Способ идентификации штаммов yersinia pestis средневекового биовара с последующей дифференциацией по филогенетической принадлежности методом полимеразной цепной реакции с гибридизационно-флуоресцентным учетом результатов



Способ идентификации штаммов yersinia pestis средневекового биовара с последующей дифференциацией по филогенетической принадлежности методом полимеразной цепной реакции с гибридизационно-флуоресцентным учетом результатов
Способ идентификации штаммов yersinia pestis средневекового биовара с последующей дифференциацией по филогенетической принадлежности методом полимеразной цепной реакции с гибридизационно-флуоресцентным учетом результатов

Владельцы патента RU 2705813:

Федеральное казенное учреждение здравоохранения "Российский научно-исследовательский противочумный институт "Микроб" Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (ФКУЗ "РосНИПЧИ "Микроб") (RU)

Изобретение относится к области медицинской микробиологии и предназначено для идентификации штаммов Yersinia pestis средневекового биовара с последующей дифференциацией по филогенетической принадлежности методом ПЦР в режиме реального времени. Проводят ПЦР с праймерами и зондами на ДНК мишени Med24, 2.Med1, 2.Med3 и pCKF. По наличию сигналов с указанными праймерами по мишеням Med24 и pCKF идентифицируют 2.MED0. По наличию сигналов с праймерами по мишени 2.Med3 и отсутствию сигналов по мишеням Med24, 2.Med1 и pCKF идентифицируют 2.MED1. По наличию сигналов с праймерами по мишеням 2.Med1 и 2.Med3 и отсутствию сигналов по мишеням Med24 и pCKF идентифицируют 2.MED2. По наличию сигналов с праймерами по мишени 2.Med1 и отсутствию сигналов по мишеням Med24, 2.Med3 и pCKF идентифицируют 2.MED3. Изобретение обеспечивает быструю и надежную идентификацию штаммов Y. pestis средневекового биовара с их разделением по филогенетической принадлежности. 1 табл., 3 пр.

 

Изобретение относится к медицинской микробиологии, в частности, к молекулярному типированию и подвидовой дифференциации штаммов Yersinia pestis и может быть использовано в научно-исследовательских медицинских учреждениях и службах Роспотребнадзора.

Бактерия Y. pestis является возбудителем особо опасной инфекции - чумы, способной приводить к возникновению чрезвычайных ситуаций в области общественного здравоохранения. Вид Y. pestis включает в себя основной подвид, отличающийся высокой вирулентностью и эпидемиологической значимостью и ряд неосновных подвидов, которые эпидемически малозначимы. На территории природных очагов чумы Российской Федерации и сопредельных государств широко распространены штаммы возбудителя чумы основного подвида. В большинстве этих очагов чумы циркулируют штаммы основного подвида средневекового биовара. Штаммы средневекового биовара высоко вирулентны и не-однократно служили причиной вспышек и случаев заболевания чумой в России в разные периоды ее истории. Ввиду этого актуальной является разработка способов быстрой и эффективной идентификации и дифференциации штаммов возбудителя чумы средневекового биовара.

Все штаммы Y. pestis основного подвида средневекового биовара делят на 4 филогенетические ветви - 2.MED0, 2.MED1, 2.MED2 и 2.MED3. Штаммы ветви 2.MED0 циркулируют только в Центрально-Кавказском высокогорном очаге в РФ, все остальные штаммы средневекового биовара из природных очагов РФ и стран ближнего зарубежья относятся к филогенетической ветви 2.MED1. Штаммы средневекового биовара ветвей 2.MED2 и 2.MED3 встречаются на территории Китая. Установление принадлежности выделенного штамма Y. pestis к средневековому биовару основного подвида позволит оценить его вирулентный и эпидемиологический потенциал, дальнейшая дифференциация по принадлежности к одной из 4-х филогенетических ветвей - определить его происхождение и установить источник инфекции.

Современный уровень молекулярно-генетических методов исследования позволяет разрабатывать быстрые и эффективные способы идентификации и дифференциации Y. pestis и других возбудителей инфекционных болезней на основе полимеразной цепной реакции (ПЦР), обладающие высокой степенью воспроизводимости. Одной из наиболее эффективных разновидностей ПЦР является ПЦР в режиме реального времени с гибридизационно-флуоресцентным учетом результатов в режиме реального времени. На текущий момент разработано несколько способов индикации и идентификации штаммов возбудителя чумы при помощи ПЦР.

Зарегистрирована «Тест-система для выявления ДНК Yersinia pestis методом ПЦР «ГенПест». Эта система основана на использовании ДНК мишеней - участков генов cafl и pla, находящихся в плазмидах pFra и pPst возбудителя чумы, соответственно. Однако эта тест-система не предназначена для внутривидовой дифференциации и идентификации штаммов средневекового биовара.

Внутривидовая дифференциация штаммов возбудителя чумы описана в патенте RU №2425891, дата опубликования 10.08.2011. При помощи указанного способа, возможно разделение штаммов Y. pestis и Y. pseudotuberculosis с дальнейшей дифференциацией штаммов Y. pestis по их принадлежности к основному и неосновным подвидам. В тоже время этот способ не предусматривает разделения биоваров основного подвида, в том числе и дифференциации штаммов средневекового биовара.

Разделение штаммов средневекового и античного биоваров основного подвида проводится способом, описанном в патенте RU №2496882 (опубликован 27.10.2013), который основан на ПЦР с электрофоретическим учетом результатов. Однако этот способ не предназначен для внутрибиоварной дифференциации штаммов средневекового биовара по принадлежности к четырем известным филогенетическим ветвям - 2.MED0, 2.MED1, 2.MED2 и 2.MED3.

Известен способ дифференциации биоваров и геновариантов штаммов Yersinia pestis основного подвида с помощью полимеразной цепной реакции (патент RU №2565554, опубликован 20.10.2015). Способ обеспечивает разделение античного, средне-векового биоваров основного подвида возбудителя чумы, а также филогенетических линий 1.ANT/1.ORI и 2.ANT/2.MED основного подвида. Однако способ не пригоден для определения филогенетической принадлежности штаммов средневекового биовара.

Опубликован способ подвидовой дифференциации штаммов возбудителя чумы методом полимеразной цепной реакции с гибридизационно-флуоресцентным учетом результатов в режиме реального времени (Патент RU №2621869, опубликован 07.06.2017). Способ обеспечивает разделение основного, кавказского, алтайского, гиссарского и улегейского подвидов, но не решает проблемы идентификации штаммов средневекового биовара и внутрибиоварной дифференциации этих штаммов.

Известен способ дифференциации типичных и атипичных штаммов Y. pestis средневекового биовара из Центрально-Кавказского высокогорного очага в России, содержащих маркерную плазмиду pCKF. (Патент RU №2550257, опубликован 10.05.2015 г.) Однако данный способ не позволяет дифференцировать штаммы средневекового биовара по их принадлежности к филогенетическим ветвям 2.MED1, 2.MED2 и 2.MED3.

В научной и специальной литературе отсутствуют другие данные о способах идентификации штаммов Y. pestis средневекового биовара с их последующей дифференциацией по филогенетической принадлежности методом ПЦР с гибридизационно-флуоресцентным учетом результатов в режиме реального времени.

Технический результат изобретения заключается в обеспечении быстрой и надежной идентификации штаммов Y. pestis средневекового биовара с разделением этих штаммов по филогенетической принадлежности.

Технический результат достигается способом идентификации штаммов Y. pestis средневекового биовара с определением филогенетической принадлежности методом полимеразной цепной реакции с гибридизационно-флуоресцентным учетом результатов в режиме реального времени, который предусматривает проведение ПЦР с праймерами и зондами на ДНК мишень «Med24», имеющими последовательность SEQ ID NO: 3 и мультиплексной ПЦР с праймерами и зондами на ДНК мишени «2.Med1», «2.Med3», «pCKF», имеющими последовательность SEQ ID NO: 1, 2, 4 с последующей дифференциацией штаммов средневекового биовара по наличию и отсутствию сигналов с указанными праймерами в соответствии с таблицей.

Заявляемый способ осуществляют следующим образом.

Выделение ДНК исследуемого штамма чумного микроба проводят по стандартной методике в соответствии с МУ 1.3.2569-09 «Организация работ лабораторий, использующих методы амплификации нуклеиновых кислот при работе с материалом, содержащим микроорганизмы I-IV групп патогенности».

Полимеразную цепную реакцию осуществляют с использованием предложенных праймеров и зондов на мишени «Med24», «pCKF», «2.Med1» и «2.Med3». Олигонуклеотидные праймеры, и зонды, применяемые для амплификации в ПЦР с гибридизационно-флуоресцентным учетом результатов хромосомных мишеней «Med24», «2.Med1» и «2.Med3», рассчитаны на основе нуклеотидных последовательностей этих участков у штаммов Y. pestis С092, KIM, Antiqua и Nepal516, а также последовательности плазмиды pCKF, представленных в базе данных NCBI GenBank. С помощью указанных праймеров в ПЦР проводят амплификацию участков «Med24», «pCKF», «2.Med1» и «2.Med3». Для проведения ПЦР используют зонды в формате TaqMan и применяют следующие условия реакции: 1 цикл 95°С 15 мин; 5 циклов 95°С 20 с, 60°С 20 с, 72°С 20 сек; 30 циклов: 95°С 15 с, 58°С 45 с, 72°С 20 с.

Принадлежность выделенного изолята Y. pestis к средневековому биовару основного подвида и его филогенетическим ветвям устанавливают по совокупному результату двух реакций. В отдельной реакции проводят определение принадлежности штаммов к средневековому биовару с использованием праймеров на ДНК мишень «Med24». У всех штаммов средневекового биовара (за исключением штаммов филогенетической ветви 2.MED0) сигнал флуоресценции по мишени «Med24» отсутствует, поскольку рассчитанный на эту ДНК мишень зонд комплементарен участку делеции в 24 пн в этом участке генома, маркерной для штаммов средневекового биовара. Составляющие исключение штаммы средневекового биовара ветви 2.MED0 (циркулируют в Центрально-Кавказском высокогорном очаге чумы) идентифицируют по наличию сигнала флуоресценции с праймерами на мишень «pCKF» - участок плазмиды pCKF, маркерной только для штаммов ветви 2.MED0. Последовательность мишени «pCKF» выявляют в мультиплексной реакции одновременно с последовательностями мишеней «2.Med1» и «2.Med3». Мультиплексную ПЦР с праймерами на ДНК мишени «2.Med1», «2.Med3» и «pCKF» применяют для внут-рибиоварной дифференциации штаммов средневекового биовара по филогенетической принадлежности.

У штаммов средневекового биовара филогенетической ветви 2.MED1 отсутствует сигнал флуоресценции с праймерами на мишень «2.Med1» и присутствует сигнал с праймерами на мишень «2.Med3». У штаммов ветви 2.MED2 присутствует сигнал с праймерами на мишени «2.Med1» и «2.Med3», а у штаммов ветви 2.MED3 присутствует сигнал флуоресценции с праймерами «2.Med1» и отсутствует сигнал с праймерами «2.Med.3». У штаммов ветви 2.MED0 с праймерами на мишень «pCKF» в ПЦР проявляется сигнал флуоресценции, в то время как у штаммов других филогенетических ветвей средневекового биовара он отсутствует. Учет результатов идентификации и дифференциации штаммов Yersinia pestis средневекового биовара представлен в таблице.

Сущность изобретения поясняется примерами.

Пример 1. Дифференциация штамма Y. pestis средневекового биовара филогенети-ческой ветви 2.MED1 (модельный эксперимент) Выделение ДНК Y. pestis проводят стандартным методом с помощью лизирующего раствора на основе 6М гуанидинизотиоцианата с предварительным обеззараживанием культуры путем добавления мертиолята натрия до концентрации 1:10000 с последующим прогреванием при температуре 56°С в течение 30 мин. [МУ 1.3.2569-09].

С праймерами на ДНК мишень «Med24» ПЦР проводят в объеме 25 мкл, реакцион-ная смесь содержит: 2,5 мкл 10х буфера для ПЦР, 2,5 мкл раствора по 2 мМ четырех дНТФ, 1 мкл 25 мМ MgCl2, по 0,1 мкл (10 пМ) каждого праймера, 0,05 мкл (5 пМ) зонда в формате TaqMan, 0,2 мкл (5 ед.) Taq полимеразы, 10 мкл ДНК штамма. Мультиплексную ПЦР с праймерами на ДНК мишени «2.Med1», «2.Med3» и «pCKF» проводят в одной ре-акции. Реакционная смесь содержит 2,5 мкл 10х буфера для ПЦР, 2,5 мкл раствора по 2 мМ четырех дНТФ, 1,5 мкл 25 мМ MgCl2, по 0,08 мкл (8 пМ) каждого праймера, 0,04 мкл (4 пМ) зонда в формате TaqMan, 0,2 мкл (5 ед.) Taq полимеразы, 10 мкл ДНК штамма. В результате проведения реакции получают следующие результаты. По мишеням «Med24», «pCKF» и «2.Med1» сигнал флуоресценции отсутствует, но он проявляется по мишени «2.Med3». Следовательно, исследуемый штамм Y. pestis относится к средневековому биовару, филогенетической ветви 2.MED1.

Пример 2. Дифференциация штамма Y. pestis средневекового биовара филогенетической ветви 2.MED2

Исследование штамма Y. pestis проводят аналогично примеру №1. В ПЦР с использованием праймеров на ДНК мишени «Med24» и «pCKF» у исследуемого штамма отсутствуют сигналы флуоресценции, однако они проявляются с праймерами на мишени 2.Medl и 2.Med3. Следовательно, исследуемый штамм Y. pestis относится к средневековому биовару, филогенетической ветви 2.MED2.

Пример 3. Дифференциация штамма Y. pestis средневекового биовара филогенетической ветви 2.MED3

Исследование штамма Y. pestis проводят аналогично примеру №1. В ПЦР с использованием праймеров на ДНК мишени «Med24» и «pCKF» и «2.Med3» у исследуемого штамма Y. pestis отсутствуют сигналы флуоресценции, но он проявляется с праймерами по мишени «2.Med1». Следовательно, исследуемый штамм Y. pestis относится к средневековому биовару, филогенетической ветви 2.MED3.

Пример 4. Дифференциация штаммов Y.pestis средневекового биовара филогенетической ветви 2.MED0

Исследование штамма Y. pestis проводят аналогично примеру №1. В ПЦР с праймерами по мишени «Med24» наблюдают наличие флуоресцентного сигнала. В реакции по мишени pCKF также наблюдают наличие сигнала, что свидетельствует о принадлежности штамма к филогенетической ветви 2.MED0.

Таким образом, заявленный способ идентификации штаммов Y. pestis средневекового биовара с последующей дифференциацией по филогенетической принадлежности методом ПЦР с гибридизационно-флуоресцентным учетом результатов с использованием мишеней «Med24», «2.Med1», «2.Med3» и «pCKF» позволяет быстро и эффективно определять принадлежность штаммов возбудителя чумы к основному подвиду средневекового биовара и дифференцировать их по филогенетической принадлежности.

Способ идентификации штаммов Yersinia pestis средневекового биовара с последующей дифференциацией по филогенетической принадлежности методом ПЦР с гибридизационно-флуоресцентным учетом результатов в режиме реального времени, предусматривающий проведение ПЦР с праймерами и зондами на ДНК мишень Med24, имеющими последовательность SEQ ID NO: 3, и мультиплексной ПЦР с праймерами и зондами на ДНК мишени 2.Med1, 2.Med3 и pCKF, имеющими последовательность SEQ ID NO: 1, 2, 4 со следующей дифференциацией штаммов средневекового биовара по их принадлежности к филогенетической ветви: 2.MED0 по наличию сигналов с указанными праймерами по мишеням Med24 и pCKF; 2.MED1 по наличию сигналов с праймерами по мишени 2.Med3 и отсутствию сигналов по мишеням Med24, 2.Med1 и pCKF; 2.MED2 по наличию сигналов с праймерами по мишеням 2.Med1 и 2.Med3 и отсутствию сигналов по мишеням Med24 и pCKF; 2.MED3 по наличию сигналов с праймерами по мишени 2.Med1 и отсутствию сигналов по мишеням Med24, 2.Med3 и pCKF.



 

Похожие патенты:

Изобретение относится к производственным процессам. Многофункциональное программно-информационное устройство включает каналы приема и передачи информации, датчики состояния окружающей среды, лазерный измеритель расстояний и запыленности воздуха, световую сигнализацию, дисплей, тепловизионный модуль, громкоговоритель, счетно-решающее устройство, соединенное со всеми элементами устройства и с возможностью передачи информации на дисплей и аккумуляторную батарею.

Изобретение относится к области медицины, конкретно к гистологии и патологической анатомии. Раскрыт способ приготовления гистологических препаратов для выявления внутриклеточных липидных включений в тканях человека и животных, включающий забор образцов исследуемой ткани, фиксацию образцов ткани в 10%-ном растворе формалина, отмывку от фиксатора, обезвоживание, приготовление гистологических срезов, нанесение срезов на предметные стекла с последующей окраской срезов в растворе Судана черного «В».

Изобретение относится к медицине, а именно к хирургии, и может быть использовано для диагностики стафилококковой абдоминальной хирургической инфекции. Проводят исследование биологических жидкостей.

Изобретение относится к медицине, а именно к онкологии, и может быть использовано для скрининга рака молочной железы и предрасположенности к нему. Проводят маммографию и УЗИ.

Изобретение относится к области медицины, а именно к способам выявления опухолевых клеток, находящихся в стадии эпителиально-мезенхимального перехода в асцитических жидкостях.

Группа изобретений относится к ускоренному и высокочувствительному способу обнаружения бактериальных патогенов. Раскрыт способ обнаружения бактерий, включающий обеспечение одной или более чем одной суспензии, причем каждая содержит по меньшей мере один вид меченых тестируемых бактериофагов, которые специфично связываются с видом бактерий, подлежащим обнаружению; добавление образца, подлежащего проверке на наличие по меньшей мере одного вида бактерий; фильтрацию полученной реакционной смеси; обнаружение комплексов бактерии-бактериофаги в концентрате; обнаружение несвязанных бактериофагов в фильтрате; обработку полученных сигналов, сгенерированных в результате обнаружения, и вывод результатов обнаружения пользователю.

Изобретение относится к медицине и может быть использовано для мониторинга возможного стойкого отклонения от нормы энергетического метаболизма эритроцитов и/или нарушения структуры их мембран.

Изобретение относится к области медицины, а именно к андрологии. Способ прогнозирования высокой степени фрагментации ДНК сперматозоидов и невынашивания беременности в паре включает исследование эякулята на содержание триклозана, при обнаружении концентрации триклозана ≥0,11 нг/мл методом газовой хроматографии с масс-спектрометрическим детектированием устанавливается высокий риск фрагментации ДНК сперматозоидов и невынашивания беременности в паре.

Изобретение относится к медицине и ветеринарии и может быть использовано для идентификации видового состава нематод методом MALDI TOFF Biotyper. Для этого проводят механическую ультразвуковую гомогенизацию головного конца нематод, который предварительно обрабатывают антибиотиками широкого спектра действия.

Изобретение может быть использовано при контроле включений и выделений, присутствующих в металлических материалах. Для извлечения частиц соединения металла из металлического материала путем травления металлического материала в электролитическом растворе используют электролитический раствор на основе неводного растворителя, содержащий реактив, который образует содержащий металл M' комплекс.

Предложенная группа изобретений относится к области медицинской микробиологии. Предложены способ и набор для генодиагностики коклюша, содержащие реакционный буфер qPCRmix-HS, 25 mM MgCl2 и 9 праймеров: hIS1001F, hIS1001R, hIS1001P, IS481F, IS481R, IS481P, IS1001F, IS1001R, IS1001P.

Предложенная группа изобретений относится к области медицинской микробиологии. Предложены способ и набор для генодиагностики коклюша, содержащие реакционный буфер qPCRmix-HS, 25 mM MgCl2 и 9 праймеров: hIS1001F, hIS1001R, hIS1001P, IS481F, IS481R, IS481P, IS1001F, IS1001R, IS1001P.

Изобретение относится к области медицины, в частности к педиатрии и эндокринологии, и предназначено для определения предрасположенности к развитию ожирения у детей в условиях избыточной контаминации алюминием.

Изобретение относится к области медицины, в частности к педиатрии и эндокринологии, и предназначено для определения предрасположенности к развитию ожирения у детей в условиях избыточной контаминации алюминием.

Изобретение относится к области медицины, биологии и биотехнологии и предназначено для определения генотипа человека по полиморфизму в гене матриксной металлопротеиназы 3 (ММР3) -1171>5А/6А.

Изобретение относится к области медицины, биологии и биотехнологии и предназначено для определения генотипа человека по полиморфизму в гене матриксной металлопротеиназы 3 (ММР3) -1171>5А/6А.

Изобретение относится к области медицины, в частности к медицинской генетике и онкогематологии, и предназначено для количественного определения мутаций F317L и F359V/C киназного домена BCR-ABL у больных хроническим миелоидным лейкозом, резистентных к терапии ингибиторами тирозинкиназ.

Изобретение относится к области медицины, в частности к медицинской генетике и онкогематологии, и предназначено для количественного определения мутаций F317L и F359V/C киназного домена BCR-ABL у больных хроническим миелоидным лейкозом, резистентных к терапии ингибиторами тирозинкиназ.

Изобретение относится к анализу на гликированные белки. Изобретение описывает способ определения фракции гликированного белка и устройство с латеральным потоком для детекции гликированных белков.
Изобретение относится к области медицины, в частности к медицинской генетике и кардиологии, и предназначено для выявления предрасположенности пациента к атеросклерозу или наличия доклинических признаков этой патологии.

Изобретение относится к соединению формулы I или его фармацевтически приемлемой соли. В формуле I: каждый из A, D, E, G, J, L, M и Q представляет атом углерода; каждый из R1 и R2 независимо выбран из водорода и галогена; каждый из R3 и R5 представляет собой водород; R4 выбирают из водорода и (C1-C6)алкила; R6 и R7 связаны друг с другом в виде кольца пирролидинона, кольца имидазолидинона, 7-членного моно- или бициклического кольца или 10-членного моно- или бициклического кольца, необязательно замещенного одним или более галогеном, (C1-C6)алкилом, (C1-C6)алкокси, (C3-C10)циклоалкилом или (C6-C10)арилом.

Изобретение относится к области медицинской микробиологии и предназначено для идентификации штаммов Yersinia pestis средневекового биовара с последующей дифференциацией по филогенетической принадлежности методом ПЦР в режиме реального времени. Проводят ПЦР с праймерами и зондами на ДНК мишени Med24, 2.Med1, 2.Med3 и pCKF. По наличию сигналов с указанными праймерами по мишеням Med24 и pCKF идентифицируют 2.MED0. По наличию сигналов с праймерами по мишени 2.Med3 и отсутствию сигналов по мишеням Med24, 2.Med1 и pCKF идентифицируют 2.MED1. По наличию сигналов с праймерами по мишеням 2.Med1 и 2.Med3 и отсутствию сигналов по мишеням Med24 и pCKF идентифицируют 2.MED2. По наличию сигналов с праймерами по мишени 2.Med1 и отсутствию сигналов по мишеням Med24, 2.Med3 и pCKF идентифицируют 2.MED3. Изобретение обеспечивает быструю и надежную идентификацию штаммов Y. pestis средневекового биовара с их разделением по филогенетической принадлежности. 1 табл., 3 пр.

Наверх