Вектор aav и анализ на нейтрализующие антитела против aav (аденоассоциированного вируса)

Изобретение относится к биотехнологии и представляет собой способ количественного определения антител, которые связываются с AAV, in vitro, включающий: (a) получение инфекционных частиц рекомбинантного AAV, содержащих рекомбинантный вектор AAV, причем рекомбинантный вектор AAV содержит репортерный трансген, где репортерный трансген содержит (a) одноцепочечный или самокомплементарный геном, (b) является функционально связанным с одним или более регуляторными элементами экспрессии, и (c) является фланкированным одним или более фланкирующими элементами;(b) получение биологического образца от индивидуума; (c) получение клеток, которые можно инфицировать указанными инфекционными частицами рекомбинантного AAV; (d) приведение в контакт или инкубирования инфекционных частиц рекомбинантного AAV (a) с биологическим образцом (b), получая таким образом, получаемую смесь (M); (e) приведение клеток в контакт (c) с получаемой смесью (M) в условиях, в которых инфекционные частицы рекомбинантного AAV (a) могут инфицировать и экспрессировать репортерный трансген в указанных клетках; (f) измерение экспрессии репортерного трансгена и (g) сравнение указанной экспрессии репортерного трансгена (f) с репортерным трансгеном отрицательного (-) контроля, (i) не содержащего антитела, которые связываются с AAV, и (+) контроля, (ii) содержащего предопределенное количество антител, которые связываются с AAV, с количественным определением, таким образом, антител в биологическом образце, которые связываются с AAV. 63 з.п. ф-лы, 5 табл., 5 пр.

 

Информация о родственных заявках

[0001] По настоящей заявке испрашивается приоритет временной заявки США номер 61/845841, поданной 12 июля 2013 года, озаглавленной "AAV VECTOR AND ASSAY FOR ANTI-AAV (ADENO-ASSOCIATED VIRUS) NEUTRALIZING ANTIBODIES", которая явным образом полностью включена в настоящее описание посредством ссылки.

Введение

[0002] Гуморальный иммунитет против векторов на основе аденоассоциированного вируса (AAV) представляет собой важный барьер для внутрисосудистого переноса генов, который приводит к клиренсу вектора до того, как проникает в клетку-мишень. Антитела, направленные против капсида AAV, преобладают у людей, естественных хозяев для этого вируса, и перекрестно реагируют с широким диапазоном серотипов вследствие определенной степени гомологии последовательности капсидного белка. В результате даже относительно низкие титры нейтрализующих антител (NAb) могут блокировать трансдукцию AAV, когда вектор вводят в кровоток. В противоположность этому, перенос генов в глаз, головной мозг или прямая внутримышечная доставка векторы AAV, по-видимому, являются менее подверженными нейтрализации NAb.

[0003] NAb против AAV встречаются в синовиальной жидкости (SF) и обладают возможностью ингибировать опосредованную вектором трансдукцию зависящим от серотипа способом. Однако немногое известно об уровнях Nab против различных серотипов в SF и взаимоотношении титра NAb против AAV в сыворотке и титра в SF. Наконец, вследствие того, что NAb может эффективно блокировать опосредованную AAV трансдукцию in vivo, для получения эффективного переноса генов очень важное значение придают стратегиям устранения гуморального иммунитета к вирусному капсиду.

Сущность изобретения

[0004] В настоящем описании раскрыты вирусные векторы, вирусные частицы и способы и применения скрининга для детекции, анализа и определения количеств антитела против вируса или активности нейтрализующего антитела образцов. Такие вирусные векторы, вирусные частицы и способы и применения можно применять к широкому диапазону типов вирусов, таких как лентивирусы, аденовирус и серотипы аденоассоциированного вируса (AAV). С использованием различных вирусных векторов, вирусных частиц и способов и применений скрининга антител можно проводить скрининг, детектировать, анализировать и определять количества иммуноглобулинов (G) против вируса, таких как IgG, IgA, IgM, IgE, IgD.

[0005] Результаты такого скрининга, детекции, анализа или определения количеств можно использовать для определения стабильности индивидуума или типов вектора, или доз для генотерапии (для замены или дополнения дефектного или дефицитного гена или для экспрессии при нокдауне или нокауте дефектного или нежелательного гена) с использованием лентивирусов, аденовируса и серотипов аденоассоциированного вируса (AAV). Например, если у индивидуума экспрессируется незначительное количество антитела или не экспрессируются антитело против конкретного серотипа вируса, такого как серотип AAV 2 (AAV2), то индивидуум является подходящим кандидатом для опосредованной AAV2 генотерапии. Если у индивидуума экспрессируется умеренное или значительное количество антитела против конкретного серотипа вируса, такого как AAV2, то индивидууму может требоваться большая доза или больше доз вектора AAV2 для опосредованной AAV2 генотерапии или в сочетании со средствами или способами фармакологической модуляции B-клеточных ответов. Таким образом, можно получать перенос гена у индивидуумов, которые по иным причинам не являются идеальными кандидатами для видов терапии на основе опосредованного вирусным вектором переноса генов. Альтернативно, для генотерапии такого индивидуума можно применять при наличии вектора не на основе AAV2 (такого как другой серотип AAV). Таким образом, введение вирусного вектора можно персонализировать, в зависимости от наличия или отсутствия, типа и/или количества (например, титра) антител против вируса, которые присутствуют (при наличии) и вектора, выбранного для данного индивидуума в зависимости от наличия, типа и количества антител против вируса у индивидуума.

[0006] Изобретение относится к последовательностям рекомбинантного вектора AAV, где последовательности вектора содержат репортерный трансген. В одном из вариантов осуществления последовательность рекомбинантного вектора AAV содержит репортерный трансген, где репортерный трансген содержит (a) одноцепочечный или самокомплементарный геном, (b) является функционально связанным с одним или несколькими регуляторными элементами экспрессии, и (c) фланкирован одним или несколькими фланкирующими элементами.

[0007] Изобретение также относится к рекомбинантным векторам AAV, где вектор содержит репортерный трансген. В одном из вариантов осуществления рекомбинантный вектор AAV содержит репортерный трансген, где репортерный трансген содержит (a) одноцепочечный или самокомплементарный геном, (b) является функционально связанным с одним или несколькими регуляторными элементами экспрессии, и (c) фланкирован одним или несколькими фланкирующими элементами. В конкретных вариантах осуществления рекомбинантный вектор AAV содержит инфекционную частицу рекомбинантного AAV.

[0008] Изобретение дополнительно относится к способам и применениям для анализа или детекции, или измерения антител, которые связываются с AAV. В одном из вариантов осуществления способ или применение включает: A) получение инфекционных частиц рекомбинантного AAV, которые that заключают в капсид рекомбинантный вектор, где (i) вектор содержит репортерный трансген, (ii) репортерный трансген содержит одноцепочечный или самокомплементарный геном, и (iii) репортерный трансген является функционально связанным с одним или несколькими регуляторными элементами экспрессии и фланкирован одним или несколькими фланкирующими элементами; B) получения биологического образца от индивидуума для анализа или детекции антител, которые связываются с AAV; C) получение клеток, которые можно инфицировать указанными инфекционными частицами рекомбинантного AAV; D) приведение в контакт или инкубацию инфекционных частиц рекомбинантного AAV (A) с биологическим образцом (B), получая, таким образом, получаемую смесь (M); приведение клеток (C) в контакт с получаемой смесью (M) в условиях, в которых инфекционные частицы рекомбинантного AAV (A) могут инфицировать и экспрессировать репортерный трансген в указанных клетках; измерение экспрессии репортерного трансгена и сравнение указанной экспрессии репортерного трансгена (f) с экспрессией репортерного трансгена контроля, где указанный контроль (i) отрицательный (-) контроль не содержит антитела, который связываются с AAV, или (ii) содержит предопределенное количество антител, которые связываются с AAV. По экспрессии репортерного трансгена (f) выше экспрессии репортерного трансгена указанного (-) контроля анализируют или детектируют, или определяют наличие антител, которые связываются с AAV, в биологическом образце. По экспрессии репортерного трансгена (f) в сравнении с экспрессией репортерного трансгена предопределенного количества антител, которые связываются с AAV, анализируют или детектируют, или измеряют антитела в биологическом образце, которые содержатся в большем или меньшем количестве, чем в контроле.

[0009] В конкретных аспектах изобретения рекомбинантный вектор включает вектор AAV. В более конкретных аспектах вектор AAV включает вектор AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11, AAV12, Rh74 или Rh10 или гибрид или химеру любого из указанных выше векторов AAV.

[0010] В конкретных аспектах изобретения способ или применение осуществляют in vitro. Например, клетки можно приводить в контакт или инкубировать in vitro с инфекционными частицами рекомбинантного AAV.

[0011] В различных вариантах осуществления изобретения анализируемые, детектируемые или измеряемые антитела связываются с белком оболочки или капсида вируса, таким как белок капсида AAV. В конкретных аспектах изобретения анализируемые, детектируемые или измеряемые антитела связываются с серотипом AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11, AAV12, Rh74 или Rh10 AAV или гибридом или химерой любого из указанных выше серотипов AAV.

[0012] В различных вариантах осуществления изобретения предопределенное количество антител, которые связываются с AAV, могут связываться с любым серотипом AAV. В конкретных аспектах изобретения предопределенное количество антител связывается с AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11, AAV12, Rh74 или Rh10, или гибридом или химерой любого из указанных выше серотипов AAV.

[0013] В дополнительных конкретных аспектах изобретения клетки включают клетки млекопитающих, такие как клетки приматов (например, человека). В более конкретных аспектах изобретения клетки включают клетки HEK-293(например, 2V6.11), клетки CHO, BHK, MDCK, 10T1/2, WEHI, COS, BSC 1, BSC 40, BMT 10, VERO, WI38, MRC5, A549, HT1080, 293, B-50, 3T3, NIH3T3, HepG2, Saos-2, Huh7, HER, HEK, HEL или клетки HeLa.

[0014] В дополнительных аспектах клетки содержат последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей вспомогательные функции для репликации и/или геномной репликации AAV. В более конкретных аспектах изобретения клетки экспрессируют ген E4 AAV и или rep или cap AAV.

[0015] В дополнительных аспектах клетки можно инфицировать частицами AAV, содержащими последовательность VP1, VP2 или VP3, идентичную на 90% или более последовательности VP1, VP2 или VP3 AAV серотипа AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11, AAV12, Rh74 или Rh10, или гибрида или химеры любого из указанных выше серотипов AAV, или клетки можно инфицировать AAV серотипа AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11, AAV12, Rh74 или Rh10, или гибридом или химерой любого из указанных выше серотипов AAV.

[0016] В еще одних дополнительных аспектах клетки приводят в контакт с получаемой смесью (M) в течение периода 6-48 часов, в течение периода 12-36 часов, в течение периода 20-30 часов или в течение периода приблизительно 24 часов. В еще одних дополнительных аспектах перед измерением экспрессии репортерного трансгена клетки лизируют.

[0017] В различных вариантах осуществления изобретения репортерный трансген кодирует белок, который обеспечивает ферментативный, колориметрический, флуоресцентный, люминесцентный, хемилюминесцентный или электрохимический сигнал. В конкретных аспектах репортерный трансген содержит ген люциферазы, такой как ген люциферазы Renilla или люциферазы светляков. В дополнительных конкретных аспектах репортерный трансген содержит ген β-галактозидазы, ген β-глюкоронидазы, ген хлорамфениколтрансферазы. В дополнительных конкретных аспектах репортерный трансген кодирует зеленый флуоресцентный белок (GFP), a красный флуоресцентный белок (RFP) или щелочную фосфатазу.

[0018] В дополнительных различных вариантах осуществления изобретения репортерный трансген представляет собой одноцепочечный геном, или репортерный трансген представляет собой самокомплементарный геном. В дополнительных аспектах изобретения самокомплементарный репортерный трансгенный геном содержит двухцепочечную структуру (или дуплекс) последовательности инвертированного повтора. В дополнительных аспектах изобретения самокомплементарный репортерный трансгенный геном содержит шпилечную структуру.

[0019] В дополнительных вариантах осуществления изобретения вектор или векторная последовательность содержит один (или более) регуляторных элементов экспрессии, таких как промоторная и/или энхансерная последовательность нуклеиновой кислоты, функциональная в клетки млекопитающих. В дополнительных вариантах осуществления изобретения вектор или векторная последовательность содержит один или более фланкирующих элементов, таких как одна или более последовательностей инвертированного концевого повтора (ITR) AAV. В дополнительных аспектах изобретения репортерный трансген располагается между одним или более фланкирующих элементов, таких как один или более 5'- и/или 3'-ITR AAV.

[0020] В более конкретных вариантах осуществления изобретения вектор или векторная последовательность содержит первый инвертированный концевой повтор (ITR) любого AAV; промотор, функциональный в клетках млекопитающих; репортерный трансген; сигнал полиаденилирования и необязательно второй ITR AAV. В конкретных аспектах изобретения рекомбинантный вектор или векторная последовательность содержит участок рестрикции для обеспечения возможности вставки репортерного трансгена ниже промотора, функционального в клетках млекопитающих, и посттранскрипционный регуляторный элемент ниже участка рестрикции. В дополнительных конкретных аспектах изобретения рекомбинантный вектор или векторная последовательность содержит участок рестрикции для обеспечения возможности вставки репортерного трансгена ниже промотора, функционального в клетках млекопитающих, и посттранскрипционный регуляторный элемент ниже участка рестрикции. В конкретных аспектах промотора участок рестрикции и посттранскрипционный регуляторный элемент располагаются ниже 5'-ITR AAV и выше необязательного 3'-ITR AAV.

[0021] В более конкретных аспектах изобретения фланкирующий элемент(ы) представляет собой мутантный ITR AAV или вариант ITR AAV, который не процессируется белком Rep AAV. В дополнительных более конкретных аспектах изобретения фланкирующий элемент(ы) представляет собой мутантный ITR AAV или вариант ITR AAV, который обеспечивает или облегчает формирование самокомплементарного репортерного трансгенного генома в двухцепочечную структуру последовательности инвертированного повтора в инфекционной частице рекомбинантного AAV. В дополнительных более конкретных аспектах изобретения фланкирующий элемент(ы) представляет собой мутантный ITR AAV или вариант ITR AAV с удаленной последовательностью D и/или a deleted последовательность сайта концевого разрешения (TRS) (например, мутантный ITR AAV или вариант ITR AAV располагается между самокомплементарными последовательностями репортерного трансгена). В еще одних дополнительных более конкретных аспектах изобретения мутантный ITR AAV или вариант ITR AAV содержит ITR AAV2, содержащий один или более нуклеотидов, соответствующих нуклеотидам 122-144 мутантной, модифицированной, измененной или удаленной геномной последовательности AAV2.

[0022] В дополнительных конкретных вариантах осуществления изобретения инфекционные частицы рекомбинантного AAV содержат серотип AAV, который инфицирует приматов. В конкретных аспектах инфекционные частицы рекомбинантного AAV содержат серотип AAV, который инфицирует людей или макак-резус. В различных конкретных аспектах инфекционные частицы рекомбинантного AAV содержат последовательность VP1, VP2 или VP3, идентичную на 90% или более последовательности VP1, VP2 или VP3 серотипа AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11, AAV12, Rh74 или Rh10 AAV или гибрида, или химера любого из указанных выше серотипов AAV. В дополнительных различных конкретных аспектах инфекционные частицы рекомбинантного AAV содержат серотип AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11, AAV12, Rh74 или Rh10 AAV или гибрид, или химеру любого из указанных выше серотипов AAV.

[0023] В различных вариантах осуществления изобретения биологический образец содержит образец от примата. Такие образцы включают без ограничения сыворотку, плазму или кровь, такую как сыворотка человека, плазма человека или кровь человека.

[0024] В дополнительных вариантах осуществления изобретения биологический образец инактивируют нагреванием или инактивировали нагреванием. В конкретном аспекте биологический образец инактивируют нагреванием или инактивировали нагреванием приблизительно при 50-70 градусах Цельсия в течение периода приблизительно от 15 минут до одного часа, или инактивируют нагреванием или инактивировали нагреванием приблизительно при 56 градусах Цельсия в течение периода приблизительно 30 минут.

[0025] В дополнительных вариантах осуществления изобретения биологический образец разбавляют перед приведением в контакт или инкубированием с инфекционными частицами рекомбинантного AAV. В конкретных аспектах анализируют, измеряют или детектируют серийные разбавления биологического образца. В дополнительных конкретных аспектах анализируют, измеряют или детектируют ряд различных степеней разбавления биологического образца. В более конкретных аспектах биологический образец разбавляют в диапазоне от 1:1 до 1:500 перед приведением контакт или инкубированием с инфекционными частицами рекомбинантного AAV; или биологический образец разбавляют в диапазоне от 1:500 до 1:5000 перед приведением контакт или инкубированием с инфекционными частицами рекомбинантного AAV. В дополнительных конкретных аспектах анализируют, измеряют или детектируют по меньшей мере 2, 3, 4, 5 или 6 различных степеней разбавления биологического образца.

[0026] В различных вариантах осуществления изобретения индивидуум (например, кандидат для генотерапии, опосредованной вирусным вектором, таким как вектор AAV) представляет собой млекопитающее (например, примата). В конкретном аспекте индивидуум представляет собой человека.

[0027] В различных вариантах осуществления изобретения индивидуум страдает нарушением, обусловленным недостаточной экспрессией или активностью белка, или страдает нарушением, обусловленным экспрессией или активностью аномального, аберрантного или нежелательного белка.

[0028] В дополнительных различных вариантах осуществления изобретения индивидуум страдает генетическим нарушением. В дополнительных различных вариантах осуществления изобретения индивидуум представляет собой кандидата для генной заместительной терапии или терапии на основе биологически активных добавок, такой как генотерапия на основе нокдауна или нокаута генов. В более конкретных вариантах осуществления изобретения индивидуум страдает заболеванием легких (например, кистозным фиброзом), нарушением свертываемости крови (например, гемофилией A или гемофилией B с ингибиторами или без них), талассемией, нарушением со стороны крови (например, анемией), болезнью Альцгеймера, болезнью Паркинсона, болезнью Хантингтона, боковым амиотрофическим склерозом (ALS), эпилепсией, лизосомными болезнями накопления, нарушениями накопления меди или железа (например, болезнью Вильсона или болезнью Менкеса) недостаточностью кислой лизосомной липазы, неврологическим или нейродегенеративным нарушением, злокачественной опухолью, диабетом 1 типа или 2 типа, болезнью Гоше, болезнью Гурлера, аденозиндезаминазной недостаточностью, дефектом метаболизма (например, болезнями накопления гликогена), дегенеративным заболеванием сетчатки (таким как недостаточность RPE65, хороидеремия и другие заболевания глаза), заболеванием паренхиматозных органов (например, головного мозга, печени, почки, сердца) или инфекционным вирусным (например, гепатитом B и C, ВИЧ и т.д.), бактериальным или грибковым заболеванием.

[0029] В различных дополнительных вариантах осуществления изобретения определяют/подсчитывают количество антител, которые связываются с AAV в биологическом образце. В одном из вариантов осуществления антитела подсчитывают на основании экспрессии репортерного трансгена (f) в сравнении с отрицательным (-) контролем. В другом варианте осуществления антитела подсчитывают на основании экспрессии репортерного трансгена (f) в сравнении с предопределенным количеством антител против AAV контроля.

[0030] В дополнительных вариантах осуществления изобретения количество антител вводят в базу данных или отчет, связанный с индивидуумом, от которого получали биологический образец. Таким образом, ввод приводит к записи в базу данный или отчет, связанный с индивидуумом.

Описание чертежей

[0031] На фигуре 1A продемонстрирован максимальный сигнал репортерного гена люциферазы в зависимости от количества пассажей клеток. Статистический анализ проводили с использованием GraphPad Prism Version 5.0b. Линейная регрессия: кривая R2 0,1509, p<0,0001, наклон кривой достоверно не равен нулю. Дополнительный статистический анализ проводили путем сравнения среднего максимального сигнала (RLU), получаемого для клеток, из пассажей 1-12, со средним максимальным сигналом пассажей 13-25. Для этой цели использовали двусторонний t-критерий для независимых выборок. Среднее значение+/-стандартная ошибка среднего: пассаж 1-12, 17921+/-1181, n=53; пассаж 13-25, 11427+/-903, n=45, p<0,0001.

[0032] На фигуре 1B продемонстрирован фоновый сигнал репортерный ген люциферазы в зависимости от количества пассажей клеток. Статистический анализ проводили с использованием GraphPad Prism Version 5.0b. Линейная регрессия: кривая R2 0,04720, p=0,0308, наклон кривой достоверно не равен нулю. Дополнительный статистический анализ проводили путем сравнения mean фонового сигнала (RLU), получаемого от клеток из пассажей 1-12 с фоновым сигналом пассажей 13-25. Для этой цели использовали двусторонний t-критерий для независимых выборок. Среднее значение+/-стандартная ошибка среднего: пассаж 1-12, 320+/-24, n=54; пассажe 13-25, 252+/-27, n=45, p=0,0651.

[0033] На фигуре 2 представлен средние титры NAb для образцов сыворотки человека для операторов 1 и 2. Величины ошибок демонстрируют ± стандартное отклонение.

[0034] На фигуре 3 представлена структура ITR AAV2 с мутантной последовательностью TRS: "CGGTTG", как указано. RBS: связывающая Rep последовательность; флоп/флип: ITR (аналоги +/- штамм).

[0035] На фигуре 4 представлена характерная структура конструкции плазмиды с репортерный трансген люциферазы. CBA: промотор бета-актина курицы; pA: полиаденилирование.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ

[0036] Изобретение по меньшей мере частично основано на чувствительном анализе для скрининга, детекции, анализа и определения количеств антитела против вируса или нейтрализующего антитела. Таким образом, изобретение относится векторам, вирусным векторам и частицам и способам, и видам использования скрининга, детекции, анализа и определения количества антитела против вируса или нейтрализующего антитело, например, в образце.

[0037] Как указано в настоящем описании, векторные последовательности, векторы (например, вирусные векторы) и частицы предоставляют средства скрининга, детекции, анализа и определения количества антитела против вируса или нейтрализующего антитела. В векторных последовательностях, векторах (например, вирусных векторах) и частицах и способах, и видах использования скрининга, детекции, анализа и определения количества антитела против вируса по изобретению применяют репортерный трансген (трансген обеспечивает детектируемый сигнал), где трансген содержит одноцепочечный или самокомплементарный геном. Самокомплементарный трансгенный геном становится двухцепочечным или является двухцепочечным димером при упаковке в вирусную частицу (вирусный вектор) или при трансдукции клетки вирусным вектором и утрате оболочки вируса в трансдуцируемой клетке.

[0038] Термины "комплементарный" или "комплемент" при использовании в отношении полинуклеотида или молекулы нуклеиновой кислоты, такой как трансген, относятся к совокупности таких химических оснований, что в результате спаривания оснований одна одноцепочечная последовательность "специфически гибридизуется" или связывается (отжигается) с другой одноцепочечной последовательностью или способна это делать с образованием двухцепочечной или дуплексной молекулы. Способность двух одноцепочечных последовательностей специфически гибридизоваться или связываться (отжигаться) друг с другом и образовывать двухцепочечную (или дуплексную) молекулу обусловлена функциональной группой основания на одной цепи (например, смысловой), которая связывается водородной связью с другим основанием на противоположной цепи нуклеиновой кислоты (например, антисмысловой). Комплементарные основания, которые способны связываться друг с другом, как правило, в ДНК представляют собой A с T и C с G и в РНК C с G и U с A. Таким образом, примером самокомплементарной последовательности может являться ATCGXXXCGAT, где X представляют собой некомплементарные основания, и структура такой двухцепочечной или дуплексной молекулы с негибридизующимися основаниями X будет выглядеть как:

[0039] Термины "комплементарный" и "комплемент" при использовании в отношении полинуклеотида или молекулы нуклеиновой кислоты, такой как трансген, таким образом, предназначены описывать физическое состояние, при котором образуется двухцепочечный или дуплексный полинуклеотид или молекула нуклеиновой кислоты, или просто описывают взаимосвязь последовательностей между двумя молекулами полинуклеотида или нуклеиновой кислоты, таким образом, что каждая одноцепочечная молекула может образовывать двойную цепь с другой. Таким образом, "комплементарные" и "комплемент" относится к взаимосвязи оснований, каждой цепи молекулы полинуклеотида или нуклеиновой кислоты, а не к тому, что две цепи должны существовать в виде двухцепочечной (или дуплексной) конфигурации или физического состояния друг с другом в виде дуплекса.

[0040] Как правило, для вирусных векторов, которые упаковывают одноцепочечную нуклеиновую кислоту, таких как AAV, последовательности инвертированного концевого повтора (ITR) участвуют в репликации и образуют петлю "шпильку", которая вносит вклад в самопраймирование, которое обеспечивает инициацию и синтез второй цепи ДНК. После синтеза второй цепи ДНК ITR AAV содержит так называемый сайт концевого разрешения (TRS), таким образом, что петля "шпилька" расщепляется на две отдельные цепи, каждая с 5'- и 3'-концевым повтором для упаковки вируса.

[0041] Использованием удаленного, мутантного, модифицированного или нефункционального TRS по меньшей мере в одном ITR приводит к образованию двухцепочечного дуплекса, которая не расщепляется в TRS. В одном из вариантов осуществления двухцепочечной дуплексной структуры самокомплементарного репортерного трансгена, как правило, содержится ITR с удаленным, мутантным TRS или вариантом TRS, располагаемым между двумя комплементарными цепями. Нерасщепляемый или неразрешаемый TRS обеспечивает образование двухцепочечной дуплексной структуры самокомплементарного репортерного трансгена, т.к. образуемая двойная цепь является нерасщепляемой. Любой неразрешаемый ITR с удаленным, мутантным TRS или вариантом TRS или разрешаемый ITR может являться подходящим для упаковки вируса. Разрешаемый ITR AAV не должен представлять собой последовательность ITR дикого типа при условии, что ITR опосредует желаемую функцию, например, упаковку или интеграцию вируса.

[0042] Последовательности ITR и TRS различных серотипы AAV, которые можно удалять, подвергать мутации, модифицировать или изменять, включают любой серотип AAV, указанный в настоящем описании, или который известен специалисту в данной области. Например, последовательности ITR и TRS различных серотипов AAV включают, например, AAV-1, -2, -3, -4, -5, -6, -7, -8, -9, -10, -11, -rh74, -rh10 или AAV-2i8. Для AAV2 характерная мутантная последовательность TRS представляет собой "CGGTTG".

[0043] Для вектора или векторной последовательности с последовательностями самокомплементарного репортерного трансгена, рассматриваемой вне трансгена, такого как один или более ITR, регулирующие экспрессию или регуляторные контрольные последовательности, ниже последовательностей и т.д., такие последовательности векторной последовательности вне репортерного трансгена могут являться, но не обязательно самокомплементарными. Таким образом, самокомплементарный можно использовать в конкретном контексте, например, по отношению к трансгену, такому как репортерный трансген, таким образом, что только трансген, такой как репортерный трансген, является самокомплементарным, тогда как другие нетрансгенные последовательности могут являться или могут не являться самокомплементарными.

[0044] Для самокомплементарного трансгена не все основания в одной цепи должны являться комплементарными каждому и любому основанию противоположной комплементарной цепи. Должно только существовать достаточное количество комплементарных нуклеотидных или нуклеозидных оснований для обеспечения возможности двум молекулам полинуклеотида или нуклеиновой кислоты специфически гибридизоваться или связываться (отжигаться) друг с другом. Таким образом, могут существовать короткие сегменты или области последовательности некомплементарных оснований между самокомплементарными молекулами полинуклеотида или нуклеиновой кислоты. Например, может содержаться 1-5, 5-10, 10-20, 20-30, 30-40, 40-50, 50-75, 75-100 или 100-150 или более смежных или несмежных некомплементарных оснований, но может содержаться достаточно комплементарных оснований на протяжении всей длины двух последовательностей, таким образом, что две молекулы полинуклеотида или нуклеиновой кислоты способны специфически гибридизоваться или связываться (отжигаться) друг с другом и образовывать двухцепочечную (или дуплексную) последовательность. Таким образом, последовательности двух одноцепочечных областей могут являться менее чес на 100% комплементарными друг другу, но все еще способными образовывать двухцепочечную дуплексную молекулу. В конкретных вариантах осуществления две одноцепочечные последовательности обладают по меньшей мере 70%, по меньшей мере 75%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 98%, по меньшей мере 99% или меньшей комплементарностью друг с другом.

[0045] Такие сегменты или области некомплементарных оснований между самокомплементарными молекулами полинуклеотида или нуклеиновой кислоты могут представлять собой внутренние последовательности, такие как, когда комплементарные участки двух одноцепочечных молекул образуют двойную цепь или дуплекс, некомплементарные основания образуют конфигурацию петли или выпетливания, и общая структура напоминает шпильку. Такие сегменты или области некомплементарных оснований между самокомплементарными молекулами полинуклеотида или нуклеиновой кислоты также могут фланкировать комплементарные области, в этом случае любая или обе из 5'- или 3'-фланкирующих областей могут не образовывать двухцепочечный дуплекс.

[0046] Самокомплементарный трансген, который образует двухцепочечную или дуплексную последовательность, как правило, экспрессируется быстрее (более быстрое начало), чем одноцепочечный трансгенный аналог. Таким образом, такую экспрессию можно детектировать путем измерения экспрессии в течение определенного периода времени, такого как в различные моменты времени (например, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 12-16, 16-20, 20-24 часа). Кроме того, количество экспрессии двухцепочечного самокомплементарного трансгена, как правило, является больше чем аналога одноцепочечного репортерного трансгена. Таким образом, такую экспрессию можно детектировать путем измерения в момент времени, в который экспрессия, как считают, приближается или является максимальной. Таким образом, двухцепочечная конфигурация самокомплементарного трансгена повышает чувствительность детекции и может улучшать точность количественных определений антитела против вируса, в частности вирусов, которые являются менее эффективными при инфицировании конкретных типов клеток, т.е. вирусов, которые обладают относительно низкими показателями инфицирующей способности или тропизма к клеткам.

[0047] Как используют в настоящем описании, "вектор" может относиться к вирусной частице, такой как парвовирус (например, AAV), которую можно использовать для доставки нуклеиновой кислоты (например, репортерного трансгена) в клетки, и где вектор содержит нуклеиновую кислоту (например, репортерный трансген), упакованную в вирионы или заключенную в капсид вирусными белками (белками оболочки или капсидными белками, такими как капсид AAV). Альтернативно, термин "вектор" можно использовать в более ограниченном контексте для обозначения векторной последовательности или нуклеиновой кислоты. Таким образом, как используют в настоящем описании, вектор можно использовать для обозначения вирусной частицы, которая содержит нуклеиновую кислоту (например, репортерный трансген), или для обозначения только нуклеиновой кислоты или последовательности, где последовательность можно обозначать как "векторная последовательность" или т.п.

[0048] Вирусный вектор получают из или на основе одного или более элементов нуклеиновой кислоты, которые содержат вирусный геном. Конкретные вирусные векторы включают векторы на основе парвовирусов, такие как векторы на основе аденоассоциированного вируса (AAV).

[0049] В конкретных вариантах осуществления рекомбинантный вектор (например, AAV) представляет собой вектор на основе парвовируса. Парвовирусы представляют собой небольшие вирусы с геном из одноцепочечной ДНК. "Аденоассоциированные вирусы" (AAV) входит в семейство парвовирусов.

[0050] Как используют в настоящем описании, термин "рекомбинантный", в качестве определения вектора, такого как вирусные векторы, а также определения последовательностей, таких как рекомбинантные полинуклеотиды и полипептиды, означает, что композиции (например, AAV или последовательности) подвергали обработке (например, их конструировали), таким способом, который, как правило, не существует в природе. Конкретный пример рекомбинантной векторной последовательности, такой как вектор AAV, является таким, где полинуклеотид, который обычно не присутствует в геноме вируса (например, AAV) дикого типа, вводят в геном вируса. Например, пример рекомбинантного вектора является таким, где гетерологичный полинуклеотид (например, трансген) клонируют в векторную последовательность с 5'-, 3'- и/или интронными областями или без них, что ген, как правило, является связанным в векторе, таком как геном вирусного (например, AAV) вектора. Хотя термин "рекомбинантный" не всегда используют в настоящем описании по отношению к вирусным векторам, таким как векторы AAV, а также векторные последовательности и полинуклеотиды, и полипептиды, рекомбинантные формы вирусных векторов, таких как AAV, векторные последовательности и полинуклеотиды, и полипептиды, явным образом включены, несмотря на любое такое упущение.

[0051] Рекомбинантный "вектор" или "вектор AAV" можно получать из генома дикого типа вируса, такого как AAV, молекулярными способами удаления генома дикого типа из последовательности вируса (например, AAV) и замены ненативной нуклеиновой кислотой, такой как репортерный трансген. Как правило, для AAV одну или обе последовательности инвертированного концевого повтора (ITR) генома дикого типа AAV сохраняют в векторе AAV. Рекомбинантный вирусный вектор (например, AAV) отличается от генома вируса (например, AAV), вследствие того, что всю или часть геномной последовательности вируса заменяли ненативной последовательностью по отношению к нуклеиновой кислоте вируса (например, AAV), такой как репортерный трансген. Таким образом, введение ненативной последовательности, такой как репортерный трансген, определяет вирусный вектор (например, на основе AAV) как "рекомбинантный" вектор, который в случае AAV можно обозначать как "вектор AAV".

[0052] "Геном" рекомбинантного вектора (например, геном вируса или вектора AAV) можно заключать в капсид или упаковывать в вирус (также обозначаемый в настоящем описании как "частица" или "вирион") для последующей инфекции (трансдукции или трансформации) клетки ex vivo, in vitro или in vivo. В случае, когда геном рекомбинантного вектора AAV заключают в капсид или упаковывают в частицу AAV, частицу можно обозначать как "rAAV". Такие частицы или вирионы, как правило, содержат белки, которые заключают в капсид или упаковывают векторный геном. Конкретные примеры включают капсидные белки и белки оболочки вируса и в случае AAV капсидные белки AAV.

[0053] Для рекомбинантной плазмиды векторный "геном" относится к участку рекомбинантной последовательности плазмиды, которую в конечном итоге упаковывают или заключают в капсид с получением вирусной частицы. В случаях, когда рекомбинантные плазмиды используют для конструкции или получения рекомбинантных векторов, геном вектора не содержит участок "плазмиды", которая не соответствует последовательности векторного генома рекомбинантной плазмиды. Такой не принадлежащий к векторному геному участок рекомбинант плазмиды обозначают как "плазмидный остов", который является важным для клонирования и амплификации плазмиды, процесса, который является необходимым для размножения и продукции рекомбинантного вируса, но сам по себе не является упакованным или заключенным в капсид в вирусные (например, AAV) частицы.

[0054] Таким образом, векторный "геном" относится к участку векторной плазмиды, который упаковывается или заключается в капсид вирусом (например, AAV) и который содержит гетерологичную (трансгенную) полинуклеотидную последовательность. Не относящийся к векторному геному участок рекомбинантной плазмиды включает остов, который является важным для клонирования и амплификации плазмиды, но сам по себе не упаковывается или заключается в капсид вирусом (например, AAV).

[0055] Рекомбинантные последовательности вектора обрабатывают путем введения или встраивания полинуклеотида. Как описано в настоящем описании, последовательность вектора или плазмида, как правило, содержит по меньшей мере участок начала репликации для размножения в клетке и один или более регулирующих экспрессию элементов.

[0056] Рекомбинантные векторы (например, AAV), последовательности вектора или плазмиды, а также способы и виды их использования включают любой штамм или серотип вируса. В качестве неограничивающего примера рекомбинантная векторная (например, AAV) плазмида может быть основная на любом геноме AAV, таком как, например, AAV-1, -2, -3, -4, -5, -6, -7, -8, -9, -10, -11, -rh74, -rh10 или AAV-2i8. Такие векторы могут быть основаны на одном и том же штамме или серотипе (или подгруппе, или варианте) или могут отличаться друг от друга. В качестве неограничивающего примера рекомбинантная векторная (например, AAV) плазмида на основе генома одного серотипа может являться идентичной одному или более капсидным белкам, которые упаковывают вектор. Кроме того, рекомбинантная векторная (например, AAV) плазмида может быть основана на геноме серотипа AAV (например, AAV2), отличного от одного или более капсидных белков, которые упаковывают вектор. Таким образом, только в качестве иллюстрации векторная плазмида rAAV-2 может содержать по меньшей мере один (или более) из трех капсидных белков из AAV-2 или любого другого капсида AAV, такого как, например, капсид AAV-1, -3, -4, -5, -6, -7, -8, -9, -10, -11, -rh74, -rh10 или AAV-2i8.

[0057] Как описано в настоящем описании, вектор используют для трансдукции клеток-мишеней репортерным трансгеном, где трансген затем транскрибируется и необязательно транслируется, таким образом, обеспечивая детектируемый сигнал для детекции или измерения экспрессии трансгена. Количество сигнала является пропорциональным эффективности трансдукции клетки и последующей экспрессии. Антитела, которые связываются с белками вектора, которые упаковывают или заключают в капсид репортерный трансген, ингибируют трансдукцию трансгеном и последующую экспрессии. Таким образом, можно подтверждать детекцию, измерение и анализ на наличие антител, которые связываются с вектор белки, такими как белки вирусного (например, AAV) вектора.

[0058] В анализах, описываемых в настоящем описании, детекцию, измерение и анализ антител определяют по идентичности белка(ов) оболочки или капсидного белка(ов), которые упаковывают или заключают в капсид репортерный трансген. Таким образом, если желательной является детекция антител против AAV-2, репортерный трансген должен заключаться в капсид капсидным белком(ами) AAV-2. Если желательной является детекция антител против AAV-7, репортерный трансген должен заключаться в капсид капсидным белком(ами) AAV-7. Если желательной является детекция антител против AAV-8, репортерный трансген должен заключаться в капсид капсидным белком(ами) AAV-8. Если присутствует антитело, антитело связывается с белком(ами) оболочки или капсидным белком(ами), которые заключают в капсид репортерный трансген, снижая эффективность трансдукции клетки и последующую экспрессию репортерного трансгена. Чем больше количество антитела, которое связывается с белком(ами) оболочки или капсидным белком(ами), тем меньше эффективность трансдукции клеток вектором и последующая экспрессия репортерного трансгена.

[0059] В соответствии с общепринятым определением серотип означает, что представляющий интерес вирус тестировали против сыворотки, специфичной ко всем существующим и охарактеризованным серотипам, на нейтрализующую активность и не выявляли антитела, которые нейтрализуют представляющий интерес вирус. Вследствие того, что все больше открывают природных изолятов вируса и/или получают капсидных мутантов, могут существовать или могут не существовать серологические отличия от любых существующих в настоящее время серотипов. Таким образом, в случаях, когда новый вирус (например, AAV) не имеет серологического отличия, этот новый вирус (например, AAV) является подгруппой или вариантом соответствующего серотипа. Во многих случаях, все еще необходимо проводить серологическое тестирование на нейтрализующую активность на мутантных вирусах с модификациями капсидной последовательности для определения, относятся ли они к другому серотипу в соответствии с общепринятым определением серотипа. Таким образом, для удобства и избегания повторения термин "серотип" в широком смысле относится к обоим серологически отличным вирусам (например, AAV), а также вирусам (например, AAV), которые не являются серологически отличными, которые могут входить в одну подгруппу, или варианту данного серотипа.

[0060] Рекомбинантные векторы (например, AAV) и последовательности векторов, включая AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11, Rh10, Rh74 или AAV-2i8, можно конструировать рекомбинантными способами, известными специалисту в данной области, чтобы они содержали одну или более гетерологичных полинуклеотидных последовательностей (трансгенов), фланкированных одной или более функциональными последовательностями ITR AAV. Такие векторы могут содержать один или более генов AAV дикого типа, полностью или частично удаленные, например, ген rep и/или cap, но сохранять по меньшей мере одну функциональную фланкирующую последовательность ITR (например, ITR AAV2 или любого другого серотипа AAV), по мере необходимости для спасения, репликации и упаковки рекомбинантного вектора в векторную частицу AAV. Таким образом, векторный геном AAV включает последовательности, которые должны находиться в cis-положении для репликации и упаковки (например, функциональных последовательностей ITR).

[0061] Термины "трансген", "последовательность", "полинуклеотид" и "нуклеиновая кислота" в настоящем описании используют взаимозаменяемо для обозначения всех форм нуклеиновой кислоты, олигонуклеотидов, включая дезоксирибонуклеиновую кислоту (ДНК) и рибонуклеиновую кислоту (РНК). Трансгены включают геномную ДНК, кДНК и антисмысловую ДНК, сплайсированную или несплайсированную. Трансгены включают природные, синтетические и целенаправленно измененные или модифицированные полинуклеотиды, а также аналоги и производные. Как правило, трансгены являются одноцепочечными или двухцепочечными, линейными или кольцевыми и могут быть любой длины. В обсуждаемых трансгенах последовательность или структура конкретного полинуклеотида может описываться в настоящем описании в соответствии с соглашением о предоставлении последовательности от 5'- к 3'-направлению.

[0062] "Гетерологичный" трансген, последовательность или полинуклеотид относится к полинуклеотиду, вводимому в вектор (например, AAV) для целей опосредованного вектором переноса/доставки полинуклеотида в клетку. Гетерологичные трансгены, последовательности или полинуклеотиды, как правило, отличаются от нуклеиновой кислоты вектора (например, AAV), т.е. не являются нативными по отношению к последовательности нуклеиновой кислоты вируса (например, AAV). После трансфекции/доставки в клетку гетерологичный трансген, последовательность или полинуклеотид, содержащийся в вирионе, может экспрессироваться (например, транскрибироваться и транслироваться в соответствующем случае). Альтернативно, трансфицированный/доставленный в клетку гетерологичный трансген, последовательность или полинуклеотид, содержащийся в вирионе, не обязательно должна экспрессироваться. Хотя термин "гетерологичный" в настоящем описании не всегда используют по отношению к трансгенам, последовательностям или полинуклеотидам, ссылка на трансген, последовательность или полинуклеотид даже при отсутствии определения "гетерологичный" предназначена включать гетерологичные трансгены, последовательности и полинуклеотиды, несмотря на упущение.

[0063] Термин "трансген" используют в настоящем описании для обозначения подходящим образом гетерологичного полинуклеотида, который вводили в клетку или организм. Трансгены включают любой полинуклеотид, такой как ген, который транскрибируется в полинуклеотиде, или ген, кодирующий полипептид или белок, как правило, посредством промежуточного транскрипта.

[0064] Как используют в настоящем описании, "репортерный" трансген представляет собой ген, который обеспечивает детектируемый сигнал. Сигнал может обеспечивать сам трансген, транскрипт трансгена или белок, кодируемый трансгеном. Конкретные неограничивающие примеры репортерных трансгенов включают ген люциферазы, который кодирует белок люциферазу, и т.д.

[0065] "Полипептиды", "белки" и "пептиды", кодируемые "трансгеном" или "полинуклеотидными последовательностями", включают полноразмерные нативные последовательности, как и природные белки, а также функциональные подпоследовательности, модифицированные формы или варианты последовательности при условии, что подпоследовательность, модифицированная форма или вариант сохраняет некоторую степень функциональности нативного полноразмерного белка. В способах и видах использования по изобретению такие полипептиды, белки и пептиды, кодируемые трансгеном или полинуклеотидными последовательностями, могут являться, но не обязательно являются идентичными белку дикого типа.

[0066] Все формы трансгена, последовательности и полинуклеотидов принадлежащие млекопитающим и не принадлежащие млекопитающим, включая неограничивающие репортерные трансгены и кодируемые белки, описываемые в настоящем описании, явным образов включены, независимо от того известны они ли неизвестны. Таким образом, изобретение включает репортерные трансгены и белки от немлекопитающих, млекопитающих, отличных от людей, и людей, где репортерные трансгены и белки можно детектировать в клетках после трансдукции или трансфекции, как описано в настоящем описании.

[0067] В клетке, содержащей трансген, трансген вводили/трансфицировали посредством вектора, такого как вирусный вектор (например, AAV). Этот процесс называют "трансдукцией" или "трансформацией" или "трансфекцией" клетки. Термины "трансдуцировать", "трансформировать" и "трансфицировать" относятся к введению молекулы, такой как трансген, в клетку.

[0068] Клетка, в которую вводили трансген, обозначают как "трансформированная клетка" или "трансформант". Таким образом, "трансдуцированная", "трансформированная" или "трансфицированная" клетка (например, у млекопитающего, такая как клетка или клетка ткани или органа) означает генетическое изменение в клетке после введения экзогенной молекулы, например, полинуклеотида или белка (например, трансгена) в клетку. Таким образом, "трансдуцированная", "трансформированная" или "трансфицированная" клетка представляет собой клетку, в которую, или в ее потомство, в которое вводили экзогенную молекулу, например. Клетка(и) можно выращивать и вводить трансгенный транскрибируемый и/или экспрессируемый белок.

[0069] Вводимый трансген может интегрироваться или может не интегрироваться в нуклеиновую кислоту реципиентной клетки. Если вводимый трансген становится интегрированным в нуклеиновой кислоте (геномной ДНК) реципиентной клетки или организма, он может стабильно сохраняться в такой клетке или организме и далее переходить или наследоваться клетками или организмами потомства реципиентной клетки или организма. Наконец, вводимый трансген может существовать в реципиентной клетке или организме-хозяине только временно.

[0070] Клетки, которые могут являться мишенью для трансдукции вектором (например, вирусным вектором), несущим трансген, могут представлять собой любую клетку, восприимчивой к инфекции вектором. Такие клетки могут обладать низкими, средними или высокими показателями восприимчивости к инфекции. Таким образом, клетки-мишени включают клетка любого типа ткани или органа, любого происхождения (например, мезодермального, эктодермального или эндодермального). Конкретные неограничивающие примеры клеток включают клетки печени (например, гепатоциты, синусоидальные эндотелиальные клетки), клетки поджелудочной железы (например, бета-клетки островков), клетки легкого, клетки центральной или периферической нервной системы, такие как клетки головного мозга (например, нейрональные, глиальные или эпендимальные клетки) или спинного мозга, клетки почки (клетки HEK-293), клетки глаза (например, компоненты клеток сетчатки), клетки селезенки, кожи, тимуса, семенников, легкого, диафрагмы, сердца (кардиомиоцит), клетки мышц или поясничной мышцы, или клетки кишечника (например, эндокринные клетки), клетки жировой ткани (белой, бурой или бежевой), мышечные клетки (например, фибробласты), синовиоциты, хондроциты, остеокласты, эпителиальные клетки, эндотелиальне клетки, клетки слюнных желез, нервные клетки внутреннего уха или гемопоэтические клетки (например, крови или лимфы). Дополнительные примеры включают стволовые клетки, такие как плюрипотентные или мультипотентные клетки-предшественники, которые развиваются или дифференцируются в клетки печени (например, гепатоциты, синусоидальные эндотелиальные клетки), клетки поджелудочной железы (например, бета-клетки островков), клетки легкого, клетки центральной или периферической нервной системы, такие как клетки головного мозга (например, нейрональные, глиальные или эпендимальные клетки) или спинного мозга, клетки почки, клетки глаза (например, компоненты клеток сетчатки), клетки селезенки, кожи, тимуса, семенников, легкого, диафрагмы, сердца (кардиомиоцит), клетки мышц или поясничной мышцы, или клетки кишечника (например, эндокринные клетки), клетки жировой ткани (белой, бурой или бежевой), мышечные клетки (например, фибробласты), синовиоциты, хондроциты, остеокласты, эпителиальные клетки, эндотелиальне клетки, клетки слюнных желез, нервные клетки внутреннего уха или гемопоэтические клетки (например, крови или лимфы).

[0071] Вирусные векторы, такие как векторы AAV, и последовательности вектора могут содержать один или более "регулирующих экспрессию элементов" или "регуляторных элементов". Как правило, регулирующие экспрессию или регуляторные элементы представляют собой последовательность(и) нуклеиновой кислоты, которая влияет на экспрессию функционально связанного полинуклеотида. Как указано в настоящем описании, регулирующие элементы, включая регулирующие экспрессию и регуляторные элементы, такие как промоторы и энхансеры, содержащиеся в векторе, вводят для облегчения правильной транскрипции гетерологичного полинуклеотида (трансгена) и при необходимости трансляции (например, промотор, энхансер, сигнал сайленсинга для интронов, сохранение правильной рамки считывания гена для обеспечения внутрирамочной трансляции иРНК и стоп-кодонов, и т.д.). Такие элементы, как правило, действуют в cis-положении, но могут также действовать в транс-положении.

[0072] Регуляцию экспрессии можно проводить на уровне транскрипции, трансляции, сплайсинга, стабильности транскрипта и т.д. Как правило, регулирующий экспрессию элемент, который модулирует транскрипцию, располагается рядом с 5'-концом транскрибируемого полинуклеотида (например, "выше"). Регулирующие экспрессию элементы также могут располагаться на 3'-конце транскрибируемой последовательности (например, "ниже") или в транскрипте (например, в интроне). Регулирующие экспрессию элементы могут располагаться на расстоянии от транскрибируемой последовательности (например, от 100 до 500, от 500 до 1000, от 2000 до 5000, от 5000 до 10000 или более нуклеотидов от полинуклеотида) даже на значительных расстояниях. Однако вследствие ограничений длины полинуклеотида для векторов AAV такие регулирующие экспрессию элементы, как правило, находятся в диапазоне от 1 до 1000 нуклеотидов от полинуклеотида.

[0073] Функционально экспрессия функционально связанного гетерологичного полинуклеотида (трансгена) по меньшей мере частично контролируется элементом (например, промотором), таким образом, что элемент модулирует транскрипцию полинуклеотида и при необходимости трансляцию транскрипта. Конкретным примером регулирующего экспрессию элемента является промотор, который, как правило, располагается в 5'-положении транскрибируемой последовательности. Другой пример регулирующего экспрессию элемента представляет собой энхансер, который может располагаться в 5'-, 3'-положении транскрибируемой последовательности или в транскрибируемой последовательности.

[0074] Как используют в настоящем описании, "промотор" может относиться к последовательности ДНК, которая располагается рядом с трансгеном. Промотор, как правило, является функционально связанным с прилежащей последовательностью, например, гетерологичным полинуклеотидом (трансгеном). Промотор, как правило, увеличивает количество, экспрессируемой из гетерологичного полинуклеотида (трансгена), по сравнению с количеством, экспрессируемым, когда промотор не содержится.

[0075] Как используют в настоящем описании, "энхансер" может относиться к последовательности, которая располагается рядом с гетерологичным полинуклеотидом (трансгеном). Энхансерные элементы, как правило, располагаются выше промоторного элемента, а также функционируют и могут располагаться ниже или в последовательности ДНК (например, трансгене). Таким образом, энхансерный элемент может располагаться на 100 пар оснований, 200 пар оснований или 300 или более пар оснований выше или ниже гетерологичного полинуклеотида (трансгена). Энхансерные элементы, как правило, повышают экспрессию гетерологичного полинуклеотида (трансгена) выше уровня экспрессии, увеличенной промоторным элементом.

[0076] Регулирующие экспрессию элементы (например, промоторы) включают регулирующие экспрессию элементы, активные в конкретной ткани или тип клеток, обозначаемые в настоящем описании как "тканеспецифические регулирующие экспрессию элементы/промоторы". Тканеспецифические регулирующие экспрессию элементы, как правило, являются активными в конкретной клетке или ткани (например, клетке печени, головного мозга, центральной нервной системы, спинного мозга, глаза, сетчатки, кости, мышцы, легкого, поджелудочной железы, сердца, почки и т.д.). Регулирующие экспрессию элементы, как правило, являются активными в этих клетках, тканях или органах вследствие того, что они распознаются белками-активаторами транскрипции или другими регуляторами транскрипции, которые являются уникальными для конкретного типа клеток, тканей или органов.

[0077] Регулирующие экспрессию элементы также включают универсальные или смешанные промоторы/энхансеры, которые способны направлять экспрессию полинуклеотида во многих различных типах клеток. Such элементы включают, но не ограничиваются ими, предранний промотор/энхансерные последовательности цитомегаловируса (CMV), промотор/энхансерные последовательности вируса саркомы Рауса (RSV)и другие вирусные промоторы/энхансеры, активные в различных типах клеток млекопитающих, или синтетические элементы, которые не встречаются в природе (см., например, Boshart et al., Cell, 41:521-530 (1985)), промотор SV40, промотор дигидрофолатредуктазы (DHFR), промотор β-актина курицы (CBA), промотор фосфоглицеринкиназы (PGK) и промотор фактора элонгации-1 альфа (EF1-альфа).

[0078] Регулирующие экспрессию элементы также обеспечивают экспрессию, таким образом, что она является регулируемой, т.е. сигнал или стимулы повышают или снижают экспрессию функционально связанного гетерологичного полинуклеотида (трансгена). Регулируемый элемент, который повышает экспрессию функционально связанного полинуклеотида в ответ на сигнал или стимулы, также обозначают как "индуцибельный элемент" (например, индуцируемый сигналом). Конкретные примеры включают, но не ограничиваются ими, гормон- (например, стероид) индуцибельный промотор. Регулируемый элемент, который снижает экспрессию функционально связанного полинуклеотида в ответ на сигнал или стимулы обозначают как "репрессивный элемент" (например, сигнал снижает экспрессию, таким образом, что когда сигнал удаляют, или он отсутствует, экспрессия увеличивается). Как правило, количество повышения или снижения, обеспечиваемого такими элементами, является пропорциональным количеству представленного сигнала или стимулов; чем больше количество сигнала или стимулов, тем больше повышение или понижение экспрессии. Конкретные неограничивающие примеры включают цинк-индуцибельный промотор металлотионина (MT) овцы; стероидный гормон-индуцибельный промотор вируса опухоли молочной железы мыши (MMTV); промоторную систему полимеразы T7 (WO 98/10088); тетрациклин-репрессивную систему (Gossen, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:5547-5551 (1992)); тетрациклин-индуцибельную систему (Gossen et al., Science. 268:1766-1769 (1995); также см. Harvey et al., Curr. Opin. Chem. Biol., 2:512-518 (1998)); RU486-индуцибельную систему (Wang et al., Nat. Biotech., 15:239-243 (1997) и Wang et al., Gene Ther., 4:432-441 (1997)]; и рапамицин-индуцибельную систему (Magari, et al., J. Clin. Invest. 100:2865-2872 (1997); Rivera et al., Nat. Medicine. 2:1028-1032 (1996)). Другие регулируемые регулирующие элементы, которые могут являться пригодными в этом контексте, представляют собой регулирующие элементы, которые регулируются конкретным физиологическим состоянием, например, температурой, острой фазой.

[0079] Регулирующие экспрессию элементы также включают нативные элементы для гетерологичного полинуклеотида (трансгена). Нативный регулирующий элемент (например, промотор) можно использовать, когда желательным является, чтобы экспрессия гетерологичного полинуклеотида имитировала нативную экспрессию. Нативный элемент можно использовать, когда экспрессия гетерологичного полинуклеотида должна регулироваться временно или в развитии, или тканеспецифическим образом или в ответ на конкретные транскрипционные стимулы. Также можно использовать другие нативные регулирующие экспрессию элементы, такие как интроны, участки полиаденилирования или консенсусные последовательности Козака.

[0080] Как используют в настоящем описании, термин "функциональная связь" или "функционально связанный" относится к физическому или функциональному смежному положению компонентов, так как описано, чтобы обеспечивать их функционирование надлежащим им образом. В примере регулирующего экспрессию элемента в функциональной связи с трансгеном взаимосвязь является такой, что регулирующий элемент модулирует экспрессию трансгена. Более конкретно, например, две функционально связанные последовательности ДНК означают, что две ДНК располагаются (цис или транс) в такой взаимосвязи, что по меньшей мере одна из последовательностей ДНК способна оказывать физиологическое действие на другую последовательность.

[0081] Как описано в настоящем описании, векторы, включая вирусные векторы, такие как AAV, и последовательности вектора могут содержать еще дополнительные элементы нуклеиновой кислоты. Эти элементы включают без ограничения одну или более копий последовательности ITR AAV, промотор/энхансерный элемент, сигнал терминации транскрипции, 5'- или 3'-нетранслируемые области (например, последовательности полиаденилирования), которые фланкируют трансген, или полный или часть интрона I. Такие элементы также необязательно включают сигнал терминации транскрипции. Конкретный неограничивающий пример сигнала транскрипции терминация представляет собой сигнал терминации транскрипции SV40.

[0082] Как используют в настоящем описании, термин "фланкирует" по отношению к элементам вектора или последовательности вектора, такой как трансген, означает, что указанный элемент располагается в 5'- или 3'-положении. Таким образом, когда регулирующий экспрессию элемент фланкирует трансген, регулирующий элемент располагается в 5'- или 3'-положении от трансгена. Термин "фланкирует" не исключает промежуточных последовательностей между ними. Например, между трансгеном и регулирующим элементом может присутствовать промежуточная последовательность, например, участок рестрикции. Участок рестрикции может представлять собой промежуточную последовательность между трансгеном и регулирующим элементом. Таким образом, последовательность, которая "фланкирует" элемент, указывает на то, что один элемент располагается в 5'- или 3'-посложении последовательности, но может содержаться промежуточная последовательность, таким образом, что фланкирующая последовательность не является непосредственно смежной с последовательностью, которую она фланкирует.

[0083] Как описано в настоящем описании, векторы AAV, как правило, допускают вставки ДНК с определенным диапазоном размера, который, как правило, составляет приблизительно от 4 т.п.н. приблизительно до 5,2 т.п.н. или незначительно больше. Таким образом, когда репортерный трансген представляет собой одноцепочечный геном или является самокомплементарным, размер трансгена может составлять менее чем приблизительно от 4 т.п.н. приблизительно до 5,2 т.п.н.

[0084] Для более коротких последовательностей вектора водят спейсер или филлер в водимый фрагмент для доведения длины до близкого к нормальному или до нормального размера геномной последовательности вируса, приемлемой для упаковки вектора AAV в вирусную частицу. В различных вариантах осуществления филлер/спейсерная последовательность нуклеиновой кислоты представляет собой нетранслируемый (не кодирующий белок) сегмент нуклеиновой кислоты. В конкретных вариантах осуществления вектора AAV длина гетерологичной полинуклеотидной последовательности составляет менее 4,7 т.п.н., и филлер или спейсер полинуклеотидной последовательности, которая при объединении (например, встраивании в вектор) с трансгенной последовательностью, имеет общую длину приблизительно 3,0-5,5 т.п.н. или приблизительно 4,0-5,0 т.п.н., или приблизительно 4,3-4,8 т.п.н.

[0085] Полинуклеотиды и полипептиды, включая модифицированные формы, можно получать с использованием различных техник стандартного клонирования, технологии рекомбинантных ДНК, путем клеточной экспрессии или трансляции in vitro и способами химического синтеза. Чистоту полинуклеотидов можно определять секвенированием, электрофорезом в геле и т.п. Например, нуклеиновые кислоты можно выделять способами гибридизации или компьютерного скрининга баз данных. Такие способы включают, но не ограничиваются ими: (1) гибридизацию геномной ДНК или библиотеки кДНК с хондами для детекции гомологичных нуклеотидных последовательностей; (2) скрининг антителом для детекции полипептидов, обладающих общими структурными признаками, например, с использованием экспрессионной библиотеки; (3) полимеразную цепную реакцию (ПЦР) на геномной ДНК или кДНК с использованием праймеров, способных отжигаться на представляющей интерес последовательности нуклеиновой кислоты; (4) компьютеризированные поиски в базах данных последовательностей на родственные последовательности и (5) дифференциальный скрининг вычитаемой библиотеки нуклеиновых кислот.

[0086] Полинуклеотиды и полипептиды, включая модифицированные формы, также можно получать способами химического синтеза, известными специалисту в данной области, например, с использованием автоматического устройства для синтеза (см., например, Applied Biosystems, Foster City, CA). Пептиды можно синтезировать полностью или частично химическими способами (см., например, Caruthers (1980). Nucleic Acids Res. Symp. Ser. 215; Horn (1980); и Banga A.K., Therapeutic Peptides and Proteins, Formulation, Processing and Delivery Systems (1995) Technomic Publishing Co., Lancaster, PA). Пептидный синтез можно проводить с использованием различных твердофазных техник (см., например, Roberge, Science 269:202 (1995); Merrifield, Methods Enzymol. 289:3(1997)) и автоматический синтез можно породить, например, с использованием пептидного синтезатора ABI 431A (Perkin Elmer) в соответствии с инструкциями производителя.

[0087] Термин "выделенный" при использовании в качестве определения композиции (например, вектора) означает, что композиции получают искусственным путем или отделяют полностью или по меньшей мере частично от их природной среды in vivo. Как правило, выделенные композиции по существу не содержат одно или более веществ, с которыми они обычно являются связанными в природе, например, одним или более белков, нуклеиновых кислот, липидов, углеводов, клеточных мембран. Термин "выделенный" не исключает комбинаций, получаемых искусственным путем, например, рекомбинантный вирусный вектор (например, AAV), последовательность вектора или вирусную частицу (например, AAV), которая упаковывает или заключает в капсид векторный геном, и фармацевтический состав. Термин "выделенный" также не исключает альтернативные физические формы композиции, такие как гибриды/химеры, мультимеры/олигомеры, модификации (например, фосфорилирование, гликозилирование, липидизацию) или дериватизированные формы, или формы, экспрессируемые в клетках-хозяевах, получаемых искусственным путем.

[0088] Несущие репортерный трансген рекомбинантные векторы, последовательности вектора, частицы и т.д. обеспечивают анализ или детекцию (измерение/количественное определение) антител, которые связываются с антигенами вируса, такими как белки оболочки или капсидные белки, включая капсиды AAV. Изобретение относится к способам анализа или детекции (измерению/количественному определению) антител, которые связываются с антигенами вируса. В одном из вариантов осуществления способ включает предоставление инфекционных рекомбинантных вирусных частиц, которые заключают в капсид рекомбинантный вектор, где (i) вектор содержит репортерный трансген, (ii) репортерный трансген представляет собой одноцепочечный или самокомплементарный геном, и (iii) репортерный трансген является функционально связанным с одним или несколькими регуляторными элементами экспрессии и фланкированным одним или более фланкирующими элементами; предоставление биологического образца от индивидуума для анализа или детекции антител, которые связываются с вирусом; предоставление клеток, которые можно инфицировать указанными инфекционными вирусными частицами; приведение в контакт или инкубацию инфекционных рекомбинантных вирусных частиц с биологическим образцом, получая таким образом, получаемую смесь; приведение клеток, которые можно инфицировать, в контакт с получаемой смесью в условиях, в которых инфекционные рекомбинантные вирусные частицы могут инфицировать и экспрессировать репортерный трансген в клетках; и измерение экспрессии репортерного трансгена. Сравнение экспрессии репортерного трансгена смеси с репортерным трансгеном в отрицательном (-) контроле, где (-) контроль (i) не содержит антитела, которые связываются с инфекционным вирусом, или (ii) содержат предопределенное количество антител, которые связываются с инфекционным вирусом. Если экспрессия репортерного трансгена смеси является больше, чем (-) контроля, это определяет или детектирует наличие антител, которые связываются с вирусом в биологическом образце.

[0089] В конкретных аспектах антителами анализировали или детектировами связывание с частицами AAV, и/или инфекционные рекомбинантные вирусные частицы содержат один или более капсидных белков AAV, и/или рекомбинантный вектор содержит вирусный вектор, такой как вектор AAV, необязательно с одним или более ITR AAV.

[0090] Термин "индивидуум" относится к животному, как правило, млекопитающему, такому как люди, не являющимся человеком приматам (обезьянам, гиббонам, гориллам, шимпанзе, орангутанам, макакам), домашнему животному (собакам и кошкам), сельскохозяйственному животному (домашней птице, такой как курицы и утки, лошади, коровы, козы, овца, свиньи) и экспериментальным животным (мышь, крыса, кролик, морская свинка). Являющиеся человеком индивидуумы включают эмбрион, индивидуумов неонатального, младенческого, подросткового и взрослого возраста.

[0091] Изобретение относится к наборам с упаковочным материалом и одним или более его компонентами. Набор, как правило, содержит этикетку или вкладыш в упаковку, содержащий описание компонентов или инструкции для применения в vitro, in vivo или ex vivo его компонентов. Набор может содержать серию таких компонентов, например, вектор (например, AAV), последовательность вектора, векторный геном или вирусную частицу, или композицию.

[0092] Набор относится к физической структуре, содержащей один или более компонентов набора. Упаковочный материал может сохранять компоненты в стерильном состоянии, и может быть выполнен из материала, общепринято используемого для таких целей (например, бумаги, гофрированного волокна, стекла, пластмассы, фольги, ампулы, флаконы, пробирки и т.д.).

[0093] Этикетки или вкладыши могут содержать идентифицирующую информацию об одном или более компонентов, количествах дозы, клинической фармакологии активного ингредиента(ов), включая механизм действия, фармакокинетику и фармакодинамику. Этикетки или вкладыши могут содержать информацию, указывающую производителя, номера партии, место и дату производства, даты истечения срока годности. Этикетки или вкладыши могут содержать информацию, указывающую информацию о производителе, номера партии, место и даты производства. Этикетки или вкладыши могут содержать инструкции для клинического врача или индивидуума по использованию одного или более компонентов набора в способе или использовании. Инструкции могут включать инструкции по практическому осуществлению любого из способов и видов использования, описываемых в настоящем описании.

[0094] Этикетки или вкладыши содержат "печатный материал", например, бумагу или картон или отдельно или в форме, прикрепленной к компоненту, набору или упаковочному материалу (например, коробке), или прикрепленной к ампуле, пробирке или флаконе, содержащем компонент набора. Этикетки или вкладыши могут дополнительно включать машиночитаемый носитель, такой как напечатанная этикетка со штриховым кодом, диск, оптический диск, такой как CD- или DVD-ROM/RAM, DVD, MP3, магнитная лента или электрические носители информации, такая как RAM и ROM, или их гибриды, такие как магнитные/оптические носители информации, носители FLASH или карты памяти.

[0095] Если не определено иное, все технические и научные термины, используемые в настоящем описании, имеют то же значение, как общепринято понимает специалист в данной области, к которой принадлежит данное изобретение. Хотя в практическом осуществлении или тестировании настоящего изобретения можно использовать способы и вещества, аналогичные или эквивалентные способам и веществам, описываемым в настоящем описании, подходящие способы и вещества описаны в настоящем описании.

[0096] Все заявки, публикации, патенты и другие ссылки, цитирования GenBank и цитирования ATCC, приводимые в настоящем описании, полностью включены посредством ссылки. В случае противоречия описание, включая определения, будет являться контрольным.

[0097] Все признаки, описываемые в настоящем описании, можно комбинировать в любой комбинации. Каждый признак, описываемый в описании, можно заменять альтернативным признаком, служащим схожей, эквивалентной или аналогичной цели. Таким образом, если явно не указано иное, описываемые признаки (например, рекомбинантный вектор (например, AAV), векторная последовательность, плазмида, геном или трансген, или рекомбинантная вирусная частица (например, AAV) являются примером класса эквивалентных или аналогичных признаков.

[0098] Как используют в настоящем описании, формы единственного числа включают определяемые объекты во множественном числе, если из контекста явно не следует иное. Таким образом, например, ссылка на "полинуклеотид" включает совокупность таких полинуклеотидов, ссылка на "вектор" включает совокупность таких векторов, "векторная последовательность, плазмида или геном" включает совокупность таких векторов, и ссылка на "вирус" или "частицу" включает совокупность таких вирионов/частиц.

[0099] Как используют в настоящем описании, все числовые величины или числовые диапазоны включают целые числа в таких диапазонах и дробные величины таких значений или целые числа в пределах диапазонов, если из контекста явно не следует иное. Таким образом, в качестве иллюстрации ссылка на по меньшей мере 80% комплементарность или идентичность включает 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91% и т.д., а также 81,1%, 81,2%, 81,3%, 81,4%, 81,5% и т.д., 82,1%, 82,2%, 82,3%, 82,4%, 82,5% и т.д., и т.д.

[0100] Ссылка на целое число с более (больше) или менее включает любое число, большее или меньшее ссылочного числа, соответственно. Таким образом, например, ссылка на более 1 включает 2, 3, 4, 5, 6 и т.д., и выше.

[0101] Как используют в настоящем описании, все числовые величины или диапазоны включают дробные величины значений и целые числа в пределах таких диапазонов и дробные величины целых чисел в пределах таких диапазонов, если из контекста явно не следует иное. Таким образом, в качестве иллюстрации ссылка на числовой диапазон, такой как диапазон процентов, такой как 1-10, включает 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, а также 1,1, 1,2, 1,3, 1,4, 1,5 и т.д., и т.д. Таким образом, ссылка на диапазон 1-50 включает 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 и т.д., до и включая 50, а также 1,1, 1,2, 1,3, 1,4, 1,5 и т.д., 2,1, 2,2, 2,3, 2,4, 2,5 и т.д., и т.д.

[0102] Ссылка на серию диапазонов включает диапазоны, которые объединяют значения границ различных диапазонов в серии. Таким образом, в качестве иллюстрации ссылка на серию диапазонов 11-10, 10-20, 20-30, 30-40, 40-50, 50-60, 60-75, 75-100, 100-150, 150-200, 200-250, 250-300, 300-400, 400-500, 500-750, 750-1000, 1000-1500, 1500-2000, 2000-2500, 2500-3000, 3000-3500, 3500-4000, 4000-4500, 4500-5000, 5500-6000, 6000-7000, 7000-8000 или 8000-9000 включает диапазоны 10-50, 50-100, 100-1000, 1000-3000, 2000-4000 и т.д.

[0103] Изобретение, как правило, описывается в настоящем описании с использованием утвердительного языка для описания различных вариантов осуществления и аспектов. Изобретение также конкретно включает варианты осуществления, в которых полностью или частично исключают конкретный объект изобретения, такой как вещества или материалы, этапы способа и условия, протоколы или процедуры. Например, в определенных вариантах осуществления или аспектах изобретения исключают материалы и/или этапы способа. Таким образом, даже несмотря на то, что изобретение, как правило, не выражают в настоящем описании в терминах, что изобретение не включает в себя аспекты, которые не исключаются явным образом в изобретении, однако описываются в настоящем описании.

[0104] Было описано несколько вариантов осуществления изобретения. Однако специалист в данной области, не выходя за рамки сущности и объема изобретения, может проводить различные изменения и модификации по изобретению для его адаптации к различным видам использования и условиям. Таким образом, следующие ниже примеры предназначены иллюстрировать, а не ограничивать объем описываемого изобретения.

Примеры

Пример 1

[0105] В этом примере описывают различные исследования, в которых оценивают эффективность анализа на нейтрализующего антитела (NAb) против AAV. Такой анализ можно использовать для скрининга индивидуумов перед включением в исследования опосредованного вектором AAV переноса генов, а также мониторинга наличия или количества нейтрализующего антитела против AAV во время терапии на основе опосредованного вектором AAV переноса генов и терапии после опосредованного вектором AAV переноса генов.

[0106] Значительная часть взрослого населения подвергалась действию AAV дикого типа, как правило, путем инфекции через дыхательные пути в детском возрасте (Calcedo, 2011). Таким образом, многие люди несут NAb против AAV, которые дают перекрестную реакцию с вектором. Проведенное ранее клиническое исследование (Manno et al., 2006) демонстрировало, что даже небольшой титр Nab, по-видимому, блокирует трансдукцию, когда вектор доставляют через кровоток. Другие исследования на не являющихся человеком приматах демонстрировали, что титры NAb до 1:5 полностью блокируют трансдукцию печени, когда вектор доставляют через кровоток (Jiang et al., Blood, 2006; Scallan, Blood, 2006). Целью этого анализа являлось определение титра NAb у индивидуумов, которые подставлены для включения в это исследование; индивидуумы с уже существующими титрами >1:5 не являлись кандидатами для участия в этом исследовании.

[0107] В этом исследовании использовали анализ на основе клеток с использованием вектора AAV, экспрессирующего репортерный ген. Тестируемую сыворотку смешивают с вектором и сравнивают уровень экспрессии люциферазы с уровнем в контрольном образце, не подвергавшемся действию сыворотки. Нейтрализующий титр определяют как наибольшее разбавление сыворотки, которое приводит к 50% или большему ингибированию экспрессии репортерного гена (например, люциферазы) по сравнению с лунками с клетками и вектором, но без сыворотки, но описывают в этом документе как диапазон; например, если наблюдают 50% или более ингибирования при разбавлении 1:3,1 образца, титр описывают как диапазон от 1:3,1 до 1:10.

[0108] Три переменных могут влиять на точность и надежность анализа. Они представляют собой эффект числа пассажей клеток на результат анализа, изменчивость и стабильность результатов, получаемых оператором, с циклами замораживание-оттаивание тестируемой сыворотки и FACT. Образцы сыворотка для тестирования обычно получают замороженными на сухом льду, хранят при -80°C и тестируют при первом оттаивании. Повторные анализы можно проводить после дополнительного цикла замораживание-оттаивание.

Пример 2

[0109] Этот пример содержит описание определенных веществ и оборудования, используемых в исследованиях, описываемых в настоящем описании.

[0110] Вещества: Тестируемые образцы, источника индивидуума представляет собой сыворотку или плазму (плазма не должна содержать гепарин в качестве антикоагулянта); PBS (фосфатно-солевой буфер), стерильный, не содержащий Ca++ и Мg++, Invitrogen 14190-136 или эквивалент; DMEM (модифицированная Дульбекко среда Игла), Invitrogen 11965-084 или эквивалент; FBS (эмбриональная телячья сыворотка), Hyclone SH30070.03IR или эквивалент; пенициллин/стрептомицин, Invitrogen 15140-122 или эквивалент; L-глутамин, 200 мМ, Invitrogen 25030-156 или эквивалент; cDMEM: полная DMEM (10% FBS, 1 × пенициллин/стрептомицин, 1 × L-глутамин); клетки эмбриональной почки человека, стабильно экспрессирующие Ad-E4 (клетки 2V6.11, номер ATCC: CRL-2784, после пассажа № 26); 1 × трипсин-EDTA (0,25% трипсин с EDTA 4Na), Invitrogen 25200-056 или эквивалент; отношение очищенной в градиенте плотности AAV-люциферазы с капсидом к векторному геному (вг) 1, после титрования дот-блот гибридизацией с использованием люциферазной плазмиды в качестве стандарта; контрольная плазма FACT, George King Biomedical кат. № 0020-1, номер партии D9d1, хранили замороженной в аликвотах 50 мкл; понастерон A, Invitrogen H101-01, восстановленный в 100% этаноле в концентрации 1 мкг/мл; 500 мл системы фильтрования, 0,22 мкм, Millipore SCGPU05RE; 96-луночный планшет с плоским дном для культивирования тканей Corning 3595; серологические пипетки, 5, 10, 25 мл; 50 мл центрифужные/конические пробирки, Corning 430290; резервуары для реагентов, Costar 4870; 12-канальный многоканальный пипеточный дозатор 1-10 мкл; 12-канальный многоканальный пипеточный дозатор 20-200 мкл; P-20, P-200 и P-1000 Rainin Pipetman; наконечники для пипетки; пробирки Eppendorf; 12-канальные резервуары, Costar 4877; пипеточный дозатор, Drummond 4-000-100 или эквивалент; мешалка Vortex; трипановый синий (Sigma T8154 или эквивалент) для подсчетов жизнеспособных клеток; набор Renilla luciferase assay, Promega, каталожный №E2820; программное обеспечение Microsoft Excel.

[0111] Оборудование: инкубатор при 37°C и 5% CO₂; бокс биологической безопасности; гемоцитометре, Reichert Bright-Line, Fisher №02-671-5 или эквивалент; инвертированный микроскоп; морозильная камера, -80°C; холодильник, 2-8°C; инкубатор, 37°C; аналитические весы; микропланшетный люминометр Veritas, Turner Biosystems и встряхиватель.

Пример 3

[0112] Этот пример содержит описание иллюстративного способа детекции и/или количественного определения антител против AAV.

[0113] Клетки 2V6.11 (клетки HEK-293, генетически модифицированные для экспрессии гена E4 из аденовируса) трансдуцировали одним вектором AAV-люцифераза или вектором, смешанным с сывороткой в диапазоне разбавлений. Через двадцать четыре часа детектировали экспрессия люциферазы с использованием люминометр. Для эти исследований и для общепринятого анализа клетки обрабатывали идентичным образом.

[0114] Результаты опыта в трех повторениях сравнивают с показаниями от одного вектора (контроль) для определения разбавления сыворотки, в котором экспрессия люциферазы является эквивалентной или меньшей 50% экспрессии для одного вектора. В этом анализе в качестве репортерного гена использовали репортерный ген люциферазы, а не lacZ, т.к. он является более чувствительным к низким уровням ингибирования.

[0115] Критерии для оценки успеха опыта включают:

1. Контрольная плазма (объединенная плазма человека, FACT) обеспечивает прочтение в диапазоне от 1:100 до 1:316 для векторов AAV8 и от 1:1000 до 1:3160 для векторов AAV2.

2. Лунки с клетками, но не с вектором и не с сывороткой, дают допустимо низкие показания.

3. Лунки с клетками и вектором, но не с сывороткой, дают допустимое показание.

[0116] Для протоколов, в которых вектор доставляют через кровоток, предпочтительным для включения в исследование, как правило, является низкий (<1:5) или недетектируемый титр. По этой причине все результаты в этом диапазоне подтверждают в повторном опыте.

[0117] Вариативность результатов разных анализов определяли в серии из 9 образцов сыворотки человека, получаемой от взрослых индивидуумов с тяжелой гемофилией, проживающих в США, с титром Nab против AAV8 в диапазоне от низкий-отрицательный до высокий. В эти исследования включали положительный контроль плазмы FACT (партия № D9d1). FACT представляет собой коммерчески доступную совокупность образцов нормальной плазмы человека по меньшей мере от 30 доноров, являющихся людьми. В объединенной популяции встречаются индивидуумы с высоким титром антител против AAV, которых обозначают в этом анализе как положительные. Использование плазмы в качестве положительного контроля является приемлемым, т.к. сыворотка и плазма содержат аналогичные уровни антител. В этом исследовании использовали одну отдельную партию плазмы FACT.

[0118] Более подробно, получают реагенты и образцы: вектор AAV-CBS-Renilla в концентрации ≥2×10¹¹ вг/мл и хранят аликвоты при -80°C. Для контрольной плазмы FACT образцы инактивируют нагреванием при 56°C в течение 30 минут и хранят аликвоты при -80°C. Для тестируемого образца образцы (сыворотки или плазмы) инактивируют нагреванием при 56°C в течение 30 минут и хранят аликвоты при -80°C. Для лизиса люциферазы и буфера для анализа получают реагенты в Renilla Люцифераза System и используют по инструкциям производителя. Для разбавления сыворотки эмбриональную телячью сыворотку инактивируют нагреванием при 56°C в течение 30 минут и охлаждают до комнатной температуры и фильтруют через 0,22 мкМ фильтр. Аликвоты хранят при -80°C.

[0119] Более подробно, для процедуры клетки 2V6.11 низкого пассажа (№2), приобретаемые от ATCC (каталожный номер CRL-2784) размораживают при 37°C на водяной бане в течение приблизительно двух минут, затем дважды промывают DMEM с 10% FBS, 1% пен/стреп и 1% глутамином. Затем клетки высевают в колбу для культивирования клеток T-75, культивируют в течение 2 суток, трипсинизируют, затем повторно высевают еще в двух пассажах в колбы T-75. Затем клетки трипсинизируют, промывают и подсчитывают, разбавляют до 1×10⁵ клеток/мл в cDMEM и добавляют понастерон A added до конечной концентрации 1 мкг/мл и вывевают на 96-луночный планшет при плотности 20000 на лунку. Клетки инкубируют в течение ночи в инкубаторе при 37°C/5% CO₂, и они должны достигать приблизительно 70-80% конфлюэнтности.

[0120] Получают серийные разведения тестируемых образцов и образцов контрольной плазмы в планшете для разведения (96-луночный планшет для культивирования тканей U-образным дном). Получают 3,1-кратное (полулогарифмическое) серийное разведение контрольной плазмы FACT с использованием FBS в качестве разбавителя. Диапазон разбавления зависит от плазмы FACT. Рекомендуют по меньшей мере шесть последовательных разбавлений, как правило, в диапазон от 1:10 до 1:3160.

[0121] Получают 3,1-кратное серийное разведение тестируемого образца с использованием FBS в качестве разбавителя. Диапазон разбавления зависит от образца: рекомендуемые разбавления составляют от 1:1 до 1:316 для исходных (до введения) образцов, 1:10 и выше для образцов после введения AAV.

[0122] Переносят 18 мкл указанных выше разбавлений из планшета для разбавлений во второй 96-луночный планшет для предварительного анализа. Получают рабочую концентрацию вектора AAV-люцифераза разбавлением вектора AAV-люцифераза до 8×10⁷-2×10⁹ вг/мл в DMEM - не использовать cDMEM или любой разбавитель, содержащий бычью сыворотку. Объем разбавленного вектора 0,5 мл является достаточным для одного полного планшета для анализа.

[0123] Получают смесь вектора с разбавленными тестируемыми и контрольными образцами для получения "нейтрализованных" образцов. Переносят разбавленный вектора в 12-канальный резервуар. Переносят 18 мкл разбавленного вектора из резервуара в 18 мкл каждого из разбавлений тестируемых и контрольных образцов в планшете для предварительного анализа. Смешивают 18 мкл разбавленного вектора с 18 мкл FBS только для контрольного вектора ("V+FBS"). Добавляют 18 мкл FBS в одну лунку в планшет для предварительного анализа в качестве "контрольной пробы". Инкубируют планшет для предварительного анализа при 37°C в течение одного часа.

[0124] После инкубации переносят 7,5 мкл разбавлений "нейтрализованных" тестируемых образцов, разбавлений "нейтрализованной" контрольной плазмы, контроля V+FBS и контрольной пробы FBS в планшет для анализа в трех повторениях. Инкубируют планшет для анализа в течение ночи в инкубаторе 37°C/5% CO₂.

[0125] Для лизиса клеток и измерений активности люциферазы получают достаточное количество лизирующего буфера (5 мл является достаточным для одного планшета) в 15 или 50 мл конической пробирке и достаточное количество буфера для анализа (7 мл является достаточным для одного планшета) в 15 или 50 мл коническую пробирку, как описано. Через 20-24 часа после трансдукции клетки промывают один раз PBS. Отсасывают супернатант клеточной культуры с использованием многоканальной пипетки. Добавляют к клеткам 200 мкл PBS, обращают внимание, чтобы не нарушать клеточный монослой. Отсасывают раствор для промывания и добавляют 40 мкл лизирующего буфера в лунку, инкубируют планшет в течение 15 минут при комнатной температуре.

[0126] Включают люминометр и нагружают буфер для анализа в отведенное для этого место, заряжают инжектор и загружают планшет с клетками (протокол для люциферазы Promega). Измеряют активности люциферазы и сохраняют все показания в Excel. Параметры для люминометра: время интеграции, 2 сек, задержку между последней операцией и этим впрыском: 0 сек, объем впрыска: 50 мкл, скорость впрыска: 333 мкл/сек, задержка между впрыском и измерением: 1 сек.

[0127] Для вычисления титра нейтрализующего антитела против AAV вычисляют среднее значение неочищенной люциферазы - значения контрольной пробы из лунок в трех повторениях в листе Excel и определяют % экспрессии люцифераза:

% экспрессии люциферазы=[(показание для люциферазы тестируемого образца - контрольная проба)/(показание для люциферазы V-FBS - контрольная проба)]×100.

% ингибирования люциферазы=100 - % экспрессии люциферазы

[0128] Нейтрализующий титр образца определяют как наибольшее разбавление, которое приводит к 50% или большему ингибированию экспрессии люциферазы. Титр NAb выражают в виде диапазона разбавлений. Например, если наблюдают 50% или более ингибирование при разбавлении образца 1:10, титр выражают в виде диапазона от 1:10 до 1:31.

[0129] Обусловленная оператором вариабельность: Обусловленную оператором вариабельность оценивали на основе результата многих определений NAb против AAV, проводимых оператором 1 и 2 на одной и той же группе образцов сыворотки человека на различные сутки. Операторы имели информацию о номера образца.

[0130] Оператор 1 проводит анализ NAb на 9 образцы сыворотки 6 раз на различные сутки. Плазму FACT тестировали всего 18 раз в течение 6 различных суток.

[0131] Оператор 2 проводит анализ NAb на 9 образцы сыворотки 5 раз на различные сутки. Плазму FACT тестировали всего 15 раз в течение 5 различных суток.

[0132] Число пассажей клеток регистрировали и использовали для анализа результатов. Наконец, определяли титр NAb против AAV8 плазмы FACT после многих циклов замораживания-оттаивания для оценки изменений NAb против AAV, связанных с обработкой образца.

Таблица 1 Схема планшета для анализа

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

11

12

A

FACT (1:10)

Образец X (1:1)

Образец Y (1:1)

Образец Z (1:1)

B

FACT (1:31,6)

Образец X (1:3,16)

Образец Y (1:3,16)

Образец Z (1:3,16)

C

FACT (1:100)

Образец X (1:10)

Образец Y (1:10)

Образец Z (1:10)

D

Максимальный сигнал

Образец X (1:31,6)

Образец Y (1:31,6)

Образец Z (1:31,6)

E

Фон

Образец X (1:100)

Образец Y (1:100)

Образец Z (1:100)

F

FACT (1:316)

Образец X (1:316)

Образец Y (1:316)

Образец Z (1:316)

G

FACT (1:1000)

Образец X (1:1000)

Образец Y (1:1000)

Образец Z (1:1000)

H

FACT (1:3160)

Образец X (1:3160)

Образец Y (1:3160)

Образец Z (1:3160)

[0133] Разбавления образца указаны в скобках. Лунки максимального сигнала содержат вирус, инкубируемый только с разбавителем образца. Лунки фона содержат только разбавитель. Максимально три неизвестных образца тестируют в 96-луночном планшете. Указанная здесь схема планшета для анализа является идентичной схеме, используемой во время проведения анализа.

Пример 4

[0134] Этот пример содержит описание результаты анализа детекции и/или количественного определения антител против AAV.

[0135] Интенсивность сигнала в зависимости от числа пассажей клеток: В этом исследовании высевали всего 33 чашки и использовали их для тестирования NAb против AAV. Максимальную и минимальную интенсивность репортерного сигнала измеряли в зависимости от числа пассажей клеток.

[0136] Снижение максимального сигнала репортерного гена (Max сигнал) наблюдали при увеличении числа пассажей клеток (фигура 1A),что, по-видимому, не влияло на результаты анализа, т.е. титр NAb являлся идентичным для образцов, анализируемых независимо от числа пассажей клеток до 25 пассажей, и все анализы соответствовали требованиям эффективного анализа. Следует отметить, что клетки, используемые в текущем анализе, никогда не пересевали более 25 раз. Для целей анализа NAb клетки должны находиться в состоянии менее или являться эквивалентными 25 пассажам.

[0137] Фоновый сигнал также снижался при увеличении числа пассажей клеток (фигура 1B). Однако средний сигнал для пассажа клеток 1-12 в сравнении с 13-25 статистически значимо не отличался.

[0138] Обусловленная оператором вариабельность: Титр NAb против AAV конкретной партии плазмы FACT, используемой для этих анализов, оцениваемый по стандартной методике в лаборатории в течение нескольких месяцев, составляет 1:100-1:316 для векторов AAV8. Титры NAb ≥ или ≤ ½ log от среднего значения исключают. Стандартный подход для исследования исключаемых серии опытов заключается в подтверждении того, что ни один из реагентов не является просроченным, и что техническое обслуживание осмотр ключевого оборудования, включая люминометр, является актуальным. Опыт показывает, что для анализов вне допустимого диапазона редко находят конкретную причину; наиболее вероятно это отражает характерную вариабельность анализа на основе клеток.

[0139] Оператор 1: В этой серии определений, проводимых оператором 1 (таблица 2A), титр NAb против AAV8 контрольной плазмы FACT измеряли 18 раз в шести отдельных исследованиях.

- 16/18 раз плазма FACT давала титр 1:100-1:316;

- 1/18 раз (планшет 2, сутки 4) титр измеряли ниже ½ log, 1:31,6-1:100, что приводили к исключению серии опытов;

- 1/18 раз (планшет 3, сутки 6) титр измеряли выше ½ log, 1:316-1:1000, что приводили к исключению серии опытов.

Таблица 2A Титры антитела против AAV в образцах плазмы FACT (оператор 1)
	Сутки 1	Сутки 2	Сутки 3	Сутки 4	Сутки 5	Сутки 6
Планшет 1	1:100-1:316	1:100-1:316	1:100-1:316	1:100-1:316	1:100-1:316	1:100-1:316
Планшет 2	1:100-1:316	1:100-1:316	1:100-1:316	1:31,6-1:100	1:100-1:316	1:100-1:316
Планшет 3	1:100-1:316	1:100-1:316	1:100-1:316	1:100-1:316	1:100-1:316	1:316-1:1000

[0140] Всего 9 образцов сыворотки человека тестировали для NAb против AAV8 в течение шести различных суток. Результаты обобщены в таблице 2B. Закрашенные серым области представляют собой серии опытов, которые исключали из анализа, т.к. титр NAb контрольный плазмы FACT отличался от первоначального диапазона.

[0141] Не наблюдали вариабельность между титрами для образцов 1, 2, 3, 5 и 7, которые оценивали отрицательными (<1:1) на все тестируемые сутки. Для образцов 4 и 9 наблюдали вариацию приблизительно 1 log в течение 5 суток тестирования с титрами в диапазоне от <1:1 до 1:3,1-1:10 и от 1:3,1-1:10 до 1:31,6-1:100, соответственно. Для образца 6 наблюдали полулогарифмическую вариацию; этот образец оценивали как отрицательный на все тестируемые сутки, но не на сутки 5, когда его оценивали 1:1-3,1. Полулогарифмическую вариацию титров также наблюдали для образца 8 с титрами в диапазоне от 1:316-1:1000 до 1:1000-1:3160.

[0142] Для приемлемости исследования каждый образец последовательно оценивали выше или ниже порогового уровня, за исключением образца 9, который оценивали выше порогового уровня на сутки 1-4 (непригодные) и ниже порогового уровня на сутки 5 (пригодные).

Таблица 2B Титры антител против AAV в образцах сыворотки человека (оператор 1)
	Сутки 1	Сутки 2	Сутки 3	Сутки 4	Сутки 5	Сутки 6
Образец 1	<1:1	<1:1	<1:1	<1:1	<1:1	<1:1
Образец 2	<1:1	<1:1	<1:1	<1:1	<1:1	<1:1
Образец 3	<1:1	<1:1	<1:1	<1:1	<1:1	<1:1
Образец 4	<1:1	<1:1	1:1-1:3,1	1:1-1:3,1	1:3,1-1:10	1:1-1:3,1
Образец 5	<1:1	<1:1	<1:1	<1:1	<1:1	<1:1
Образец 6	<1:1	<1:1	<1:1	<1:1	1:1-1:3,1	<1:1
Образец 7	<1:1	<1:1	<1:1	<1:1	<1:1	<1:1
Образец 8	1:1000-1:3160	1:1000-1:3160	1:316-1:1000	1:1000-1:3160	1:316-1:1000	1:316-1:1000
Образец 9	1:10-1:31,6	1:31,6-1:100	1:31,6-1:100	1:10-1:31,6	1:3,1-1:10	1:10-1:31,6
Образцы 1-3 находились на планшете 1; образцы 4-6 находились на планшете 2; образцы 7-9 находились на планшете 3.

[0143] Оператор 2: В части исследования, проводимым оператором 2 (таблица 3A) титр NAb против AAV8 контрольной плазмы FACT измеряли 15 раз в пяти отдельных экспериментах.

- 13/15 раз плазма FACT давала титр 1:100-1:316;

- 1/15 раз (планшет 3, сутки 3) титр измеряли выше ½ log, 1:316-1:1000, что приводили к исключению серии опытов.

- 1/15 раз (планшет 3, сутки 5) титр измеряли ниже ½ log, 1:31,6-1:100, что приводили к исключению серии опытов.

Таблица 3A Титры антител против AAV в образцах плазмы FACT (оператор 2)
	Сутки 1	Сутки 2	Сутки 3	Сутки 4	Сутки 5
Планшет 1	1:100-1:316	1:100-1:316	1:100-1:316	1:100-1:316	1:100-1:316
Планшет 2	1:100-1:316	1:100-1:316	1:100-1:316	1:31,6-1:100	1:100-1:316
Планшет 3	1:100-1:316	1:100-1:316	1:316-1:1000	1:100-1:316	1:31,6-1:100

[0144] Всего 9 образцов сыворотки человека тестировали для NAb против AAV8 на пять различных суток. Результаты обобщены в таблице 3B. Заштрихованные области представляют собой серии опытов, которые исключали из анализа, т.к. титр NAb контрольный плазмы FACT отличался от первоначального диапазона.

[0145] Образцы 1, 2, 3, 5, 6 с отрицательными титрами NAb против AAV8 (<1:1) и образец 4 с титром 1:1-1:3,1 постоянно давали одни и те же титры в течение всех пяти суток тестирования. Образцы с более высоким титром, образцы 8 и 9, также являлись постоянными в течение всех суток тестирования; образец 8 оценивали 1:100-1:316 и образец 9 оценивали 1:10-1:31,6. Образец 7 оценивали как отрицательный (<1:1) на все сутки тестирования за исключением суток 2, когда его оценивали 1:1-1:3,1, полулогарифмическая вариация.

[0146] Для приемлемости исследования каждый образец последовательно оценивали выше или ниже порогового значения.

Таблица 3B Титры антител против AAV в образцах сыворотки человека (оператор 2)
	Сутки 1	Сутки 2	Сутки 3	Сутки 4	Сутки 5
Образец 1	<1:1	<1:1	<1:1	<1:1	<1:1
Образец 2	<1:1	<1:1	<1:1	<1:1	<1:1
Образец 3	<1:1	<1:1	<1:1	<1:1	<1:1
Образец 4	1:1-1:3,1	1:1-1:3,1	1:1-1:3,1	1:1-1:3,1	1:1-1:3,1
Образец 5	<1:1	<1:1	<1:1	<1:1	<1:1
Образец 6	<1:1	<1:1	<1:1	<1:1	<1:1
Образец 7	<1:1	1:1-1:3,1	<1:1	<1:1	<1:1
Образец 8	1:100-1:316	1:100-1:316	1:316-1:1000	1:100-1:316	1:316-1:1000
Образец 9	1:10-1:31,6	1:10-1:31,6	1:100-1:316	1:10-1:31,6	1:3,1-1:10
Образцы 1-3 находились на планшете 1; образцы 4-6 находились на планшете 2; образцы 7-9 находились на планшете 3.

[0147] Вариабельность результатов среди операторов: Средние титры NAb против AAV для каждого образца, как измеряли операторы 1 и 2, приведены в таблице 4 и на фигуре 2. Среднее значение рассчитывали с использованием обратной величины меньшего значения описанного диапазона титра. Например, если титр для образца в данной серии опытов описывали как 1:3,1-1:10, значение 3,1 использовали для вычисления среднего значения. Для титров, описанных как <1:1, использовали значение 0.

[0148] Не наблюдали вариабельность результатов среди операторов для образцов 1, 2, 3, 4 или 5. Некоторую вариабельность результатов среди операторов наблюдали для образцов 6, 7, 8 и 9, хотя различие среди средних значений операторов составляло не более 1 log для любого образца. Средние титры FACT являлись практически одинаковыми среди операторов, отличаясь только на 0,01 log (вычисление среднего титра FACT включало исключаемые опыты, где титр FACT отличался от своего исходного диапазона).

Таблица 4 Средние титры и стандартные отклонения для операторов 1 и 2
	Оператор 1	Оператор 2
Среднее значение	Стандартное отклонение	Среднее значение	Стандартное отклонение
Образец 1	0	0	0	0
Образец 2	0	0	0	0
Образец 3	0	0	0	0
Образец 4	1,0	1,3	1,0	0
Образец 5	0	0	0	0
Образец 6	0,2	0,5	0	0
Образец 7	0	0	0,3	0,6
Образец 8	726,4	374,6	100,0	0
Образец 9	17,3	13,4	10,0	0
FACT	108,2	109,8	109,8	59,7

[0149] Эффект циклов замораживание-оттаивание: Эффект повторных циклов замораживания-оттаивания на титр NAb против AAV оценивали на положительном контроле плазме FACT. Образцы подвергали до шести циклов замораживания-оттаивания (оттаивание при 37°C и замораживание на бане этанол/сухой лед, с промежуточным хранением при -80°C) и измеряли титр NAb против AAV8. Тест повторяли дважды. Следует отметить, что тестируемые образцы также хранят при -80°C, но размораживают на льду (0°C). Результаты теста замораживание-оттаивание обобщены в таблице 5. Не измеряли изменений титра NAb против AAV после шести циклов замораживания-оттаивания.

Таблица 5 Эффект замораживания-оттаивания на титр NAb против AAV8 контрольной плазмы FACT
Циклы замораживания-оттаивания	Титр NAb первого опыта (пассаж клеток 3)	Титр NAb второго опыта (пассаж клеток 4)
0	1:100-1:316	1:100-1:316
1	1:100-1:316	1:100-1:316
2	1:316-1:1000	1:100-1:316
3	1:100-1:316	1:100-1:316
4	1:100-1:316	1:100-1:316
5	1:100-1:316	1:100-1:316
6	1:100-1:316	1:100-1:316

Пример 5

[0150] Этот пример содержит описание выводов, основанных на анализе антител против AAV.

[0151] В течение 25 пассажей от первоначального оттаивания клеток, используемых в анализе NAb, наблюдали значительное снижение максимального сигнала люциферазы. Однако это снижение по-видимому, не влияло на результаты теста, т.е. титр NAb против AAV являлся идентичным для образцов, оцениваемых независимо от число пассажей клеток до 25 пассажей, и все анализы соответствовали требованиям для эффективного анализа.

[0152] Шесть циклов замораживания-оттаивания не влияют на титр NAb образца контрольной плазмы, измеряемого в анализе. Контрольную плазму, используемую в этом анализе разделяют на аликвоты и замораживают при получении и оттаявшие аликвоты не замораживают.

[0153] Наблюдали ограниченную вариабельность титра NAb в течение нескольких определений в той же группе образцов (вариабельность результатов разных анализов). Более высокую вариабельность измеряли для образцов с титром NAb от среднего до высокого, тогда как более низкую вариабельность наблюдали в образцах с низким титром NAb.

[0154] Аналогично, более высокую вариабельность титра NAb наблюдали среди операторов (вариабельность результатов среди операторов) для образцов с титром NAb от среднего до высокого, тогда как более низкую вариабельность наблюдали в образцах с низким титром NAb.

[0155] Принимая во внимание, что пороговое значение титра NAb для включения в текущие испытания опосредованного AAV переноса генов составляет <1:5, сомнительный результат наблюдали только для образца 9, который оценивали >1:5 в 7/8 тестовых опытах (не пригоден для включения в исследование) и <1:5 в 1/8 опытов (пригоден для включения в исследование. Если бы это был действительный образец от индивидуума, для титра <1:5 было бы предложено провести повторное тестирование.

[0156] Эти результаты указывают на то, что анализ NAb представляет собой надежный тест для измерения титра NAb против AAVs в образцах сыворотки (или плазмы) человека. Такой анализ можно использовать для идентификации индивидуумов с низкими титрами антител против AAV до включения в испытания опосредованного AAV переноса генов и/или для мониторинга титров AAV во время или после опосредованного AAV переноса генов.

1. Способ количественного определения антител, которые связываются с AAV, in vitro, включающий:

(a) получение инфекционных частиц рекомбинантного AAV, содержащих рекомбинантный вектор AAV, причем рекомбинантный вектор AAV содержит репортерный трансген, где репортерный трансген содержит (a) одноцепочечный или самокомплементарный геном, (b) является функционально связанным с одним или более регуляторными элементами экспрессии, и (c) является фланкированным одним или более фланкирующими элементами;

(b) получение биологического образца от индивидуума;

(c) получение клеток, которые можно инфицировать указанными инфекционными частицами рекомбинантного AAV;

(d) приведение в контакт или инкубирования инфекционных частиц рекомбинантного AAV (a) с биологическим образцом (b), получая таким образом получаемую смесь (M);

(e) приведение клеток в контакт (c) с получаемой смесью (M) в условиях, в которых инфекционные частицы рекомбинантного AAV (a) могут инфицировать и экспрессировать репортерный трансген в указанных клетках;

(f) измерение экспрессии репортерного трансгена и

(g) сравнение указанной экспрессии репортерного трансгена (f) с репортерным трансгеном отрицательного (-) контроля, (i) не содержащего антитела, которые связываются с AAV, и (+) контроля, (ii) содержащего предопределенное количество антител, которые связываются с AAV, с количественным определением, таким образом, антител в биологическом образце, которые связываются с AAV.

2. Способ по п.1, где клетки включают клетки млекопитающих.

3. Способ по п.1, где клетки содержат последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей вспомогательные функции для репликации и/или геномной интеграции AAV.

4. Способ по п.1, где клетки можно инфицировать частицами AAV, содержащими последовательность VP1, VP2 или VP3, идентичную на 90% или более последовательности VP1, VP2 или VP3 серотипа AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11, AAV12, Rh74 или Rh10 AAV, или гибрида или химеры любого из указанных выше серотипов AAV.

5. Способ по п.1, где клетки можно инфицировать серотипом AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11, AAV12, Rh74 или Rh10 AAV, или гибридом или химерой любого из указанных выше серотипов AAV.

6. Способ по п.1, где клетки включают клетки млекопитающих.

7. Способ по п.1, где клетки включают клетки HEK-293, CHO, BHK, MDCK, 10T1/2, WEHI, клетки COS, BSC1, BSC40, BMT10, VERO, WI38, MRC5, A549, HT1080, 293, B-50, 3T3, NIH3T3, HepG2, Saos-2, Huh7, HER, HEK, HEL или HeLa.

8. Способ по п.1, где клетки экспрессируют ген E4 AAV.

9. Способ по п.1, где клетки включают клетки 2V6.11.

10. Способ по п.1, где репортерный трансген кодирует белок, который обеспечивает ферментативный, колориметрический, флуоресцентный, люминесцентный, хемилюминесцентный или электрохимический сигнал.

11. Способ по п.1, где репортерный трансген содержит ген люциферазы.

12. Способ по п.11, где ген люциферазы включает ген люциферазы Renilla или люциферазы светляка.

13. Способ по п.1, где репортерный трансген содержит ген β-галактозидазы, ген β-глюкоронидазы или ген хлорамфениколтрансферазы.

14. Способ по п.1, где репортерный трансген кодирует зеленый флуоресцентный белок (GFP), красный флуоресцентный белок (RFP) или щелочную фосфатазу.

15. Способ по п.1, где рекомбинантный вектор содержит вектор AAV.

16. Способ по п.15, где вектор AAV включает вектор AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11, AAV12, Rh74 или Rh10, или гибрид или химеру любого из указанных выше векторов AAV.

17. Способ по п.1, где регуляторные элементы экспрессии включают функциональную в клетках млекопитающих промоторную и/или энхансерную последовательность нуклеиновой кислоты.

18. Способ по п.1, где регуляторные элементы экспрессии включают предранний промотор/энхансер цитомегаловируса (CMV), промотор/энхансер вируса саркомы Рауса (RSV), промотор SV40, промотор дигидрофолатредуктазы (DHFR), промотор β-актина курицы (CBA), промотор фосфоглицеринкиназы (PGK) или промотор фактора элонгации-1 альфа (EF1-альфа).

19. Способ по п.1, где фланкирующий элемент(ы) содержит одну или более последовательностей инвертированного концевого повтора (ITR) AAV.

20. Способ по п.19, где репортерный трансген располагается между одним или более 5'- и/или 3'-ITR AAV.

21. Способ по п.1, где самокомплементарный репортерный трансгенный геном содержит двухцепочечную структуру последовательности инвертированного повтора.

22. Способ по п.1, где фланкирующий элемент(ы) содержит мутантный ITR AAV или вариант ITR AAV, который не процессируется белком Rep AAV.

23. Способ по п.1, где фланкирующий элемент(ы) содержит мутантный ITR AAV или вариант ITR AAV, который обеспечивает или облегчает формирование самокомплементарного репортерного трансгенного генома в двухцепочечную структуру последовательности инвертированного повтора в инфекционных частицах рекомбинантного AAV.

24. Способ по п.22 или 23, где мутантный, модифицированный ITR AAV или вариант ITR AAV содержит удаленную последовательность D и/или мутантную, модифицированную последовательность сайта концевого разрешения (TRS) или ее вариант.

25. Способ по п.24, где мутантная, модифицированная последовательность сайта концевого разрешения (TRS) или ее вариант содержит: CGGTTG.

26. Способ по п.22 или 23, где мутантный ITR AAV или его вариант располагается между самокомплементарными последовательностями репортерного трансгена.

27. Способ по п.22 или 23, где мутантный ITR AAV или его вариант содержит ITR AAV2, содержащий нуклеотиды, соответствующие нуклеотидам 122-144 удаленной геномной последовательности AAV2.

28. Способ по п.1, где рекомбинантный вектор содержит первый инвертированный концевой повтор (ITR) AAV; промотор, функциональный в клетках млекопитающих; репортерный трансген; сигнал полиаденилирования и необязательно второй ITR AAV.

29. Способ по п.1, где рекомбинантный вектор содержит участок рестрикции для обеспечения возможности вставки репортерного трансгена ниже промотора, функционального в клетках млекопитающих, и посттранскрипционного регуляторного элемента ниже участка рестрикции, где промотор, участок рестрикции и посттранскрипционный регуляторный элемент располагаются ниже 5'-ITR AAV и выше необязательного 3'-ITR AAV.

30. Способ по п.1, где инфекционные частицы рекомбинантного AAV содержат серотип AAV, который инфицирует приматов.

31. Способ по п.1, где инфекционные частицы рекомбинантного AAV содержат серотип AAV, который инфицирует людей или макак-резус.

32. Способ по п.1, где инфекционные частицы рекомбинантного AAV содержат последовательность VP1, VP2 или VP3, идентичную на 90% или более последовательности VP1, VP2 или VP3 серотипа AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11, AAV12, Rh74 или Rh10 AAV, или гибрида или химеры любого из указанных выше серотипов AAV.

33. Способ по п.1, где инфекционные частицы рекомбинантного AAV содержат серотип AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11, AAV12, Rh74 или Rh10 AAV, или гибрида или химеры любого из указанных выше серотипов AAV.

34. Способ по п.1, где биологический образец включает образец от примата.

35. Способ по п.1, где биологический образец содержит сыворотку.

36. Способ по п.1, где биологический образец содержит плазму.

37. Способ по п.1, где биологический образец содержит сыворотку человека или плазму человека.

38. Способ по п.1, где индивидуум представляет собой млекопитающее.

39. Способ по п.1, где индивидуум представляет собой человека.

40. Способ по п.1, где индивидуум страдает нарушением, обусловленным недостаточностью экспрессии или активности белка.

41. Способ по п.1, где индивидуум страдает нарушением, обусловленным экспрессией или активностью аномального, аберрантного или нежелательного белка.

42. Способ по п.1, где индивидуум страдает генетическим нарушением.

43. Способ по п.1, где индивидуум является кандидатом для генной заместительной терапии или терапии на основе биологических активных добавок.

44. Способ по п.1, где индивидуум является кандидатом для терапии на основе нокдауна или нокаута гена.

45. Способ по п.1, где индивидуум страдает заболеванием легких (например, кистозным фиброзом), нарушением свертываемости крови (например, гемофилией A или гемофилией B с ингибиторами или без них), талассемией, нарушением со стороны крови (например, анемией), болезнью Альцгеймера, болезнью Паркинсона, болезнью Хантингтона, боковым амиотрофическим склерозом (ALS), эпилепсией, лизосомными болезнями накопления, нарушениями накопления меди или железа (например, болезнью Вильсона или болезнью Менкеса) недостаточностью кислой лизосомной липазы, неврологическим или нейродегенеративным нарушением, злокачественной опухолью, диабетом 1 типа или 2 типа, болезнью Гоше, болезнью Гурлера, аденозиндезаминазной недостаточностью, дефектом метаболизма (например, болезнями накопления гликогена), дегенеративным заболеванием сетчатки (таким как недостаточность RPE65, хороидеремия и другие заболевания глаза), заболеванием паренхиматозных органов (например, головного мозга, печени, почки, сердца) или инфекционным вирусным (например, гепатитом B и C, ВИЧ и т.д.), бактериальным или грибковым заболеванием.

46. Способ по п.1, дополнительно включающий подсчет количества антител, которые связываются с AAV, в биологическом образце на основании экспрессии репортерного трансгена (f) в сравнении с (-) контролем.

47. Способ по п.1, дополнительно включающий введение или включение количества антител, которые связываются с AAV в биологическом образце, в отчет, связанный с указанным индивидуумом.

48. Способ по п.1, дополнительно включающий введение или включение количества антител, которые связываются с AAV в биологическом образце, в базу данных, таким образом проводя введение записи в базу данных, где запись в базе данных связана с указанным индивидуумом.

49. Способ по п.2, где антитела связываются с капсидным белком AAV.

50. Способ по п.2, где антитела связываются серотипом AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11, AAV12, Rh74 или Rh10 AAV, или гибридом, или химерой любого из указанных выше серотипов AAV.

51. Способ по п.1, где биологический образец разбавляют перед приведением в контакт или инкубированием с инфекционными частицами рекомбинантного AAV (a).

52. Способ по п.1, где анализируют совокупность разбавлений биологического образца.

53. Способ по п.1, где анализируют совокупность различных степеней разбавления биологического образца.

54. Способ по п.1, где биологический образец разбавляют в диапазоне от 1:1 до 1:500 перед приведением в контакт или инкубированием с инфекционными частицами рекомбинантного AAV (a).

55. Способ по п.1, где биологический образец разбавляют в диапазоне от 1:500 до 1:5000 перед приведением в контакт или инкубированием с инфекционными частицами рекомбинантного AAV (a).

56. Способ по п.1, где анализируют по меньшей мере 2, 3, 4, 5 или 6 различных степеней разбавления биологического образца.

57. Способ по п.1, где клетки приводят в контакт с получаемой смесью (d) в течение периода 6-48 часов.

58. Способ по п.1, где клетки приводят в контакт с получаемой смесью (d) в течение периода 12-36 часов.

59. Способ по п.1, где клетки приводят в контакт с получаемой смесью (d) в течение периода 20-30 часов.

60. Способ по п.1, где клетки приводят в контакт с получаемой смесью (d) в течение периода приблизительно 24 часов.

61. Способ по п.1, где клетки лизируют перед измерением экспрессии репортерного трансгена.

62. Способ по п.1, где биологический образец инактивировали нагреванием.

63. Способ по п.1, где биологический образец инактивировали нагреванием приблизительно при 50-70 градусах Цельсия в течение периода приблизительно от 15 минут до одного часа.

64. Способ по п.1, где биологический образец инактивировали нагреванием приблизительно при 56 градусах Цельсия в течение периода приблизительно 30 минут.