Штамм бактерий methylococcus capsulatus concept-8 - продуцент белковой биомассы

Изобретение относится к микробиологической промышленности и может быть использовано для получения белковой биомассы. Предлагается штамм бактерий Methylococcus capsulatus, депонированный во Всероссийской коллекции микроорганизмов ИБФМ им. Г.К. Скрябина РАН под регистрационным номером ВКМ В-3289Д. Штамм продуцирует белковую биомассу с содержанием белка свыше 79%, обладает метанокисляющими свойствами, резистентностью к внешним воздействиям в широких пределах параметров культивирования, высокой скоростью роста в оптимальных условиях. 1 табл., 5 пр.

 

Изобретение относится к микробиологической промышленности и может быть использовано для биосинтеза высокобелкового премикса к кормам сельскохозяйственных, домашних и содержащихся в неволе животных. Заявленный штамм бактерий Methylococcus capsulatus CONCEPT-8, обладающий метанокисляющими свойствами, резистентностью к внешним воздействиям в широких пределах параметров культивирования, высокой скоростью роста в оптимальных условиях, депонирован во Всероссийской коллекции микроорганизмов под номером ВКМ В-3289Д

Метанокисляющие бактерии, использующие метан и его производные в качестве источника углерода и энергии, находят применение для снижения концентрации метана в угольных шахтных газах, в биосинтезе богатой белком биомассы, нашедшей применение в качестве премикса к животным кормам.

Метанокисляющие бактерии, использующие метан и его производные в качестве источника углерода и энергии, широко распространены в природе, являясь биофильтром, снижающим вероятность попадания метана в тропосферу планеты и нарушения озонового слоя.

Особый интерес представляет собой использование бактерий Methylococcus capsulatus, как биосинтетической системы, активно перерабатывающей содержащийся в природном, в том числе, шахтном газе метан, и быстро наращивающей свою биомассу, отличающуюся высоким содержанием ценного белка, а также биологически активных веществ, в том числе витаминов. Биомасса Methylococcus capsulatus характеризуется высоким уровнем сырого протеина (не менее 70%), а также похожим на рыбную муку соотношением аминокислот, что позволяет использовать ее как белковый премикс к кормам.

Испытания кормов с включением биомассы метанокисляющих бактерий, проведенные на сельскохозяйственных животных, птицах и рыбе подтвердили высокую биологическую ценность этой биомассы как источника протеина, витаминов и других питательных веществ. Давно доказана безвредность применения биомассы метанокисляющих бактерий (1-5). Ветеринарными и санитарно-гигиеническими исследованиями установлена доброкачественность и безвредность продуктов животноводства, птицеводства и рыбоводства, полученных при использовании кормов с биомассой метанокисляющих бактерий. (6-8).

Несмотря на то, что по ряду показателей бактериальная биомасса отличается от традиционных белковых премиксов, в частности, высоким содержанием нуклеиновых кислот, отсутствием полиненасыщенных жирных кислот и наличием жирных кислот (9), применение биомассы метанокисляющих бактерий не оказывают отрицательного влияния на рост и развитие животных, в частности мальков и товарной рыбы. (10, 11).

Различные виды микроорганизмов являются продуцентами полноценного белка и витаминов. Многие из них нашли применение в кормопроизводстве благодаря разработанным и испытанным технологиям (12).

В ряде технологий, в качестве продуцентов белка используются высоко продуктивные грибы рода Candida. (13-16). (Патент РФ №2042713, №2090610, Авт.Св. СССР №№3221059, 1817471). В других успешно используются дрожжи Saccharomyces cerevisiae (Авт. св. СССР №1575570; Патент РФ №2650689), отличающиеся, однако, невысокой продуктивностью и способные развиваться только при низкой концентрации субстрата в среде, что снижает экономическую эффективность их применения (17-18).

Известны штаммы молочнокислых и пропионовывокислых бактерий, используемые в качестве продуцентов белка (патенты РФ №2244000; 2390554; №2244001; №2250258 и ряд других). (19- 22). Общим недостатком данных штаммов является недостаточно высокая концентрация биомассы, биосинтез которой подавляется образующейся молочной или пропионовой кислотами.

Известены шляпочные грибы Flammulina velutipes НБК F-112 (А.С. №727687) и Pleurotus ostreatus Kummer (А.С. №427993) продуценты белка, биомасса которого может быть использована как полноценный белковый премикс (23-24). Однако использование для их выращивания сложных сред с высоким содержанием глюкозы и отходов пищевой промышленности, непосредственно используемых в качестве добавок в корм сельскохозяйственных животных, делает их использование практически бессмысленным.

Известен штамм ацидофильных метилотрофных бактерий Acetobacter methylicum ВСБ-867 - продуцент белково-витаминной биомассы (А.С. №925112), характеризующийся, однако, недостаточно высокой продуктивностью и нестабильным выходом конечного продукта (25)

Известны штаммы метанотрофных бактерий, культивируемых на природном газе и активно размножаясь, наращивая свою биомассу, продуцирующих белок, обогащенный биологически активными соединениями и пригодный для использования в качестве премикса к кормам (26-32). (Патент РФ №№2613365, 206416; Авт.св. СССР №№770200, 908085, 501681, 1072815, 615871).

Наиболее активным продуцентом белковой биомассы на природном газе является вид Methylococcus capsulatus. К недостаткам данного вида метанотрофа можно отнести нестабильность его роста на природном газе при длительном культивировании в условиях проточного режима, что снижает продуктивность процесса и выход готового продукта.

Наиболее близким к заявленному изобретению является штамм метаноокисляющих бактерий Methylococcus capsulatus ГБС-15, описанный в патенте РФ №2613365 (33). Полученный штамм Methylococcus capsulatus ГБС-15 обладает рядом свойств, обеспечивающих ему более стабильный рост в процессе культивирования. Авторами патента показана фагоустойчивость штамма при выращивании его в атмосфере природного газа разного состава (с содержанием метана от 85% об. до 99,9%. об.) и на различной воде, которые являются потенциальными источниками поступления в систему внешних фагов, а также могут спровоцировать активность профагов самой культуры. Авторами была показана также устойчивость штамма Methylococcus capsulatus ГБС-15 к гомологам метана, поступающим в среду культивирования вместе с метаном в составе природного газа, в частности этану (2-4%), пропану (1,5-3%) и бутану (0,1-0,8%). В патенте также отмечается рост штамма Methylococcus capsulatus ГБС-15 в условиях повышенного давления до 6 атм. При этом достигается концентрация биомассы 32 г/л и скорость протока 0,25 час-1.

Однако следует отметить, что в примере №1 авторами не указывается продолжительность процесса культивирования, что затрудняет оценку фагоустойчивости штамма. Кроме того, в зависимости от месторождения природного газа (особенно газоконденсатных месторождений) в его составе содержится более высокие количества гомологов метана, а также обнаруживается пентан. В попутных газах в небольших количествах могут встречаться высшие углеводороды. В шахтных газах помимо прочего содержится СО2, концентрация которого составляет 3-6%. Следует отметить, что в процессе культивирования метанокисляющих микроорганизмов в среде могут накапливаться продукты неполного окисления метана (метанол, формальдегид, формиат), органические кислоты, углеводы и др., которые также могут оказывать ингибирующее действие на рост бактерий.

Задачей, на решение которой направлено предлагаемое изобретение, является получение нового штамма метанокисляющих бактерий с более широким потенциалом устойчивости, сохраняющего стабильный рост и высокую продуктивность в процессе длительного культивирования на природном газе.

Техническим результатом, на достижение которого направлено предлагаемое изобретение, является повышение продуктивности штамма метанокисляющих микроорганизмов Methylococcus capsulatus, достижение стабильного выхода конечного продукта, а также обеспечение резистентности к вариациям внешних условий, в том числе:

- механорезистентности, что позволяет интенсифицировать потоки в культуральной среде, снизить диффузионные ограничения и увеличить концентрацию метана активизировать аэрацию;

- барорезистентности, что позволяет, при необходимости, регулировать растворимость газов в культуральной жидкости и увеличивать выход биомассы, варьируя давление;

- резистентности к повышенным концентрациям гомологов метана содержащихся в природном газе, в том числе, шахтном газе, что позволяет снизить его концентрацию в шахтном газе, а также использовать сырье для биосинтеза белка метанокисляющими микроорганизмами Methylococcus capsulatus из различных источников и уменьшить вариабельность выхода конечного продукта;

- повышенной резистентности к ингибирующему эффекту продуктов метаболизма в возвращаемой в процесс культивирования отработанной культуральной жидкости, что позволяет снизить потери составляющих минерального питания и, соответственно, увеличить эффективность процесса.

Для достижения указанного технического результата штамм Methylococcus capsulatus CONCEPT-8 был получен из коллекционного штамма Methylococcus capsulatus ВКМ В - 2116. Предварительную адаптацию штамма к потенциальным ингибиторам проводили в условиях качалочных колб при последовательном многократном пассировании штамма в заданных условиях. Дальнейший отбор штамма вели путем последовательной многоступенчатой селекции в условиях проточного культивирования штамма на природном газе в условиях незащищенной ферментации в присутствии выбранных потенциальных ингибиторов при постепенном увеличении скорости протока от 0,05 час-1 до 0,35 час-1. Критериями отбора служили технологические параметры: скорость роста и содержание белка в биомассе.

В результате проведенной селекции, выделен штамм метанокисляющих бактерий Methylococcus capsulatus (CONCEPT-8) ВКМ В -3289Д, который может найти применение в технологиях получения биомассы с высоким содержанием белка, при культивировании на метане,

содержащимся как в природном газе, так и в шахтном газе.

Штамм Methylococcus capsulatus ВКМ В -3289Д хранят на жидкой минеральной среде при температуре 4°С, пересев 1 раз в 3 месяца на минеральной среде в атмосфере метана.

Культурально-морфологические признаки штамма.

Клетки штамма имеют форму кокка и диплококка, диаметром 0,8-1,0 мкм, неподвижные. На агаризованной среде образует мелкие прозрачные колонии (d - 1 мм на 2-ые сутки культивирования), выпуклые, блестящие, гладкие с ровным краем. Штамм сохраняет жизнеспособность в широком диапазоне температур (20-б0°С) и рН (4,5-8,0). Оптимальные значения температуры 40-42°С и рН 6,6-6,7. Штамм является облигатным метанотрофом, использует метан в качестве единственного источника углерода и энергии. Не нуждается в факторах роста. Устойчив к примесям гомологов метана и CO2, содержащихся в природном газе. Штамм способен образовывать покоящиеся формы типа незрелых цист Azotobacter.

Штамм непатогенен.

Генетические манипуляции со штаммом не производились Полученный в результате селекционных работ штамм Methylococcus capsulatus ВКМ В -3289Д характеризуется:

- механорезистентно.стью, в результате чего число целых, способных к нормальной жизнедеятельности клеток, практически не уменьшается в поле акустических микропотоков с высокими градиентами скростей, что позволяет интенсифицировать перемешивание в культуралной среде, снизить диффузионные ограничения, ускорить процесс растворения и увеличить концентрацию растворенных в культуральной среде газов;

- барорезистентностью, что позволяет увеличить концентрацию растворенных в культуральной среде газов;

- резистентностью к повышенным концентрациям гомологов метана содержащихся в природном газе, в том числе, шахтном газе, что позволяет снизить его концентрацию в шахтном газе, а также использовать сырье для биосинтеза белка метанокисляющими микроорганизмами Methylococcus capsulatus ВКМ В -3289Д из различных источников и уменьшить вариабельность выхода конечного продукта;

- повышенной резистентностью к ингибирующему эффекту продуктов метаболизма в возвращаемой в процесс культивирования отработанной культуральной жидкости, что позволяет снизить потери составляющих минерального питания и, соответственно, увеличить эффективность процесса.

Конечный продукт, получаемый при культивировании штамма Methylococcus capsulatus ВКМ В -3289Д - микробная биомасса с

высоким содержанием белка.

Область применения штамма -промышленный биосинтез биомассы с высоким содержанием белка.

Изобретение поясняется примерами, не носящими, однако, ограничительного характера.

Пример 1. Штамм Methylococcus capsulatus (CONCEPT-8) ВКМ В -3289Д выращивали на ферментере с рабочим объемом 1,7 л на минеральной среде следующего состава г/л: KNO3 - l,0; MgSO4⋅7Н2О-0,2; CaCl2 - 0,02;

Na2HPO4⋅12H2O -1,5; KH2PO4 - 0,7;

FeSO4⋅7H2O-2,0 мг; ZnSO4 ⋅ 7H2O - 0, 1 мг;

MnCl2⋅4H2O - 0,03 мг; CuCl2⋅5H2O - 0,1 мг; CoCl2⋅6H2O - 0,2 мг; NiCl2⋅6H2O - 0, 02 мг; Na2MoO4 - 0,03 мг; H3BO3 - 0,03 мг; ЭДТА-Na2 - 5,0.

рН среды 6,7

Процесс вели при давлении 0,2 МПа, газовая фаза содержала смесь метан:воздух в соотношении 1:3.

Метан -99,9%

Температура культивирования 42°С

Продолжительность процесса - 336 часов

Скорость протока Д=0,28 час-1

Концентрация биомассы составила 11,8-12,3 г/л, содержание сырого протеина в биомассе - 79,4%

Пример 2.

Культивирование вели как описано в примере 1.

Газовая смесь содержала метан: этан в %-ом соотношении 94: 6. Скорость протока Д=0,28 час -1

Концентрация биомассы составила 11,7-12,0 г/л, содержание сырого протеина 78,1%

Пример 3.

Культивирование вели как описано в примере 1.

Газовая смесь содержала метан: этан: пентан в %-ом соотношении 92: 6:2. Скорость протока Д=0,28 час -1

Концентрация биомассы составила 11, 5-11, 7. г/л, содержание сырого протеина 78%

Пример 4.

Культивирование вели как описано в примере 1. Процесс вели при давлении 0,2 МПа, газовая фаза содержала смесь метан: воздух в соотношении 1:3.

Метан - 99,9%

В среду культивирования добавляли отработанную культуральную жидкость (ОКЖ), полученную после отделения клеток метанотрофа.

ОКЖ содержит весь комплекс продуктов метаболизма метанотрофа, которые образуются в процессе выращивания метанотрофа на природном газе

, включая метанол, формальдегид, формиат, полисахариды, органические кислоты и др. (33-38).

Суммарной количественной характеристикой всех органических веществ, образующихся в процессе культивирования являются показатели ХПК(мгО2/л) и БПК(мгО2/л).

В среду культивирования добавляли ОКЖ со следующими показателями:

ХПК = 1650 мгО2

БПК = 1100 мгО2

ОКЖ в среду культивирования добавляли в количестве 1-10 об.%.

Пример 5

Культивировании штамма Methylococcus capsulatus (CONCEPT-8) ВКМ В -3289Д вели на ферментере с рабочим объемом 1,7 л на минеральной среде как и в примере 1.

рН среды 6,7

Процесс вели при давлении 0,1 МПа, газовая фаза на входе в ферментер содержала смесь: метан -6%, кислород - 19%, углекислый газ - 1,5%, остальное - азот.

Метан -99,9%

Температура культивирования 42°С

Продолжительность процесса - 336 часов

Скорость протока Д=0,25 час -1

Концентрация биомассы составила 0,7-0,8 г/л, содержание сырого протеина в биомассе - 78,0%.

Газовая фаза на выходе из ферментера содержала смесь: метан -3,7%, кислород - 17%, углекислый газ - 4,3%, остальное - азот.

Представленные примеры характеризуют штамм Methylococcus capsulatus ВКМ В -3289Д, как продуцент высокого содержания белка в микробной биомассе, способный обеспечивать высокие его показатели в широком диапазоне концентрации метана (от 6 до 99,9%) при его культивировании и повышенной резистентности к ингибирующему эффекту продуктов метаболизма.

Штамм метанокисляющих бактерий Methylococcus capsulatus ВКМ В-3289Д для биосинтеза белковой биомассы.



 

Похожие патенты:

Изобретение относится к ферментативному синтезу L-нуклеиновых кислот в присутствии полимеразы. Предложен способ добавления одного или нескольких L-нуклеотидов к 3’-концу L-нуклеиновой кислоты, включающий стадию проведения реакции одного или нескольких L-нуклеотидов с L-нуклеиновой кислотой в присутствии полимеразы, где указанная полимераза способна добавлять один или несколько L-нуклеотидов к 3’-концу указанной L-нуклеиновой кислоты, при этом указанная полимераза состоит из аминокислотной последовательности, причём аминокислоты указанной аминокислотной последовательности представляют собой D-аминокислоты.
Изобретение относится к микробиологической промышленности, в частности к штамму дрожжей Metschnikowia pulcherrima ВКПМ Y-4339 - продуценту микробного белка и этанола. Предложенный штамм Metschnikowia pulcherrima ВКПМ Y-4339 неприхотливый к культивированию и хранению, обладает невысокой температурой размножения, обеспечивает высокий прирост биомассы при получении микробного белка, а также высокий выход этанола..

Изобретение относится к области биотехнологии, конкретно к рекомбинантному получению терапевтических белков, и может быть использовано для получения рекомбинантного фолликулостимулирующего гормона человека (рчФСГ).

Изобретение относится к клеточным технологиям и может быть использовано для рекомбинантного получения фолликулостимулирующего гормона (ФСГ) человека. Клеточную линию huFSHKKc6 получают путем трансформации клеток huFSHIK экспрессионной плазмидой длиной 7719 п.о., состоящей из гена устойчивости PuroR с SV40 polyA, укороченного 3'LTR HIV-1, гена устойчивости AmpR, промотора AmpR, ориджина репликации SV40 и pBR322, промотора NP гена р53 человека, pgk - конститутивного промотора гена фосфоглицераткиназы, синтетической нуклеотидной последовательности, кодирующей полноразмерную альфа-субъединицу ФСГ человека, сигнала терминации трансляции, состоящего из 3 пар оснований и консенсусной сигнальной последовательности Козак.

Группа изобретений относится к области биотехнологии. Предложен способ получения рекомбинантного белка и его выделения (варианты).

Изобретение относится к пептидам для улучшения памяти, способности к обучению и когнитивных способностей. Подтверждено, что пептид с C-концевой областью, заканчивающейся GAG, обладает эффектом улучшения памяти.

Группа изобретений относится к биотехнологии. Предложены композиция среды для культивирования Clostridium botulinum и способ получения ботулинического токсина.

Изобретение относится к области биотехнологии, в частности к способу синтеза белка в культурах бактериальных клеток. Способ включает модификацию поверхности клеток методом послойной адсорбции противоположно заряжённых полимеров и последующее термостатирование культуры клеток.

Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано для получения микробной белковой массы для кормления животных. Штамм гетеротрофных бактерий Klebsiella pneumonia 1-17, способный использовать продукты соокисления гомологов метана, присутствующих в природном газе, депонирован в Государственной коллекции патогенных микроорганизмов и клеточных культур «ГКПМ - ОБОЛЕНСК» под регистрационным номером В-8465.
Изобретение относится к микробиологической промышленности. Штамм гетеротрофных бактерий Stenotrophomonas acidaminiphila GBS-15-2 обладает способностью использовать продукты соокисления гомологов метана, присутствующие в природном газе.
Изобретение относится к иммунобиотическому комплексу для нормализации кишечной микрофлоры организма. Указанный комплекс включает сухую микробную массу живых бактерий и биологически активные вещества (БАВ).

Изобретение относится к микробиологии. Способ производства сухих солей желчных кислот из нативной желчи крупного рогатого скота предусматривает осветление нативной желчи путем добавления активированного угля, прогреванием смеси до заданной температуры и охлаждением с последующей фильтрацией с получением осветленной желчи.

Изобретение относится к биотехнологии. Штамм лактобактерий Enterococcus hirae Т-8 13-2018, обладающий способностью продуцировать молочную кислоту и высокой антагонистической активностью по отношению к условно-патогенной и патогенной микрофлоре депонированный под регистрационным номером ВКПМ В-13055.

Изобретение относится к микробиологии. Изобретение касается нового штамма (вида) микроорганизма – продуцента актифенола.
Изобретение относится к биотехнологии. Штамм Lactobacillus plantarum Лб (н)37 2-2018, обладающий антагонистической активностью по отношению к условно-патогенной и патогенной микрофлоре, депонирован во Всероссийской Коллекции Промышленных Микроорганизмов под регистрационным номером ВКПМ В-13052.

Изобретение относится к клинической и санитарной микробиологии. Питательная среда для выделения клебсиелл содержит панкреатический гидролизат рыбной муки, пептон мясной, дрожжевой экстракт, мезо-инозит, натрий хлористый, соли желчных кислот, кристаллический фиолетовый, нейтральный красный, натрий углекислый, карбенициллин, агар микробиологический и дистиллированную воду при заданном соотношении компонентов.

Изобретение относится к медицинской микробиологии и может быть использовано для изготовления вакцинных препаратов. Предложен способ получения вакцины гемофильной тип b конъюгированной.

Изобретение относится к области биотехнологии, а именно к применению штамма Rickettsia raoultii «Шайман» генотипа DnSH, депонированного во Всероссийском музее риккетсиозных культур ФГБУ «Федеральный научно-исследовательский центр эпидемиологии и микробиологии им.

Изобретение относится к микробиологии и биотехнологии. Предложен штамм бактерий Bifidobacterium longum ICIS-505, который является продуцентом биологически активных веществ, обладающих антиперсистентной активностью в отношении условно-патогенных и патогенных бактерий и дрожжевых грибов.

Изобретение относится к областям биотехнологии, молекулярной биологии и медицинской микробиологии. Разработан набор олигонуклеотидных праймеров для реакции петлевой изотермической амплификации (LAMP), который позволяет амплифицировать специфические для бактерий вида Francisella tularensis фрагменты ДНК из целевого гена, имеющего нуклеотидную последовательность SEQ ID №:1.

Изобретение относится к микробиологической промышленности и может быть использовано для получения белковой биомассы. Предлагается штамм бактерий Methylococcus capsulatus, депонированный во Всероссийской коллекции микроорганизмов ИБФМ им. Г.К. Скрябина РАН под регистрационным номером ВКМ В-3289Д. Штамм продуцирует белковую биомассу с содержанием белка свыше 79, обладает метанокисляющими свойствами, резистентностью к внешним воздействиям в широких пределах параметров культивирования, высокой скоростью роста в оптимальных условиях. 1 табл., 5 пр.

Наверх