаза". Ферменты, принадлежащие к этому классу, могут включать углевод-связывающий модуль (CBM).

Углевод-связывающий модуль. Углевод-связывающие модули или углевод-связывающие домены представляют собой белковые структуры, способные связывать углевод, как правило, при помощи нековалентного связывания. Углевод-связывающие домены включают в себя домены, связывающие полисахариды, такие как целлюлоза, ксилан или крахмал. Несколько углевод-связывающих доменов были описаны в литературе и сгруппированы в семейства, обзор см. в Boraston et al. (2004) Biochem. J. 382: 769-781 и http://afmb.cnrs-mrs.fr/CAZY/index.html относительно группировки семейств CBM. "Крахмал-связывающий домен" представляет собой углевод-связывающий домен, характеризующийся специфичностью относительно крахмала, в частности, сырого крахмала. Крахмал-связывающие домены обнаружены по меньшей мере в семействах углевод-связывающих доменов CBM-20, CBM-21, CBM-25, CBM-26, CBM-34, CBM-41 и CBM-45.

Идентичность последовательностей. Родство между двумя аминокислотными последовательностями или между двумя нуклеотидными последовательностями описывается параметром “идентичность последовательностей”.

В рамках настоящего изобретения идентичность последовательностей для двух аминокислотных последовательностей определяют с помощью алгоритма Нидлмана-Вунша (Needleman and Wunsch, 1970, J. Mol. Biol. 48: 443-453), который реализован в программе Needle из пакета EMBOSS (EMBOSS: The European Molecular Biology Open Software Suite, Rice et al., 2000, Trends Genet. 16: 276-277), предпочтительно версии 5.0.0 или более поздней. Используемыми параметрами являются штраф за открытие гэпа 10, штраф за продолжение гэпа 0,5 и матрица замен EBLOSUM62 (EMBOSS версия BLOSUM62). Выводимые данные в Needle, помеченные как “наиболее длинный идентичный участок” (полученные с применением опции – nobrief), применяют в качестве процента идентичности и рассчитывают следующим образом:

(идентичные остатки x 100)/(длина выравниваемого участка – общее число гэпов в

выравниваемом участке)

Вариант. Термин "вариант" означает полипептид, характеризующийся альфа-амилазной активностью, содержащий изменение, т.е. замену, вставку и/или делецию в одном или более (например, нескольких) положениях. Замена означает замещение аминокислоты, занимающей какое-либо положение, другой аминокислотой; делеция означает удаление аминокислоты, занимающей какое-либо положение; и вставка означает добавление одной или более (например, нескольких) аминокислот, например, 1-5 аминокислот, примыкающих к аминокислоте, занимающей какое-либо положение. В одном аспекте варианты по настоящему изобретению характеризуются по меньшей мере 20%, например, по меньшей мере 40%, по меньшей мере 50%, по меньшей мере 60%, по меньшей мере 70%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95% или по меньшей мере 100% альфа-амилазной активностью зрелого полипептида с SEQ ID NO: 1. В другом аспекте вариант по настоящей заявке характеризуется по меньшей мере 20%, например, по меньшей мере 40%, по меньшей мере 50%, по меньшей мере 60%, по меньшей мере 70%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95% или по меньшей мере 100% альфа-амилазной активностью своей исходной формы. Альфа-амилазную активность можно определять с помощью анализа с применением PNP-G7, описанного в Примерах.

Альфа-амилаза дикого типа. Термин альфа-амилаза "дикого типа" означает альфа-амилазу, экспрессируемую микроорганизмом, встречающимся в естественных условиях, таким как бактерия, дрожжи или нитчатый гриб, обнаруживаемые в природе.

Правила обозначения вариантов. В рамках настоящего изобретения зрелый полипептид, раскрытый в SEQ ID NO: 1, используют для определения соответствующего аминокислотного остатка в другой альфа-амилазе. Аминокислотную последовательность другой альфа-амилазы выравнивают со зрелым полипептидом, раскрытым в SEQ ID NO: 1, и на основании выравнивания номер положения аминокислоты, соответствующий любому аминокислотному остатку в зрелом полипептиде, раскрытом в SEQ ID NO: 1, определяют с применением алгоритма Нидлмана-Вунша (Needleman and Wunsch, 1970, J. Mol. Biol. 48: 443-453), который реализован в программе Needle из пакета EMBOSS (EMBOSS: The European Molecular Biology Open Software Suite, Rice et al., 2000, Trends Genet. 16: 276-277), предпочтительно версии 5.0.0 или более поздней. Используемыми параметрами являются штраф за открытие гэпа 10, штраф за продолжение гэпа 0,5 и матрица замен EBLOSUM62 (EMBOSS версия BLOSUM62).

Идентификацию соответствующего аминокислотного остатка в другой альфа-амилазе можно определить с помощью выравнивания множественных полипептидных последовательностей с использованием нескольких компьютерных программ, в том числе без ограничения MUSCLE (множественное сравнение последовательностей с помощью log-ожидания; версия 3.5 или более поздняя; Edgar, 2004, Nucleic Acids Research 32: 1792-1797), MAFFT (версия 6.857 или более поздняя; Katoh and Kuma, 2002, Nucleic Acids Research 30: 3059-3066; Katoh et al., 2005, Nucleic Acids Research 33: 511-518; Katoh and Toh, 2007, Bioinformatics 23: 372-374; Katoh et al., 2009, Methods in Molecular Biology 537: 39-64; Katoh and Toh, 2010, Bioinformatics 26: 1899-1900) и EMBOSS EMMA, в которой применяется ClustalW (1.83 или более поздняя; Thompson et al., 1994, Nucleic Acids Research 22: 4673-4680), с применением их соответствующих параметров по умолчанию.

Если другой фермент отличается от зрелого полипептида с SEQ ID NO: 1, так что с помощью традиционного сравнения на основании последовательностей невозможно обнаружить их родство (Lindahl and Elofsson, 2000, J. Mol. Biol. 295: 613-615), можно применять другие алгоритмы попарного сравнения последовательностей. Большей чувствительности поиска на основании последовательности можно достичь с применением программ поиска, которые применяют вероятностные представления семейств полипептидов (профилей) для поиска по базам данных. Например, программа PSI-BLAST создает профили посредством итеративного процесса поиска по базам данных и способна обнаруживать отдаленные гомологи (Atschul et al., 1997, Nucleic Acids Res. 25: 3389-3402). Еще большей чувствительности можно достичь, если семейство или суперсемейство для данного полипептида имеет одного или несколько представителей в базах данных структуры белков. Программы, такие как GenTHREADER (Jones, 1999, J. Mol. Biol. 287: 797-815; McGuffin and Jones, 2003, Bioinformatics 19: 874-881), используют информацию из ряда источников (PSI-BLAST, данные прогнозирования вторичной структуры, профили структурного выравнивания и потенциалы сольватации) в качестве данных, вводимых в нейронную сеть, с помощью которой предсказывают структурную укладку запрашиваемой последовательности. Аналогично, способ по Gough et al., 2000, J. Mol. Biol. 313: 903-919, можно применять для выравнивания последовательности с неизвестной структурой с моделями суперсемейств, присутствующими в базе данных SCOP. Эти выравнивая можно, в свою очередь, применять для создания моделей гомологии для полипептида, и точность таких моделей можно оценивать с помощью ряда инструментов, разработанных для этой цели.

Для белков с известной структурой доступны несколько инструментов и ресурсы для отыскания и создания структурных выравниваний. Например, суперсемейства белков в SCOP были выравнены по структуре, и результаты этих выравниваний находятся в открытом доступе, а также доступны для загрузки. Структуры двух или более белков можно выравнять с применением ряда алгоритмов, таких как выравнивание на основе матрицы расстояний (Holm and Sander, 1998, Proteins 33: 88-96) или комбинаторного удлинения (Shindyalov and Bourne, 1998, Protein Engineering 11: 739-747), и выполнение этих алгоритмов можно дополнительно применять для составления запросов по представляющей интерес структуре в базах данных структуры с целью нахождения возможных структурных гомологов (например, Holm and Park, 2000, Bioinformatics 16: 566-567).

При описании вариантов по настоящему изобретению описанная ниже номенклатура адаптирована для простоты упоминания. Используется принятое IUPAC однобуквенное или трехбуквенное сокращение для аминокислот.

Замены. В отношении аминокислотной замены применяется следующая номенклатура: исходная аминокислота, положение, заменяющая аминокислота. Соответственно, замена треонина в положении 226 на аланин обозначается как “Thr226Ala” или “T226A”. Несколько мутаций разделяют знаками сложения (“+”), например, “Gly205Arg+Ser411Phe” или “G205R+S411F”, представляют замены в положениях 205 и 411 глицина (G) на аргинин (R) и серина (S) на фенилаланин (F), соответственно. В Примерах настоящей заявки несколько мутаций разделяют пробелами, например, G205R S411F представляет G205R+S411F.

Делеции. В отношении делеции аминокислоты применяется следующая номенклатура: исходная аминокислота, положение, *. Соответственно, делеция глицина в положении 195 обозначается как “Gly195*” или “G195*”. Несколько делеций разделяют знаками сложения (“+”), например, “Gly195*+Ser411*” или “G195*+S411*”.

Вставки. В отношении вставки аминокислоты применяется следующая номенклатура: исходная аминокислота, положение, исходная аминокислота, вставленная аминокислота. Соответственно, вставка лизина после глицина в положении 195 обозначается “Gly195GlyLys” или “G195GK”. Вставку нескольких аминокислот обозначают [исходная аминокислота, положение, исходная аминокислота, вставленная аминокислота #1, вставленная аминокислота #2 и т.д]. Например, вставка лизина и аланина после глицина в положении 195 обозначается как “Gly195GlyLysAla” или “G195GKA”.

В таких случаях вставленный аминокислотный остаток(и) нумеруют путем добавления строчных букв к номеру положения аминокислотного остатка, предшествующего вставленному аминокислотному остатку(ам). Следовательно, в вышеуказанном примере последовательность будет представлять собой:

Исходная форма: Вариант:
195 195 195a 195b
G G - K - A

Множественные изменения. Варианты, содержащие множественные изменения, разделяют знаками сложения (“+”), например, “Arg170Tyr+Gly195Glu” или “R170Y+G195E”, представляющие замену аргинина и глицина в положениях 170 и 195 на тирозин и глутаминовую кислоту, соответственно.

Различные изменения. Когда различные изменения могут вводиться в какое-либо положение, различные изменения разделяют запятой, например, “Arg170Tyr,Glu” представляет замену аргинина в положении 170 на тирозин или глутаминовую кислоту. Следовательно, “Tyr167Gly,Ala+Arg170Gly,Ala” обозначает следующие варианты:

“Tyr167Gly+Arg170Gly”, “Tyr167Gly+Arg170Ala”, “Tyr167Ala+Arg170Gly” и “Tyr167Ala+Arg170Ala”.

Способ получения сахаров и сиропов

Как раскрыто, например, в WO 2013/057141 и WO 2013/057143, включенных в данный документ посредством ссылки, варианты альфа-амилазы, содержащие изменение в одном или нескольких положениях, соответствующих замене в любом из положений 1, 2, 68, 71, 126, 133, 142, 144, 156, 158, 176, 185, 201, 205, 213, 239, 279, 316, 318, 360, 416, 437 и 450 из SEQ ID NO: 1, показывают повышенную стабильность при инкубации при низком рН и/или при высокой температуре, в частности, при низких концентрациях кальция и, в частности, в присутствии по меньшей мере 0,1% крахмала, например, в присутствии 0,9% или 1% крахмала.

Гранулированный крахмал, подлежащий обработке в способах по настоящему изобретению, в частности, можно получать из клубней, корней, стеблей, бобов, злаков или цельного зерна. Более конкретно, гранулированный крахмал можно получать из кукурузы, стержней початка кукурузы, пшеницы, ячменя, ржи, майло, саго, маниоки, тапиоки, сорго, риса, разновидностей гороха, фасоли, банана или разновидностей картофеля. Специально предусмотрены как восковые, так и невосковые типы кукурузы и ячменя. Гранулированный крахмал, подлежащий обработке, может представлять собой крахмал высокой степени очистки, предпочтительно с чистотой более 90%, 95%, 97% или 99,5%, или он может представлять собой более неочищенный крахмалсодержащий материал, включающий меленое цельное зерно, в том числе некрахмальные фракции, такие как остатки зародыша и волокна. Сырье, такое как цельное зерно, размалывают, чтобы открыть доступ к структуре и обеспечить возможность дальнейшей обработки. Согласно настоящему изобретению являются предпочтительными два способа помола: мокрый и сухой помол. При сухом помоле цельное зерно размалывают и используют. Мокрый помол обеспечивает хорошее разделение зародыша и муки (гранул крахмала и белка) и его, за несколькими исключениями, применяют в местах, где гидролизат крахмала используют в получении сиропов. Как сухой, так и мокрый помол хорошо известны в области переработки крахмала, и они в равной степени предусмотрены в способах по настоящему изобретению. Способы по настоящему изобретению можно выполнять в системе ультрафильтрации, где ультраконцентрат подвергают рециркуляции в присутствии ферментов, сырого крахмала и воды и где фильтрат представляет собой растворимый гидролизат крахмала. В равной степени предусмотрен способ, выполняемый в мембранном реакторе непрерывного действия с мембранами для ультрафильтрации, и где ультраконцентрат подвергают рециркуляции в присутствии ферментов, сырого крахмала и воды, и где фильтрат представляет собой растворимый гидролизат крахмала. Также предусмотрен способ, выполняемый в мембранном реакторе непрерывного действия с мембранами для микрофильтрации, и где ультраконцентрат подвергают рециркуляции в присутствии ферментов, сырого крахмала и воды, и где фильтрат представляет собой растворимый гидролизат крахмала.

Суспензия крахмала, подлежащая обработке с помощью способов по настоящему изобретению, может характеризоваться 20-55% сухих веществ гранулированного крахмала, предпочтительно, 25-40% сухих веществ гранулированного крахмала, более предпочтительно, 30-35% сухих веществ гранулированного крахмала.

После обработки с помощью способов по настоящему изобретению по меньшей мере 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или, предпочтительно, 99%, в частности, по меньшей мере 99,1%, 99,2%, 99,3%, 99,4%, 99,5%, 99,6%, 99,7%, 99,8% или 99,9% сухих веществ гранулированного крахмала превращается в сироп, например, декстрозный сироп или глюкозный сироп.

Анализы декстрозного сиропа и способы его дополнительной очистки и/или концентрирования хорошо известны в данной области техники.

В некоторых аспектах комбинация варианта альфа-амилазы, глюкоамилазы и пуллуланазы, полученной из Bacillus deramificans, приводит к усиленному эффекту в отношении конечного сиропа, что наблюдается, в частности, в повышении DX по сравнению с процентом DX, наблюдаемым в отсутствие этих комбинированных ферментов.

В некоторых аспектах вариант альфа-амилазы можно добавлять во время стадии b) осахаривания.

Добавление варианта альфа-амилазы на стадии a) ожижения, стадии b) осахаривания или их комбинация может приводить к улучшениям по сравнению с аналогичной реакцией без варианта альфа-амилазы. Улучшения могут включать в себя, например, более высокий выход продукта DP1, сниженный выход продукта DP4+ и/или сниженный выход продукта DP2 по сравнению с аналогичной реакцией без варианта альфа-амилазы.

Процесс ожижения

"Ожижение" представляет собой процесс, при котором длинноцепочечный крахмал расщепляется на более короткие разветвленные и линейные элементы (мальтодекстрины) под действием альфа-амилазы. Ожижение можно выполнять как трехстадийный процесс с горячей суспензией. Суспензию нагревают до 60-95°C (например, 70-90°C) и добавляют альфа-амилазу для запуска ожижения (разжижения).

В одном из вариантов осуществления суспензию можно обрабатывать в струйном варочном котле при температуре 95-140°C, например, 105-125°C, в течение приблизительно 1-15 минут, например, приблизительно 3-10 минут, в частности, около 5 минут. Затем суспензию охлаждают до 60-95°C и добавляют дополнительное количество альфа-амилазы для осуществления конечного гидролиза (вторичное ожижение). Процесс обработки в струйном варочном котле выполняют при рН 4,5-6,5, как правило, при рН от 5 до 6. Альфа-амилазу можно добавить в виде единой дозы, например, перед обработкой в струйном варочном котле.

Процесс ожижения выполняют при температуре 70-95°C, например, 80-90°C, например, около 85°C, в качестве альтернативы, около 95°C, в течение от приблизительно 10 минут до 5 часов, как правило, в течение 1-2 часов. Значение рН находится от 4 до 7, например, от 5,5 до 6,2. Для того чтобы обеспечить оптимальную стабильность фермента в этих условиях, можно необязательно добавлять кальций (для обеспечения 1-60 ppm свободных ионов кальция, например, приблизительно 40 ppm свободных ионов кальция). После такой обработки ожиженный крахмал, как правило, будет характеризоваться "декстрозным эквивалентом" (DE) 4-40, например, 4-28, в том числе 8-15, например, 9-13, в том числе 9-12 или даже 10-15. Согласно предпочтительному варианту осуществления ожижение выполняют обработкой в струйном варочном котле при температуре в диапазоне 100-115°C в течение 1-60 минут, охлаждения до 90-100°C и выдерживания в течение 30-120 минут при pH приблизительно 5,5-6,0.

В целом ожижение и условия ожижения хорошо известны в данной области техники.

Процесс осахаривания

"Осахаривание" представляет собой процесс, при котором мальтодекстрины (такие как ожиженный крахмалсодержащий материал) превращают в низкомолекулярные сахара, такие как сахара с DP1-3. Осахаривание ожиженного крахмалсодержащего материала хорошо известно в данной области техники. Стандартное осахаривание обычно осуществляют ферментативно с помощью по меньшей мере одного образующего источник углеводов фермента, такого как, в частности, глюкоамилаза.

Согласно настоящему изобретению ожиженный крахмалсодержащий материал осахаривают в присутствии, например, глюкоамилазы и пуллуланазы, полученной из Bacillus deramificans, Bacillus subtilis, Bacillus amyloderamificans или Bacillus acidopullulyticus. Что касается стандартных процессов осахаривания, процесс осахаривания по настоящему изобретению может продолжаться в пределах от 20 до 100 часов, предпочтительно, от приблизительно 24 до приблизительно 72 часов, например, от приблизительно 30 до приблизительно 60 часов, и, предпочтительно, его можно выполнять при температуре в диапазоне от приблизительно 30 до 65°С, более предпочтительно приблизительно 60°С, и при рН от 4 до 6, как правило, рН около 4,5-5,5 или рН около 4,0-4,5.

Процесс изомеризации

В некоторых вариантах осуществления декстрозный сироп подвергают превращению в фруктозный сироп, такой как сироп на основе крахмала с высоким содержанием фруктозы (HFSS), такой как кукурузный сироп с высоким содержанием фруктозы (HFCS). Такое превращение предпочтительно достигают с применением глюкозоизомеразы и, более предпочтительно, посредством иммобилизованной глюкозоизомеразы, закрепленной на твердом носителе. Предусмотренные изомеразы включают коммерческие продукты Sweetzyme™ IT от Novozymes A/S, G-zyme™ IMGI и G-zyme™ G993, Ketomax™ и G-zyme™ G993 от Rhodia, жидкий G-zyme™ G993 и GenSweet™ IGI от Genencor Int.

Варианты альфа-амилазы

Вариант альфа-амилазы, пригодный согласно настоящему изобретению, описан, например, в WO 2013/057141 и WO 2013/057143, включенные в данный документ посредством ссылки.

В частности, варианты альфа-амилазы, содержащие изменение в одном или нескольких положениях, соответствующих любому из положений 1, 2, 68, 71, 126, 133, 142, 144, 156, 158, 176, 185, 201, 205, 213, 239, 279, 316, 318, 360, 416, 437 и 450 из SEQ ID NO: 1, где вариант характеризуется по меньшей мере 60% и менее, чем 100% идентичностью последовательности с (i) зрелым полипептидом с любой из SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13 или 14, или (ii) аминокислотами с 1 по 483 из SEQ ID NO: 1, аминокислотами с 1 по 483 из SEQ ID NO: 2, аминокислотами с 1 по 485 из SEQ ID NO: 3, аминокислотами с 1 по 482 из SEQ ID NO: 4, аминокислотами с 1 по 484 из SEQ ID NO: 5, аминокислотами с 1 по 483 из SEQ ID NO: 6, аминокислотами с 1 по 485 из SEQ ID NO: 7, аминокислотами с 1 по 485 из SEQ ID NO: 8, аминокислотами с 1 по 485 из SEQ ID NO: 9, аминокислотами с 1 по 485 из SEQ ID NO: 10, аминокислотами с 1 по 485 из SEQ ID NO: 11, аминокислотами с 1 по 480 из SEQ ID NO: 12, аминокислотами с 1 по 483 из SEQ ID NO: 13 или аминокислотами с 1 по 481 из SEQ ID NO: 14, и где вариант имеет альфа-амилазную активность.

Предпочтительно, варианты являются выделенными.

Варианты альфа-амилазы, предусмотренные в данном документе, предпочтительно содержат замену в одном или нескольких положениях, соответствующих любому из положений 1, 2, 68, 71, 126, 133, 142, 144, 156, 158, 176, 185, 201, 205, 213, 239, 279, 316, 318, 360, 416, 437 и 450 из SEQ ID NO: 1, где вариант характеризуется по меньшей мере 60% и менее, чем 100% идентичностью последовательности с (i) зрелым полипептидом с любой из SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13 или 14, или (ii) аминокислотами с 1 по 483 из SEQ ID NO: 1, аминокислотами с 1 по 483 из SEQ ID NO: 2, аминокислотами с 1 по 485 из SEQ ID NO: 3, аминокислотами с 1 по 482 из SEQ ID NO: 4, аминокислотами с 1 по 484 из SEQ ID NO: 5, аминокислотами с 1 по 483 из SEQ ID NO: 6, аминокислотами с 1 по 485 из SEQ ID NO: 7, аминокислотами с 1 по 485 из SEQ ID NO: 8, аминокислотами с 1 по 485 из SEQ ID NO: 9, аминокислотами с 1 по 485 из SEQ ID NO: 10, аминокислотами с 1 по 485 из SEQ ID NO: 11, аминокислотами с 1 по 480 из SEQ ID NO: 12, аминокислотами с 1 по 483 из SEQ ID NO: 13 или аминокислотами с 1 по 481 из SEQ ID NO: 14, и где вариант характеризуется альфа-амилазной активностью.

В одном варианте осуществления вариант содержит одно или несколько изменений, выбранных из группы, состоящей из A1AH, A1AF, A1AY, A1AW, A1H, A1F, A1Y, A1W, N2NH, N2N2F, N2NY, N2NW, N2H, N2F, N2Y, N2W, H68F, H68Y, H68W, G71F, G71H, G71Y, G71W, N126F, N126H, N126Y, N126W, H133F, H133Y, H133W, H142F, H142Y, H142W, P144F, P144H, P144Y, P144W, Y156F, Y156H, Y156W, Y158F, Y158H, Y158W, K176L, E185P, I201F, I201Y, H205Y, K213T, S239A, S239Q, F279Y, F279W, H316F, H316Y, H316W, L318F, L318H, L318Y, L318W, Q360S, D416V, R437F, R437H, R437Y, R437W, H450F, H450Y и H450W.

В предпочтительном варианте осуществления вариант содержит одну или несколько замен, выбранных из группы, состоящей из A1H, A1W, N2H, N2W, H68W, G71W, N126W, H133Y, H142W, P144W, Y156W, Y158W, K176L, E185P, I201Y, H205Y, K213T, S239A, S239Q, F279W, H316W, L318W, Q360S, D416V, R437W и H450W.

В еще одном предпочтительном варианте осуществления вариант содержит две или более замены, выбранные из группы, состоящей из A1H, A1W, N2H, N2W, H68W, G71W, N126W, H133Y, H142W, P144W, Y156W, Y158W, K176L, E185P, I201Y, H205Y, K213T, S239A, S239Q, F279W, H316W, L318W, Q360S, D416V, R437W и H450W.

В еще одном варианте осуществления вариант содержит три или более замены, выбранные из группы, состоящей из A1H, A1W, N2H, N2W, H68W, G71W, N126W, H133Y, H142W, P144W, Y156W, Y158W, K176L, E185P, I201Y, H205Y, K213T, S239A, S239Q, F279W, H316W, L318W, Q360S, D416V, R437W и H450W. В еще одном варианте осуществления вариант содержит четыре или более замены, выбранные из группы, состоящей из A1H, A1W, N2H, N2W, H68W, G71W, N126W, H133Y, H142W, P144W, Y156W, Y158W, K176L, E185P, I201Y, H205Y, K213T, S239A, S239Q, F279W, H316W, L318W, Q360S, D416V, R437W и H450W.

В одном варианте осуществления вариант содержит замену в положении, соответствующем положению 176, в частности, замену K176L, в комбинации с изменением в одном или нескольких положениях, соответствующих любому из положений 1, 2, 68, 71, 126, 133, 142, 144, 156, 158, 185, 201, 205, 213, 239, 279, 316, 318, 360, 416, 437 и 450, в частности, с одним или несколькими изменениями, выбранными из группы, состоящей из A1AH, A1AW, A1H, A1W, N2NH, N2NW, N2H, N2W, H68W, G71W, N126W, H133Y, H142W, P144W, Y156W, Y158W, E185P, I201Y, H205Y, K213T, S239A, S239Q, F279W, H316W, L318W, Q360S, D416V, R437W и H450W.

В предпочтительном варианте осуществления вариант содержит замену в положении, соответствующем положению 176, в частности, замену K176L, в комбинации с изменением в одном или нескольких положениях, соответствующих любому из положений 1, 2, 68, 71, 126, 133, 142, 144, 156, 158, 185, 201, 205, 213, 239, 279, 316, 318, 360, 416, 437 и 450, в частности, с одним или несколькими изменениями, выбранными из группы, состоящей из A1AH, A1AW, A1H, A1W, N2NH, N2NW, N2H, N2W, H68W, G71W, N126W, H133Y, H142W, P144W, Y156W, Y158W, E185P, I201Y, H205Y, K213T, S239A, S239Q, F279W, H316W, L318W, Q360S, D416V, R437W и H450W, и вариант характеризуется по меньшей мере 60%, например, по меньшей мере 65%, по меньшей мере 70%, по меньшей мере 75%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 91%, по меньшей мере 92%, по меньшей мере 93%, по меньшей мере 94%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99% идентичностью последовательности с (i) зрелым полипептидом с SEQ ID NO: 1 или (ii) аминокислотами 1-483 из SEQ ID NO: 1.

В предпочтительном варианте осуществления вариант содержит замену в положении, соответствующем положению 176, в частности, замену K176L, в комбинации с изменением в одном или нескольких положениях, соответствующих любому из положений 1, 2, 68, 71, 126, 133, 142, 144, 156, 158, 185, 201, 205, 213, 239, 279, 316, 318, 360, 416, 437 и 450, в частности, с одним или несколькими изменениями, выбранными из группы, состоящей из A1AH, A1AW, A1H, A1W, N2NH, N2NW, N2H, N2W, H68W, G71W, N126W, H133Y, H142W, P144W, Y156W, Y158W, E185P, I201Y, H205Y, K213T, S239A, S239Q, F279W, H316W, L318W, Q360S, D416V, R437W и H450W, и вариант характеризуется по меньшей мере 60%, например, по меньшей мере 65%, по меньшей мере 70%, по меньшей мере 75%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 91%, по меньшей мере 92%, по меньшей мере 93%, по меньшей мере 94%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99% идентичностью последовательности с (i) зрелым полипептидом с SEQ ID NO: 14 или (ii) аминокислотами 1-481 из SEQ ID NO: 14.

В одном варианте осуществления вариант содержит замену в положении, соответствующем положению 185, в частности, замену E185P, в комбинации с заменой в одном или нескольких положениях, соответствующих любому из положений 1, 2, 68, 71, 126, 133, 142, 144, 156, 158, 176, 201, 205, 213, 239, 279, 316, 318, 360, 416, 437 и 450, в частности, с одной или несколькими заменами, выбранными из группы, состоящей из A1H, A1W, N2H, N2W, H68W, G71W, N126W, H133Y, H142W, P144W, Y156W, Y158W, K176L, I201Y, H205Y, K213T, S239A, S239Q, F279W, H316W, L318W, Q360S, D416V, R437W и H450W.

В предпочтительном варианте осуществления вариант содержит замену в положении, соответствующем положению 185, в частности, замену E185P, в комбинации с заменой в одном или нескольких положениях, соответствующих любому из положений 1, 2, 68, 71, 126, 133, 142, 144, 156, 158, 176, 201, 205, 213, 239, 279, 316, 318, 360, 416, 437 и 450, в частности, с одной или несколькими заменами, выбранными из группы, состоящей из A1H, A1W, N2H, N2W, H68W, G71W, N126W, H133Y, H142W, P144W, Y156W, Y158W, K176L, I201Y, H205Y, K213T, S239A, S239Q, F279W, H316W, L318W, Q360S, D416V, R437W и H450W, и вариант характеризуется по меньшей мере 60%, например, по меньшей мере 65%, по меньшей мере 70%, по меньшей мере 75%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 91%, по меньшей мере 92%, по меньшей мере 93%, по меньшей мере 94%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99% идентичностью последовательности с (i) зрелым полипептидом с SEQ ID NO: 1 или (ii) аминокислотами 1-483 из SEQ ID NO: 1.

В предпочтительном варианте осуществления вариант содержит замену в положении, соответствующем положению 185, в частности, замену E185P, в комбинации с заменой в одном или нескольких положениях, соответствующих любому из положений 1, 2, 68, 71, 126, 133, 142, 144, 156, 158, 176, 201, 205, 213, 239, 279, 316, 318, 360, 416, 437 и 450, в частности, с одной или несколькими заменами, выбранными из группы, состоящей из A1H, A1W, N2H, N2W, H68W, G71W, N126W, H133Y, H142W, P144W, Y156W, Y158W, K176L, I201Y, H205Y, K213T, S239A, S239Q, F279W, H316W, L318W, Q360S, D416V, R437W и H450W, и вариант характеризуется по меньшей мере 60%, например, по меньшей мере 65%, по меньшей мере 70%, по меньшей мере 75%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 91%, по меньшей мере 92%, по меньшей мере 93%, по меньшей мере 94%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99% идентичностью последовательности с (i) зрелым полипептидом с SEQ ID NO: 14 или (ii) аминокислотами 1-481 из SEQ ID NO: 14.

В одном варианте осуществления вариант содержит замену в положении, соответствующем положению 360, в частности, замену Q360S, в комбинации с заменой в одном или нескольких положениях, соответствующих любому из положений 1, 2, 68, 71, 126, 133, 142, 144, 156, 158, 176, 185, 201, 205, 213, 239, 279, 316, 318, 416, 437 и 450, в частности, с одной или несколькими заменами, выбранными из группы, состоящей из A1H, A1W, N2H, N2W, H68W, G71W, N126W, H133Y, H142W, P144W, Y156W, Y158W, K176L, E185P, I201Y, H205Y, K213T, S239A, S239Q, F279W, H316W, L318W, D416V, R437W и H450W.

В предпочтительном варианте осуществления вариант содержит замену в положении, соответствующем положению 360, в частности, замену Q360S, в комбинации с заменой в одном или нескольких положениях, соответствующих любому из положений 1, 2, 68, 71, 126, 133, 142, 144, 156, 158, 176, 185, 201, 205, 213, 239, 279, 316, 318, 416, 437 и 450, в частности, с одной или несколькими заменами, выбранными из группы, состоящей из A1H, A1W, N2H, N2W, H68W, G71W, N126W, H133Y, H142W, P144W, Y156W, Y158W, K176L, E185P, I201Y, H205Y, K213T, S239A, S239Q, F279W, H316W, L318W, D416V, R437W и H450W, и вариант характеризуется по меньшей мере 60%, например, по меньшей мере 65%, по меньшей мере 70%, по меньшей мере 75%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 91%, по меньшей мере 92%, по меньшей мере 93%, по меньшей мере 94%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99% идентичностью последовательности с (i) зрелым полипептидом с SEQ ID NO: 1 или (ii) аминокислотами 1-483 из SEQ ID NO: 1.

В предпочтительном варианте осуществления вариант содержит замену в положении, соответствующем положению 360, в частности, замену Q360S, в комбинации с заменой в одном или нескольких положениях, соответствующих любому из положений 1, 2, 68, 71, 126, 133, 142, 144, 156, 158, 176, 185, 201, 205, 213, 239, 279, 316, 318, 416, 437 и 450, в частности, с одной или несколькими заменами, выбранными из группы, состоящей из A1H, A1W, N2H, N2W, H68W, G71W, N126W, H133Y, H142W, P144W, Y156W, Y158W, K176L, E185P, I201Y, H205Y, K213T, S239A, S239Q, F279W, H316W, L318W, D416V, R437W и H450W, и вариант характеризуется по меньшей мере 60%, например, по меньшей мере 65%, по меньшей мере 70%, по меньшей мере 75%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 91%, по меньшей мере 92%, по меньшей мере 93%, по меньшей мере 94%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99% идентичностью последовательности с (i) зрелым полипептидом с SEQ ID NO: 14 или (ii) аминокислотами 1-481 из SEQ ID NO: 14.

В одном варианте осуществления вариант содержит замену в положении, соответствующем положению 437, в частности, замену R437W, в комбинации с заменой в одном или нескольких положениях, соответствующих любому из положений 1, 2, 68, 71, 126, 133, 142, 144, 156, 158, 176, 185, 201, 205, 213, 239, 279, 316, 318, 360, 416 и 450, в частности, с одной или несколькими заменами, выбранными из группы, состоящей из A1H, A1W, N2H, N2W, H68W, G71W, N126W, H133Y, H142W, P144W, Y156W, Y158W, K176L, E185P, I201Y, H205Y, K213T, S239A, S239Q, F279W, H316W, L318W, Q360S, D416V и H450W.

В предпочтительном варианте осуществления вариант содержит замену в положении, соответствующем положению 437, в частности, замену R437W, в комбинации с заменой в одном или нескольких положениях, соответствующих любому из положений 1, 2, 68, 71, 126, 133, 142, 144, 156, 158, 176, 185, 201, 205, 213, 239, 279, 316, 318, 360, 416 и 450, в частности, с одной или несколькими заменами, выбранными из группы, состоящей из A1H, A1W, N2H, N2W, H68W, G71W, N126W, H133Y, H142W, P144W, Y156W, Y158W, K176L, E185P, I201Y, H205Y, K213T, S239A, S239Q, F279W, H316W, L318W, Q360S, D416V и H450W, и вариант характеризуется по меньшей мере 60%, например, по меньшей мере 65%, по меньшей мере 70%, по меньшей мере 75%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 91%, по меньшей мере 92%, по меньшей мере 93%, по меньшей мере 94%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99% идентичностью последовательности с (i) зрелым полипептидом с SEQ ID NO: 1 или (ii) аминокислотами 1-483 из SEQ ID NO: 1.

В предпочтительном варианте осуществления вариант содержит замену в положении, соответствующем положению 437, в частности, замену R437W, в комбинации с заменой в одном или нескольких положениях, соответствующих любому из положений 1, 2, 68, 71, 126, 133, 142, 144, 156, 158, 176, 185, 201, 205, 213, 239, 279, 316, 318, 360, 416 и 450, в частности, с одной или несколькими заменами, выбранными из группы, состоящей из A1H, A1W, N2H, N2W, H68W, G71W, N126W, H133Y, H142W, P144W, Y156W, Y158W, K176L, E185P, I201Y, H205Y, K213T, S239A, S239Q, F279W, H316W, L318W, Q360S, D416V и H450W, и вариант характеризуется по меньшей мере 60%, например, по меньшей мере 65%, по меньшей мере 70%, по меньшей мере 75%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 91%, по меньшей мере 92%, по меньшей мере 93%, по меньшей мере 94%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99% идентичностью последовательности с (i) зрелым полипептидом с SEQ ID NO: 14 или (ii) аминокислотами 1-481 из SEQ ID NO: 14.

В предпочтительном варианте осуществления вариант содержит набор замен, выбранных из группы, состоящей из:

A1H+N2W+K176L+E185P,

A1W+N2H+K176L+E185P,

N2H+H68W+H133Y+K176L+E185P,

N2H+H68W+Y156W+K176L+E185P,

N2H+H68W+Y158W+K176L+E185P,

N2H+H68W+K176L+E185P,

N2H+H68W+K176L+E185P+I201Y+H205Y+D207V+V209D,

N2H+H68W+K176L+E185P+F279W,

N2H+H133Y+K176L+E185P+H316W+R437W,

N2H+H133Y+K176L+E185P+Q360S+R437W,

N2H+H142W+K176L+E185P+H316W+R437W,

N2H+H142W+K176L+E185P+Q360S+R437W,

N2H+P144W+K176L+E185P,

N2H+Y156W+Y158W+K176L+E185P+H316W+R437W,

N2H+Y156W+K176L+E185P+Q360S+R437W,

N2H+Y158W+K176L+E185P+I201Y+H205Y+D207V+V209D+H316W,

N2H+K176L+E185P,

N2H+K176L+E185P+H316W,

N2H+K176L+E185P+H316W+L318W+R437W,

N2H+K176L+E185P+H316W+Q360S+R437W,

N2H+K176L+E185P+H316W+R437W,

N2H+K176L+E185P+R437W,

N2H+K176L+E185P+Q360S+R437W,

N2H+K176L+E185P+H316W+Q360S+R437W,

N2H+K176L+I201Y+H205Y+K213T+Q360S+D416V+R437W,

H68W+K176L+E185P,

H68W+K176L+E185P+I201Y+H205Y+K213T+Q360S+D416V+R437W,

H68W+K176L+I201Y+H205Y+K213T+Q360S+D416V+R437W,

G71W+K176L+E185P,

N126W+K176L+I201Y+H205Y+K213T+Q360S+D416V+R437W,

H133Y+Y158W+K176L+E185P+I201Y+H205Y+K213T+Q360S+D416V+R437W,

H133Y+K176L+I201Y+H205Y+K213T+Q360S+D416V+R437W,

H142W+Y158W+K176L+E185P+I201Y+H205Y+K213T+Q360S+D416V+R437W,

H142W+K176L+E185P,

H142W+K176L+E185P+I201Y+H205Y+K213T+Q360S+D416V+R437W,

H142W+K176L+I201Y+H205Y+K213T+Q360S+D416V+R437W,

P144W+K176L+E185P,

Y156W+Y158W+K176L+E185P+I201Y+H205Y+K213T+Q360S+D416V+R437W,

Y156W+Y158W+K176L+E185P+H316W+R437W,

Y156W+K176L+E185P+Q360S+R437W,

Y156W+K176L+I201Y+H205Y+K213T+Q360S+D416V+R437W,

Y158W+K176L+E185P,

Y158W+K176L+E185P+I201Y+H205Y+D207V+V209D+H316W,

Y158W+K176L+E185P+I201Y+H205Y+K213T+H316L+L318W+Q360S+D416V+R437, Y158W+K176L+E185P+I201Y+H205Y+K213T+H316W+Q360S+D416V+R437W,

Y158W+K176L+E185P+I201Y+H205Y+K213T+Q360S+D416V+R437W,

Y158W+K176L+I201Y+H205Y+K213T+Q360S+D416V+R437W,

K176L+E185P,

K176L+E185P+I201Y+H205Y+K213T+Q360S+D416V+R437W,

K176L+E185P+I201Y+H205Y+R437W,

K176L+E185P+F279W,

K176L+E185P+H316W,

K176L+E185P+L318W,

K176L+E185P+H450W,

K176L+I201Y+H205Y+K213T+S239Q+Q360S+D416V+R437W,

K176L+I201Y+H205Y+K213T+H316W+Q360S+D416V+R437W,

K176L+I201Y+H205Y+K213T+L318W+Q360S+D416V+R437W,

K176L+I201Y+H205Y+K213T+Q360S+D416V+R437W,

K176L+I201Y+H205Y+K213T+Q360S+R437W,

K176L+I201Y+H205Y+K213T+D416V+R437W, и

K176L+I201Y+H205Y+Q360S+D416V+R437W.

В еще одном предпочтительном варианте осуществления вариант содержит набор замен, выбранных из группы, состоящей из:

A1H+N2W+K176L+E185P,

A1W+N2H+K176L+E185P,

N2H+H68W+H133Y+K176L+E185P,

N2H+H68W+Y156W+K176L+E185P,

N2H+H68W+Y158W+K176L+E185P,

N2H+H68W+K176L+E185P,

N2H+H68W+K176L+E185P+I201Y+H205Y+D207V+V209D,

N2H+H68W+K176L+E185P+F279W,

N2H+H133Y+K176L+E185P+H316W+R437W,

N2H+H133Y+K176L+E185P+Q360S+R437W,

N2H+H142W+K176L+E185P+H316W+R437W,

N2H+H142W+K176L+E185P+Q360S+R437W,

N2H+P144W+K176L+E185P,

N2H+Y156W+Y158W+K176L+E185P+H316W+R437W,

N2H+Y156W+K176L+E185P+Q360S+R437W,

N2H+Y158W+K176L+E185P+I201Y+H205Y+D207V+V209D+H316W,

N2H+K176L+E185P,

N2H+K176L+E185P+H316W,

N2H+K176L+E185P+H316W+L318W+R437W,

N2H+K176L+E185P+H316W+Q360S+R437W,

N2H+K176L+E185P+H316W+R437W,

N2H+K176L+E185P+R437W,

N2H+K176L+E185P+Q360S+R437W,

N2H+K176L+E185P+H316W+Q360S+R437W,

N2H+K176L+I201Y+H205Y+K213T+Q360S+D416V+R437W,

H68W+K176L+E185P,

H68W+K176L+E185P+I201Y+H205Y+K213T+Q360S+D416V+R437W,

H68W+K176L+I201Y+H205Y+K213T+Q360S+D416V+R437W,

G71W+K176L+E185P,

N126W+K176L+I201Y+H205Y+K213T+Q360S+D416V+R437W,

H133Y+Y158W+K176L+E185P+I201Y+H205Y+K213T+Q360S+D416V+R437W,

H133Y+K176L+I201Y+H205Y+K213T+Q360S+D416V+R437W,

H142W+Y158W+K176L+E185P+I201Y+H205Y+K213T+Q360S+D416V+R437W,

H142W+K176L+E185P,

H142W+K176L+E185P+I201Y+H205Y+K213T+Q360S+D416V+R437W,

H142W+K176L+I201Y+H205Y+K213T+Q360S+D416V+R437W,

P144W+K176L+E185P,

Y156W+Y158W+K176L+E185P+I201Y+H205Y+K213T+Q360S+D416V+R437W,

Y156W+Y158W+K176L+E185P+H316W+R437W,

Y156W+K176L+E185P+Q360S+R437W,

Y156W+K176L+I201Y+H205Y+K213T+Q360S+D416V+R437W,

Y158W+K176L+E185P,

Y158W+K176L+E185P+I201Y+H205Y+D207V+V209D+H316W,

Y158W+K176L+E185P+I201Y+H205Y+K213T+H316L+L318W+Q360S+D416V+

R437W,

Y158W+K176L+E185P+I201Y+H205Y+K213T+H316W+Q360S+D416V+R437W,

Y158W+K176L+E185P+I201Y+H205Y+K213T+Q360S+D416V+R437W,

Y158W+K176L+I201Y+H205Y+K213T+Q360S+D416V+R437W,

K176L+E185P,

K176L+E185P+I201Y+H205Y+K213T+Q360S+D416V+R437W,

K176L+E185P+I201Y+H205Y+R437W,

K176L+E185P+F279W,

K176L+E185P+H316W,

K176L+E185P+L318W,

K176L+E185P+H450W,

K176L+I201Y+H205Y+K213T+S239Q+Q360S+D416V+R437W,

K176L+I201Y+H205Y+K213T+H316W+Q360S+D416V+R437W,

K176L+I201Y+H205Y+K213T+L318W+Q360S+D416V+R437W,

K176L+I201Y+H205Y+K213T+Q360S+D416V+R437W,

K176L+I201Y+H205Y+K213T+Q360S+R437W,

K176L+I201Y+H205Y+K213T+D416V+R437W, и

K176L+I201Y+H205Y+Q360S+D416V+R437W.

В предпочтительном варианте осуществления вариант содержит набор замен, выбранных из группы, состоящей из:

T49H+K176L+E185P,

T49G+K176L+E185P,

T49L+S50T+K176L+E185P,

T116G+K176L+E185P,

K176L+E185P,

K176L+E185P+I201Y+H205Y+K213T+Q360S+D416V+R437W,

K176L+E185P+L241D,

K176L+E185P+R375V, и

K176L+E185P+R375G.

В еще одном предпочтительном варианте осуществления вариант содержит набор замен, выбранных из группы, состоящей из:

G48A+T49H+G107A+H156Y+K176L+A181T+E185P+N190F+I201F+A209V+Q264S;

G48A+T49G+G107A+H156Y+K176L+A181T+E185P+N190F+I201F+A209V+Q264S;

G48A+T49L+S50T+G107A+H156Y+K176L+A181T+E185P+N190F+I201F+A209V+

Q264S;

G48A+T49I+G107A+T116G+H156Y+K176L+A181T+E185P+N190F+I201F+A209V+

Q264S;

G48A+T49I+G107A+H156Y+K176L+A181T+E185P+N190F+I201F+A209V+Q264S;

G48A+T49I+G107A+H156Y+K176L+A181T+E185P+N190F+I201Y+H205Y+A209V+

K213T+Q264S+Q360S+D416V+R437W;

G48A+T49I+G107A+H156Y+K176L+A181T+E185P+N190F+I201F+L241D+A209V+

Q264S;

G48A+T49I+G107A+H156Y+K176L+A181T+E185P+N190F+I201F+A209V+Q264S+

R375V;

G48A+T49I+G107A+H156Y+K176L+A181T+E185P+N190F+I201F+A209V+Q264S+

R375G; и

G48A+G107A+H156Y+K176L+A181T+E185P+N190F+I201F+A209V+Q264S.

В одном варианте осуществления вариант содержит замену в положении 176 и/или 185. Предпочтительно, замена представляет собой 176+185 и, более предпочтительно, K176L+E185P.

В одном варианте осуществления вариант содержит замену в одном или нескольких положениях 176, 185, 360 и/или 437. Предпочтительно, замена представляет собой 176+185+360+437 и, более предпочтительно, K176L+E185P+Q360S+R437W.

В одном варианте осуществления вариант дополнительно содержит делецию в обоих из двух положений непосредственно перед положением, соответствующим положению 180 из SEQ ID NO: 1. Т.e. делецию двух аминокислот, соответствующих положениям 181 и 182 из SEQ ID NO: 2.

В еще одном варианте осуществления вариант дополнительно содержит делецию двух аминокислот после положения, соответствующего положению 177 из SEQ ID NO: 1 и перед положением, соответствующим положению 180 из SEQ ID NO: 1. Т.e. делецию двух аминокислот в пептиде R179-G180-I181-G182 из SEQ ID NO: 2 или гомологичных аминокислот в любой из SEQ ID NO: 3-11.

Варианты могут дополнительно содержать одно или более (например, несколько) дополнительных изменений, например, одну или более (например, несколько) дополнительных замен.

Дополнительные аминокислотные изменения могут иметь несущественную природу, то есть представлять собой консервативные аминокислотные замены или вставки, которые не оказывают существенного влияния на укладку и/или активность белка; небольшие делеции, как правило, 1-30 аминокислот; небольшие амино- или карбокси-концевые удлинения, такие как амино-концевой остаток метионина; небольшой линкерный пептид до 20-25 остатков или небольшое удлинение, которое облегчает очистку путем изменения суммарного заряда или другой функции, такое как полигистидиновый участок, антигенный эпитоп или связывающий домен.

Примерами консервативных замен являются замены в пределах групп основных аминокислот (аргинин, лизин и гистидин), кислых аминокислот (глутаминовая кислота и аспарагиновая кислота), полярных аминокислот (глутамин и аспарагин), гидрофобных аминокислот (лейцин, изолейцин и валин), ароматических аминокислот (фенилаланин, триптофан и тирозин) и малых аминокислот (глицин, аланин, серин, треонин и метионин). Аминокислотные замены, которые в целом не изменяют специфическую активность, известны из уровня техники и описаны, например, H. Neurath and R.L. Hill, 1979, в The Proteins, Academic Press, New York. Обычные замены представляют собой Ala/Ser, Val/Ile, Asp/Glu, Thr/Ser, Ala/Gly, Ala/Thr, Ser/Asn, Ala/Val, Ser/Gly, Tyr/Phe, Ala/Pro, Lys/Arg, Asp/Asn, Leu/Ile, Leu/Val, Ala/Glu и Asp/Gly.

В качестве альтернативы, изменения аминокислот имеют такую природу, что физико-химические свойства полипептидов изменяются. Например, изменения аминокислот могут улучшать термостабильность полипептида, изменять субстратную специфичность, изменять оптимальное значение pH и т.п.

Существенные аминокислоты в полипептиде можно идентифицировать в соответствии с процедурами, известными в данной области техники, такими как сайт-направленный мутагенез или аланин-сканирующий мутагенез (Cunningham and Wells, 1989, Science 244: 1081-1085). В последней методике отдельные мутации, заключающиеся в замене на аланин, вводят в каждый остаток в молекуле, и полученные в результате мутантные молекулы тестируют в отношении альфа-амилазной активности для идентификации аминокислотных остатков, которые определяют активность молекулы. См. также Hilton et al., 1996, J. Biol. Chem. 271: 4699-4708. Активный центр при ферментативном или другом биологическом взаимодействии можно также определить с помощью физического анализа структуры, которую определяют с помощью таких методик, как ядерный магнитный резонанс, кристаллография, дифракция электронов или фотоаффинное мечение в сочетании с мутацией аминокислот предполагаемого контактирующего центра. См., например, de Vos et al., 1992, Science 255: 306-312; Smith et al., 1992, J. Mol. Biol. 224: 899-904; Wlodaver et al., 1992, FEBS Lett. 309: 59-64. Об идентичности существенных аминокислот можно также сделать заключение на основании выравнивания с родственным полипептидом.

Варианты могут состоять из 300-700 аминокислот, например, 350-650, 400-600, 450-500 или 470-490 аминокислот.

В конкретном аспекте вариант альфа-амилазы присутствует в количестве приблизительно 0,0001-3 мг белка-фермента на грамм сухих веществ, например, 0,0005-2 мг EP/г DS, предпочтительно, 0,001-1 мг/г DS, более предпочтительно, 0,005-0,5 мг EP/г DS, и еще более предпочтительно, 0,005-0,006 мг EP/г.

Глюкоамилаза

В предпочтительном варианте осуществления глюкоамилазу (E.C.3.2.1.3) можно получить из микроорганизма или растения.

Глюкоамилаза предпочтительно представляет собой глюкоамилазу, полученную из штамма рода Aspergillus, предпочтительно, A. niger, A. awamori или A. oryzae, или штамма Talaromyces, предпочтительно, штамма Talaromyes emersonii или штамма Athelia, предпочтительно, Athelia rolfsii (ранее обозначаемая Corticium rolfsii-см., например, патент США № 4727026).

Предпочтительными являются глюкоамилазы из Trametes, такие как глюкоамилаза из Trametes cingulata (WO 2006/069289) или ее варианты или фрагменты.

Иллюстративная глюкоамилаза грибного или бактериального происхождения выбрана из группы, состоящей из глюкоамилаз из Aspergillus, в частности, G1 или G2 глюкоамилазы из A. niger (Boel et al., 1984, EMBO J. 3 (5): 1097-1102) или ее вариантов, таких как раскрытые в WO 92/00381 и WO 00/04136; глюкоамилазы из A. awamori (WO 84/02921), A. oryzae (Agric. Biol. Chem., 1991, 55(4): 941-949) или их вариантов или фрагментов.

Другие предусмотренные варианты глюкоамилаз из Aspergillus включают варианты для повышения термостабильности: G137A и G139A (Chen et al., 1996, Prot. Engng. 9: 499-505); D257E и D293E/Q (Chen et al., 1995, Prot. Engng. 8: 575-582); N182 (Chen et al., 1994, Biochem. J. 301: 275-281); дисульфидные связи, A246C (Fierobe et al., 1996, Biochemistry, 35: 8698-8704; и введение остатков Pro в положение A435 и S436 (Li et al., 1997, Protein Engng. 10: 1199-1204. Кроме того, Clark Ford выступил с докладом 17 октября 1997 года, ENZYME ENGINEERING 14, Beijing/China Oct 12-17, 97, Abstract book p. 0-61. В реферате высказано предположение, что мутации в положениях G137A, N20C/A27C и S30P в глюкоамилазе из Aspergillus awamori улучшают термостабильность.

Другие предусмотренные глюкоамилазы включают в себя глюкоамилазы из Talaromyces, в частности, полученные из Talaromyces emersonii (WO 99/28448), Talaromyces leycettanus (патент США № RE 32153), Talaromyces duponti, Talaromyces thermophilus (патент США № 4587215). Предусмотренные бактериальные глюкоамилазы включают в себя глюкоамилазы из рода Clostridium, в частности, C. thermoamylolyticum (EP 135138) и C. thermohydrosulfuricum (WO 86/01831). Предпочтительные глюкоамилазы включают в себя глюкоамилазы, полученные из Aspergillus oryzae. Также предусмотрены коммерческие продукты AMG 200L; AMG 300 L; SAN™ SUPER и AMG™ E (от Novozymes); OPTIDEX™ 300 (от Genencor Int.); AMIGASE™ и AMIGASE™ PLUS (от DSM); G-ZYME™ G900 (от Enzyme Bio-Systems); G-ZYME™ G990 ZR (глюкоамилаза из A. niger с низким содержанием протеаз).

Глюкоамилазу можно, соответствующим образом, добавлять в количествах 0,005-2 AGU/г DS, предпочтительно, 0,02-2,0 AGU/г DS, предпочтительно, 0,01-1 AGU/г DS, например, в частности, около 0,3 AGU/г DS или около 0,2 AGU/г DS. Глюкоамилазы можно также добавлять в других эффективных количествах, хорошо известных специалисту в данной области техники.

Пуллуланаза

Пуллуланазы (E.C. 3.2.1.41, пуллулан 6-глюканогидролаза) представляют собой деветвящие ферменты, которые отличаются своей способностью гидролизовать альфа-1,6-гликозидные связи, например, в амилопектине и пуллулане.

Пуллуланаза может представлять собой любую пуллуланазу, предпочтительно, бактериальную пуллуланазу, предпочтительно, полученную из штамма рода Bacillus, в частности, полученную из штамма Bacillus deramificans, Bacillus subtilis, Bacillus amyloderamificans или Bacillus acidopullulyticus.

Специально предусмотренные пуллуланазы, пригодные согласно настоящему изобретению, включают в себя пуллуланазы из Bacillus deramificans, раскрытые как последовательность с номером 4 в WO 01/151620 (включенной в данный документ посредством ссылки), а также пуллуланазы из Bacillus deramificans, раскрытые как последовательности 2, 4 и 6 в WO 2008/024372 (включенной в данный документ посредством ссылки).

Специально предусмотренные пуллуланазы, пригодные согласно настоящему изобретению, включают в себя пуллуланазы из Bacillus amyloderamificans, раскрытые в патенте США № 4560651 (включенной в данный документ посредством ссылки), пуллуланазу, раскрытую как SEQ ID NO: 2 в WO 01/151620 (включенной в данный документ посредством ссылки), и пуллуланазу из Bacillus acidopullulyticus, раскрытую как SEQ ID NO: 6 в WO 01/151620 (включенной в данный документ посредством ссылки) и также описанную в FEMS Mic. Let. (1994) 115, 97-106.

Согласно настоящему изобретению пуллуланазу можно добавлять в эффективном количестве, которое включает в себя предпочтительный диапазон от 1 до 100 мкг на г DS, в частности, от 10 до 60 мкг на г DS. Пуллуланазную активность можно определять в виде NPUN. Анализ для определения NPUN описан в разделе “Материалы и методы” ниже.

В предпочтительном варианте осуществления пуллуланазу применяют в количестве от 1 до 100 мкг белка-фермента на г DS, предпочтительно, от 10 до 60 мкг белка-фермента на г DS. Подходящие коммерчески доступные пуллуланазные продукты включают PROMOZYME D, PROMOZYME™ D2 (Novozymes A/S, Дания), OPTIMAX L-1000, OPTIMAX L-300 и AMANO 8 (Amano, Япония).

Смесь с глюкоамилазной и пуллуланазной активностью

В предпочтительном варианте осуществления осахаривание осуществляют в присутствии смеси, такой как коммерческий продукт со смесью ферментативных активностей, содержащей по меньшей мере глюкоамилазную и пуллуланазную активность. В продукте также могут присутствовать другие активности. Иллюстративные смеси с глюкоамилазной и пуллуланазной активностью включают в себя DEXTROZYME DX 2.0x (Novozymes A/S, Дания), DEXTROZYME DX H (Novozymes A/S, Дания), DEXTROZYME DX 1.5X (Novozymes A/S, Дания), DEXTROZYME DX PLUS 1.5X (Novozymes A/S, Дания), SUHONG GA FERMENT, OPTIMAX 4060 VHP (Genencor Int., США), OPTIMAX SUPRA (Genencor Int., США).

Дополнительные ферменты

В некоторых вариантах осуществления в способы по настоящему изобретению необязательно включены дополнительные ферменты.

Грибная альфа-амилаза

Конкретным ферментом для применения в качестве дополнительного фермента в способах по настоящему изобретению является грибная альфа-амилаза (EC 3.2.1.1), такая как фунгамил-подобная альфа-амилаза. В настоящем раскрытии термин "фунгамил-подобная альфа-амилаза" означает альфа-амилазу, которая демонстрирует высокую гомологию, т.е. более 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85% или даже 90% гомологии с аминокислотной последовательностью с SEQ ID NO: 7. Грибную альфа-амилазу можно добавлять в количестве 0,001-1,0 AFAU/г DS, предпочтительно, от 0,002 до 0,5 AFAU/г DS, предпочтительно, 0,02-0,1 AFAU/г DS, или в других эффективных количествах, хорошо известных специалисту в данной области техники.

Бета-амилаза

Другим конкретным ферментом для применения в качестве дополнительного фермента в способах по настоящему изобретению может быть бета-амилаза (E.C 3.2.1.2). Бета-амилаза представляет собой название, традиционно даваемое экзогенно-действующим мальтогенным амилазам, которые катализируют гидролиз 1,4-альфа-гликозидных связей в амилозе, амилопектине и родственных глюкозных полимерах.

Бета-амилазы были выделены из различных растений и микроорганизмов (W.M. Fogarty and C.T. Kelly, 1979, Progress in Industrial Microbiology, 15: 112-115). Эти бета-амилазы характеризуются диапазоном оптимальных температур от 40°C до 65°C и диапазоном оптимального pH от 4,5 до 7,0. Предусмотренные бета-амилазы включают в себя бета-амилазу из ячменя Spezyme® BBA 1500, Spezyme® DBA и Optimalt™ ME, Optimalt™ BBA от Genencor Int., а также Novozym™ WBA от Novozymes A/S. Бета-амилазу можно добавлять в эффективных количествах, хорошо известных специалисту в данной области техники.

Альфа-амилаза из Bacillus

Альфа-амилаза из Bacillus (зачастую называемая “Термамил-подобные альфа-амилазы”). Широко известные Термамил-подобные альфа-амилазы включают в себя альфа-амилазу, полученную из штамма B. licheniformis (коммерчески доступную как Термамил), альфа-амилазу из B. amyloliquefaciens и B. stearothermophilus. Другие Термамил-подобные альфа-амилазы включают в себя альфа-амилазу, полученную из штаммов Bacillus sp. NCIB 12289, NCIB 12512, NCIB 12513 или DSM 9375, все из которых подробно описаны в WO 95/26397, и альфа-амилазу, описанную Tsukamoto et al., 1988, Biochemical and Biophysical Research Communications, 151: 25-31. В контексте настоящего изобретения Термамил-подобная альфа-амилаза представляет собой альфа-амилазу, которая определена в WO 99/19467 со страницы 3, строка 18 по страницу 6, строка 27. Предусмотренные варианты и гибриды описаны в WO 96/23874, WO 97/41213 и WO 99/19467. Специально предусмотрен рекомбинантный вариант альфа-амилазы из B. stearothermophilus с мутациями: I181*+G182*+N193F. Альфа-амилазы из Bacillus можно добавлять в эффективных количествах, хорошо известных специалисту в данной области техники.

Деветвящие ферменты

Еще одним конкретным ферментом по настоящему способу может быть деветвящий фермент, такой как изоамилаза (E.C. 3.2.1.68) или еще одна пуллуланаза (E.C. 3.2.1.41). Изоамилаза гидролизует альфа-1,6-D-гликозидные ветвящие связи в амилопектине и бета-конечных декстринах и ее можно отличить от пуллуланазы по неспособности изоамилазы разрушать пуллулан и по ограниченному действию на альфа-конечные декстрины. Деветвящий фермент можно добавлять в эффективных количествах, хорошо известных специалисту в данной области техники.

Объем описанного и заявленного в данном документе изобретения не должен ограничиваться конкретными аспектами, раскрытыми в данном документе, поскольку эти аспекты предполагаются как иллюстрации некоторых аспектов настоящего изобретения. Предполагается, что любые эквивалентные аспекты находятся в пределах объема настоящего изобретения. Действительно, различные модификации настоящего изобретения в дополнение к продемонстрированным и описанным в данном документе станут очевидны специалистам в данной области из вышеприведенного описания. Предполагается, что такие модификации также входят в объем прилагаемой формулы изобретения. В случае противоречия настоящее раскрытие, в том числе определения, будет иметь преобладающую силу.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Анализы для измерения амилолитической активности (альфа-амилазной активности)

Анализ с применением PNP-G7:

Альфа-амилазную активность определяют при помощи метода с использованием субстрата PNP-G7. PNP-G7 представляет собой аббревиатуру 4,6-этилиден(G7)-пара-нитрофенил(G1)-α,D-мальтогептаозида, блокированного олигосахарида, который может расщепляться эндоамилазой, такой как альфа-амилаза. После расщепления альфа-глюкозидаза, включенная в набор, дополнительно расщепляет гидролизованный субстрат с высвобождением свободной молекулы PNP, которая имеет желтый цвет и, вследствие этого, может измеряться с помощью спектрофотометрии в видимой области при λ=405 нм (400-420 нм). Набор, содержащий субстрат PNP-G7 и альфа-глюкозидазу, производится Roche/Hitachi (№ по кат. 11876473).

РЕАКТИВЫ:

Субстрат G7-PNP из набора содержит 22 мM 4,6-этилиден-G7-PNP и 52,4 мM HEPES (2-[4-(2-гидроксиэтил)-1-пиперазинил]-этансульфоновая кислота), pH 7,0.

Альфа-глюкозидазный реактив содержит 52,4 мM HEPES, 87 мM NaCl, 12,6 мM MgCl2, 0,075 мM CaCl2, > 4 кЕд/л альфа-глюкозидазы.

Рабочий раствор субстрата готовят смешиванием 1 мл альфа-глюкозидазного реактива с 0,2 мл субстрата G7-PNP. Этот рабочий раствор субстрата готовят непосредственно перед применением.

Буфер для разведения: 50 мM EPPS, 0,01% (вес/объем) Triton X100 (полиэтиленгликоль пара-(1,1,3,3-тетраметилбутил)-фениловый эфир (C14H22O(C2H4O)n (n = 9-10))), 1 мM CaCl2, pH 7,0.

ПОРЯДОК ВЫПОЛНЕНИЯ:

Образец амилазы, подлежащий анализу, разводят в буфере для разведения, чтобы обеспечить рН 7 в разведенном образце. Анализ осуществляют путем переноса 20 мкл разведенных образцов фермента в 96-луночный микротитрационный планшет и добавления 80 мкл рабочего раствора субстрата. Раствор перемешивают и предварительно инкубируют 1 минуту при комнатной температуре и измеряют поглощение каждые 20 сек. в течение 5 минут при OD 405 нм.

Наклон (поглощение в минуту) кривой поглощения в зависимости от времени прямо пропорционален удельной активности (активности на мг фермента) рассматриваемой альфа-амилазы при данном комплексе условий. Образец амилазы следует разбавлять до уровня, при котором наклон составляет менее 0,4 единиц поглощения в минуту.

Анализ активности с применением Phadebas:

Альфа-амилазную активность можно также определить при помощи метода с применением субстрата Phadebas (например, от Magle Life Sciences, Лунд, Швеция). Таблетка Phadebas содержит взаимосвязанные крахмальные полимеры, находящиеся в форме шаровидных микросфер, которые не растворимы в воде. Синий краситель ковалентно связан с этими микросферами. Взаимосвязанные крахмальные полимеры в микросфере разрушаются со скоростью, которая пропорциональна альфа-амилазной активности. Когда альфа-амилаза разрушает крахмальные полимеры, высвобожденный синий краситель растворяется в воде и концентрацию красителя можно определить путем измерения поглощения при 620 нм. Концентрация синего красителя пропорциональна альфа-амилазной активности в образце.

Образец амилазы, подлежащий анализу, разводят в буфере для разведения с требуемым рН. Одну таблетку субстрата суспендируют в 5 мл буфера для определения активности и перемешивают на магнитной мешалке. В процессе перемешивания 150 мкл субстрата переносят в микротитрационный планшет (MTP) или PCR-MTP. К 150 мкл субстрата добавляют 30 мкл разведенного образца амилазы и смешивают. Инкубируют в течение 15 минут при 37°C. Реакцию останавливают добавлением 30 мкл 1M NaOH и смешивают. Центрифугируют MTP в течение 5 минут при 4000xg. Переносят 100 мкл в новый MTP и измеряют поглощение при 620 нм.

Образец амилазы следует разбавлять так, чтобы поглощение при 620 нм составляло от 0 до 2,2.

Анализ EnzChek®:

Для определения остаточной амилазной активности применяли набор EnzChek® Ultra Amylase Assay (E33651, Invitrogen, Ла-Хойя, Калифорния, США).

Субстратом является производное кукурузного крахмала, крахмал DQTM, который представляет собой кукурузный крахмал, меченый красителем BODIPY® FL в такой степени, что флуоресценция гасится. Одну пробирку, содержащую приблизительно 1 мг лиофилизированного субстрата, растворяют в 100 микролитрах 50 мМ ацетата натрия (рН 4,0). Пробирку перемешивают вихревым способом в течение 20 секунд и оставляют при комнатной температуре в темноте с периодическим перемешиванием до полного растворения. Затем добавляют 900 микролитров 100 мM ацетата, 0,01% (вес/объем) TRITON® X100, 0,125 мM CaCl2, pH 5,5, тщательно перемешивают вихревым способом и хранят при комнатной температуре в темноте до применения. Исходный рабочий раствор субстрата готовят путем 10-кратного разведения буфером для определения остаточной активности (100 мM ацетат, 0,01% (вес/объем) TRITON® X100, 0,125 мM CaCl2, pH 5,5). Непосредственно после инкубации фермент разводят до концентрации 10-20 нг белка-фермента/мл в 100 мМ ацетате, 0,01% (вес/объем) TRITON® X100, 0,125 мM CaCl2, pH 5,5.

Для анализа 25 микролитров рабочего раствора субстрата перемешивают в течение 10 секунд с 25 микролитрами разбавленного фермента в черном 384-луночном микротитрационном планшете. Измеряют интенсивность флуоресценции (возбуждение: 485 нм, излучение: 555 нм) один раз в минуту в течение 15 минут в каждой лунке при 25°C и рассчитывают Vmax как наклон графика зависимости интенсивности флуоресценции от времени. График должен быть линейным и анализ остаточной активности корректировали так, чтобы раствор разбавленного эталонного фермента находился в пределах линейного диапазона анализа активности.

Альфа-амилазная активность (KNU(T))

Амилолитическую активность можно определять с применением в качестве субстрата картофельного крахмала. Этот способ основан на разложении модифицированного картофельного крахмала ферментом, и реакция сопровождается перемешиванием образцов крахмала/раствора фермента с раствором йода. Первоначально образуется черно-синий цвет, но в ходе разложения крахмала синий цвет становится слабее и постепенно превращается в красновато-коричневый, который сравнивают со стандартом из цветного стекла.

Одну килоединицу альфа-амилазы Novo (KNU(T)) определяют как количество фермента, которое, при стандартных условиях (т.е. при 37°C +/- 0,05; 0,0003 M Ca2+ и pH 5,6) превращает в декстрины 5260 мг сухого вещества крахмала Amylum solubile от Merck.

Анализ глюкоамилазной активности (AGU)

Глюкоамилазную активность можно измерить в глюкоамилазных единицах (AGU).

Единицу глюкоамилазы Novo (AGU) определяют как количество фермента, которое гидролизует 1 микромоль мальтозы в минуту при стандартных условиях 37°C, pH 4,3, субстрат: мальтоза 23,2 мM, буфер: ацетат 0,1 M, время реакции 5 минут.

Можно применять автоматическую аналитическую систему. К глюкозодегидрогеназному реактиву добавляют мутаротазу, так что любая присутствующая альфа-D-глюкоза превращается в бета-D-глюкозу. Глюкозодегидрогеназа специфически реагирует с бета-D-глюкозой в реакции, упомянутой выше, с образованием NADH, который определяют с помощью фотометра при 340 нм в качестве показателя исходной концентрации глюкозы.

Инкубация AMG:
Субстрат: мальтоза 23,2 мМ
Буфер: ацетатный 0,1 М
pH: 4,30±0,05
Температура инкубации: 37°C ± 1
Время реакции: 5 минут
Рабочий диапазон для фермента: 0,5-4,0 AGU/мл

Цветная реакция:
Глюкозодегидрогеназа: 430 Ед/л
Мутаротаза: 9 Ед/л
NAD:
Буфер: фосфат 0,12 M; 0,15 M NaCl
pH: 7,60±0,05
Температура инкубации: 37°C ± 1
Время реакции: 5 минут
Длина волны: 340 нм

Определение пуллуланазной активности (NPUN)

Эндопуллуланазную активность в NPUN измеряют относительно стандарта пуллуланазы от Novozymes. Одну пуллуланазную единицу (NPUN) определяют как количество фермента, которое высвобождает 1 микромоль глюкозы в минуту при стандартных условиях (0,7% пуллулана красного (Megazyme), pH 5, 40°C, 20 минут). Активность измеряют в NPUN/мл с применением пуллулана красного.

1 мл разбавленного образца или стандарта инкубируют при 40°C в течение 2 минут. Добавляют 0,5 мл 2% пуллулана красного, 0,5 M KCl, 50 мM лимонной кислоты, pH 5, и смешивают. Пробирки инкубируют при 40°C в течение 20 минут и останавливают добавлением 2,5 мл 80% этанола. Пробирки оставляют стоять при комнатной температуре в течение 10-60 минут и затем центрифугируют в течение 10 минут при 4000 об/мин. Затем измеряют OD в надосадочной жидкости при 510 нм и рассчитывают активность с использованием стандартной кривой.

Определение лизофосфолипазной активности (LLU)

Лизофосфолипазную активность в LLU измеряют относительно стандарта лизофосфолипазы от Novozymes. Лизофосфолипаза (EC 3.1.1.5) катализирует гидролиз L-альфа-лизофосфатидилхолина до глицерофосфохолина и свободных жирных кислот. Активность фермента пропорциональна количеству высвобожденных свободных жирных кислот. Их количественно оценивают с помощью ферментативного колориметрического набора Wako NEFA-HR(2) при 37°C, pH 6,9. Образцы растворяют и разбавляют до приблизительно 0,00714 LLU/мл в мерной колбе с помощью разбавителя (4,9 мM MgCl2, 5,0 мM CaCl2, 0,15% Brij, 10 мM ацетат натрия, pH 5,5) и перемешивают в течение 15 минут. Образцы дополнительно разбавляют разбавителем (4,9 мM MgCl2, 5,0 мM CaCl2, 0,15% Brij, 10 мM ацетат натрия, pH 5,5) до конечного разведения приблизительно 0,00714 LLU/мл. Измеряют поглощение при 540 нм и рассчитывают активность с использованием стандартной кривой.

Определение профиля сахаров и солюбилизированных сухих веществ

DE можно рассчитывать согласно способам, известным в данной области техники, как описано, например, в Rong et al., J. Food Science, vol. 74., nr. 1, C33-C40 (2009).

Композицию сахаров в гидролизатах крахмала определяют с помощью HPLC и вслед за этим выход глюкозы рассчитывают как DX. °BRIX, солюбилизированные (растворимые) сухие вещества гидролизатов крахмала, определяют путем измерения показателя преломления.

Материалы

Варианты альфа-амилазы

Тестируемые варианты альфа-амилазы представляют собой варианты LE399 (SEQ ID NO: 14, ранее раскрыта, например, в WO 2002/010355), описанные в WO 2013/057143. LE399 содержит аминокислоты 1-37 из альфа-амилазы из Bacillus amyloliquefaciens (SEQ ID NO: 6) и аминокислоты 40-483 из альфа-амилазы из Bacillus licheniformis (SEQ ID NO: 1) со следующими заменами G48A T49I G107A H156Y A181T N190F I201F A209V Q264S. Замены в каждом варианте, перечисленные ниже, представляют собой замены по сравнению с LE399. Нумерация положений находится в соответствии с SEQ ID NO: 1.

LE399 на две аминокислоты короче, чем SEQ ID NO: 1, на N-конце, т.е. отсутствуют аминокислоты, соответствующие положениям 1 и 2 из SEQ ID NO: 1 в LE399. Изменение, отмеченное в таблицах как *2aH, означает вставку H перед N-концевой V из LE399. Аналогичное изменение в SEQ ID NO: 1 будет заменой аминокислоты N2 на H, т.e. N2H (в качестве альтернативы, делецией аминокислоты A1 в сочетании с заменой аминокислоты N2 на H, т.e. A1* N2H). Подобным образом, изменения, отмеченные в таблицах как *2aH *2bW, означают вставку HW перед N-концевой V из LE399. Аналогичное изменение в SEQ ID NO: 1 будет заменами A1H N2W.

Вариант А альфа-амилазы:

H68W+K176L+E185P+I201Y+H205Y+K213T+Q360S+D416V+R437W

Вариант В альфа-амилазы:

H142W+K176L+E185P+I201Y+H205Y+K213T+Q360S+D416V+R437W

Вариант С альфа-амилазы: N2H+H133Y+K176L+E185P+Q360S+R437W

Вариант D альфа-амилазы:

K176L+E185P+I201Y+H205Y+K213T+Q360S+D416V+R437W

Фермент осахаривания

Фермент осахаривания А: Dextrozyme DX 2,0x доступен от Novozymes A/S, характеризуется глюкоамилазной и пуллуланазной активностью.

Фермент осахаривания B: Optimax 4060 VHP доступен от DuPont/Genencor, характеризуется глюкоамилазной и пуллуланазной активностью.

Фермент осахаривания C: Dextrozyme DX 1,5X доступен от Novozymes A/S, характеризуется глюкоамилазной и пуллуланазной активностью.

Фермент осахаривания D: Dextrozyme DX Plus 1,5X доступен от Novozymes A/S, характеризуется глюкоамилазной и пуллуланазной активностью.

Фермент Активность
Фермент осахаривания C 279 AGU, 588,3 NPUN, 35,02 LLU
Фермент осахаривания D 378,2 AGU/г, 1574,0 NPUN/г, 35,37 LLU/г
Фермент осахаривания B 329 AGU/г, 666 NPUN_XD/г, 25,8 FAU (A)/г
Вариант А альфа-амилазы 580 KNU (T)/г

Иллюстративное оборудование

• Устройство для манипулирования жидкостями Gilson 215 (серийный №: 259C9200)

• Флаконы на 50 мл от Pyrex (артикул: 1395-50) с перегородками

• Небольшие якоря для магнитной мешалки

• Компьютер с программным обеспечением Gilson 735 Sampler

• Шприцевые фильтры Millipore 13 мм Millex Nylon 0,2 мкм (артикул: SLGNX13NK)

• Пробирки для HPLC

• Боросиликатные пробирки, 16×100 мм (артикул: 14-961-29)

Пример 1

100 кг кукурузного крахмала суспендировали в водопроводной воде, содержащей 100 ppm Ca2+, и объем доводили до 225 литров. Значение pH доводили до 6,3 и добавляли 135 г варианта альфа-амилазы.

Эту суспензию непрерывно прокачивали через струйный варочный котел (Hydro-Thermal Corp. Milwaukee), где ее нагревали до 105°C при подаче и поддерживали при 105°C в течение пяти минут. Суспензию ожиженного крахмала мгновенно охлаждали и перекачивали в осахариватель, где ее выдерживали в течение 1 часа при 95°C.

Значение pH ожиженного крахмала доводили до 4,5 при 95°C для остановки реакции и затем партию подвергали сушке распылением без очистки. DE высушенного распылением мальтодекстрина можно было измерить.

Субстраты для осахаривания готовили путем повторного растворения подходящих количеств этого мальтодекстрина в деионизированной воде и доведения до приблизительно 30% DS. Затем аликвоты этого субстрата брали и нагревали до 50°C и pH доводили до 4,0. Добавляли различные количества фермента осахаривания. Реакционные смеси можно было отбирать через установленные промежутки времени и определяли % декстрозы в каждом образце с помощью HPLC.

Пример 2

Аликвоты субстрата, подготовленного как в примере 1, нагревали до 55°C или 60°C и pH доводили до 4,5 или 6,0. Фермент осахаривания добавляли в различных количествах. Реакционные смеси отбирали и анализировали, как в примере 1.

Пример 3

Аликвоты субстрата, подготовленного как в примере 1, инкубировали при 50°C, 55°C и 60°C при pH 3,5 и 4,0. Добавляли различные количества фермента осахаривания. Реакционные смеси отбирали через установленные промежутки времени и анализировали, как в примере 1.

Пример 4

Аликвоты субстрата, подготовленного как в примере 1, инкубировали при различных значениях рН при 50°C. Добавляли фермент осахаривания. Реакционные смеси отбирали через установленные промежутки времени и анализировали, как в примере 1.

Пример 5

Субстраты в различным содержанием сухих веществ готовили путем растворения 100 г мальтодекстрина из примера 1 в различных количествах деионизированной воды. Образцы нагревали до 60°C и доводили до pH 4,5 или до 50°C и pH 4,0, и добавляли фермент осахаривания. Реакционные смеси отбирали и анализировали, как в примере 1.

Пример 6

Дополнительную партию мальтодекстринового субстрата готовили, как в примере 1. После 1 часа при 90°C pH доводили до 4,5 и партию подвергали сушке распылением. DE мальтодекстрина можно было измерить.

Субстраты для осахаривания можно было готовить путем повторного растворения подходящих количеств мальтодекстрина в деионизированной воде и доведения содержания твердых веществ до приблизительно 30% DS.

Аликвоты восстановленного мальтодекстрина нагревали до 50°C и 55°C и pH доводили до 4,0. Добавляли фермент осахаривания. Реакционные смеси отбирали через регулярные промежутки и определяли содержание декстрозы с помощью HPLC.

Пример 7

Субстраты в различным содержанием сухих веществ готовили путем растворения 100 г мальтодекстрина из примера 6 в различных количествах деионизированной воды. Образцы нагревали до 55°C и 60°C и доводили до pH 4,5 или до 55°C и pH 4,0, и добавляли фермент осахаривания. Реакционные смеси отбирали и анализировали, как в примере 1.

Пример 8

Глюкозный сироп готовили путем обработки суспензии крахмала, содержащей 30% DS (30% сухого вещества) крахмала воскового маиса, 40 ppm Ca2+ (в виде CaCl2), при pH 6,0 с 0,1 мг белка-фермента/г DS варианта альфа-амилазы. Температуру поддерживали при 95°С в течение одного часа и 80°С в течение 72 часов.

Пример 9A

День 1: 125,2 кг маисового крахмала (C*PharmGel 03406, Cargill Europe Limited) с 56 ppm кальция объединяли с 210 кг воды, полученной с помощью ионообмена, и доводили до проводимости 501 мкСм/см и pH 5,19. Добавляли Liquozyme Supra (Novozymes A/S) из расчета дозы фермента 0,25 кг/т DS. Суспензию прокачивали через струйный варочный котел, где ее нагревали до 105°C при скорости потока 230 л/ч в течение времени удержания 5 минут. Суспензию после обработки в струйном варочном котле собирали в резервуар и температуру постепенно доводили до 95°C и выдерживали в течение приблизительно 60 минут, после чего собирали 260 кг суспензии. Декстрозный эквивалент регистрировали с помощью измерения DE (осмометр). Через 55 минут после того, как реакционный резервуар заполняли 260 кг суспензии, гидролиз останавливали доведением рН до 2,8 с помощью HCl. Через приблизительно 30 минут pH повторно доводили до 4,5 и температуру снижали до 72°C для хранения суспензии до следующего дня.

День 2: Измеренная температура составляла 72°C и pH доводили до 4,5. Перемешивание в реакционном резервуаре прекращали и продукт фильтровали с получением 774 л фильтрата с 31,8° Брикс.

День 3: Фильтрат сушили распылением (температура на входе 200°C, температура на выходе 82°C) с получением 58,8 кг конечного продукта. Анализ высушенного распылением продукта показал DE 10,7. Продукт назвали “мальтодекстрин, полученный под действием Liquozyme Supra”.

Пример 9B

123,7 кг маисового крахмала (C*PharmGel 03406, Cargill Europe Limited, ~88% DS) объединяли с 209 кг деминерализованной воды с получением крахмальной суспензии с 33% DS. Значение pH доводили до 4,5 и проводимость доводили до 500 мкСм/см с помощью NaCl. Вариант А альфа-амилазы добавляли до приблизительно 75 KNU(T)/кг DS. Суспензию прокачивали через струйный варочный котел при 106±1°C с последующей вторичной обработкой в струйном варочном котле при 95°C в течение приблизительно 60 минут. Через приблизительно еще один час рН доводили до 2,4 для остановки гидролиза. Через приблизительно 45 минут pH повторно доводили до 4,4 и температуру снижали до 72°C.

Измеренная температура составляла 72°C и pH доводили до 4,5. Перемешивание в реакционном резервуаре прекращали и продукт фильтровали с получением 126 л фильтрата с 32,6° Брикс. Затем фильтрат сушили распылением (температура на входе 200°C, температура на выходе 80°C) с получением 48 кг высушенного распылением порошка, который показывает DE 11,6. Его назвали “мальтодекстрин, полученный под действием варианта А альфа-амилазы”.

Определили, что мальтодекстрин, полученный под действием Liquozyme Supra, и мальтодекстрин, полученный под действием варианта А альфа-амилазы, имели аналогичные среднечисленную молекулярную массу (Mn) и средневесовую молекулярную массу (Mw), и, таким образом, аналогичные значения полидисперсности (PD = Mw/Mn), а также аналогичное распределение от DP1 до DP10 (данные не показаны).

Пример 10

Субстраты для осахаривания готовили путем растворения подходящих количеств мальтодекстрина, полученных в примере 9А-9В, в деионизированной воде и доведения до приблизительно 33% DS. Значение рН раствора доводили до 4,5. Аликвоты этого субстрата отбирали и помещали в флаконы Pyrex на 50 мл. Затем добавляли различные количества фермента осахаривания. Затем образцы нагревали до 60°C в автоматическом манипуляторе для осахаривания Gilson 215. Планировали отбор образцов через установленные промежутки времени. % декстрозы, DP2, DP3 и DP4+ в каждом образце определяли с помощью HPLC.

Условия осахаривания были следующими:

Исходное значение рН 4,5
Температура 60°C
DS мальтодекстрина 33%
Масса образца (г) 45

Пример 11

Фермент осахаривания представлял собой фермент осахаривания С при уровне дозы 0,045% вес/вес. Время осахаривания составляло 48 часов. Отбирали образцы реакционных смесей и анализировали, как в примере 10.

В таблице 1 обобщены результаты осахаривания:

Мальтодекстрин DP1% DP2% DP3% DP4+%
Мальтодекстрин, полученный под действием варианта А альфа-амилазы 95,9 2,2 0,7 1,2
Мальтодекстрин, полученный под действием Liquozyme Supra 95,4 2,2 0,7 1,7

Пример 12

Фермент осахаривания представлял собой фермент осахаривания B при уровне дозы 0,038% вес/вес. Уровень дозы AGU был точно таким же, как в примере 11. Время осахаривания составляло 48 часов. Реакционные смеси отбирали через установленные промежутки времени и анализировали, как в примере 10.

В таблице 2 обобщены результаты осахаривания:

Мальтодекстрин DP1% DP2% DP3% DP4+%
Мальтодекстрин, полученный под действием варианта А альфа-амилазы 94,9 2,2 0,6 2,3
Мальтодекстрин, полученный под действием Liquozyme Supra 93,9 2,1 0,6 3,3

Пример 13

Фермент осахаривания представлял собой фермент осахаривания С при уровне дозы 0,045% вес/вес. К осахариванию добавляли активный LE2488. Время осахаривания составляло 48 часов. Отбирали образцы реакционных смесей и анализировали, как в примере 10.

В таблице 3 обобщены результаты осахаривания:

Мальтодекстрин DP1% DP2% DP3% DP4+%
Мальтодекстрин, полученный под действием варианта А альфа-амилазы 96,0 2,2 0,9 0,9
Мальтодекстрин, полученный под действием Liquozyme Supra - - - -

Пример 14

Фермент осахаривания представлял собой фермент осахаривания B при уровне дозы 0,038% вес/вес. Кроме того, к осахариванию добавляли вариант А альфа-амилазы. Время осахаривания составляло 48 часов. Отбирали образцы реакционных смесей и анализировали, как в примере 10.

В таблице 4 обобщены результаты осахаривания:

Мальтодекстрин DP1% DP2% DP3% DP4+%
Мальтодекстрин, полученный под действием варианта А альфа-амилазы 95,9 2,0 0,8 1,3
Мальтодекстрин, полученный под действием Liquozyme Supra 94,4 2,0 0,7 2,9

Пример 15

Фермент осахаривания представлял собой фермент осахаривания D при уровне дозы 0,033% вес/вес. Уровень дозы AGU был точно таким же, как в примере 11. Время осахаривания составляло 48 часов. Отбирали образцы реакционных смесей и анализировали, как в примере 10.

В таблице 5 обобщены результаты осахаривания:

Мальтодекстрин DP1% DP2% DP3% DP4+%
Мальтодекстрин, полученный под действием варианта А альфа-амилазы 95,8 2,1 0,8 1,4
Мальтодекстрин, полученный под действием Liquozyme Supra 95,7 2,2 0,8 1,4

1. Способ получения декстрозного или фруктозного сиропа, включающий стадии:

a) ожижения водной суспензии гранулированного крахмала вариантом альфа-амилазы, содержащим замены K17L+E185P SEQ ID NO:1, с получением ожиженного крахмалсодержащего материала;

b) осахаривания ожиженного крахмалсодержащего материала со стадии a) в присутствии глюкоамилазы, пуллуланазы, полученной из Bacillus deramificans, Bacillus subtilis, Bacillus amyloderamificans или Bacillus acidopullulyticus, с получением декстрозного сиропа,

где стадия дополнительно включает добавление варианта альфа-амилазы, содержащего замены K176L+E185P SEQ ID NO:1, и, необязательно,

c) изомеризации с получением фруктозного сиропа;

где стадию a) осуществляют при pH 4-7.

2. Способ по п.1, где вариант альфа-амилазы добавляют в количестве приблизительно 0,0001-3 мг белка-фермента на грамм сухих веществ.

3. Способ по п.1 или 2, где пуллуланаза получена из Bacillus deramificans.

4. Способ по п.1 или 2, где суспензия крахмала характеризуется 20-55% сухих веществ гранулированного крахмала.

5. Способ по п.4, где по меньшей мере 85% сухих веществ гранулированного крахмала превращается в сироп, например декстрозный сироп или фруктозный сироп.

6. Способ по п.1 или 2, где гранулированный крахмал получен из клубней, корней, стеблей или цельного зерна.

7. Способ по п.1 или 2, где гранулированный крахмал получен из зерновых культур.

8. Способ по п.1 или 2, где гранулированный крахмал получен из кукурузы, стержней початка кукурузы, пшеницы, ячменя, ржи, майло, саго, маниоки, тапиоки, сорго, риса или картофеля.

9. Способ по п.8, где гранулированный крахмал получен в результате сухого помола цельного зерна или в результате мокрого помола цельного зерна.



 

Похожие патенты:

Изобретение относится к биотехнологии. Предложен способ повышения степени извлечения декстрозы из содержащего декстрозу раствора.

Описаны композиции ферментной смеси для гидролиза смеси целлюлозных и гемицеллюлозных материалов и способы гидролиза таких смесей. Представленные ферментные смеси включают три композиции, первая из которых содержит смесь цельной целлюлазы T.reesei, дополненную β-глюкозидазой Т.

Изобретение относится к биотехнологии и пищевой промышленности и касается способа ферментативного гидролиза зернистого крахмала в растворимый гидролизат крахмала при температуре ниже, чем начальная температура желатинизации указанного зернистого крахмала.

Изобретение относится к биотехнологии . .

Группа изобретений относится к области биохимии. Предложен способ получения кристаллического мальтита и способ получения отвержденного мальтита.

Изобретение относится к области биотехнологии. .
Настоящее изобретение относится к жидкостям для бурения скважин на водной основе. Обнаружено, что частицы на основе целлюлозы, которые включают в свой состав материал клеточных стенок, а также сетчатые структуры их волокон и нанофибрилл на основе целлюлозы, могут быть использованы для получения суспензий, характеризующихся вязкостью и реологическими характеристиками, в частности, удовлетворяющими требованиям для использования в качестве бурового раствора.

Изобретение относится к биотехнологии. Предложен способ повышения степени извлечения декстрозы из содержащего декстрозу раствора.

Изобретение относится к способу получения фибриллированного целлюлозного материала и к фибриллированной целлюлозе. Способ получения фибриллированного целлюлозного материала включает фибриллирование исходного материала на основе целлюлозы с помощью фермента(ов) и усиление фибриллирования путем механического перемешивания, перед фибриллированием исходный материал на основе целлюлозы добавляют в суспензию, содержащую, таким образом, после добавления исходный материал на основе целлюлозы с консистенцией от 10% до 60%, после чего фибриллирование выполняют с применением ферментативной смеси, проявляющей главным образом целлобиогидролазную активность и низкую эндоглюканазную активность, при этом эндоглюканазная активность является достаточной для создания новых концевых групп цепи, в сочетании с механическим перемешиванием без измельчающего действия, и при этом фибриллирование осуществляют в две стадии путем селективного регулирования температуры реакции, при этом на первой стадии выбирают такую температуру реакции, которая позволяет быть активной как целлобиогидролазе, так и эндоглюканазе, и на второй стадии инактивируют эндоглюканазную активность путем повышения температуры реакции.

Группа изобретений относится к области биохимии. Предложен способ получения кристаллического мальтита и способ получения отвержденного мальтита.

Изобретение относится к получению ксилитола. Способ предусматривает обработку лигноцеллюлозного материала водным раствором, который содержит спирт, в частности C1-4 спирт или фенол, и имеет значение pH от 11,0 до 14,0, для расщепления лигноцеллюлозы.

Изобретение относится к пищевой промышленности. Согласно предложенному способу производства сахарной жидкости с применением целлюлозосодержащей биомассы в качестве сырья происходит гидролизация целлюлозосодержащей биомассы для получения водного раствора сахара и его фильтрование через ультрафильтрационную мембрану.
Изобретение относится к биотехнологии. Способ предусматривает увлажнение зерна и бобов и разрушение плющением оболочки и целостной структуры эндосперма зерна и бобовых с образованием развитой структуры трещин в теле зерна и бобов с последующим влажным дроблением зерна, бобов и зерновых отрубей.

Настоящее изобретение относится к способу получения сахаросодержащей жидкости. Способ включает следующие стадии: стадию добавления целлюлазы из мицелиальных грибов к продукту предварительной обработки целлюлозы для получения гидролизата; стадию добавления отбросной мелассы к указанному гидролизату для получения смешанной сахаросодержащей жидкости и стадию подвергания указанной смешанной сахаросодержащей жидкости твердофазно-жидкостному разделению.

Группа изобретений относится к биотехнологии, а именно к непрерывному способу ферментативного гидролиза целлюлозной биомассы и способу получения моносахаридов, химических веществ на основе сахаров, биологических топлив или материалов вместе с сульфонированным лигнином из лигноцеллюлозной биомассы.

Изобретение относится к способу получения жидкого сахара и к устройству для осуществления способа. Способ предусматривает стадию (1) добавления целлюлазы, выделенной из нитчатого гриба, принадлежащего роду Trichoderma, к целлюлозе для осуществления первичного гидролиза, (2)стадию добавления свежей выделенной из нитчатого гриба целлюлазы к гидролизату со стадии (1) для осуществления вторичного гидролиза и стадию (3), на которой гидролизат со стадии (2) подвергают разделению твердого вещества и жидкости, получая жидкий сахар, из которого получают регенерированный фермент, при этом регенерированный фермент, получаемый на стадии (3), используют на стадии (1) следующего и дальнейших процессов получения жидкого сахара, причём способ предусматривает повторение стадий (1)-(3) два или более раза.

Группа изобретений относится к получению тагатозы из фруктозы. Предложен белок для получения тагатозы из фруктозы, имеющий аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO:1-7.

Группа изобретений относится к рекомбинантной дрожжевой клетке-хозяину для продуцирования ксилита и ее применению. Указанная клетка-хозяин продуцирует D-арабит из глюкозы и содержит последовательность гетерологичной нуклеиновой кислоты, кодирующую NAD+-специфическую D-арабит-4-оксидоредуктазу (EC 1.1.1.11), использующую D-арабит в качестве субстрата и дающую D-ксилулозу в качестве продукта, и последовательность гетерологичной нуклеиновой кислоты, кодирующую NADPH-специфическую ксилитдегидрогеназу, использующую D-ксилулозу в качестве субстрата и дающую ксилит в качестве продукта.

Группа изобретений относится к области биохимии. Предложены устройство и способ осуществления фотосинтеза.
Настоящее изобретение относится к жидкостям для бурения скважин на водной основе. Обнаружено, что частицы на основе целлюлозы, которые включают в свой состав материал клеточных стенок, а также сетчатые структуры их волокон и нанофибрилл на основе целлюлозы, могут быть использованы для получения суспензий, характеризующихся вязкостью и реологическими характеристиками, в частности, удовлетворяющими требованиям для использования в качестве бурового раствора.

Изобретение относится к биотехнологии и пищевой промышленности и представляет собой способ получения декстрозного или фруктозного сиропа, включающий стадию ожижения водной суспензии гранулированного крахмала вариантом альфа-амилазы, содержащим замены K17L+E185P SEQ ID NO:1, с получением ожиженного крахмалсодержащего материала; осахаривания ожиженного крахмалсодержащего материала со стадии a) в присутствии глюкоамилазы, пуллуланазы, полученной из Bacillus deramificans, Bacillus subtilis, Bacillus amyloderamificans или Bacillus acidopullulyticus, с получением декстрозного сиропа, где стадия дополнительно включает добавление варианта альфа-амилазы, содержащего замены K176L+E185P SEQ ID NO:1, и, необязательно, c) изомеризации с получением фруктозного сиропа; где стадию a) осуществляют при pH 4-7. Изобретение позволяет получить декстрозный или фруктозный сироп с высокой степенью эффективности. 8 з.п. ф-лы, 1 ил., 5 табл., 15 пр.

Наверх