Способ прогнозирования готовности эндометрия к успешной имплантации эмбриона у женщин с маточной формой бесплодия с использованием компьютерной морфометрии

Изобретение относится к области медицины, а именно к гинекологии и репродуктологии, и касается прогнозирования готовности эндометрия к успешной имплантации эмбриона у женщин с маточной формой бесплодия. Для этого на микрофотографии гистологического препарата измеряют площадь и высоту пиноподий, а также площадь сосудов. На основании этих параметров вычисляют прогностический индекс (PI) по разработанной формуле. При значениях PI более 0 прогнозируют высокий риск репродуктивных неудач при осуществлении вспомогательных репродуктивных технологий. При значениях PI менее 0 прогнозируют готовность эндометрия к успешной имплантации эмбриона. Способ обеспечивает высокую эффективность прогнозирования репродуктивных удач или неудач за счет объективной оценки рецептивности эндометрия. 5 ил., 3 пр.

 

Изобретение относится к области медицины, а именно к гинекологии и репродуктологии и может быть использовано для оценки имплантационных возможностей эндометрия при лечении бесплодия и подготовки пациенток к вспомогательным репродуктивным технологиям (ВРТ).

Изобретение обеспечивает возможность коррекции тактики ведения женщин с маточной формой бесплодия на этапе прегравидарной подготовки и подготовки к ВРТ.

Нарушение имплантации человеческого эмбриона в связи с нерецептивным эндометрием является наиболее значимой причиной репродуктивных неудач вспомогательных репродуктивных технологий, занимая в их структуре до 70%, при переносе эмбрионов хорошего качества [Регистр ВРТ РАРЧ. Отчет за 2017 год: [Электронный ресурс].- СПб., 2018.- 48 С. – Режим доступа : http://www.rahr.ru. Боярский, К.Ю. Современный взгляд на проблему рецептивности и тонкого эндометрия в программах ВРТ. Обзор литературы/ К.Ю.Боярский, С.Н.Гайдуков, Н.А. Пальченко // Проблемы репродукции.- 2013.- № 4.- С. 3-7]. Потому в последние годы в фокусе научного интереса находятся исследования, посвященные изучению ультраструктурных морфологических характеристик рецептивности эндометрия при патологии имплантации. Активизация «окна имплантации» характеризуется значительными ультраструктурными изменениями клеток ламинарного эпителия. В этот период плазменные мембраны покровного эпителия эндометрия теряют микроворсинки и апикальные поверхности клеток формируют куполоподобные выпячивания – пиноподии. При использовании сканирующей электронной микроскопии пиноподии определяются в 78% биопсий эндометрия на 6-й постовуляторный день у женщин с регулярным менструальным циклом [Носенко, Е.Н. Особенности формирования пиноподий в эндометрии в зависимости от наличия в нем хронических воспалительных и гиперпролиферативных процессов у женщин хороших ответчиков с неудачными попытками вспомогательных репродуктивных технологий (ВРТ) в анамнезе /Е.Н. Носенко, А.И. Саенко, О.И. Парницкая [и др.] //Современные проблемы науки и образования. – 2014. – № 6. – С. 1158.]. Формирование пиноподий в период имплантации зависит от наличия в нем таких патологических процессов, как хроническое воспаление и гиперплазия, однако даже при их отсутствии отличается от такового у здоровых фертильных женщин. Общими отличительными чертами эндометрия женщин с бесплодием и репродуктивными неудачами является снижение количества зрелых пиноподий, повышение численности созревающих пиноподий; наличие на апикальной поверхности участков отсутствия пиноподий; мозаицизм их размеров, формы и стадии развития [Дюжева, Е.В. Гормональная подготовка с учетом морфофункционального состояния эндометрия у пациенток с неэффективными попытками ЭКО в анамнезе /Е.В. Дюжева, Е.А. Калинина, Е.А. Коган [и др.] //Материалы IV Международный конгресс по репродуктивной медицине. – Москва, 2010. – С. 255–256. Левиашвили, М.М. Оценка рецептивности эндометрия у пациенток с безуспешными программами экстракорпорального оплодотворения в анамнезе /М.М. Левиашвили, Т.А. Демура, Н.Г. Мишиева //Акушерство и гинекология. – 2012. – № 4/1. – С. 65–68.].

Стандартная процедура гистологического исследования образцов эндометрия заключается в том, что материал берется из полости матки без деления на зоны. Затем происходит фиксация, обезвоживание, уплотнение материала для приготовления гистосрезов с последующим их окрашиванием гематоксилином и эозином и оценкой структуры клеток с помощью световой микроскопии.

Однако далеко не всегда можно визуально оценить рецептивность эндометрия.

Аналогами данного изобретения являются описанные в научно-медицинской и патентной литературе способы оценки рецептивности эндометрия путем исследования апикальной поверхности клеток ламинарного эпителия эндометрия в трансмиссионном электронном микроскопе с определением количества, и степени зрелости пиноподий.

Недостатками данного метода являются:

• длительная и трудоемкая подготовка материала, требующая соответствующей подготовки лаборантов;

• наличие дорогостоящего оборудования;

• невозможность оценки всего препарата;

• невозможность применения в рутинной практике.

Известен способ прогнозирования рецептивности эндометрия на основании оценки экспрессии гонадотропин - рилизинг гормона (GnRG) и рецептора гонадотропин - рилизинг гормона (GnRGR)  в «окно имплантации» в эндометрии женщин с бесплодием и неудачными попытками программ ЭКО. Гистологическое датирование эндометрия, оценку процента клеток поверхностного эпителия с наличием зрелых пиноподий осуществляют на том же световом микроскопе при увеличении ×400 в 5 полях зрения. Пиноподии оцениваются как изобилующие, умеренные и незначительные в зависимости от % занимаемой ими поверхности эндометрия (>40, 20-40 и <20, соответственно) [патент RU 2617515].

Недостатки: необходимость проведения ИГХ исследования, отсутствие данных о методе подсчета клеток, имеющих пиноподии.

Наиболее близким аналогом (прототипом) является описанный в зарубежной литературе метод ручного подсчета количества клеток, имеющих на поверхности пиноподии (в зависимости от площади, занимающей эпителиальный покров, пиноподии характеризуются как изобилующие (более 50%), умеренные (от 20 до 50%) и не выраженные (менее 20%) и визуальное определение их характера: созревающие, зрелые и увядающие. (Achache, H. Endometrium receptivity markers, the journey to successful embryo implantation / H. Achache, A. Revel // Hum Reprod Update. –2006. – Vol. 12 (6). – P. 731–746).

Недостатками способа являются длительность и субъективность подсчета клеток, имеющих пиноподии и определение их характера, используются только два показателя, а также отсутствие математического моделирования, позволяющего делать прогноз с высокой точностью.

В настоящее время в литературе имеются данные об использовании программ для компьютерной морфометрии в практическом здравоохранении, что делает возможным быструю и объективную оценку площади и высоты пиноподий а так же площади капилляров в ламинарном эпителии.

Задачей изобретения является разработка способа готовности эндометрия к успешной имплантации эмбриона у женщин с маточной формой бесплодия с использованием компьютерной морфометрии на основании данных о площади, высоте пиноподий и площади капилляров, полученных с использованием методов компьютерной морфометрии и метода математического моделирования.

Технический результат при использовании изобретения – повышение эффективности прогнозирования репродуктивных неудач у женщин с маточной формой бесплодия.

Заявляется способ прогнозирования готовности эндометрия к успешной имплантации эмбриона у женщин с маточной формой бесплодия, с использованием компьютерной морфометрии отличающийся тем, что измерение площади и высоты пиноподий, площади сосудов проводят на микрофотографии гистологического препарата, с последующим вычислением прогностического индекса (PI) по формуле:

PI =10,63- Х1×0,082- Х2×0,202- Х3×0,776,

где:

Х1 – площадь пиноподий, %,

Х2 – средняя высота пиноподий, пиксели,

Х3 – площадь сосудов, %,

10,63 – Const,

при PI более 0 прогнозируют высокий риск репродуктивных неудач в программах ВРТ, а при PI менее 0 делают заключение о готовности эндометрия к успешной имплантации эмбриона у женщин с маточной формой бесплодия.

Способ поясняется фигурами иллюстраций.

На Фиг. 1 представлена микрофотография ламинарного эпителия, выполненная с использованием программного обеспечения AxioVision при увеличении ×200, обработанная в программе ImageJ, где: 1  – строма эндометрия, 2  – ламинарный эпителий, 3 – пиноподии на апикальной поверхности клеток.

На Фиг.2 представлена микрофотография ламинарного эпителия, выполненная с использованием программного обеспечения AxioVision при увеличении ×200, обработанная в программе ImageJ, , где: 1 – строма эндометрия, 2 – ламинарный эпителий, 4 – участок эпителия, имеющий пиноподии на апикальной поверхности, 5  – участок эпителия, не имеющий пиноподий на апикальной поверхности

На Фиг.3 представлена микрофотография ламинарного эпителия, выполненная с использованием программного обеспечения AxioVision при увеличении 400, обработанная в программе  ImageJ, где: 1  – строма эндометрия, 3 – пиноподии на апикальной поверхности клеток (показаны стрелками).

На Фиг.4 представлена микрофотография секреторного эндометрия, выполненная с использованием программного обеспечения AxioVision при увеличении 200, отражающая положительную экспрессию CD34 в капиллярах эндометрия, где 1  – строма эндометрия, 6 – капилляры с CD34+ экспрессией (показаны стрелками).

На Фиг.5 представлена микрофотография секреторного эндометрия, выполненная с использованием программного обеспечения AxioVision при увеличении 400, обработанная в программе ImageJ, где 6 – капилляры с CD34+ экспрессией (показаны стрелками).

Способ осуществляют следующим образом: изготавливаются обычные парафиновые срезы образцов эндометрия, полученных путем Пайпель биопсии или при гистероскопии, толщиной до 0,2 мкм с последующей окраской гематоксилином и эозином. Приготовленные срезы при увеличении ×400-1000 фотографируются так, чтобы в кадр попадал ламинарный эпителий. Затем с использованием программ компьютерной морфометрии производится оценка изображений при использовании программы ImageJ 1,50d (Java-based). Первым шагом идет определение единиц измерения, это могут быть пиксели или любая другая единица измерения, определяемая путем наложения морфометрической решетки или измерения заведомо известных параметров, например диаметра эритроцита.

Затем проводят поэтапное измерение длины ламинарного эпителия в препарате (Фиг. 1) и длины отрезков эпителиоцитов, имеющих на апикальной поверхности пиноподии. (Фиг. 2). Измерение высоты пиноподий производится путем измерения от апикальной поверхности до верхушки (Фиг. 3) не менее чем в 10 полях зрения и выводится среднее значение.

На втором этапе с парафинового блока изготавливаются срезы, которые окрашиваются моноклональными мышиными антителами к CD34 (QBEnd/1 Leica Biosystems Newcastle Ltd.) по стандартной методике на иммуногистостейнере закрытого типа Bond Max, полученные препараты фотографируются так, чтобы капилляры были максимально контрастны. В программе ImageJ 1,50d (Java-based). С помощью последовательности команд Image→Type→8-bit→ Image→Adjust→Threshold корректируется цвет и контрастность таким образов, чтобы на фотографии остались только капилляры. Затем с помощью команды Analyze → Analyze Particles анализируются количество, периметр и площадь капилляров, и рассчитывают их процент от общей площади препарата.

Нами проведено исследование 52 образцов эндометрия женщин, полученных на 20-22 день менструального цикла в период предполагаемого окна имплантации: в 1-ю группу включены 26 женщин с маточной формой бесплодия, 2-ю группу составили 26 фертильных женщин, имеющие детей.

При формировании групп учитывали сопоставимость женщин по возрасту, длительности менструального цикла, сопутствующим заболеваниям. Иммуногистохимические (ИГХ) реакции проводили на серийных депарафинированных срезах толщиной 3-4 мкм по общепринятым методикам (DAKO protocols).

В результате проведенных исследований выявлены наиболее информативные морфометрические показатели эндометрия репродуктивных неудач у женщин с маточной формой бесплодия. С использованием метода дискриминантного анализа разработана математическая модель прогнозирования данной патологии, заключающаяся в определении прогностического индекса (PI) по формуле:

PI =10,63 - Х1×0,082- Х2×0,202- Х3×0,776, где:

Х1 – площадь пиноподий, %;

Х2 – средняя высота пиноподий, пиксели;

Х3 – площадь сосудов, %;

10,63 – Const.

При PI более 0 прогнозируют высокий риск репродуктивных неудач в программах ВРТ, а при PI менее 0 делают заключение о готовности эндометрия к успешной имплантации эмбриона у женщин с маточной формой бесплодия.

Чувствительность предлагаемого способа составляет 84,46%, специфичность – 87,2%. Эффективность способа – 82,69%.

Пример 1 Пациентка Б., 39 лет (история болезни 8808, диагноз первичное бесплодие 1 в течение 6 лет, две неудачные попытки ЭКО в анамнезе, гипоплазия эндометрия). Жалоб пациентка не предъявляла, Соматически не отягощена. Материал получен методом Пайпель биопсии на 20 день менструального цикла. При рутинном гистологическом исследовании: фрагменты эндометрия соответствуют начальной стадии фазы секреции, единичные железы – средняя секреция. При расширенном гистологическом и ИГХ исследовании с применением компьютерной морфометрии: площадь клеток имеющих пиноподии на апикальной поверхности -20%, средняя высота пиноподий – 19,36 пикс, средняя площадь капилляров 2,071%

По формуле определили значение прогностического индекса:

PI = 10,63-20×0,082 -19,36×0,202-2,071×0,776 = 3,47

PI > 0, что свидетельствует о высоком риске репродуктивных неудач в программах ВРТ.

Пациентке рекомендовано проведение лечения.

Пример 1 Пациентка А., 37 лет (амбулаторная карта 502, диагноз первичное бесплодие 1 в течение 7 лет, попытки ЭКО не предпринимались. Диагноз эндометриоз, гипоплазия эндометрия). Жалобы на скудные болезненные менструации. Соматически генетическая тромбофилия: гены MTR AG, MTHFR AC. Материал получен методом Пайпель биопсии на 20 день менструального цикла. При рутинном гистологическом исследовании: фрагменты эндометрия соответствуют начальной стадии фазы секреции. При расширенном гистологическом и ИГХ исследовании с применением компьютерной морфометрии: площадь клеток имеющих пиноподии на апикальной поверхности - 15%, средняя высота пиноподий – 12,23 пикс, средняя площадь капилляров 3,12%

По формуле определили значение прогностического индекса:

PI = 10,63-15×0,082-12,23×0,202-3,12×0,776 = 4,51

PI > 0, что свидетельствует о высоком риске репродуктивных неудач, в программах ВРТ.

Женщина была пролечена в течение трех месяцев. Результат расширенного гистологического и ИГХ исследования с применением компьютерной морфометрии после лечения: площадь клеток имеющих пиноподии на апикальной поверхности - 75%, средняя высота пиноподий – 29,52 пикс, средняя площадь капилляров 4,42%

По формуле определили значение прогностического индекса:

PI = 10,63-75×0,082-29,52×0,202-4,42×0,776 = -4,913

PI < 0, что свидетельствует о готовности эндометрия к успешной имплантации эмбриона у женщин с маточной формой бесплодия.

Через 2 месяца криоперенос эмбриона – диагностирована прогрессирующая маточная беременность.

Пример 3. В. 30 лет (история болезни 825) Обратилась в связи с диагностированной кистой в яичнике. В анамнезе 2 года назад срочные роды в сроке 37 нед, мальчик 3250 г, 52 см, 7/8 по Апгар, растет и развивается в соответствии с возрастом. Соматически не отягощена, отмечает аллергическую реакцию на пенициллин – высыпаня и зуд. Материал получен методом Пайпель биопсии на 22 день менструального цикла. При рутинном гистологическом исследовании: эндометрий средней стадии-поздней фазы секреции. При расширенном гистологическом и ИГХ исследовании с применением компьютерной морфометрии: площадь клеток имеющих пиноподии на апикальной поверхности -80%, средняя высота пиноподий – 42,65 пикс, средняя площадь капилляров 5,063%.

По формуле определили значение прогностического индекса:

PI = 10,63-80×0,082-42,65×0,202-2,071×0,776 = -8,474

PI < 0, что свидетельствует о готовности эндометрия к успешной имплантации эмбриона у женщин с маточной формой бесплодия.

Таким образом, прогнозирование готовности эндометрия к успешной имплантации эмбриона у женщин с маточной формой бесплодия с использованием компьютерной морфометрии, предлагаемым способом позволит уменьшить количество неэффективных протоколов лечения и циклов ВРТ.

Заявляемый способ прост в исполнении, включает объективную оценку морфометрических параметров, не требует дорогостоящего оборудования.

В отличие от прототипа:

- не требует длительной и трудоемкой подготовки образцов перед исследованием и наличия громоздкого оборудования, дополнительных сред

- позволяет использовать программы компьютерной морфометрии, имеющиеся в свободном доступе и проводить объективную оценку рецептивности эндометрия

- используется в повседневной клинической практике без специальной подготовки врача-патоморфолога.

Источники информации

1. Боярский, К.Ю. Современный взгляд на проблему рецептивности и тонкого эндометрия в программах ВРТ // Проблемы репродукции. 2013. № 4. С. 3-7

2. Дюжева, Е.В, Калинина Е.А., Коган Е.А. Гормональная подготовка с учетом морфофункционального состояния эндометрия у пациенток с неэффективными попытками ЭКО в анамнезе // Материалы IV Международный конгресс по репродуктивной медицине. Москва, 2010. С. 255–256.

3. Левиашвили, М.М. Оценка рецептивности эндометрия у пациенток с безуспешными программами экстракорпорального оплодотворения в анамнезе // Акушерство и гинекология. 2012. № 4/1. С. 65–68.)

4. Носенко Е.Н. , Саенко А.И. , Парницкая О.И. Особенности формирования пиноподий в эндометрии в зависимости от наличия в нем хронических воспалительных и гиперпролиферативных процессов у женщин хороших ответчиков с неудачными попытками вспомогательных репродуктивных технологий (ВРТ) в анамнезе // Современные проблемы науки и образования. 2014. № 6. С. 1158

5. Регистр ВРТ РАРЧ. Отчет за 2017 год: [Электронный ресурс].- СПб., 2018.- 48 С. – Режим доступа: http://www.rahr.ru.

6. Achache, H. Endometrium receptivity markers, the journey to successful embryo implantation // Hum Reprod Update. 2006. Vol. 12 (6). P. 731–746.

Способ прогнозирования готовности эндометрия к успешной имплантации эмбриона у женщин с маточной формой бесплодия с использованием компьютерной морфометрии, отличающийся тем, что измерение площади и высоты пиноподий, площади сосудов проводят на микрофотографии гистологического препарата с последующим вычислением прогностического индекса (PI) по формуле

PI =10,63-Х1×0,082-Х2×0,202-Х3×0,776,

где Х1 – площадь пиноподий, %,

Х2 – средняя высота пиноподий, пиксели,

Х3 – площадь сосудов, %;

10,63 – Const,

при PI более 0 прогнозируют высокий риск репродуктивных неудач в программах ВРТ, а при PI менее 0 делают заключение о готовности эндометрия к успешной имплантации эмбриона у женщин с маточной формой бесплодия.



 

Похожие патенты:
Изобретение относится к патологической анатомии и может быть использовано для полуколичественной визуальной оценки синтеза регуляторного белка PDCD4 в гистологических срезах ткани иммуногистохимическим методом с детекцией в ядре и цитоплазме.
Группа изобретений относится к фармации и медицине. Предложено применение композиции в получении жидкого продукта для профилактики или лечения индивидуума, имеющего нарушенные уровни в плазме одного или нескольких полярных липидов: фосфатидилхолина (РС) PC aa C36:6, PC aa C38:0, PC aa C38:6, PC aa C40:6, PC ae C40:6 и ряда других, причём указанная композиция включает по меньшей мере один витамин группы В, выбранный из витамина B6, витамина B12 и витамина B9 (варианты).

Изобретение относится к медицине, а именно к педиатрии и инфектологии, и касается прогнозирования развития неспецифических осложнений острых кишечных инфекций с синдромом гемоколита у детей.

Изобретение относится к медицинской иммунологии и может быть использовано для определения функциональной активности классического пути системы комплемента. Для этого проводят реакцию лизиса эритроцитов барана, сенсибилизированных антителами кролика (ЕА), с 1% сывороткой крови человека.

Изобретение относится к области медицины, а именно профилактической медицине, и раскрывает способ прогнозирования значений концентрации холинэстеразы в сыворотке крови у работающих в условиях экспозиции винилхлоридом со стажем более 5 лет.
Изобретение относится к области медицины, хирургии и проктологии и раскрывает способ оценки риска послеоперационных осложнений хирургического лечения геморроя путем исследования крови.

Изобретение относится к медицине, а именно к кардиологии, и касается прогнозирования эссенциальной гипертензии. Для этого из периферической венозной крови пациентов выделяют ДНК с последующей амплификацией полиморфных вариантов CACNA1C G2236129A (rs1006737), CACNA1C G2585485A (rs112532048), CACNA1H G1134967A (rs11865472), CACNA1G G50615794A (rs11079919), CACNB2 C18539252T (rs143326262), RYR2 G237115840T (rs2490389).

Изобретение относится к области биохимии и молекулярной биологии. Предложен набор синтетических олигонуклеотидов для определения последовательности генов главного комплекса гистосовместимости HLA-A, HLA-B, HLA-C, HLA-DQB1, HLA-DRB1 в ходе ПЦР с дальнейшей визуализацией продуктов реакции методом электрофореза в агарозном геле.

Изобретение относится к медицине и может быть использовано для мониторинга возможного стойкого отклонения от нормы энергетического метаболизма эритроцитов и/или нарушения структуры их мембран.

Изобретение относится к области медицины, а именно дерматовенерологии и онкологии, в частности к способу дифференциальной диагностики актинического кератоза и плоскоклеточного рака.
Изобретение относится к области медицины, в частности к онкологии. Предложен способ комбинированного лечения немелкоклеточного рака легкого (НМРЛ) IB - III стадии. В ткани опухоли определяют уровни экспрессии генов монорезистентности. Проводят 2 курса неоадъювантной химиотерапии (НАХТ) путем внутривенного введения дублетов химиопрепаратов по схеме: при RRM1 или TYMS менее 1,0 и АВСС5 менее 0,5 назначают гемцитабин, при ERCC1 менее 0,5 или BRCA1 менее 1,0 назначают карбоплатин, при TUBB3 1,0-5,0 назначают винорелбин, при ТОР2а более 4,0 назначают доксорубицин, при BRCA1 более 1,5 назначают паклитаксел, при ТОР1 более 2,0 назначают иринотекан. После проведения хирургического вмешательства проводят в количестве 3 курсов персонализированную адъювантную химиотерапию дублетами химиопрепаратов, выбор которых осуществляют на основании уровней экспрессии генов монорезистентности в операционном материале ткани опухоли по вышеуказанной схеме НАХТ. Изобретение обеспечивает повышение выживаемости больных за счет снижения частоты местных рецидивов и отдаленных метастазов. 3 пр.
Изобретение относится к медицине, в частности к лабораторной диагностике, ревматологии, ортопедии и травматологии, и может быть использовано для диагностики молекулярных фенотипов остеоартрита. Способ диагностики молекулярных фенотипов остеоартрита включает определение в плазме венозной крови методом иммуноферментного анализа концентрации фактора, индуцированного оксидативным стрессом 1, и интерлейкина 1, при этом, в случае повышения концентрации только фактора, индуцированного оксидативным стрессом 1, диагностируют оксидативный фенотип остеоартрита, при повышении концентрации только интерлейкина 1 диагностируют воспалительный фенотип остеоартрита, при одновременном повышении или нормальных показателях фактора, индуцированного оксидативным стрессом 1, и интерлейкина 1 диагностируют смешанный воспалительно-оксидативный фенотип остеоартрита. 2 пр.

Изобретение относится к области медицины, а именно к гинекологии и репродуктологии, и касается прогнозирования готовности эндометрия к успешной имплантации эмбриона у женщин с маточной формой бесплодия. Для этого на микрофотографии гистологического препарата измеряют площадь и высоту пиноподий, а также площадь сосудов. На основании этих параметров вычисляют прогностический индекс по разработанной формуле. При значениях PI более 0 прогнозируют высокий риск репродуктивных неудач при осуществлении вспомогательных репродуктивных технологий. При значениях PI менее 0 прогнозируют готовность эндометрия к успешной имплантации эмбриона. Способ обеспечивает высокую эффективность прогнозирования репродуктивных удач или неудач за счет объективной оценки рецептивности эндометрия. 5 ил., 3 пр.

Наверх