Способ полуколичественной оценки белка pdcd4 иммуногистохимическим методом

Авторы патента:

G01N33/53 - иммунологический анализ, анализ биоспецифического связывания, материалы для этого (препараты для терапевтических целей, содержащие антигены или антитела,A61K; гептены вообще, см. соответствующие рубрики в классе C07; пептиды, например протеины, вообще C07K)

G01N33/50 - химический анализ биологических материалов, например крови, мочи; испытания, основанные на способах связывания биоспецифических лигандов; иммунологические испытания (способы измерения или испытания с использованием ферментов или микроорганизмов иные, чем иммунологические, составы или индикаторная бумага для них, способы образования подобных составов, управление режимами микробиологических и ферментативных процессов C12Q)

Изобретение относится к патологической анатомии и может быть использовано для полуколичественной визуальной оценки синтеза регуляторного белка PDCD4 в гистологических срезах ткани иммуногистохимическим методом с детекцией в ядре и цитоплазме. Для этого рассчитывают индекс экспрессии PDCD4 в тканях при суммировании экспрессии в ядрах (ЭЯ) и экспрессии в цитоплазме (ЭЦ). ЭЯ представляет собой произведение частоты окрашивания ядер (0-3 балла) и полуколичественной визуальной оценки интенсивности окрашивания ядер (0-3 балла). ЭЦ представляет собой полуколичественную визуальную оценку интенсивности окрашивания цитоплазмы (0-3 балла). Изобретение обеспечивает определение регуляторного белка PDCD4 в тканях с большой чувствительностью и специфичностью, что позволяет обнаруживать нарушение экспрессии PDCD4 в эпителиальных клетках на ранних этапах опухолевой трансформации клетки. 1 табл., 2 ил., 2 пр.

PDCD4 представляет собой клеточный белок, связанный с регуляцией активности eIF4F-зависимого белкового комплекса инициации трансляции, был впервые выделен как протеин, ассоциированный с клеточным циклом [S. Matsuhashi. Isolation of a novel gene from a human cell line with Pr-28 MAb which recognizes a nuclear antigen involved in the cell cycle. / Matsuhashi S., Yoshinaga H., Yatsuki H.et. al. // Res Commun Biochem Cell Mol Biol. -1997. - №1 - P. 109-120, H. Yoshinaga. Novel human PDCD4 (H731) gene expressed in proliferative cells is expressed in the small duct epithelial cells of the breast as revealed by an anti-H731 antibody. / Yoshinaga H., Matsuhashi S., Fujiyama C. et. al. // Pathol Int. - 1999. - №49 - P. 1067-1077.]. Увеличение количества белка ассоциировано с апоптозом [K. Shibahara. Isolation of a novel mouse gene MA-3 that is induced upon programmed cell death. / Shibahara K., Asano M., Ishida Y. et. al. // Gene. - 1995. - №166 - P. 297-301.] [M. Nakashima. Regulation of tumor suppressor PDCD4 by novel protein kinase С isoforms. / Nakashima M., Hamajima H., Xia J. et. al. // Biochim Biophys Acta. - 2010. - №1803 - P. 1020-1027.]. Белок PDCD4 в норме преимущественно расположен в ядре пролиферирующих клеток [L. Azzoni. Differential transcriptional regulation of CD161 and a novel gene, 197/15a, by IL-2, IL-15, and IL-12 in NK and T cells. / Azzoni L., Zatsepina O., Abebe B. et. al. // Journal of immunology. - 1998. - №161 - P. 3493-3500.]. Снижение продукции PDCD4 ассоциировано с опухолевой прогрессией и неблагоприятным прогнозом при раке легкого, колоректальном раке, раке молочной железы и раке желудка [S. Lee. Differential expression in normal-adenoma-carcinoma sequence suggests complex molecular carcinogenesis in colon. / Lee S., Bang S., Song K. et. al. // O ncol Rep. - 2006. - №16 - P. 747-754.] [Y.H. Wen. Alterations in the expression of PDCD4 in ductal carcinoma of the breast.. / Wen Y.H., Shi X., Chiriboga L. et. al. // Oncol Rep. - 2007. - №18 - P. 1387-1393.]. В клетках рака желудка кишечного типа как и в большинстве других опухолей, отмечается выраженное снижение уровня PDCD4, за счет, в большей степени, утраты ядерной фракции, при этом цитоплазменная метка может сохраняться, пропадая только при раздифференцировке опухоли [Н. Zhang. Involvement of programmed cell death 4 in transforming growth factor-β1-induced apoptosis in human hepatocellular carcinoma. / Zhang H., Ozaki I., Mizuta T. et. al. // Oncogene. - 2006. - №25 - P. 6101-6112.]. [G. Ma. Expression of programmed cell death 4 and its clinico-pathological significance in human pancreatic cancer.. / Ma G., Guo K.J., Zhang H. et. al. // Oncol Rep.- 2005. - №25 - P. 597-600.]. PDCD4 за счет своей основной функции - ингибирования активности белкового комплекса инициации трансляции eIF4F ведет к снижению трансляции белков (в том числе за счет специфического связывание с их мРНК в ядре клетки), играющих роль в молекулярных механизмах пролиферации и клеточного цикла, апоптоза, эпителиально-мезенхимального перехода и деградации межклеточного матрикса [Р.N. Vikhreva. Programmed cell death 4 mechanism of action: The model to be updated?. / Vikhreva P.N., Kalinichenko S.V., Korobko I. V. // Cell Cycle. - 2017. - №16 (19) - P. 1761-1764.]. Участие PDCD4 в молекулярных механизмах имеющих ключевое значение в канцерогенезе, делает оценку уровня синтеза в клетках этого белка важной для оценки риска развития и ранней диагностики рака желудка кишечного типа.

Особенно актуальна оценка уровня синтеза данного белка в гистологических срезах ткани биоптатов in situ с помощью иммуногистохимического метода, что позволяет избирательно оценить его уровень именно в эпителиальных клетках, увеличивая тем самым точность за счет возможности исключения из оценки стромальных клеток и клеток воспалительного ряда. Для иммуногистохимической оценки белка применяют различные подходы, основывающиеся на его детекции в ядре и цитоплазме. Прототипом предлагаемого способа оценки является методика предложенная Yu Н. и соавт. [Н. Yu. Helicobacter pylori promotes epithelial-mesenchymal transition in gastric cancer by downregulating programmed cell death protein 4 (PDCD4). / Yu H., Zeng J., Liang X. et. al. //. PLoS One. - 2014. - №9(8). - P. 105-116], при которой уровень PDCD4 вычисляется как произведение оценки процента позитивно окрашенных клеток и индекса интенсивности окраски клеток, при этом оценка позитивно окрашенных клеток подсчитывается в процентах и переводится в баллы соответственно шкале: <20% - 0 баллов; 20-40% - 1 балл; 40-60% - 2 балла; 60-80% - 3 балла; >80% - 4 балла, а индекс интенсивности окраски клеток распределяется слудующим оразом: 0 - отсутствие окраски; 1 - слабая; 2 - умеренная; 3 - выраженная окраска клеток. Однако такой подход обладает рядом недостатков:

1. Равный вклад ядерной и цитоплазматической метки в общий индекс, тогда как на основании молекулярно-биологических особенностей в аспекте риска опухолевой трансформации значительно большее значение имеет изменение ядерной экспресии PDCD4 [Y. Li. PDCD4 suppresses proliferation, migration and invasion of endometrial cells by inhibiting autophagy and NF-κB/MMP2/MMP9 signal pathway. / Li Y., Wang X., Wang X. et. al. //. Biol Reprod. - 2018. - №99(2). - P. 235-247, Y. Liu. Expression of tumor suppressor programmed cell death 4 in endometrioid endometrial carcinomas and clinicopathological significance. / Liu Y., Sun H., Mao H. et. al. //. Oncol Lett. - 2018. - №15(6). - P. 9369-9376]

2. Отсутствие раздельной оценки ядерной и цитоплазматической метки ввиду их частого несовпадения, а также различного уровня прогностической ценности (см. выше).

3. Отсутствие оценки интенсивности окраски ядер клеток.

Для преодоления недостатков существующих методов в серии наблюдений и экспериментов была разработан собственный способ полуколичественной оценки результатов иммуногистохимической окраски белка PDCD4 в тканях. Предлагаемый способ основывается на подсчете Индекса экспрессии PDCD4 в тканях, который рассчитывается путем суммации экспрессии в ядре (ЭЯ) и экспрессии в цитоплазме (ЭЦ), при этом экспрессия в ядре представляет собой произведение частоты окрашивания ядер (балла полуколичественной оценки распространенности положительно окрашенных ядер согласно таблице 1) и полуколичественной визуальной оценки интенсивности окрашивания ядер (отсутствие метки, отражающее отсутствие белка - 0 баллов, слабое/метка светло-коричневого цвета, отражающая низкое количество белка - 1 балл, умеренное/метка коричневого цвета, отражающая умеренное количество белка - 2 балла, выраженное/метка темно-коричневая, отражающая большое количество белка - 3 балла), а экспрессия в цитоплазме, представляет собой полуколичественную визуальную оценку интенсивности окрашивания цитоплазмы (отсутствие метки, отражающее отсутствие белка - 0 баллов, слабое/метка светло-коричневого цвета, отражающая низкое количество белка - 1 балл, умеренное/метка коричневого цвета, отражающая умеренное количество белка - 2 балла, выраженное/ метка темно-коричневая, отражающая большое количество белка - 3 балла).

Экспрессия PDCD4 рассчитывается по следующей формуле:

Индекс экспрессии PDCD4 = ЭЯ + ЭЦ, где

ЭЯ - экспрессия в ядре; ЭЯ = ЧОЯ × ИЯ

ЧОЯ - частота окрашивания ядер (отсутствие окрашенных ядер - 0 баллов, 1-30% положительно окрашенных ядер эпителиальных клеток - 1 балл, 31-70%) положительно окрашенных ядер - 2 балла, >70% положительно окрашенных ядер эпителиальных клеток - 3 балла;

ИЯ - полуколичественная визуальная оценка интенсивности окраски ядер (отсутствие метки, отражающее отсутствие белка - 0 баллов, слабое/метка светло-коричневого цвета, отражающая низкое количество белка - 1 балл, умеренное/метка коричневого цвета, отражающая умеренное количество белка - 2 балла, выраженное/ метка темно-коричневая, отражающая большое количество белка - 3 балла);

ЭЦ - экспрессия в цитоплазме, полуколичественная визуальная оценка интенсивности окраски цитоплазмы (отсутствие метки, отражающее отсутствие белка - 0 баллов, слабое/метка светло-коричневого цвета, отражающая низкое количество белка - 1 балл, умеренное/метка коричневого цвета, отражающая умеренное количество белка - 2 балла, выраженное/метка темно-коричневая, отражающая большое количество белка - 3 балла).

Полуколичественная оценка распространенности положительно окрашенных ядер эпителиальных клеток

Максимальное значение общего индекса составляет 12, минимальное - 0. При этом выделяется 4 группы:

0 - отрицательный результат;

1-4 - слабая окраска;

5-8 - умеренная окраска;

9-12 - выраженная окраска.

Оценка Индекса экспрессии PDCD4 на примере фрагмента слизистой оболочки антрального отдела желудка с гистологической картиной хронического гастрита (фигура 1). При оценке иммуногистохимической реакции мы выявили 80% положительно окрашенных ядер эпителиальных клеток, что, согласно таблице, соответствует 3 баллам частоты окрашивания ядер, при этом ядерная метка была темно-коричневого цвета -полуколичественная визуальная оценка интенсивности окраски ядер - 3 балла. Таким образом, экспрессия в ядре в данном случае составила 3×3=9. При этом цитоплазматическая метка была светло-коричневого цвета - экспрессия в цитоплазме составила й балла. В итоге, при сложении экспрессии в ядре и экспрессии в цитоплазме мы получили значение Индекса экспрессии PDCD4 равное 10 баллам.

Оценка Индекса экспрессии PDCD4 на примере фрагмента аденокарциномы желудка кишечного типа (фигура 2). При оценке иммуногистохимической реакции мы выявили 5% положительно окрашенных ядер опухолевых клеток, что, согласно таблице, соответствует 1 баллу частоты окрашивания ядер, при этом ядерная метка была светло-коричневого цвета - полуколичественная визуальная оценка интенсивности окраски ядер - 1 балл. Таким образом, экспрессия в ядрах в данном случае составила 1×1=1. При этом цитоплазматическая метка была светло-коричневого цвета - экспрессия в цитоплазме составила 1 балл. В итоге, при сложении экспрессии в ядрах и экспрессии в цитоплазме мы получили значение Индекса экспрессии PDCD4 равное 2 баллам.

Такой способ оценки уровня синтеза регуляторного белка PDCD4 в тканях позволяет придать большее значение изменению ядерной экспрессии PDCD4 в общем индексе и с большей точностью фиксировать изменение его количества в эпителиальных клетках, что позволит обнаруживать нарушение экспрессии PDCD4 на ранних этапах опухолевой трансформации клетки с большей чувствительностью и специфичностью.

При проведения пробной оценки общего индекса иммуногистохимической метки регуляторного белка PDCD4 в гистологических срезах ткани с использованием предлагаемого способа в 129 исследуемых образцах тканей слизистой оболочки желудка -при хроническом атрофическом гастрите (80 образцов) и ткани аденокарциномы желудка кишечного типа (49 образцов) были получены статистически значимые (р=0,00001) отличия значений общего индекса полуколичественной оценки белка PDCD4 в тканях исследуемых групп. При этом для группы аденокарцинома желудка кишечного типа была достигнута чувствительность 95% и специфичность 92%.

Способ полуколичественной оценки белка PDCD4 иммуногистохимическим методом в тканях представляет собой расчет индекса экспрессии PDCD4, отличающийся тем, что рассчитывается путем суммации экспрессии в ядрах и экспрессии в цитоплазме, при этом экспрессия в ядрах представляет собой произведение частоты окрашивания ядер: отсутствие окрашенных ядер эпителиальных клеток - 0 баллов, 1-30% положительно окрашенных ядер эпителиальных клеток - 1 балл, 31-70% положительно окрашенных ядер эпителиальных клеток - 2 балла, >70% положительно окрашенных ядер эпителиальных клеток - 3 балла, и полуколичественной визуальной оценки интенсивности окрашивания ядер: отсутствие метки, отражающее отсутствие белка - 0 баллов, слабое (метка светло-коричневого цвета), отражающая низкое количество белка - 1 балл, умеренное (метка коричневого цвета), отражающая умеренное количество белка - 2 балла, выраженное (метка темно-коричневая), отражающая большое количество белка - 3 балла, а экспрессия в цитоплазме представляет собой полуколичественную визуальную оценку интенсивности окрашивания цитоплазмы: отсутствие метки, отражающее отсутствие белка - 0 баллов, слабое (метка светло-коричневого цвета), отражающая низкое количество белка - 1 балл, умеренное (метка коричневого цвета), отражающая умеренное количество белка - 2 балла, выраженное (метка темно-коричневая), отражающая большое количество белка - 3 балла.

Изобретение относится к медицине, а именно к онкологии, и может быть использовано для скрининга рака молочной железы и предрасположенности к нему. Проводят маммографию и УЗИ.

Способ скрининга рака молочной железы и предрасположенности к нему // 2705344

Способ молекулярно-генетической диагностики наследственных форм рака молочной железы // 2702755

Изобретение относится к области медицины. Предложен способ молекулярно-генетической диагностики наследственных форм рака молочной железы.

Способ молекулярно-генетической диагностики наследственных форм рака молочной железы // 2702755

Метод обнаружения канцерогенеза шейки матки // 2702334

Изобретение относится к медицине, а именно к онкодиагностике, и может быть использовано для обнаружения неопластического перерождения клеток, вызываемого вирусом папилломы человека (ВПЧ) у женщин, проходящих скрининг на рак шейки матки.

Способ прогнозирования риска развития рака или диагностирования рака у индивидуума // 2701730

Изобретение относится к области медицины. Предложен способ прогнозирования риска развития рака молочной железы у индивидуума, который не страдает раком молочной железы.

Способ прогнозирования риска развития рака или диагностирования рака у индивидуума // 2701730

Биомаркеры и способы лечения связанных с pd-1 и pd-l1 состояний // 2701378

Группа изобретений относится к медицине, в частности к способам отбора больных и прогнозирования злокачественного заболевания. Способ идентификации индивидуума со злокачественной опухолью, который с большей вероятностью будет отвечать на лечение антагонистом, связывающимся с PD-L1, включает: определение наличия или уровня биомаркера PD-L1 в образце от индивидуума, при этом по наличию или уровню биомаркера PD-L1 в образце идентифицируют индивидуума как такого, который вероятно будет отвечать на лечение антагонистом, связывающимся с PD-L1, и предоставление рекомендации по поводу того, что индивидуум вероятно будет отвечать на лечение антагонистом, связывающимся с PD-L1.

Биомаркеры и способы лечения связанных с pd-1 и pd-l1 состояний // 2701378

Нуклеиновые кислоты, кодирующие антитела против сиалированного антигена льюисаа человека // 2699289

Изобретение относится к области биохимии. Описана группа изобретений, включающая в себя выделенное антитело или его функциональный фрагмент, которое связывается с сиалированным антигеном Льюисаa, выделенный полинуклеотид, кодирующий тяжелую цепь вышеуказанного антитела или его функционального фрагмента, выделенный полинуклеотид, кодирующий легкую цепь вышеуказанного антитела или его функционального фрагмента, конъюгат, который связывается с сиалированным антигеном Льюисаа, содержащий вышеуказанное антитело или его функциональный фрагмент, фармацевтическую композицию для лечения заболевания, способ лечения или профилактики заболевания, где указанным заболеванием является злокачественное или опухолевое образование с клетками, экспрессирующими сиалированный антиген Льюисаа, и способ обнаружения опухоли у пациента, включающий введение вышеуказанного конъюгата.

Способ прогнозирования эффективности применения средства для повышения относительного содержания высокодифференцированных клеток в аденокарциноме молочной железы и композиция для его осуществления // 2705398

Изобретение относится к медицине, а именно к онкологии, и может быть использовано для прогнозирования эффективности применения средства для повышения относительного содержания высокодифференцированных клеток в аденокарциноме молочной железы пациента с инвазивным протоковым раком.

Способ прогнозирования эффективности лечения преэклампсии средней тяжести // 2705374

Изобретение относится к медицине, а именно к акушерству и может быть использовано для прогнозирования эффективности лечения преэклампсии средней тяжести у беременных женщин в сроки гестации 24-37 недель, в том числе у пациенток с хронической артериальной гипертензией.

Способ подготовки компонентов для проведения экспресс-теста на токсоплазмоз животных и экспресс-тест на токсоплазмоз // 2704973

Группа изобретений относится к области ветеринарии, а именно к диагностике, и может быть использована для выявления антигенов Toxoplasma gondii или антител к ним в сыворотке или плазме крови животных, а также в материале, полученном от животных методом биопсии, и в тканях и органах животных после убоя.

Способ диагностики степени дисплазии шейки матки // 2704966

Изобретение относится к медицине, а именно к гинекологии, и может быть использовано для диагностики степени дисплазии шейки матки. Способ диагностики степени дисплазии шейки матки, заключающийся в том, что проводят гистологическое исследование биоптатов шейки матки и дополнительно проводят иммуногистохимическое исследование эксцизионных биоптатов шейки матки с определением маркеров Ki-67, р16 INK4a, Cyclin D1 в покровном эпителии и в железах, и при значениях Ki-67 - 11-20% в покровном эпителии, 7-13% в железах, р16 INK4a - 4-8% в покровном эпителии, 0% в железах, Cyclin D1 - 10-11% в покровном эпителии и железах - диагностируют стадию CIN 1; при значениях Ki-67 - 55-75% в покровном эпителии, 73-91% в железах, р16 INK4a 50-60% в покровном эпителии, 80-95% в железах Cyclin D1 - 8-9% в покровном эпителии и железах - диагностируют стадию CIN II; при значениях Ki-67 - 85-95% в покровном эпителии, 92-95% в железах, р16 INK4a - 70-80% в покровном эпителии, 96-98% в железах, Cyclin D1 - 5-6% в покровном эпителии и железах - диагностируют стадию CIN III, при значениях Ki-67 - 96-100% в покровном эпителии, 96-100% в железах, р16 INK4a - 96-100% в покровном эпителии, 99-100% в железах, Cyclin D1 - 3-4% в покровном эпителии и железах - диагностируют стадию CIS.

Способ прогнозирования увеличения размеров лейомиомы матки // 2704819

Изобретение относится к медицине, а именно к гинекологии, и может быть использовано в качестве прогнозирования увеличения размеров лейомиомы матки у женщин репродуктивного возраста в течение одного года наблюдения.

Способ прогнозирования увеличения размеров лейомиомы матки // 2704817

Средства и способы для определения биологической активности полипептидов нейротоксина в клетках // 2704808

Группа изобретений относится к способам и наборам для определения биологической активности нейротоксинов. Раскрыт способ прямого определения биологической активности полипептида нейротоксина в клетках, включающий инкубацию клеток, чувствительных к интоксикации нейротоксином, с полипептидом нейротоксина; фиксацию клеток; приведение клеток в контакт по меньшей мере с первым связывающим антителом, специфически связывающимся с нерасщепленным и расщепленным нейротоксином субстратом, и по меньшей мере со вторым связывающим антителом, специфически связывающимся с сайтом расщепления субстрата, расщепленного нейротоксином; приведение клеток в контакт по меньшей мере с первым детектирующим антителом, специфически связывающимся с первым связывающим антителом, с образованием, таким образом, первых детектируемых комплексов, и по меньшей мере со вторым детектирующим антителом, специфически связывающимся со вторым связывающим антителом, с образованием, таким образом, вторых детектируемых комплексов, где первое детектирующее антитело и второе детектирующее антитело конъюгированы с различными ферментами; определение количества первых и вторых детектируемых комплексов и определение биологической активности указанного полипептида нейротоксина в указанных клетках.

Способ определения тактики ведения пациенток с умеренными диспластическими изменениями шейки матки // 2704798

Изобретение относится к медицине, а именно к гинекологии, и представляет собой способ определения тактики ведения пациенток с умеренными диспластическими изменениями шейки матки, заключающийся в том, что выполняют прицельную точечную биопсию шейки матки, проводят иммуногистохимическое исследование с определением экспрессии маркеров Ki-67 и CK7, затем по формуле рассчитывают принадлежность пациентки к нижней или верхней подгруппе группы CIN 2: где ƒ1(ai)=0,266⋅Х1+0,067⋅Х2-12,519; ƒ2(ai)=0,134⋅Х1+0,019⋅Х2-3,472; Х1 – значение Ki-67; Х2 – значение CK7; «0» – верхняя подгруппа CIN 2; «1» – нижняя подгруппа CIN 2; пациенткам верхней группы CIN 2 прогнозируют прогрессию изменений до более тяжелой степени CIN 3 и CIS и рекомендуют выполнение эксцизии шейки матки, пациенткам нижней группы CIN 2 прогнозируют регресс изменений до более легкой степени CIN 1 и рекомендуют наблюдение в течение 18 месяцев с последующим решением о целесообразности выполнения эксцизии шейки матки.

Способ прогнозирования риска кардиогенных нарушений у пациентов с коморбидным течением сахарного диабета 2 типа и ишемической болезни сердца // 2703527

Изобретение относится к области медицины, а именно к кардиологии и эндокринологии. Оно может быть использовано для определения тактики лечения пациентов с коморбидным течением сахарного диабета 2 типа и ишемической болезни сердца.

Способ прогнозирования развития плацентарной недостаточности // 2703463

Группа изобретений относится к медицине, а именно к клинико-лабораторной диагностике, и может быть использована для прогнозирования развития плацентарной недостаточности.

Способ для оценки и лечения или профилактики нарушенных уровней полярных липидов в плазме // 2705208

Группа изобретений относится к фармации и медицине. Предложено применение композиции в получении жидкого продукта для профилактики или лечения индивидуума, имеющего нарушенные уровни в плазме одного или нескольких полярных липидов: фосфатидилхолина (РС) PC aa C36:6, PC aa C38:0, PC aa C38:6, PC aa C40:6, PC ae C40:6 и ряда других, причём указанная композиция включает по меньшей мере один витамин группы В, выбранный из витамина B6, витамина B12 и витамина B9 (варианты).