Аденовирусный вектор, кодирующий гомолог-1 белка atonal человека (hath1)



Аденовирусный вектор, кодирующий гомолог-1 белка atonal человека (hath1)
Аденовирусный вектор, кодирующий гомолог-1 белка atonal человека (hath1)
Аденовирусный вектор, кодирующий гомолог-1 белка atonal человека (hath1)
C12N2710/10043 - Микроорганизмы или ферменты; их композиции (биоциды, репелленты или аттрактанты или регуляторы роста растений, содержащие микроорганизмы, вирусы, микробные грибки, ферменты, агенты брожения или вещества, получаемые или экстрагируемые из микроорганизмов или из материала животного происхождения A01N 63/00; пищевые составы A21,A23; лекарственные препараты A61K; химические аспекты или использование материалов для бандажей, перевязочных средств, впитывающих подкладок или хирургических приспособлений A61L; удобрения C05); размножение, консервирование или сохранение микроорганизмов (консервирование живых тканей или органов людей или животных A01N 1/02); мутации или генная инженерия; питательные среды (среды для микробиологических испытаний C12Q)

Владельцы патента RU 2707131:

ДЖЕНВЕК, ИНК. (US)

Настоящее изобретение относится к области биотехнологии, конкретно к экспрессионным системам терапевтических белков, и может быть использовано в терапии для образования сенсорных клеток во внутреннем ухе человека. Конструируют дефектный по репликации аденовирусный вектор, включающий последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую белок гомолог-1 белка atonal у человека (Hath1), функционально связанную с промотором гена человеческого глиального фибриллярного кислого белка (GFAP). Изобретение позволяет эффективно стимулировать регенерацию сенсорных клеток во внутреннем ухе человека. 3 н. и 12 з.п. ф-лы, 2 ил., 1 пр.

 

Перекрестная ссылка на родственные заявки

По этой заявке на патент испрашивается приоритет временной заявки на патент США с № 62/061748, поданной 9 октября 2014, которая включена посредством ссылки.

Включение посредством ссылки материала, представленного в электронном виде.

В настоящую заявку полностью включен посредством ссылки машиночитаемый список нуклеотидных/аминокислотных последовательностей, представленный одновременно с настоящей заявкой и определенный следующим образом: один ASCII (текстовый) файл размеров 49240 байтов с именем «721767_ST25.TXT», созданный 25 сентября 2015 года.

Предпосылки к созданию изобретения

Большая часть населения мира, вероятно, будет испытывать некоторое снижение слуховой способности или нарушение равновесия в своей жизни. Приблизительно 17 процентов (36 миллионов) взрослых американцев сообщают о некоторой степени потери слуха, и приблизительно 2-3 из каждых 1000 детей в Соединенных Штатах рождаются глухими или слабослышащими (в соответствии со статистикой из Национального института тугоухости и других расстройств коммуникации (NIDCD)).

Как в случае способности слышать, так и в случае равновесия, механические стимулы трансформируются в нервные сигналы волосковыми сенсорными клетками, повреждение которых отвечает за многие виды потери слуха и нарушений равновесия. Механическое повреждение в результате, например, громкого шума, наклоняет волосковые клетки улитки насколько, что волосковая клетка больше не может передавать сигналы на слуховые нервы. Поскольку волосковые клетки млекопитающих не восстанавливаются естественно, может произойти постоянная потеря слуха, если повреждены волосковые клетки. Помимо акустической травмы, которая является основной причиной нарушения слуха, потеря слуха также может быть вызвана наследственными синдромами, бактериальными или вирусными инфекциями, применением отпускаемых по рецепту лекарственных средств, а также пресбиакузисом (потеря слуха, связанная со старческим возрастом). Подобным же образом, нарушения равновесия, особенно вестибулярные расстройства, могут быть вызваны инфекцией, травмой головы, фармацевтическим применением, а также возрастом.

Наиболее распространенные методы лечения потери слуха включают слухопротезирования и кохлеарные имплантаты. Кохлеарные имплантаты получили приблизительно 188000 человек во всем мире, которые включают приблизительно 41599 взрослых и 25500 детей в Соединенных Штатах (в соответствии со статистикой NIDCD). Варианты лечения нарушений равновесия включают переобучение равновесию, лекарственные средства от головокружения или тошноты и вестибулярную реабилитационную терапию. Однако такие методы лечения, вероятно, будут требоваться в течение длительных периодов времени, если нарушение прогрессирует, и многие методы лечения нарушений равновесия не обеспечивают постоянное избавление от головокружения. В настоящее время не существует эффективных фармацевтических методов лечения нарушений, связанных с потерей или повреждением волосковых клеток в ухе.

Таким образом, сохраняется потребность в средствах, которые могут уменьшить интенсивность нарушений, связанных с разрушением или потерей волосковых сенсорных клеток, таких как потеря слуха и нарушения баланса. Настоящим изобретением обеспечивается такое средство.

Краткое изложение сущности изобретения

Настоящее изобретение относится к аденовирусному вектору, включающему геном аденовируса серотипа 5, за исключением того, что две пары оснований делетированы в районе ВА-РНК-1, один или более эндогенных нуклеотидов Е1-района делетированы, чтобы сделать эндогенный ген в Е1-районе функционально дефектным, один или более эндогенных нуклеотидов Е3-района делетированы, и один или более эндогенных нуклеотидов Е4-района делетированы, чтобы сделать эндогенный ген в Е4-районе функционально дефектным, причем инвертированный концевой повтор (ITR) с правой стороны, последовательность полиаденилирования Е4-района и промотор Е4-района сохранены, (b) последовательность раннего полиаденилирования SV40, (с) последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую белок гомолог-1 белка atonal у человека (Hath1), включающий SEQ ID NO:1, (d) промотор гена человеческого глиального фибриллярного кислого белка (GFAP) и (е) транскрипционно инертный спейсер (TIS). Элементы (b), (c) и (d) расположены последовательно от 3' к 5' относительно генома аденовируса в Е1-районе генома аденовируса, а элемент (е) расположен в Е4-районе генома аденовируса между последовательностью полиаденилирования Е4-района и промотором Е4-района.

Настоящее изобретение также относится к композиции и способу с использованием вышеупомянутого аденовирусного вектора для образования сенсорных клеток во внутреннем ухе человека.

Краткое описание нескольких видов чертежей

Фиг. 1 представляет собой схематическую карту плазмиды pAdE1(GFAP.Hath1)E3(10)E4(TIS1).

Фиг. 2 представляет собой схематическую карту аденовирусного вектора AdGFAP.HATH1.11D.

Подробное описание изобретения

Настоящее изобретение основывается, по меньшей мере частично, на обнаружении того факта, что волосковые сенсорные клетки можно образовать путем доставки во внутреннее ухо аденовирусного вектора серотипа 5, который включает последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую белок гомолог-1 белка atonal у человека (Hath1).

Используемый здесь термин «аденовирусный вектор» относится к аденовирусу, в котором геном аденовируса был изменен для размещения последовательности нуклеиновой кислоты, которая является неродной относительно генома аденовируса. Как правило, аденовирусный вектор создают путем введения одной или нескольких мутаций (например, делеции, вставки или замены) в геном аденовируса, чтобы вместить вставку неродной последовательности нуклеиновой кислоты внутри аденовируса.

Источник вирусного генома для аденовирусного вектора представляет собой аденовирус серотипа 5 человека. Аденовирус человека относится к подгруппе А (например, серотипы 12, 18 и 31), подгруппе В (например, серотипы 3, 7, 11, 14, 16, 21, 34, 35 и 50), подгруппе С (например, серотипы 1, 2, 5 и 6), подгруппе D (например, серотипы 8, 9, 10, 13, 15, 17, 19, 20, 22-30, 32, 33, 36-39 и 42-48), подгруппе Е (например, серотип 4), подгруппе F (например, серотипы 40 и 41) или не отнесенной к определенной группе серогруппе (например, серотипы 49 и 51). Аденовирусные серотипы с 1 по 51 включительно (т.е. с Ad1 по Ad51 включительно) доступны из Американской коллекции типовых культур (АТСС, Manassas, Virginia).

Являющийся объектом настоящего изобретения аденовирусный вектор является дефектным по репликации. Для дефектного по репликации аденовирусного вектора требуется комплементация одной или более функций генов или районов генома аденовируса, которые необходимы для репликации, в результате, например, дефекта по одной или более функций генов или районов, необходимых для репликации, так что аденовирусный вектор не реплицируется в типичных клетках-хозяевах, особенно тех клетках у человека, которые инфицируются аденовирусным вектором.

Дефект по функции гена или району генома, в рамках изобретения, определяется как разрушение (например, делеция) достаточного количества генетического материала генома аденовируса, чтобы уничтожить или ухудшить функционирование гена (например, так что уменьшается по крайней приблизительно в 2 раза, в 5 раз, 10 раз, 20 раз, 30 раз или в 50 раз функционирование продукта гена), последовательность нуклеиновой кислоты которого была нарушена (например, делетирована) полностью или частично, тем самым делая ген или геномный район «функционально дефектным». Делеция всего генного района часто не требуется для нарушения функционирования гена, необходимого для репликации. Однако с целью обеспечения достаточного места в геноме аденовируса для одного или более трансгенов может быть желательным удаление большей части одного или более генных районов. В связи с этим, аденовирусный вектор предпочтительно включает геном аденовируса, за исключением того, что один или более эндогенных нуклеотидов одного или более необходимых для репликации генов или районов генома делетированы, чтобы сделать эндогенный ген или район генома функционально дефектным. Хотя делеция генетического материала является предпочтительной, мутация генетического материала также является подходящим для нарушения функционирования гена. Функциями необходимых для репликации генов являются функции таких генов, которые необходимы для репликации (например, размножения) аденовируса и кодируются, например, ранними районами (например, районами E1, E2 и E4), поздними районами (например, L1, L2, L3, L4 и L5) аденовируса, генами, участвующими в упаковке вируса (например, геном IVa2), и вирус-ассоциированными (ВА) РНК (например, ВА-РНК-1 и/или ВА-РНК-2).

В дефектном по репликации аденовирусном векторе предпочтительно сохраняется по меньшей мере часть генома аденовируса. Аденовирусный вектор может включать любую часть генома аденовируса, в том числе, кодирующие белки и не кодирующие белки районы. Аденовирусный вектор может включать последовательность нуклеиновой кислоты, которая кодирует любой подходящий белок аденовируса, такой как, например, белок, кодируемый любым из генов ранних районов (т.е. районов Е1А, Е1В, Е2А, E2B, Е3 и/или Е4), или белок, кодируемый любым из генов поздних районов, которые кодируют вирусные структурные белки (например, районов L1, L2, L3, L4 и L5). В качестве альтернативы, аденовирусный вектор может включать не кодирующие белки районы генома аденовируса, в том числе, например, один или более промоторов, последовательностей терминации транскрипции или последовательностей полиаденилирования генов ранних районов или поздних районов, или одну или более последовательностей инвертированных концевых повторов (ITR). В одном варианте осуществления в являющейся предметом настоящего изобретения аденовирусном векторе сохраняется по меньшей мере инвертированный концевой повтор (ITR) с правой стороны, последовательность полиаденилирования Е4-района и промотор Е4-района.

Дефектный по репликации аденовирусный вектор может быть модифицирован любым подходящим способом, чтобы вызвать дефекты по функциям одного или более необходимых для репликации генов в одном или более районов генома аденовируса для размножения. Комплементация дефектов по функциям одного или более необходимых для репликации генов в одном или более районов генома аденовируса относится к использованию экзогенных средств для обеспечения функционирования функционально дефектных генов, необходимых для репликации. Такая комплементация может быть осуществлена любым подходящим способом, например, с помощью дополняющих клеток и/или экзогенной ДНК (например, аденовируса-помощника), кодирующей нарушенные функции необходимых для репликации генов.

Аденовирусный вектор может быть дефектным по функциям одного или более необходимых для репликации генов только ранних районов (т.е. районов Е1-Е4) генома аденовируса, только поздних районов (т.е. районов L1-L5) генома аденовируса, как ранних, так и поздних районов генома аденовируса, или всех аденовирусных генов (т.е. аденовектор большой емкости (HC-Ad)). Смотрите Morsy et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 95: 965-976 (1998); Chen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 94: 1645-1650 (1997); и Kochanek et al., Hum. Gene Ther., 10: 2451-2459 (1999). Примеры дефектных по репликации аденовирусных векторов описаны в патентах США с № 5837511, 5851806, 5994106, 6127175, 6482616 и 7195896 и публикациях международных заявок на патенты WO 1994/028152, WO 1995/002697, WO 1995/016772, WO 1995/034671, WO 1996/022378, WO 1997/012986, WO 1997/021826 и WO 2003/022311.

Ранние районы генома аденовируса включают районы E1, E2, E3 и E4. Е1-район включает субрайоны Е1А и Е1В, и один или более дефектов по функциям необходимых для репликации генов в Е1-районе могут включать один или более дефектов по функциям необходимых для репликации генов в одном или обоих из субрайонов Е1А и Е1В, в результате чего для размножения аденовирусного вектора (например, для образования частиц аденовирусного вектора) требуется комплементация Е1А-субрайона и/или Е1В-субрайона генома аденовируса. Е2-район включает субрайоны E2A и E2B, и один или более дефектов по функциям необходимых для репликации генов в Е2-районе могут включать один или более дефектов по функциям необходимых для репликации генов в одном или обоих из субрайонов Е2А и Е2В, в результате чего для размножения аденовирусного вектора (например, для образования частиц аденовирусного вектора) требуется комплементация Е2А-субрайона и/или Е2В-субрайона генома аденовируса.

Е3-район не включает какие-либо функции необходимых для репликации генов, так что в случае делеции Е3-района частично или полностью не требуется комплементация каких-либо функций генов в Е3-районе для размножения аденовирусного вектора (например, для образования частиц аденовирусного вектора). В контексте настоящего изобретения Е3-район определяется как район, который начинается с открытой рамки считывания, которая кодирует белок с высокой степенью гомологии с белком 12,5К из Е3-района аденовируса 5 человека (со стандартной последовательностью в NCBI AP_000218) и заканчивается открытой рамкой считывания, которая кодирует белок с высокой степенью гомологии с белком 14,7К из Е3-района аденовируса 5 человека (со стандартной последовательностью в NCBI AP_000224.1). E3-район может быть делетирован полностью или частично, или сохранен полностью или частично. Размер делеции может быть адаптирован таким образом, чтобы сохранить аденовирусный вектор, геном которого точно соответствует оптимальному размеру для упаковки генома. Делеция большего размера будет обеспечивать вставку больших последовательностей гетерологичных нуклеиновых кислот в геном аденовируса. В одном варианте осуществления настоящего изобретения, сохранена сигнальная последовательность полиаденилирования L4-района, которая находится в E3-районе.

Е4-район включает множество открытых рамок считывания (ORF), которые кодируют множество эндогенных генов. В случае аденовирусного вектора с делецией всех открытых рамок считывания Е4-района, за исключением ORF6, а в некоторых случаях ORF3, не требуется комплементация каких-либо функций генов в Е4-районе для размножения аденовирусного вектора (например, для образования частиц аденовирусного вектора). С другой стороны, в случае аденовирусного вектора с нарушением или делецией ORF6, а в некоторых случаях ORF3, Е4-района (например, с дефектом по функции необходимого для репликации гена, базирующегося в ORF6 и/или ORF3 Е4-района), с или без нарушения(ем) или делеции(ей) какой-либо из других открытых рамок считывания Е4-района или родного промотора Е4-района, последовательности полиаденилирования, и/или инвертированного концевого повтора (ITR) с правой стороны, требуется комплементация Е4-района (в частности, ORF6 и/или ORF3 Е4-района) для размножения аденовирусного вектора (например, для образования частиц аденовирусного вектора).

Поздние районы генома аденовируса включают районы L1, L2, L3, L4 и L5. Аденовирусный вектор также может иметь мутацию в главном позднем промоторе (MLP), как описано в публикации международной заявки на патент WO 2000/000628, которая может сделать аденовирусный вектор дефектным по репликации, если это желательно.

Предпочтительно, когда один или более районов генома аденовируса, которые содержат один или более дефектов по функциям необходимых для репликации генов, желательно представляют собой один или более ранних районов генома аденовируса, т.е. районов E1, E2 и/или Е4, необязательно с делецией частично или полностью E3-района.

В одном варианте осуществления один или более эндогенных нуклеотидов Е1-района и Е4-района делетированы в являющемся предметом настоящего изобретения аденовирусном векторе, чтобы сделать эндогенный ген в Е1-районе функционально дефектным и эндогенный гена в Е4-района функционально дефектным (называемый Е1/Е4-дефектным аденовирусным вектором). Являющийся предметом настоящего изобретения аденовирусный вектор может включать делецию функции по меньшей мере одного необходимого для репликации гена Е1-района генома аденовируса, а предпочтительно включает делецию функций всех необходимых для репликации генов Е1-района. В связи с этим, делеция Е1-района являющегося предметом настоящего изобретения аденовирусного вектора может включать делецию промоторов и кодирующих областей эндогенных генов Е1А и Е1В. Делеция Е4-района желательно включает делецию функции по меньшей мере одного необходимого для репликации гена Е4-района, а предпочтительно включает делецию функций всех необходимых для репликации генов Е4-района. В связи с этим, делеция Е4-района являющегося предметом настоящего изобретения аденовирусного вектора может включать делецию всех эндогенных генов Е4-района. В дополнение к делеции Е1-района и Е4-района генома аденовируса, один или более эндогенных нуклеотидов E3-района может быть делетирован в являющемся предметом настоящего изобретения аденовирусном векторе, и предпочтительно являющийся предметом настоящего изобретения аденовирусный вектор включает делецию функции по меньшей мере одного гена несущественного E3-района генома аденовируса (называемый Е1/E3/E4-дефектным аденовирусным вектором). В дополнение к делециям районов Е1, E3 и E4 генома аденовируса серотипа 5, являющийся предметом настоящего изобретения аденовирусный вектор также желательно включает делецию в одной из вирус-ассоциированных (ВА) РНК (например, ВА-РНК-1 и/или ВА- РНК-2). Предпочтительно, являющийся предметом настоящего изобретения аденовирусный вектор включает делецию в районе ВА-РНК-1. Делеция района ВА-РНК-1 может быть любого подходящего размера, но желательно составляет от 1 до 10 пар оснований, предпочтительно от 1 до 5 пар оснований и наиболее предпочтительно от 1 до 3 пар оснований, или находится в диапазоне, определяемом любыми двумя из указанных выше значений. В одном варианте осуществления две пары оснований делетированы в районе ВА-РНК-1 аденовирусного вектора.

В предпочтительном варианте осуществления, геном являющегося объектом настоящего изобретения аденовирусного вектора серотипа 5 включает делецию нуклеотидов 356-3510 Е1-района, включительно, делецию нуклеотидов 28593-30471 Е3-района, включительно, делецию нуклеотидов 32827-35563 Е4-района и делецию нуклеотидов 10594 и 10595 района ВА-РНК-1. Однако другие делеции могут быть соответствующими. Например, нуклеотиды 356-3329 или 356-3510 могут быть удалены для создания дефекта по функциям необходимых для репликации генов Е1-района, и нуклеотиды 28594-30469 могут быть делетированы из E3-района генома аденовируса.

Являющийся объектом настоящего изобретения аденовирусный вектор включает транскрипционно инертный спейсер (TIS). Последовательность транскрипционно инертного спейсера обеспечивает рост множественно дефектного по репликации аденовирусного вектора (например, E1/E4-дефектного аденовирусного вектора) в линии дополняющих клеток, аналогичный тому, который достигается с помощью аденовирусного вектора, дефектного по функции одного необходимого для репликации гена (например, Е1-дефектного аденовирусного вектора). Последовательность TIS может содержать любую нуклеотидную последовательность или последовательности, которые имеют желаемую длину, такие как последовательности из по меньшей мере приблизительно 15 нуклеотидов (например, между приблизительно 15 нуклеотидами и приблизительно 12000 нуклеотидами), предпочтительно от приблизительно 100 нуклеотидов до приблизительно 10000 нуклеотидов, более предпочтительно от приблизительно 500 нуклеотидов до приблизительно 8000 нуклеотидов, еще более предпочтительно от приблизительно 1500 нуклеотидов до приблизительно 6000 нуклеотидов, а наиболее предпочтительно от приблизительно 2000 до приблизительно 3000 нуклеотидов в длину или в диапазоне, определяемом любыми двумя из вышеуказанных значений. Последовательность TIS может быть кодирующей или некодирующей и родной или неродной относительно генома аденовируса, но не восстанавливает необходимую для репликации функцию по отношению к дефектному району. TIS может также содержать экспрессионную кассету.

В одном варианте осуществления транскрипционно инертный спейсер включает последовательность полиаденилирования и/или ген, который является неродным относительно аденовирусного вектора. Спейсерный элемент может включать любую подходящую последовательность полиаденилирования, такую как, например, последовательности полиаденилирования бычьего гормона роста (BGH), полиомавируса, тимидинкиназы (ТК), вируса Эпштейна-Барра (EBV), папилломавируса человека (HPV) и папилломавируса крупного рогатого скота (BPV). Предпочтительно, когда последовательность TIS включает последовательность полиаденилирования обезьяньего вируса-40 (SV40). Примеры подходящих неродных генов для включения в TIS включают, но без ограничения ими, последовательности нуклеиновых кислот, кодирующие маркерные белки, такие как pGUS, секреторная щелочная фосфатаза, люцифераза, β-галактозидаза и человеческий антитрипсин; терапевтические факторы; потенциальные иммуномодуляторы, такие как B3-19K, E3-14.7, ICP47, лиганд fas и CTLA4; биологически неактивные последовательности (например, последовательности, которые (i) не транскрибируется с образованием продукта, или (ii) кодируют дефектный или биологически неактивный продукт); и другие безвредные последовательности (например, ген β-глюкуронидазы).

Предпочтительно, когда TIS включает последовательно расположенные от 5' к 3' относительно генома аденовируса (i) последовательность полиаденилирования (поли(А)) и последовательность терминации транскрипции из обезьяньего вируса 40 (SV40), (ii) последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую ген β-глюкуронидазы, и (iii) последовательность полиаденилирования (поли(А)) и последовательность терминации транскрипции из гена бычьего гормона роста (BGH). Использование транскрипционно инертного спейсера в аденовирусном векторе дополнительно описано, например, в патенте США с № 5851806 и публикации международной заявки на патент WO 1997/021826.

За счет удаления всего или части генома аденовируса, например, одного или более эндогенных нуклеотидов районов Е1, E3 и E4 генома аденовируса, результирующий аденовирусный вектор способен акцептировать вставки экзогенных последовательностей нуклеиновых кислот при сохранении способности быть упакованным в аденовирусные капсиды. Экзогенная последовательности нуклеиновой кислоты может быть вставлена ​​в любое положение в геноме аденовируса при условии, что вставка в этом положении делает возможным образование частицы аденовирусного вектора. Экзогенная последовательность нуклеиновой кислоты предпочтительно располагается в Е1-районе, Е3-районе или Е4-районе генома аденовируса.

Дефектный по репликация аденовирусный вектор согласно настоящему изобретению может быть получен в линиях дополняющих клеток, которые обеспечивают функции генов, не присутствующие в дефектном по репликации аденовирусном векторе, но требуется для размножения вирусов, на соответствующих уровнях в целях получения высоких титров биомассы вирусных векторов. Такие линии дополняющих клеток известны и включают, но без ограничения ими, клетки 293 (описанные, например, в Graham et al., J. Gen., 36: 59-72 (1977)), клетки PER.C6 (описанные, например, в публикации международной заявки на патент WO 1997/000326 и в патентах США с № 5994128 и 6033908), а также клетки 293-ORF6 (описанные, например, в публикации международной заявки на патент WO 95/34671 и Brough et al., J. Virol., 71: 9206-9213 (1997)). Другие подходящие линии дополняющих клеток включают клетки, которые были образованы для размножения аденовирусных векторов, кодирующих трансгены, экспрессия которых ингибирует рост вируса в клетках-хозяевах (смотрите, например, публикацию заявки на патент США с № 2008/0233650). Дополнительные подходящие дополняющие клетки описаны, например, в патентах США с № 6677156 и 6682929, и публикации международной заявки на патент WO 2003/020879. В некоторых случаях клеточный геном может не включать последовательности нуклеиновых кислот, генные продукты которых служат дополнением ко всем дефектам дефектного по репликации аденовирусного вектора. Одна или более функций необходимых для репликации генов, отсутствующих у дефектного по репликации аденовирусного вектора, может обеспечиваться с помощью вируса-помощника, например, аденовирусного вектора, который поставляет in trans одну или более существенных функций генов, необходимых для репликации дефектного по репликации аденовирусного вектора. В качестве альтернативы, являющийся объектом настоящего изобретения аденовирусный вектор может включать неродной необходимый для репликации ген, который служит дополнением к одной или более функций необходимых для репликации генов, отсутствующих у являющегося объектом настоящего изобретения аденовирусного вектора. Например, может быть сконструирован Е1/Е4-дефектный аденовирусный вектор, который содержит последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую ORF6 E4-района, которая получена или происходит из отличного аденовируса (например, аденовируса серотипа, отличного от такового являющегося объектом настоящего изобретения аденовирусного вектора, или аденовируса вида, отличного от такового являющегося предметом настоящего изобретения аденовирусного вектора).

Являющийся объектом настоящего изобретения аденовирусный вектор включает последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую белок гомолог-1 белка atonal у человека (Hathl). Hathl является atonal-ассоциированным (atonal-родственным) фактором. Atonal-ассоциированные факторы являются факторами транскрипции семейства белков основная спираль-петля-спираль (bHLH), которые трансдифференцируют поддерживающие клетки в волосковые сенсорные клетки в ухе. Основной домен белка отвечает за связывания с ДНК и белковую функции. Atonal-ассоциированные факторы найдены у различных животных и насекомых, в том числе мышей (гомолог-1 белка atonal у мышей (Math1)), кур (гомолог-1 белка atonal у кур (Cath1)), Xenopus (гомолог-1 белка atonal в Xenopus (Xath1)) и людей (гомолог-1 белка atonal у человека (Hath1)). Было установлено, что atonal-ассоциированные белки вроде Math1 и Hath1 необходимы для развития волосковых клеток и могут стимулировать регенерацию волосковых клеток в ухе (смотрите, например, Groves et al., Annu. Rev. Neurosci, 36: 361-381 (2013)). Hath1, кроме того, охарактеризованы, например, в Ben-Arie et al., Human Molecular Genetics, 5, 1207-1216 (1996); и Mulvaney, J. and Dabdoub, A, J. Assoc. Res. Otolaryngol., 13(3): 281-289 (2012), а atonal-ассоциированные факторы описаны в общем в международной заявке на патент WO 00/73764.

Нуклеотидная и аминокислотная последовательности Hathl являются общедоступными, например, в виде номеров доступа в GenBank U61148 (GI № 1575354) и AAB41305.1 (GI № 1575355), соответственно. Предпочтительно, являющийся объектом настоящего изобретения аденовирусный вектор включает последовательность нуклеиновой кислоты, включающую SEQ ID NO:1, которая кодирует белок Hath1.

В то время как последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая белок Hath1, включает SEQ ID NO:1, множество модификаций и вариаций (например, мутация) последовательности нуклеиновой кислоты возможно и уместно в контексте настоящего изобретения. Считается, что функция atonal-ассоциированных факторов зависит от части белка спираль-петля-спираль (HLH), в частности, основного района домена HLH (Chien et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 93, 13239-13244 (1996)). Соответственно, любая модификация последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей белок Hath1, желательно расположена вне основного домена белка, так что функция белка Hathl сохраняется или увеличивается.

В дополнение к последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей белок Hathl, являющийся объектом настоящего изобретения аденовирусный вектор предпочтительно включает контролирующие экспрессию последовательности, такие как промоторы, энхансеры, сигналы полиаденилирования, терминаторы транскрипции, внутренние сайты связывания рибосом (IRES) и тому подобное, которые обеспечивают экспрессию последовательности нуклеиновой кислоты в клетке-хозяине. Приводимые в качестве примера контролирующие экспрессию последовательности известны в данной области и описаны, например, в Goeddel, Gene Expression Technology: Methods in Enzymology, Vol. 185, Academic Press, San Diego, California (1990). Идеально, когда кодирующая Hath1 последовательность нуклеиновой кислоты функционально связана с промотором и последовательностью полиаденилирования. Промотор предпочтительно является тканеспецифическим промотором, т.е. промотором, который предпочтительно активируется в данной ткани и приводит к экспрессии генного продукта в ткани, где активизирован. Тканеспецифический промотор для использования в являющемся объектом настоящего изобретения аденовирусном векторе может быть выбран на основе ткани-мишени или типа клеток, в котором кодирующая Hath1 последовательность нуклеиновой кислоты должна экспрессироваться. Предпочтительные тканеспецифические промоторы для использования в являющемся объектом настоящего изобретения аденовирусном векторе являются специфическими для поддерживающих клеток или сенсорных волосковых клеток. Тканеспецифические промоторы, специфически активируемые в волосковых клетках, включают, например, промотор гена белка atonal или промотор гена миозина VIIa. Тканеспецифические промоторы, специфически активируемые в поддерживающих клетках, включают, например, промотор hes-1 и промотор гена человеческого глиального фибриллярного кислого белка (GFAP). В предпочтительном варианте осуществления промотор представляет собой промотор GFAP человека, включающий SEQ ID NO:2. Белок GFAP человек представляет собой растворимый структурный белок, экспрессирумый преимущественно в астроцитах центральной нервной системы, не формирующих миелин шванновских клетках, а также других избранных типах клеток. В анатомии внутреннего уха, экспрессия GFAP в основном ограничивается поддерживающими клетками органов чувств (т.е. клетками Дейтерса и фаланговыми клетками органа Корти, теми, которые расположены в пределах ампул канала, и поддерживающими клетками областей вне стриолы в пятне эллиптического мешочка/сферического мешочка).

Другие примеры тканесецифических промоторов, которые могут быть использованы в настоящем изобретении, включают промотор BRN.3C, промотор BRN 3.1, промотор фактора ORF3 POU, промотор BRK1, промотор BRK3, промотор хордина, промотор ноггина, промотор jagged1, промотор jagged2 и промотор notch1.

Для оптимизации продукции белка, кодирующая Hath1 последовательность нуклеиновой кислоты, кроме того, включает последовательность полиаденилирования 3' от кодирующей Hath1 последовательности. Может быть использована любая подходящая последовательность полиаденилирования, в том числе синтетическая оптимизированная последовательность, а также последовательность полиаденилирования бычьего гормона роста (BGH), полиомавируса, тимидинкиназы (ТК), вируса Эпштейна-Барра (EBV), папилломавируса человека (HPV) и папилломавируса крупного рогатого скота (BPV). Последовательность полиаденилирования предпочтительно представляет собой последовательность раннего полиаденилирования обезьяньего вируса-40 (SV40), которая представляет собой последовательность полиаденилирования для ранних РНК-продуктов SV40 (смотри, например, Carswell, S. and Alwine, J.C., Mol. Cell. Biol., 9(10): 4248-4258 (1989)). В дополнение к промотору и последовательности полиаденилирования, последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая Hath1, желательно включает все требуемые сигналы транскрипции (и сигналы трансляции, где это уместно), которые правильно расположены, так что последовательность нуклеиновой кислоты должным образом экспрессируется в клетках, в которые она введена. При желании, последовательность нуклеиновой кислоты также может включать сайты сплайсинга (т.е. акцепторные и донорные сайты сплайсинга) для облегчения продукции мРНК.

Тканеспецифический промотор, последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая белок Hath1, и последовательность раннего полиаденилирования SV40 могут быть расположен в являющемся объектом настоящего изобретения аденовирусном векторе в любой подходящей ориентации при условии, что продукция аденовирусного вектора не затруднена, и кодирующая Hath1 последовательность нуклеиновой кислоты эффективно экспрессируется в клетках-хозяевах. В общем, промотор будет располагаться 5' от кодирующей Hath1 последовательности нуклеиновой кислоты, а последовательность раннего полиаденилирования SV40 будет располагаться 3' от кодирующей Hath1 последовательности нуклеиновой кислоты. В одном варианте осуществления аденовирусный вектор может включать вышеупомянутые элементы последовательно расположенные от 5' к 3' относительно генома аденовируса: тканеспецифический промотор (например, промотор GFAP человека), последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая белок Hathl, и последовательность раннего полиаденилирования SV40. В качестве альтернативы, аденовирусный вектор может включать вышеупомянутые элементы последовательно расположенные от 3' к 5' относительно генома аденовируса: последовательность раннего полиаденилирования SV40, последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая белок Hath1, и тканеспецифический промотор (например, промотор GFAP человека). Последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая белок Hath1, а также тканеспецифический промотор и ранняя поли(А) последовательность SV40, функционально связанные с ней, могут быть вставлены в любое положение в геноме аденовируса при условии, что вставка в этом положении позволяет формировать частицы аденовирусного вектора. Предпочтительно, когда кодирующая Hath1 последовательность нуклеиновой кислоты расположена в Е1-районе или Е4-районе генома аденовируса. В предпочтительном варианте осуществления Е1-район генома аденовируса заменен последовательностью раннего полиаденилирования SV40, последовательностью нуклеиновой кислоты, кодирующей белок Hath1 и промотором GFAP человека последовательно расположенные от 3' к 5' относительно генома аденовируса.

Являющийся объектом настоящего изобретения аденовирусный вектор может включать последовательность нуклеиновой кислоты, например, SEQ ID NO:3.

Настоящее изобретение относится к композиции, включающей аденовирусный вектор, описанный здесь, и носитель для этой цели (например, фармацевтически приемлемый носитель). Композиция предпочтительно представляет собой физиологически приемлемую (например, фармацевтически приемлемую) композицию, которая включает носитель, предпочтительно физиологически (например, фармацевтически) приемлемый носитель и аденовирусный вектор. Любой подходящий носитель может быть использован в контексте настоящего изобретения, и такие носители хорошо известны в данной области техники. Выбор носителя будет определяться, частично, в соответствии с конкретным применением композиции (например, введением животному) и конкретным способом, используемым для введения композиции. В идеальном случае, в контексте дефектных по репликации аденовирусных векторов, фармацевтическая композиция предпочтительно не содержит компетентного по репликации аденовируса. Фармацевтическая композиция необязательно может быть стерильной.

Подходящие композиции включают водные и неводные изотонические стерильные растворы, которые могут содержать антиоксиданты, буферы и антимикробные добавки, а также водные и неводные стерильные суспензии, которые могут включать суспендирующие агенты, солюбилизаторы, загустители, стабилизаторы и консерванты. Композиция может быть представлена ​​в однодозовых или многодозовых герметичных контейнерах, таких как ампулы и флаконы, и может храниться в высушенном замораживанием (лиофилизированном) состоянии, требующем только добавления стерильного жидкого носителя, например воды, непосредственно перед использованием. Растворы и суспензии для немедленного применения могут быть приготовлены из стерильных порошков, гранул и таблеток. Предпочтительно носитель представляет собой забуференный солевой раствор. Более предпочтительно, аденовирусный вектор является частью композиции, приготовленной для защиты аденовирусного вектора от повреждения до введения. Например, композиция может быть приготовлена для уменьшения потери аденовирусного вектора на устройствах, используемых для приготовления, хранения или введения аденовирусного вектора, таких как изделия из стекла, шприцы или иглы. Композиция может быть получена для уменьшения чувствительности к свету и/или чувствительности к температуре аденовирусного вектора. С этой целью, композиция предпочтительно включает фармацевтически приемлемый жидкий носитель, такой как, например, те, которые описаны выше, и стабилизатор, выбираемый из группы, состоящей из полисорбата 80, L-аргинина, поливинилпирролидона, трегалозы и их комбинации. Использование такой композиции позволит продлить срок годности аденовирусного вектора и облегчить его введение. Препараты содержащих аденовирусный вектор композиций дополнительно описаны, например, в патенте США с № 6225289, патенте США с № 6514943 и публикации международной заявки на патент WO 2000/034444.

Композиция может быть также получена в целях повышения эффективности трансдукции. Кроме того, специалисту со средним уровнем компетентности в данной области техники будет понятно, что аденовирусный вектор может присутствовать в композиции с другими терапевтическими или биологически-активными агентами. Например, факторы, которые контролируют воспалительные процессы, такие как ибупрофен или стероиды, могут быть частью композиции, чтобы уменьшить опухание и воспаление, связанные с in vivo введением аденовирусного вектора. Антибиотики, т.е., бактерициды и фунгициды, могут присутствовать для лечения существующей инфекции и/или снижения риска инфекции в будущем, такой как инфекция, связанная с процедурами переноса генов.

Настоящее изобретение также относится к способу образования сенсорных клеток во внутреннем ухе человека, нуждающегося в этом. Способ включает введение композиции, включающей являющийся объектом настоящего изобретения аденовирусный вектор, описанный здесь, после чего последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая белок Hath1, экспрессируется, и образуются сенсорные клетки во внутреннем ухе. Используемые здесь термины «лечение» и т.п. относятся к получению желаемого фармакологического и/или физиологического эффекта. Предпочтительно, эффект является терапевтическим, т.е. эффект частично или полностью излечивает от заболевания и/или неблагоприятного симптома, связанного с заболеванием. С этой целью способ являющийся объектом настоящего изобретения способ включает введение человеку «терапевтически эффективного количества» композиции. «Терапевтически эффективное количество» относится к количеству, эффективному, в дозах и в течение периодов времени, которые необходимы, для достижения желаемого терапевтического результата. Терапевтически эффективное количество может изменяться в зависимости от таких факторов, как состояние заболевания, возраст, пол и вес индивидуума, а также способности являющего объектом настоящего изобретения аденовирусного вектора вызывать желаемый ответ у индивидуума. Например, терапевтически эффективное количество композиции настоящего изобретения представляет собой количество, которое приводит к экспрессии белка Hath1 на уровне, который лечит потерю слуха или нарушение равновесия у человека.

В качестве альтернативы, фармакологический и/или физиологический эффект может быть профилактическим, т.е. эффект полностью или частично предотвращает заболевание или его симптом. В связи с этим, являющийся объектом настоящего изобретения способ включает введение «профилактически эффективного количества» композиции, включающей являющийся объектом настоящего изобретения аденовирусный вектор. «Профилактически эффективное количество» относится к количеству, эффективному, в дозах и в течение периодов времени, которые необходимы, для достижения желаемого профилактического результата (например, предотвращения начала заболевания). Терапевтическую или профилактическую эффективность можно контролировать с помощью периодической оценки подвергнутых лечению пациентов.

Подходящие дозы и схемы дозирования могут быть определены с помощью обычных методов определения диапазонов, известных специалистам со средним уровнем компетентности в данной области техники. Желательно, когда однократная доза аденовирусного вектора составляет приблизительно 1×105 или более частиц (которые также именуются единицами частиц (pu)) аденовирусного вектора, например, приблизительно 1×106 или более частиц, приблизительно 1×107 или более частиц, приблизительно 1×108 или более частиц, приблизительно 1×109 или более частиц, или приблизительно 3×108 или более частиц аденовирусного вектора. В качестве альтернативы, или в дополнение, однократная доза аденовирусного вектора составляет приблизительно 3×1014 частиц или менее аденовирусного вектора, например, приблизительно 1×1013 частиц или менее, приблизительно 1×1012 частиц или менее, приблизительно 3×1011 частиц или менее, приблизительно 1×1011 частиц или менее, приблизительно 1×1010 частиц или менее, или приблизительно 1×109 частиц или менее аденовирусного вектора. Таким образом, однократная доза аденовирусного вектора может составлять количество частиц аденовирусного вектора в диапазоне, определяемом любыми двумя из вышеуказанных значений. Например, однократная доза аденовирусного вектора может составлять 1×105-1×1014 частиц, 1×107-1×1012 частиц, 1×108-1×1011 частиц, 3×108-3×1011 частиц, 1×109-1×1012 частиц, 1×109-1×1011 частиц, 1×109-1×1010 частиц или 1×1010-1×1012 частиц, аденовирусного вектора. Другими словами, однократная доза аденовирусного вектора может составлять, например, приблизительно 1×106 pu, 2×106 pu, 4×106 pu, 1×107 pu, 2×107 pu, 4×107 pu, 1×108 pu, 2×108 pu, 3×108 pu, 4×108 pu, 1×109 pu, 2×109 pu, 3×109 pu, 4×109 pu, 1×1010 pu, 2×1010 pu, 3×1010 pu, 4×1010 pu, 1×1011 pu, 2×1011 pu, 3×1011 pu, 4×1011 pu, 1×1012 pu, 2×1012 pu, 3×1012 pu, или 4×1012 pu аденовирусного вектора. Конечно, другие пути введения могут требовать меньших или больших доз для достижения терапевтического эффекта. Любые необходимые изменения доз и путей введения могут быть определены специалистом со средним уровнем компетентности, используя обычные методы, известные в данной области техники.

Внутреннее пространство структур внутреннего уха ограничено. Объем фармацевтической композиции, вводимой непосредственно в структуры внутреннего уха, следует тщательно контролировать, поскольку принудительная подача слишком большого количества композиции может привести к повреждению сенсорного эпителия. Для являющегося человеком пациента, вводимый объем составляет предпочтительно от приблизительно 1 мкл до приблизительно 500 мкл (например, от приблизительно 10 мкл до приблизительно 400 мкл) композиции. Например, от приблизительно 10 мкл до приблизительно 200 мкл (например, приблизительно 15 мкл, 20 мкл, 30 мкл, 40 мкл, 50 мкл, 60 мкл, 70 мкл, 80 мкл, 90 мкл, 100 мкл, 125 мкл, 150 мкл, 175 мкл или диапазон, определяемый любыми двумя из вышеуказанных значений) композиции может быть введено. В одном варианте осуществления все жидкое содержимое внутренней структуры уха, например, улитки или полукружных каналов, заменяется фармацевтической композицией. В другом варианте осуществления фармацевтическая композиция, включающая экспрессионный вектор являющегося объектом настоящего изобретения способа, медленно выпускают во внутреннюю структуру уха, так что механическая травма сводится к минимуму.

В одном варианте осуществления являющегося объектом настоящего изобретения способа, композиция, включающая кодирующий Hath1 аденовирусный вектор, желательно вводят только один раз во внутреннее ухо человека в течение определенного периода лечения. Другими словами, являющийся объектом настоящего изобретения способ включает введение однократной дозы являющегося объектом настоящего изобретения аденовирусного вектора во внутреннее ухо человека. В других вариантах осуществления может быть предпочтительным введения композиции два или более (т.е., несколько) раз во внутреннее ухо человека. Таким образом, в настоящем изобретении предусматривается введение двух или более доз являющегося объектом настоящего изобретения аденовирусного вектора во внутреннее ухо человека. Например, композицию, включающую являющийся объектом настоящего изобретения аденовирусный вектор, можно вводить по меньшей мере дважды в одно и тоже ухо. Когда композицию вводят многократно во внутреннее ухо человека, каждое введение может быть отделено на несколько дней, недель, месяцев или даже лет в зависимости от реакции человека на первое и последующие введения композиции. Например, многократные введения могут быть отделены на от приблизительно 1 недели до приблизительно 4 недель (например, 2 или 3 недели), или на от приблизительно 30 дней до приблизительно 90 дней (например, приблизительно 40 дней, приблизительно 50 дней, приблизительно 60 дней, приблизительно 70 дней, приблизительно 80 дней, или диапазон, определяемый любыми двумя из вышеуказанных значений). Однако многократные введения композиции (например, 3, 4, 5, 6 или более введений) могут быть отделены на любое подходящее количество дней (например, 2, 7, 10, 14, 21, 28, 35, 42, 49, 56, 63, 70, 77, 85 или более дней между дозами), месяцев (например, 1, 3, 6 или 9 месяцев между дозами) или лет (например, 1, 2, 3, 4, 5 или более лет между дозами) при условии, что последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая белок Hath1, экспрессируется в достаточной степени, и образуются сенсорные клетки во внутреннем ухе.

Композицию предпочтительно вводят человеку для лечения нарушения, связанного с потерей, повреждением или отсутствием волосковых сенсорных клеток во внутреннем ухе, такого как потеря слуха и нарушения равновесия. В связи с этим, композицию можно вводить человеку, страдающему потерей или нарушением равновесия, или человека, страдающему как потерей слуха, так и нарушением равновесия. Потеря слуха может быть вызвана повреждением волосковых клеток органа Корти вследствие бактериальной или вирусной инфекции, наследственности, физической травмы, акустической травмы, и тому подобное. В то время как потеря слуха легко идентифицируется, нарушения равновесия проявляются в широком разнообразии осложнений, которые могут быть легко приписаны другим недомоганиям. Симптомы нарушения равновесия включают дезориентацию, головокружение, головокружение, тошноту, расфокусированное зрение, неуклюжесть и частые падения. Нарушения равновесия, подвергаемые лечению являющимся объектом настоящего изобретения способом, предпочтительно включают периферическое вестибулярное нарушение (например, нарушение в вестибулярном аппарате) с вовлечением дисфункциональной трансформации механических стимулов в нервные импульсы из-за повреждения или отсутствия волосковых сенсорных клеток. В вариантах осуществления композицию вводят человеку для лечения двусторонней потери слуха от тяжелой степени до полной.

Композицию можно вводить во внутреннее ухо человека, используя любой подходящий способ, известный в данной области техники. Внутреннее ухо у людей состоит из костного лабиринта, который представляет собой систему проходов, состоящую из двух основных частей: (a) улитки, предназначенной для слуха, и (b) вестибулярной системы, предназначенной для равновесия. Композицию желательно вводить в улитку или вестибулярную систему, или как в улитку, так и вестибулярную систему. Независимо от пути введения, являющийся объектом настоящего изобретения аденовирусный вектор должен достигнуть сенсорного эпителия внутреннего уха, например, сенсорного эпителия улитки и/или вестибулярной системы. Наиболее прямые пути введения, следовательно, делают необходимыми хирургические процедуры, которые позволяют получить доступ к внутренней части структур внутреннего уха. Инокуляция посредством кохлеостомии позволяет вводить экспрессионный вектор непосредственно в области внутреннего уха, связанные со слухом. Кохлеостомия включает просверливание отверстия через стенку улитки, например, в слуховой капсуле ниже стремянной артерии, как описано в Kawamoto et al., Molecular Therapy, 4(6), 575-585 (2001), и выпуск композиции, включающей аденовирусный вектор. Введение в эндолимфатический компартмент особенно полезно для введения композиции в области внутреннего уха, отвечающие за слух. Альтернативно, композицию можно вводить в полукружные каналы посредством каналостомии. Каналостомия обеспечивает экспрессию трансгена в вестибулярной системе и улитке, в то время как кохлеостомия не обеспечивает эффективную трансдукцию в вестибулярном пространстве. Риск повреждения функции улитки уменьшается с использованием кохлеостомии, поскольку прямая инъекция в пространство улитки может привести к механическому повреждению волосковых клеток (Kawamoto et al., выше). Процедуры введения также могут быть выполнены под жидкостью (например, искусственной перилимфой), которая может включать факторы, которые облегчают побочные эффекты лечения или процедуры введения, такие как ингибиторы апоптоза или противовоспалительные препараты.

Еще один прямой путь введения во внутреннее ухо через окно улитки, либо путем инъекции или местного нанесения на окно улитки. Введение через окно улитки является особенно предпочтительным для доставки аденовирусного вектора в перилимфатическое пространство. Экспрессия трансгена в кохлеарных и вестибулярных нейронах и сенсорном эпителии улитки наблюдалась после введения экспрессионных векторов через окно улитки (Staecker et al., Acta Otolaryngol, 121, 157-163 (2001)). В другом варианте осуществления композиция может быть введена во внутреннее ухо с помощью внутрилабиринтной (IL) инфузии через окно преддверия для доставки композиции в перилимфатическое пространство. В некоторых случаях может быть целесообразным назначение нескольких нанесений и/или использование несколько путей, например, каналостомии и кохлеостомии, чтобы обеспечить достаточное подвергание поддерживающих клеток воздействию аденовирусного вектора. Особенно предпочтительный способ доставки являющейся объектом настоящего изобретения композиции во внутреннее ухо описан, например, в патенте США с № 7387614.

Композиция, включающая являющийся объектом настоящего изобретения аденовирусный вектор, может присутствовать в или на устройстве, которое делает возможным контролируемое или замедленное высвобождение аденовирусного вектора, таком как губка, сетчатая структура, механический резервуар или насос, или механическом имплантате. Например, биосовместимая губка или гелевая форма, размоченные в композиции, включающей аденовирусный вектор, может быть помещена рядом с окном улитки, через которое экспрессионный вектор проникает с достижением улитки (как описано в Jero et al., Hum. Gene Ther., 12: 539-548 (2001)). В другом варианте осуществления, миниосмотические насосы могут быть использованы для обеспечения замедленного высвобождения аденовирусного вектора в течение продолжительных периодов времени (например, от пяти до семи дней), что позволяет вводить небольшие объемы композиции, включающей аденовирусный вектор, которые могут предотвратить механическое повреждение эндогенных сенсорных клеток. Композицию также можно вводить в виде композиций с замедленным высвобождением (смотрите, например, патент США с № 5378475), включающей, например, желатин, хондроитин сульфат, полифосфоэфир, такой как бис-2-гидроксиэтил-терефталат (BHET), или сополимер молочной и гликолевой кислоты.

Хотя и не предпочтительно, композиция, включающая являющийся объектом настоящего изобретения аденовирусный вектор, может вводиться парентерально, внутримышечно, внутривенно или внутрибрюшинно. В случае парентерального введения пациенту, аденовирусный вектор желательно специфически нацелен на сенсорные эпителиальных клеток, такие как поддерживающие клетки. Например, аденовирусный вектор может быть нацелен на травмированный сенсорный эпителий, чтобы способствовать образованию экзогенных волосковых клеток для замены поврежденных эндогенных волосковых клеток. Аденовирусный вектор может быть модифицирован для изменения специфичности связывания или распознания экспрессионного вектора в отношении рецептора на потенциальной клетке-хозяине путем делеции участков нити, пентона или гексона, вставки различных природных или неприродных лигандов в части белка оболочки, и тому подобное. Специалисту со средним уровнем компетентности в данной области техники будет понятно, что в случае парентерального введения могут потребоваться большие дозы или многократные введения для эффективной доставки экспрессионного вектора в соответствующие клетки-хозяева.

В одном варианте осуществления являющийся объектом настоящего изобретения способ включает введение однократной дозы, составляющей приблизительно от 20 мкл до 90 мкл являющейся объектом настоящего изобретения композиции (в концентрации, составляющей 5,0×1011 частиц (vp)/мл аденовирусного вектора) человеку с помощью внутрилабиринтной (IL) инфузии.

В одном варианте осуществления являющийся объектом настоящего изобретения способ включает введение однократной дозы, составляющей приблизительно от 20 мкл до 90 мкл являющейся объектом настоящего изобретения композиции (в концентрации, составляющей 5,0×1011 частиц (vp)/мл аденовирусного вектора) человеку с помощью внутрилабиринтной (IL) инфузии со скоростью инфузии в диапазоне от приблизительно 10 мкл/минуту до приблизительно 20 мкл/минуту.

Являющийся объектом настоящего изобретения способ может быть частью схемы лечения с применением других терапевтических способов. Например, являющийся объектом настоящего изобретения способ может быть выполнен на человеке, который был подвергнут лечению, проходит лечение или будет подвергнут лечению с помощью одного или более лекарственных средств или хирургического вмешательства. Кроме того, являющийся объектом настоящего изобретения способ может быть использован в сочетании с агентами для пролиферации, которые вызывают пролиферацию поддерживающих клеток во внутреннем ухе, такими как факторы роста сосудистого эндотелия (VEGF), факторы роста фибробластов (FGF), эпидермальный фактор роста (EGF), E2F и активаторы клеточного цикла. Являющийся объектом настоящего изобретения способ также может быть выполнен в сочетании с имплантацией слуховых устройств, таких как кохлеарные имплантаты.

Образование сенсорных клеток (например, волосковых клеток) во внутреннем ухе может быть определено, используя различные способы, известные в данной области техники. Например, сенсорные волосковые клетки могут быть обнаружены с помощью сканирующей электронной микроскопии или через обнаружение миозина VIIa, который является специфическим для волосковых клеток белком, детектируемым с помощью иммунохимии. Однако само по себе присутствие сенсорных волосковых клеток не обязательно подразумевает функциональную систему для распознавания внешних стимулов. Функциональные сенсорные клетки должны быть функционально связаны с нервными путями, так что механические стимулы трансформируются в нервные импульсы, распознаваемые головным мозгом. Соответственно, хотя обнаружение образования волосковых клеток является подходящим для определения успешной экспрессию кодирующей Hath1 последовательности нуклеиновой кислоты в ткани-мишени, предпочтительно, когда образование сенсорных клеток приводит к улучшению чувственного восприятия являющимся человеком субъектом. В связи с этим, исследование осознания субъектом является индикатором изменений чувственного восприятия.

Изменение способности у субъекта улавливать звук можно оценить с помощью назначения простых проверок остроты слуха, например, испытания посылкой тонового сигнала, обычно назначаемого отоларингологом. У большинства млекопитающих, реакция на разные частоты указывает на изменение чувственного восприятия. В случае людей, понимание языка также является целесообразным. Например, возможно, что субъект слышит, будучи не в состоянии понимать речь. На изменение чувственного восприятия указывает способность различать различные типы фоностимулов, например, проведение отличия языка от фонового шума, а также понимание речи. Проверки на порог и разборчивость речи применимы для таких оценок.

Оценка изменений равновесия, осознания движения, и/или измерение времени реакции на двигательные стимулы также могут быть успешно выполнены, используя множество методов. Вестибулярная функция может быть определена путем сравнения величины реакции на двигательный стимул (увеличения) или времени начала ответа (фазы). Животные могут быть проверены на усиление вестибулоокулярного рефлекса (VOR) и его фазы, используя измерительную катушку для склеры для оценки улучшений чувственного восприятия. Электронистагмография (ENG) фиксирует движения глаз в ответ на такие стимулы, как, например, перемещение источника света или вспышки света, изменение положения тела, движение жидкости внутри полукружных каналов, и тому подобное. В связи с этим также полезна оценка равновесия во время движения с использованием вращающегося стула или движущейся платформы.

Следующие примеры дополнительно иллюстрируют настоящее изобретение, но, конечно, их не следует рассматривать как ограничение каким-либо образом его объема.

Пример 1

Этот пример демонстрирует способ создания являющегося объектом настоящего изобретения аденовирусного вектора серотипа 5.

Аденовирусный вектор, включающий геном аденовируса серотипа 5 с делецией районов Е1, E3 и E4 и кодирующий белок Hath1, был сконструирован, используя протокол ADFAST™, описанный, например, в патенте США с № 6475757. Используя процедуру ADFAST™, была сконструирована плазмида, которая кодирует весь геном аденовирусного вектор серотипа 5. Изоляция одного генетического клона с геномом конечного вектора была успешно выполнена с помощью двух последовательных стадий выращивания колоний бактерий. Эта плазмида AdFAST™ была превращена в вирусный вектор при введении в клетки млекопитающих, которые служат дополнением для роста аденовирусного вектора. Затем было выполнено последующее размножение через последовательные пассажи для создания биомассы аденовирусного вектора. Стадии конструирования экспрессирующего Hath1 аденовирусного вектора серотипа 5 кратко описаны ниже.

Конструирование плазмид

Плазмиду, обозначенную pAd3511gfa2.HATH1.sv, расщепляли ферментами рестрикции для экстракции из геля экспрессионной кассеты GFAP.HATH1. Базовую плазмиду, включающую геном аденовируса серотипа 5 геном с делециями в районах Е1, E3 и E4, и транскрипционно инертный спейсер, содержащий поли(А) и последовательность терминации транскрипции из SV40, ген β-глюкуронидазы, и поли(А) и последовательность терминации транскрипции гена бычьего гормона роста (BGH) (обозначенную pAdE1(BN)Е3(10)E4(TIS1)), подвергали линеаризации и очистке. Плазмида pAdE1(BN)Е3(10)E4(TIS1) подвергалась гомологичной рекомбинации с экспрессионной кассетой GFAP.HATH1 в E.coli, с получением плазмиды pAdE1(GFAP.Hath1)Е3(10)E4(TIS1).

Для обеспечения клональности полноразмерной аденовирусной векторной плазмиды, аликвоту плазмидной ДНК ADFAST™ pAdE1(GFAP.Hath1)Е3(10)E4(TIS1) использовали для трансформации DH10B E.coli, с использованием предельных серийных разведений. Четко определенные и изолированные колонии были отобраны с чашки с наибольшим разведением, содержащей наименьшее количество колоний. Минипрепарат плазмидной ДНК получали и расщепляли с помощью HindIII+SpeI для подтверждения целостности плазмиды с помощью ПДРФ-анализа. Соответствующую положительному результату минипрепаративную ДНК использовали для создания другой серии предельных разведений, которые затем были использованы для трансформации DH10B E.coli. Аликвоту жидкой культуры на основе одной колонии на чашке, содержащей наименьшее количество колоний, использовали для получения минипрепаративной ДНК, после чего ApaI использовали для дальнейшего подтверждения целостности плазмиды. Оставшуюся жидкую культуру позитивного клона использовали для посева штрихом на чашку с LB-канамицином. Один бактериальный трансформант размножали для приготовления плазмидной ДНК EndoFree ADFAST™ с помощью набора HISPEED™ Plasmid Maxi (Qiagen, Venlo, Нидерланды) в соответствии с протоколом производителя. Полученный препарат плазмиду подтверждали с помощью расщепления рестрикционными эндонуклеазами BglI, EcoRV, HindIII, KpnI и BamHI+PacI. Карта pAdE1(GFAP.Hath1)Е3(10)E4(TIS1)представлена на фиг. 1. Затем была определена последовательность ДНК pAdE1(GFAP.Hath1)Е3(10)E4(TIS1).

Преобразование вектора

18 мкг не содержащей эндотоксинов pAdE1(GFAP.Hath1)Е3(10)E4(TIS1) расщепляли в 300 мкл с использованием рестрикционной эндонуклеазы PacI и очищали с использованием смеси фенол-хлороформ-изоамиловый спирт (PCI). Вкратце, 100 мкл PCI добавляли к реакции рестрикции, перемешивали путем энергичного перевертывания, центрифугировали при 13000 оборотов/мин в течение двух минут в микроцентрифуге, и верхнюю водную фазу переносили в новую пробирку. ДНК осаждали добавлением 30 мкл (0,1 объема) 5 М NaCl и 800 мкл абсолютного этанола, инкубировали на льду в течение 10 минут, а затем центрифугировали в микроцентрифуге при 13000 оборотов/мин в течение 10 минут, и супернатант сливали. Осадок промывали 500 мкл 70%-ного этанола, центрифугировали, и супернатант сливали, как указано выше, и ДНК-осадок сушили на воздухе. ДНК ресуспендировали в 30 мкл TE, и концентрацию ДНК определяли по оптической плотности при длине волны 260 нм. Клетки 293-ORF6 трансфецировали 4 мкг PacI-расщепленной и очищенной ДНК, используя реагент Polyfect™ (Qiagen, Venlo, Нидерланды), и инкубировали при 37οС, 5% CO2, в течение трех дней. Лизат после трансфекции (полученный с помощью трех циклов замораживания-оттаивания) был использован для инициирования последовательных пассажей для получения лизата с высоким титром. После подтверждения с помощью ПЦР, лизат с высоким титром использовали для размножения аденовектора AdGFAP.HATH1.11D.

Конструирование аденовирусного вектора AdGFAP.HATH1.11D

Для конструирования аденовирусного вектора AdGFAP.HATH1.11D, также называемого GV501A (карта которого представлена на фиг. 2) и CGF166, ADFAST™ плазмиду pAdE1(GFAP.Hath1)Е3(10)E4(TIS1) расщепляли с использованием рестрикционной эндонуклеазы PacI и трансфецировали в клетки 293-ORF6, используя стандартные процедуры. Содержащий аденовектор лизат трансфецированных клеток последовательно пассировали пять раз для увеличения титра и объема лизата AdGFAP.HATH1.11D/GV501 и получения биомассы с высоким титром (НТ2). Клетки 293-ORF6, используемые для трансфекции и конструирования GV501A, поддерживали в помещении для культивирования клеток с ограниченным доступом, чтобы обеспечить отделение от других видов деятельности. Кроме того, трансфекция, последовательные пассажи и продукция вектора AdGFAP.HATH1.11D/GV501A были проведены в отдельной комнате для вирусных культур в соответствии с процедурами, чтобы поддерживать разделение и ограниченный доступ. Идентичность и целостность вектора AdGFAP.HATH1.11D/GV501 подтверждали с помощью ПЦР-анализа на стадии пассажа HT2. Лизат НТ2 затем использовали для получения размножений биомассы аденовектора.

Анализы экспрессии Hath1-трансгена

Вектор AdGFAP.HATH1.11D был сертифицирован в отношении экспрессии функционального трансгена на основе HATH1.11D-задаваемой регенерации сенсорных клеток в модели эллиптического мешочка на мыши. Результаты этого эксперимента показали, что вектор AdGFAP.HATH1.11D был способен вызывать регенерацию сенсорных клеток, и, следовательно, продуцировал функциональный белок HATH1. К тому же, AdGFAP.HATH1.11D был проверен в отношении экспрессии мРНК для Hathl-трансгена с использованием модифицированного анализа экспрессии мРНК для Hathl. Анализ включал в себя инфицирование клеток 293 с использованием AdGFAP.HATH1.11D и выделение тотальной РНК через 24 часа после инфицирования. Экспрессию Hath1-специфической мРНК измеряли с помощью полуколичественного метода ОТ-PCR. Результаты этого анализа показали наличие экспрессии Hath1 на основе РНК/ДНК- и только ДНК-праймеров и зондов, которая наблюдалась.

Результаты этого примера подтверждают создание аденовирусного вектора серотипа 5, в котором были делетированы один или более эндогенных нуклеотидов Е1-района и Е4-района и который включает последовательность раннего полиаденилирования SV40, кодирующую Hathl последовательность нуклеиновой кислоты, функционально связанную с промотором GFAP человека, и транскрипционно инертный спейсер (TIS).

Пример 2

В данном примере описано клиническое исследование, предназначенное для оценки безопасности, переносимости и потенциальной способности CGF166 (AdGFAP.HATH1.11D), доставляемого с помощью внутрилабиринтной (IL) инфузии для улучшения слуха и вестибулярной функции у человека.

Клиническое испытание будет представлять собой состоящее из трех частей открытое исследования с использованием однократной дозы, последовательных когорт пациентов с двусторонней потерей слуха от тяжелой степени до полной с неповрежденной вестибулярной функцией в неподлежащем лечении ухе. Пациенты должны будут иметь документально подтвержденную, не являющуюся неустойчивой двустороннюю потерю слуха от тяжелой степени до полной до зачисления. Максимум 45 пациентов могут быть зачислены в это состоящее из трех частей, включающее шесть когорт испытание.

Часть А испытания будет оценивать безопасность и переносимость, а также потенциальную эффективность после однократной IL дозы - 20 мкл CGF166 с концентрацией (5,0×1011 вирусных частиц (vp)/мл). Зачисление пациентов будет ступенчатым, так что оценка данных, касающихся безопасности, может быть завершена после каждого подвергнутого лечению пациента (приблизительно 4 недели после лечения) перед введением дозы каждому последующему пациенту.

Часть В испытания будет включать план увеличения объема для оценки вплоть до четырех возможных инфузионных объемов (между 20 мкл и 90 мкл) той же концентрации CGF166 (5,0×1011 vp/мл) в четырех когортах пациентов (n=3/когорту, всего 12 пациентов). Все объемы дозы будут изменяться на основе данных, касающихся безопасности испытания.

Каждой последующей когорте дозу будут вводить только после того, как объем, доставленный предыдущей когорте, будет считаться безопасным и переносимым, как определено Комитетом по рассмотрению вопросов безопасности (SRC). Кроме того, (календарное) планирование и дозирование для первого пациента в каждой когорте будет ступенчатым для допуска составляющего по меньшей мере четыре недели интервала между лечением оставшихся двух пациентов в каждой когорте.

Наибольший безопасный и переносимый объем, определенный в части B, будет использоваться для IL инфузии пациентам части C. Всего 20 пациентов потребуется для части С настоящего исследования. Оценка безопасности, аналогичная той, которая описана для частей А и В, будет происходить каждый раз, когда блок из пяти субъектов завершит оценки первых четырех недель исследования.

Пациенты будут проходить одни и те же оценки в соответствии с требованиями протокола и график посещений во всех частях испытания (А-С). Часть C исследования будет начинаться только после установки предварительной безопасности и переносимости CGF166 и связанных с ним методов доставки у пациентов в частях А и В.

Продолжительность испытания будет состоять из 63-дневного периода скрининга с последующим (1-3)-дневным периодом оценки исходного состояния и периода собственной оценки хирургической операции по введению дозы/после такой операции (приблизительно 6-14 дней), а затем 6-месячным периодом оценки после введения дозы. Кроме того, всем подвергнутым введению дозы субъектам в частях A-C будет предлагаться возможность зачисления в отдельное проводимое в течение 5 лет испытание для изучения отдаленных результатов, кающихся безопасности.

В течение периода скрининга, приемлемость потенциальных пациентов будет проверяться в исследовательских центрах.

Потенциальные пациенты будут оцениваться на пригодность до подвергания хирургическому вмешательству в соответствии с требованиями протокола и для запланированной терапии на основе на физикального обследования, ЯМР-томографии, прошлой/текущей истории болезни и лабораторных испытаний. В течение периода скрининга, потенциальные пациенты будут также проходить проверки до начала лечения качества жизни, слуховых способностей и вестибулярных функций.

По меньшей мере два амбулаторных посещения в период скрининга ожидаются для завершения необходимой проверки и оценок. Если все оценки в период скрининга могут быть завершены за одно посещение, то это разрешается. Разрешаются дополнительные амбулаторные посещения в период скрининга (т.е. более двух посещений), обусловленные режимом работы пациентов и клиники и необходимостью перепроверок и возможного повторного тестирования.

На основе скрининга в период скрининга, одно ухо будет выбрано в качестве исследуемого уха и будет подвергнуто требуемому оперативному вмешательству исследования. Критерии отбора исследуемого уха включают: (1) ухо с более тяжелой потерей слуха, как определено с помощью тональной аудиометрии и оценки распознавания речи и (2), если оба уха имеют потерю слуха одинаковой степени тяжести, то исследуемое ухо будет выбрано в соответствии с предпочтением исследователя.

По окончании посещений периода скрининга, для подходящих пациентов будут запланированы посещения для оценки исходного состояния и хирургическое вмешательство.

Исходный уровень (с дня -3 по -1)

Приемлемые пациенты будут возвращаться в исследовательский центр на исходном уровне (с дня -3 по -1) и подвергаться дооперационной подготовке, а также функциональным оценкам до лечения.

Посещение в день 1

В день 1, исследуемые пациенты будут проходить оценки в соответствии с требованиями протокола и подвергаться стапедотамии для доставки исследуемого препарата в перилимфатическое пространство лестницы преддверия внутреннего уха. По завершении хирургического вмешательства и инфузии исследуемого лекарственного средства, исследуемые пациенты будут восстанавливаться в послеоперационном помещении хирургического центра и проходить анализы и оценки после хирургического вмешательства. Исследуемые пациенты могут быть переведены либо в стационарное отделение хирургического центра, либо заранее подготовленное временное жилье недалеко от хирургического центра.

Посещения с дня 2 по день 6

За исследуемыми пациентами будут следить в течение следующих 5 дней после операции (с дня 2 по день 6), и они будут подвергаться оценкам для изучения отдаленных результатов безопасности в соответствии с требованиями протокола. Исследуемые пациенты будут отпущены домой, если у них не будет каких-либо существенных неблагоприятных явлений, требующих длительного наблюдения. Пациенты будут иметь возможность оставаться в предоставленном жилье до завершения посещения в день 14. Последующие визиты будут запланированы вместе с исследуемыми пациентами до их выписки.

Посещение в день 14

Исследуемые пациенты будут возвращаться в исследовательский центр с целью удаления из их уха хирургического тампона, а также будет проходить оценки в соответствии с требованиями исследования. Пациенты будут отпущены домой или в их местное жилье в конце всех оценок в соответствии с требованиями исследования. Пациентам будут напоминать об их следующем запланированном посещении.

Посещения с целью изучения отдаленных результатов и их завершение (каждые четыре недели)

Во время каждого ежемесячного посещения исследовательского центра, послеоперационное восстановление исследуемого уха будет контролироваться и оцениваться. Исследуемые пациенты также будут проходить проверки безопасности, качества жизни, слуховых способностей и вестибулярных функций в соответствии с требованиями, во время каждого посещения. Образцы крови для анализа биораспределения также будут собираться во время каждого посещения. Образцы для проверки иммуногенности будут собираться в соответствии протоколом забора крови. По завершении посещения через шесть месяцев после операции (окончании посещений исследования), если не существует каких-либо существенных неблагоприятных событий, требующих длительного наблюдения, исследуемые пациенты будут считаться завершими исследование и будет выписаны домой.

Будут ожидать, что все подвергнутые введению доз пациенты будут участвовать в отдельном продленном испытании/испытании с целью изучения отдаленных результатов.

Оценки данных, касающихся безопасности.

Перед введением дозы каждому пациенту в части А (когорты 1) и перед введением дозы двум оставшимся пациентам в части В (когорт 2-5), будет проводиться оценка всех данных, касающихся безопасности и переносимости, а также оценка отдельных слуховых способностей и вестибулярных функций. Данные, анализируемые для оценки, будут теми, которые доступны вплоть до четырех недель после введения дозы, как указано в регламенте SRC. Безопасность и переносимость должны быть оценены как удовлетворительные для того, чтобы перейти к остальным пациентам в когорте. Для когорт 2-5, решение о введение дозы оставшимся двум пациентам будет приниматься SRC. Если заметные нежелательные явления или проблемы безопасности обнаруживаются на одном из запланированных уровней доз, следующий запланированный уровень дозы может быть изменен.

После завершения работы с одной когортой и до перехода к следующей когорте, будет выполняться оценка всех данных, касающихся безопасности и переносимости, а также данных, касающихся ограниченных слуховых способностей и вестибулярных функций, для всех пациентов, получивших дозу CGF166 и завершивших оценки по меньшей мере 4 недель исследования. Безопасность и переносимость должны быть оценены как удовлетворительные для того, чтобы перейти к следующей когорте. Это решение будет приниматься SRC. В случае обнаружения заметных нежелательных явлений или проблем безопасности на одном из запланированных уровней доз, следующий запланированный уровень дозы может быть изменен.

Для части C, оценка безопасности, описанная выше, будет выполняться, когда каждые пять субъектов завершат свои оценки первых четырех недель исследования.

Результаты

Каждый из первых пациентов, подвергнутых лечению от 20 до 40 мкл композиции настоящего изобретения, в когортах A, B и C сообщил о 0-3 неблагоприятных явлениях - все отнесены к легкой-средней степени тяжести - на протяжении 2-6 месяцев последующего врачебного наблюдения. Не было подозрений, что большинство неблагоприятных явлений, в том числе все явления, отнесенные к средней степени тяжести, связаны с лечением. Кроме того, не было клинически значимых изменений лабораторных показателей после лечения композицией. Эти результаты указывают на то, что являющаяся объектом настоящего изобретения композиция безопасна при введении человеку.

В этом примере описан клинический протокол, предназначенный для оценки безопасности и эффективности являющегося объектом настоящего изобретения аденовирусного вектора для лечения потери слуха у людей.

Все ссылки, включая публикации, заявки на патенты и патенты, приведенные здесь, включены сюда посредством ссылки в той же степени, как если бы было отдельно и конкретно указано, что каждая ссылка включена посредством ссылки, и как если бы она была изложена здесь в полном объеме.

Использование терминов «а», и «an», и «the», и «по меньшей мере один», и подобных ссылок в контексте описания настоящего изобретения (особенно в контексте нижеследующей формулы изобретения) должно толковаться как охватывание как единственного, так и множественного числа, если иное не указано здесь или явно не противоречит контексту. Использование термина «по меньшей мере один» с последующим списком из одного или нескольких элементов (например, «по меньшей мере один из А и В») должен быть истолкованы в смысле одного элемента, выбираемого из перечисленных элементов (А или В), или любой комбинации из двух или более перечисленных элементов (А и В), если иное не указано здесь или явно не противоречит контексту. Термины «включающий», «имеющий», «включающий» и «содержащий» должны быть истолкованы как открытые термины (т.е. означающие «включающий, но без ограничения этим»), если не указано иное. Указание диапазонов значений здесь просто предназначено для использования в качестве стенографического способы ссылки индивидуально на каждую отдельную величину, попадающую в этот диапазон, если здесь не указано иное, и каждое отдельное значение включено в описание, как если бы оно было индивидуально указано здесь. Все описанные здесь способы могут быть выполнены в любом подходящем порядке, если здесь не указано иное, или иное явно не противоречит контексту. Использование любых и всех примеров, или иллюстративная формулировка (например, «такой как»), предусмотренная здесь, предназначено только для лучшего освещения настоящего изобретения и не накладывает ограничений на объем настоящего изобретения, если не заявлено иное. Ни одна формулировка в описании не должна быть истолкована как указание на какой-либо не заявленный элемент как существенный для практического осуществления настоящего изобретения.

Здесь описаны предпочтительные варианты осуществления настоящего изобретения, в том числе лучший вариант, известный авторам настоящего изобретения, для осуществления изобретения. Вариации этих предпочтительных вариантов осуществления могут стать очевидными специалистам со средним уровнем компетентности в данной области техники после прочтения приведенного выше описания. Авторы настоящего изобретения полагают, что квалифицированные специалисты будут использовать такие вариации в зависимости от обстоятельств, и авторы настоящего изобретения подразумевают, что настоящее изобретение будет осуществлено на практике иначе, чем конкретно описано здесь. Соответственно, это изобретение включает все модификации и эквиваленты предмета изобретения, изложенного в прилагаемой к этому описанию формуле изобретения, в соответствии с применяемой правовой нормой. Кроме того, любая комбинация вышеописанных элементов во всех их возможных вариантах охватывается настоящим изобретением, если иное не указано здесь, или иное явно не противоречит контексту.

1. Аденовирусный вектор для экспрессии белка гомолога-1 белка atonal у человека (Hath1), включающий

(а) геном аденовируса серотипа 5, за исключением того, что две пары оснований делетированы в районе ВА-РНК-1, один или более эндогенных нуклеотидов Е1-района делетированы, чтобы сделать эндогенный ген в Е1-районе функционально дефектным, один или более эндогенных нуклеотидов Е3-района делетированы, и один или более эндогенных нуклеотидов Е4-района делетированы, чтобы сделать эндогенный ген в Е4-районе функционально дефектным, причем инвертированный концевой повтор (ITR) с правой стороны, последовательность полиаденилирования Е4-района и промотор Е4-района сохранены,

(b) последовательность раннего полиаденилирования SV40,

(с) последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую белок гомолог-1 белка atonal у человека (Hath1), включающий SEQ ID NO:1,

(d) промотор гена человеческого глиального фибриллярного кислого белка (GFAP) и

(е) транскрипционно инертный спейсер (TIS),

причем элементы (b), (c) и (d) расположены последовательно от 3' к 5' относительно генома аденовируса в Е1-районе генома аденовируса, и причем элемент (е) расположен в Е4-районе генома аденовируса между последовательностью полиаденилирования Е4-района и промотором Е4-района.

2. Аденовирусный вектор по п.1, в котором геном аденовируса не включает эндогенные промоторы и кодирующие области генов Е1А и Е1В.

3. Аденовирусный вектор по п.2, в котором геном аденовируса не включает эндогенные нуклеотиды 356-3510, включительно, Е1-района генома аденовируса серотипа 5.

4. Аденовирусный вектор по любому из пп. 1-3, в котором геном аденовируса не включает эндогенные нуклеотиды 28593-30471, включительно, Е3-района генома аденовируса серотипа 5.

5. Аденовирусный вектор по любому из пп. 1-4, в котором геном аденовируса не включает любую из кодирующих последовательностей Е4-района.

6. Аденовирусный вектор по п.5, в котором геном аденовируса не включает эндогенные нуклеотиды 32827-35563, включительно, Е4-района генома аденовируса серотипа 5.

7. Аденовирусный вектор по любому из пп. 1-6, в котором делецией двух пар оснований в районе ВА-РНК-1 является делеция эндогенных нуклеотидов 10594 и 10595 генома аденовируса серотипа 5.

8. Аденовирусный вектор по любому из пп. 1-7, в котором промотор гена человеческого глиального фибриллярного кислого белка (GFAP) включает SEQ ID NO:2.

9. Аденовирусный вектор по любому из пп. 1-8, в котором транскрипционно инертный спейсер (TIS) включает последовательно расположенные от 5' к 3' относительно генома аденовируса (i) последовательность полиаденилирования (поли(А)) и последовательность терминации транскрипции из обезьяньего вируса 40 (SV40), (ii) последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую ген β-глюкуронидазы, и (iii) последовательность полиаденилирования (поли(А)) и последовательность терминации транскрипции из гена бычьего гормона роста (BGH).

10. Аденовирусный вектор по любому из пп. 1-9, который включает последовательность нуклеиновой кислоты SEQ ID NO:3.

11. Композиция для образования сенсорных клеток во внутреннем ухе человека, включающая аденовирусный вектор по любому из пп. 1-10 и фармацевтически приемлемый носитель.

12. Способ стимуляции регенерации сенсорных клеток во внутреннем ухе человека, нуждающегося в этом, который включает введение композиции по п.11 во внутреннее ухо человека, после чего последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая белок Hath1, экспрессируется, и образуются сенсорные клетки во внутреннем ухе.

13. Способ по п.12, в котором композицию вводят человеку, страдающему потерей слуха.

14. Способ по п.12, в котором композицию вводят человеку, страдающему нарушением равновесия.

15. Способ по любому из пп. 12-14, в котором композицию вводят один раз во внутреннее ухо человека.



 

Похожие патенты:

Изобретение относится к области биотехнологии, а именно к получению популяции человеческих индуцированных плюрипотентных стволовых клеток (hiPSC), поддержанию hiPSC, модификации целевого геномного локуса в hiPSC и композиции для культивирования и поддержания hiPSC.

Данное изобретение относится к области геномной инженерии. Предложен способ мультиплексирования инсерций экзогенных последовательностей нуклеиновых кислот в ДНК клетки, экспрессирующей РНК-направляемый ДНК-связывающий белок из системы CRISPR II типа, включающий введение в клетку нескольких гидРНК, комплементарных различным сайтам ДНК, и нескольких экзогенных последовательностей донорных нуклеиновых кислот, получая несколько изменений ДНК клетки, и повторение указанной стадии множество раз.

Изобретение относится к области биотехнологии, молекулярной биологии и вирусологии. Предложен нереплицируемый, поглощаемый клеткой рабдовирус, представляющий собой вирус везикулярного стоматита, причем указанный вирус получен путем воздействия на живой вирус УФ излучением, применяемым в дозе от 100 мДж/см2 до 1000 мДж/см2, так что по меньшей мере 0,05%, но не более 80% нуклеотидов РНК вируса сшивается и/или РНК вируса расщепляется на по меньшей мере две дискретные полинуклеотидные последовательности, и при этом поверхность оболочки вирусной частицы содержит по меньшей мере 5% от числа G белков вирусной частицы дикого типа.

Изобретение относится к области биотехнологии, а именно к получению одногормональных инсулинположительных клеток. Способ, за исключением способа, в котором клетки поджелудочной железы передней кишки и клетки энтодермы поджелудочной железы получены с использованием человеческих эмбрионов, включает дифференцировку клеток поджелудочной железы передней кишки, экспрессирующих PDX-1 и NKX6.1, в клетки энтодермы поджелудочной железы путем обработки клеток поджелудочной железы передней кишки, экспрессирующих PDX-1 и NKX6.1, ингибитором shh, низкой дозой ретиноевой кислоты и аскорбиновой кислотой.

Изобретение относится к биотехнологии. Описаны способы для модулирования экспрессии целевой нуклеиновой кислоты в клетке, включающие применение множества ортогональных белков Cas9 для того, чтобы одновременно и независимо регулировать соответствующие гены или одновременно и независимо редактировать соответствующие гены.

Изобретение относится к области биотехнологии. Описана группа изобретений, включающая соединение для снижения количества РНК прекалликреина (ПКП), содержащее модифицированный олигонуклеотид, содержащий по меньшей мере одну модифицированную межнуклеозидную связь, модифицированный сахар или модифицированное основание, и группу конъюгата, соль вышеуказанного соединения, фармацевтическую композицию для лечения, предупреждения или облегчения протекания заболевания, расстройства или состояния, связанного с ПКП, пролекарство для снижения количества РНК прекалликреина (ПКП), применение соединения, соли, фармацевтической композиции или пролекарства для предупреждения, лечения или облегчения заболевания, расстройства или состояния, связанного с ПКП.

Изобретение относится к области биотехнологии, конкретно к получению антибактериальных рекомбинантных белков, и может быть использовано в медицине в качестве антибактериальной композиции, проявляющей активность в отношении грамотрицательных бактерий Pseudomonas aeruginosa.

Изобретение относится к биотехнологии. Описано соединение, содержащее модифицированный олигонуклеотид, состоящий из 12-30 связанных нуклеозидов и имеющий последовательность нуклеотидных оснований, содержащую часть из по меньшей мере 8, по меньшей мере 9, по меньшей мере 10, по меньшей мере 11, по меньшей мере 12, по меньшей мере 13, по меньшей мере 14, по меньшей мере 15, по меньшей мере 16, по меньшей мере 17, по меньшей мере 18, по меньшей мере 19 или по меньшей мере 20 последовательных нуклеотидных оснований, комплементарных:(a) части равной длины нуклеотидных оснований 1053-1109 SEQ ID NO: 1;(b) части равной длины нуклеотидных оснований 606-656 SEQ ID NO: 1;(c) части равной длины нуклеотидных оснований 1693-1767 SEQ ID NO: 1;(d) части равной длины нуклеотидных оснований 1789-1826 SEQ ID NO: 1;(e) части равной длины нуклеотидных оснований 1844-1877 SEQ ID NO: 1;(f) части равной длины нуклеотидных оснований 1957-1988 SEQ ID NO: 1;(g) части равной длины нуклеотидных оснований 2291-2350 SEQ ID NO: 1;(h) части равной длины нуклеотидных оснований 3082-3141 SEQ ID NO: 1;(i) части равной длины нуклеотидных оснований 3903-3946 SEQ ID NO: 1;(j) части равной длины нуклеотидных оснований 4005-4054 SEQ ID NO: 1 или(k) части равной длины нуклеотидных оснований 4429-4454 SEQ ID NO: 1;причем модифицированный олигонуклеотид содержит по меньшей мере одну модификацию, выбранную из модифицированного сахарида и модифицированной межнуклеозидной связи, и причем модифицированный олигонуклеотид способен снижать уровни мРНК атаксина 2.

Настоящее изобретение относится к биотехнологии. Предложены композиции и системы, содержащие векторы, включающие полинуклеотидные последовательности, кодирующие компоненты комплекса CRISPR-Cas типа II, а также набор, содержащий одну из таких композиций или систем.

Изобретение относится к области биотехнологии. Описана группа изобретений, включающая соединение для ингибирования экспрессии фактора комплемента В (CFB) (варианты), фармацевтическую композицию для лечения заболевания, связанного с дисрегуляцией альтернативного пути комплемента у субъекта, способ лечения заболевания, связанного с дисрегуляцией альтернативного пути комплемента у субъекта, применение вышеуказанного соединения или композиции для лечения заболевания, связанного с дисрегуляцией альтернативного пути комплемента, применение вышеуказанного соединения или композиции при изготовлении лекарственного средства для лечения заболевания, связанного с дисрегуляцией альтернативного пути комплемента.

Изобретение относится к биотехнологии и представляет собой способ количественного определения антител, которые связываются с AAV, in vitro, включающий: (a) получение инфекционных частиц рекомбинантного AAV, содержащих рекомбинантный вектор AAV, причем рекомбинантный вектор AAV содержит репортерный трансген, где репортерный трансген содержит (a) одноцепочечный или самокомплементарный геном, (b) является функционально связанным с одним или более регуляторными элементами экспрессии, и (c) является фланкированным одним или более фланкирующими элементами;(b) получение биологического образца от индивидуума; (c) получение клеток, которые можно инфицировать указанными инфекционными частицами рекомбинантного AAV; (d) приведение в контакт или инкубирования инфекционных частиц рекомбинантного AAV (a) с биологическим образцом (b), получая таким образом, получаемую смесь (M); (e) приведение клеток в контакт (c) с получаемой смесью (M) в условиях, в которых инфекционные частицы рекомбинантного AAV (a) могут инфицировать и экспрессировать репортерный трансген в указанных клетках; (f) измерение экспрессии репортерного трансгена и (g) сравнение указанной экспрессии репортерного трансгена (f) с репортерным трансгеном отрицательного (-) контроля, (i) не содержащего антитела, которые связываются с AAV, и (+) контроля, (ii) содержащего предопределенное количество антител, которые связываются с AAV, с количественным определением, таким образом, антител в биологическом образце, которые связываются с AAV.

Настоящее изобретение относится к биотехнологии. В частности, изобретение относится к терапии злокачественных опухолей человека.

Изобретение относится к области биотехнологии, конкретно к векторам на основе серотипа AAV-Rh74 аденоассоциированного вируса (AAV), содержащим полинуклеотидную последовательность, кодирующую фактор IX человека, и может быть использовано в медицине.

Предложенная группа изобретений относится к области медицины. Предложен аденовирусный вектор для стимулирования пептидоспецифичного иммунного ответа у субъекта, содержащий полипептиды, присоединенные к вирусному капсиду, выбранные из группы, состоящей из полипептидов, специфичных в отношении главного комплекса гистосовместимости класса I (MHC-I), или полипептидов, специфичных в отношении главного комплекса гистосовместимости класса II (MHC-II), которые являются опухолеспецифичными.
Изобретение относится к области медицины. Предложен способ регенерации нервных волокон кровеносных сосудов генным стимулированием ангиогенеза.

Предложенная группа изобретений относится к области медицины. Предложены способы доставки защитной изоформы ApoE и кодирующей ее нуклеиновой кислоты в центральную нервную систему млекопитающего.

Группа изобретений относится к области медицины. Предложена нуклеиновая кислота, способствующая выживаемости фоторецепторов, содержащая последовательность нуклеотидов, которая кодирует белок RdCVF человека, и вторую последовательность нуклеотидов, которая кодирует сигнальную последовательность Igk, функционально связанную с последовательностью нуклеотидов, кодирующей белок RdCVF человека, где последовательность, кодирующая RdCVF человека, содержит перекодированную последовательность нуклеотидов.

Изобретение относится к области медицины. Предложен способ стимулирования ангиогенеза, в котором в область ишемии вводят трансдуцированные комбинацией Ad VEGF + Ad Ang мононуклеарные клетки крови пуповины.

Изобретение относится к области биотехнологии, конкретно к получению вектора экспрессии, содержащего (а) нуклеотидную последовательность С68 и (б) мультиантигенную конструкцию ДНК, кодирующую иммуногенные полипептиды простатоассоциированных антигенов (РАА), что может быть использовано в медицине.

Предложенное изобретение относится к области биотехнологии. Предложен рекомбинантный аденовирус для обнаружения раковых клеток или диагностики рака, содержащий репликативную кассету, маркерную кассету, ген, который кодирует связывающий CD46 фибриллярный белок.

Согласно настоящему изобретению предложена комбинация, содержащая по меньшей мере онколитический вирус и один или более чем один модулятор иммунологической контрольной точки для применения для лечения пролиферативного заболевания, такого как рак.

Настоящее изобретение относится к области биотехнологии, конкретно к экспрессионным системам терапевтических белков, и может быть использовано в терапии для образования сенсорных клеток во внутреннем ухе человека. Конструируют дефектный по репликации аденовирусный вектор, включающий последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую белок гомолог-1 белка atonal у человека, функционально связанную с промотором гена человеческого глиального фибриллярного кислого белка. Изобретение позволяет эффективно стимулировать регенерацию сенсорных клеток во внутреннем ухе человека. 3 н. и 12 з.п. ф-лы, 2 ил., 1 пр.

Наверх