Использование молекулярных маркеров il-3, il-33 и il12ρ40 для характеристики степени тяжести респираторных инфекций, вызванных респираторно-синцитиальным вирусом человека и метапневмовирусом человека

Изобретение относится к биотехнологии и определению респираторных заболеваний с помощью молекулярных маркеров в качестве средства прогнозирования развития случаев респираторных инфекций. Профиль экспрессии гена молекулярных маркеров может определяться в биологических образцах посредством анализа ELISA, проточной цитометрии или PCR в реальном времени. На основании подтверждения этиологического фактора инфекции вместе с определением профиля молекулярных маркеров IL-3, IL-33 и IL12p40 будет прогнозироваться тяжесть заболевания. 2 н. и 1 з.п. ф-лы, 5 ил., 1 табл., 1 пр.

 

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Настоящее изобретение относится к использованию молекулярных маркеров в качестве средства обнаружения развития случаев респираторных инфекций. В частности, в процессе дифференциальной диагностики респираторных инфекций, вызванных респираторно-синцитиальным вирусом (SRV) и метапневмовирусом человека (MPV).

В частности, настоящее изобретение описывает использование маркеров IL-3, IL-12p40 и IL-33 для прогнозирования возникновения случаев рецидивирующих респираторных инфекций после бронхиолита, вызванных SRV.

ПРЕДЫДУЩИЙ УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

Респираторно-синцитиальный вирус (SRV) является наиболее широко распространенной причиной инфекции дыхательных путей и первопричиной госпитализации вследствие острой инфекции нижних дыхательных путей у грудных детей. Бронхиолит, вызванный SRV, связан с астмой и рецидивирующей бронхиальной обструкцией, тем не менее, объяснение механизмов, которые связаны с этим, не выявлено.

SRV представляет собой оболочечный вирус, который относится к семейству Paramyxoviridae и является одним из наиболее широко распространенных этиологических факторов острых инфекций дыхательных путей, вызывающих сверх нагрузку на системы общественного здравоохранения.

SRV приводит к заболеванию нижних дыхательных путей у пациентов любого возраста, с большей степенью тяжести инфекции у грудных детей младше 6 месяцев, в частности, у пациентов с хроническими или основными заболеваниями. У большинства грудных детей с бронхиолитом, вызванным SRV, в течение первых месяцев жизни развивается рецидивирующая бронхиальная обструкция и астма, но четкое определение конкретных механизмов, задействованных в иммунопатогенезе бронхиолита SRV, до сих пор отсутствует. Более того, текущие клинические параметры не позволяют прогнозировать возможность возникновения некоторых из этих хронических заболеваний позже у грудных детей, после того, как они переболели бронхиолитом, вызванным SRV.

Воспаление, вызванное этим вирусом, характеризуется наличием масштабной инфильтрации клеток в нижних дыхательных путях, преимущественно нейтрофилов. Такие изменения в легких были описаны как возникновение инфекции, вызванной SRV в эпителиальных клетках дыхательных путей, альвеолярных макрофагов и периферийных кровяных нейтрофилов, которая вызывает выделение определенных цитокинов и хемокинов. Эти молекулы характеризуются хемотактическими свойствами в отношении воспалительных клеток и других типов клеток. Дисбаланс цитокинов типа Th1/Th2 также был рассмотрен как ключевое событие при воспалении с миграцией клеток в результате инфекции, вызванной SRV, что может быть опосредовано эозинофилами и другими клетками, которые относятся к аллергической индукции, например, базофилы и мастоциты, которые могут способствовать развитию астмы. Более того, известно, что некоторые цитокины, образованные эпителиальными клетками дыхательных путей, непосредственно задействованы в аллергической индукции и астме, включая IL-25, IL-33 и тимусный стромальный лимфопоэтин (TSL).

Некоторые документы в отношении предыдущего уровня техники предусмотрены по использованию маркеров в качестве средства дифференциальной диагностики респираторных заболеваний, среди них: заявка на патент WO 2012169887 A2 относится к способу прогнозирования степени тяжести SRV, тем не менее, данный документ позволяет работать с маркерами OLFM4, CD177, ММР8, ММР9, РТХ3, IL-8, RANTES и CD4, а также их комбинациями, без указания использования маркеров IL-3, IL-12p40 и IL-33. В настоящем документе не подразумевается, что цитокины IL-33, IL12p40 или IL-3 имеют отношение к пациентам, у которых была обнаружена рецидивирующая бронхиальная обструкция или возможность развития астмы в будущем после заражения инфекцией, вызванной SRV.

В документе ЕР 1867734 А1 представлено описание использования молекулярных маркеров для диагностики и прогнозирования заболеваний. Тем не менее, заболевания, в отношении которых он предусмотрен, относятся к цереброваскулярному типу, он не относится к маркерам для диагностики респираторных заболеваний.

Верхние и нижние части дыхательных путей были проанализированы в ходе нескольких исследований при бронхиолите SRV у грудных детей. Цель настоящего изобретения состоит в раскрытии вариантов использования цитокинов IL-3, IL-12р40 и IL-33, молекулярных маркеров для прогнозирования возникновения рецидивирующей бронхиальной обструкции в будущем (IL-3 и IL12p40) или вероятного развития астмы (IL-33) на более поздних этапах жизни этих грудных детей из-за бронхиолита, вызванного заражением SRV.

ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ

Фиг. 1. На фиг. 1 показан профиль получения цитокинов и хемокинов в жидкостях бронхоальвеолярных выделений (BALF) пациентов, зараженных SRV, по сравнению с контрольными группами. Определялась концентрация цитокинов и хемокинов в BALF грудных детей с бронхиолитом SRV и здоровых грудных детей в качестве контрольной группы, подверженных люминесцентному анализу. Концентрация цитокинов и хемокинов выражается в пг/мл и разделяются по группам согласно их вероятного среднего значения и диапазона их сравнения. Значимость бронхиолита посредством сравнения SRV (N=14) с грудными детьми в контрольной группе (N=5) определена с помощью непараметрического U-критерия Манна-Уитни (*значение Р<0,05 рассматривалось как статистически значимое). Получение IL-3, IL-4, IL-10 и IL-13 (a), IL-1β, IL-6, IL-7 и TNF-β (b), хемокинов CCL2/MCP-1, CCL3/MIP 1α, эотаксина и IL-8 (с), а также IL-12p40, IL-12р70, IFN-γ и EL-17 (d) анализировалось в образцах BALF.

Фиг. 2. На фиг. 2 показаны профили получения цитокинов и хемокинов в образцах носоглоточных аспиратов (NPA) пациентов, зараженных SRV, по сравнению с лицами в контрольной группе. Экспрессия переносчика в NPA грудных детей с бронхиолитом SRV (N=14) сравнивалась с грудными детьми в контрольной группе (N=5) посредством относительного количественного определения (RQ) с помощью линейных разрушаемых зондов в количественной RT-PCR. Использовались специальные линейные разрушаемые зонды для амплификации цитокинов IL-1α, IL-1β, TNFα, IL-6 и IL-8 (а); хемокинов CXCL10, CCL2/MCP-1, CCL3/MIP-1α и CCL4/MIP-1β (b). Относительные концентрации переносчиков были выражены в виде увеличения частоты по отношению к относительной индукции в контрольных группах. Средние и вероятные значения показаны в виде горизонтальной полосы и прямоугольников соответственно (значение Р<0,05 рассматривалось как статистически значимое).

Фиг. 3. На фиг. 3 показано получение цитокинов и хемокинов в образцах BALF грудных детей с бронхиолитом SRV по развитию астмы за период последующего наблюдения. Концентрации цитокинов и хемокинов: Эотаксин, IL-3, IL-5, TNF-β (а) и IL-12p40, IL-12p70 и IL-7 (b), обнаруженные посредством люминесцентного анализа в образцах BALF грудных детей с бронхиолитом, вызванного SRV (N=14), анализировались по развитию астмы за период последующего наблюдения. Концентрации переносчиков выражаются в пг/мл и их средние и вероятные значения показаны в виде горизонтальных полос и прямоугольников соответственно (значение Р<0,05 рассматривалось как статистически значимое).

Фиг. 4. На фиг. 4 показано относительное количественное определение мессенджеров ARN IL-33 в носоглоточном аспирате грудных детей с бронхиолитом SRV, проанализированное с учетом случаев атопии в семье. Генная экспрессия IL-33 определялась в носоглоточном аспирате грудных детей с бронхиолитом SRV (N=14) с учетом или без учета случаев атопии в семье. Результаты показаны в виде увеличения частоты посредством относительной индукции контрольных групп. Средние и вероятные значения каждой группы показаны в виде горизонтальных полос и прямоугольников соответственно (значение *Р<0,05 рассматривалось как статистически значимое).

Фиг. 5. На фиг. 5 показана корреляция между IL-12p40 и IL-3 в образцах BALF пациентов, зараженных SRV, с количеством случаев рецидивирующей бронхиальной обструкции. Было установлено, что соответствие корреляция Пирсона между IL-12p40 (а) или IL-3 (b) и случаями рецидивирующей бронхиальной обструкции в образцах BALF грудных детей с SRV (14). Результаты выражаются в пг/мл для цитокинов и количестве случаев за период последующего наблюдения (значение *Р<0,05 рассматривалось как статистически значимое).

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

В настоящем изобретении описывается использование молекулярных маркеров IL-3, IL-12p40 и IL-33 в качестве маркеров для прогнозирования рецидивирующей бронхиальной обструкции (IL-3, IL-12p40) и вероятного развития астмы (IL-33) на более поздних этапах жизни этих грудных детей после бронхиолита, вызванного SRV, особенно у пациентов младше 12 месяцев.

Способ прогнозирования тяжести заболевания, вызванного заражением SRV и MPV, включает следующее:

- Амплификацию образцов респираторных секреций с помощью молекулярно-биологической процедуры, например, PCR, используя маркеры IL-3, IL-12p40 и IL-33;

- подсчет посредством способа молекулярного количественного определения, такого как ELISA, сверхэкспрессии последовательности-мишени в дополнение к маркерам IL-3, IL-33 или IL-12p40;

- соотношение на основании количественного определения полученной сверхэкспрессии и развития болезни, вызванной SRV: высокая вероятность развития бронхиальной обструкции, если концентрация в бронхоальвеолярных выделениях превышает 500 пг/мл IL-12p40 или IL-3; высокая вероятность развитие астмы, если концентрация в бронхоальвеолярных выделениях превышает 500 пг/мл IL-33.

ПРИМЕР

Ранее здоровые грудные дети младше 12 месяцев, госпитализированные из-за вирусного бронхиолита, были зарегистрированы в исследовании. Регистрируемые пациенты должны быть положительными по иммунофлуоресценции для SRV и должны быть младше 12 месяцев, при условии отсутствия факторов риска тяжелых заболеваний и с уровнем развития во время первой недели от заболевания легкой степени до средней степени, определенного по клиническим показателям. Грудные дети с хроническими заболеваниями, или получавшие кортикостероиды на момент регистрации, были исключены из исследования. В течение того же периода времени регистрировались здоровые грудные дети, которые подвергались инвазивной процедуре в результате неинфекционного заболевания (паховая грыжа=4; киста щитовидно-язычного протока=1). Образцы таких пациентов использовались в качестве контрольной группы.

Профили цитокина и хемокина оценивались в верхних и нижних дыхательных путях у грудных детей, страдающих от бронхиолита, вызванного заражением SRV. Также учитывались клинические результаты за период последующих трех лет. Носоглоточный аспират и BALF госпитализированных грудных детей в результате бронхиолита SRV и здоровых представителей контрольной группы объединялись и анализировались для обнаружения цитокинов и хемокинов посредством люминесцентного анализа и количественного определения RT-PCR в реальном времени. Вследствие этого оцениваемые уровни цитокинов типа Th2 (IL-3, IL-4, IL-10 и IL-13), провоспалительных цитокинов и хемокинов (IL-1β, IL-6, TNF-β, MCP-1/CCL2, MIP-1α/CCL3 и IL-8) наблюдались в BALF грудных детей с бронхтолитом SRV по сравнению с контрольными группами. Было установлено, что у пациентов, имеющих случаи атопии в семье, вырабатывались уровни IL-33 выше, чем у пациентов, не имеющих таких случаев (фиг. 4). Помимо этого была обнаружена прямая связь уровней IL-3 и IL-12p40 у грудных детей, зараженных SRV, с развитием рецидивирующей бронхиальной обструкции в дальнейшем. Фактически была обнаружена прямая связь между уровнями IL-12p40 и IL-3 в образцах BALF от пациентов, зараженных SRV, с рядом случаев заболевания рецидивирующей бронхиальной обструкцией в период наблюдений (корреляция Пирсона: r=0,68; р=0,0071; r=0,71; р=0,0058 соответственно) (фиг. 5).

В данных результатах подразумевается, что IL-3 и IL-12p40 - молекулярные прогностические параметры в отношении рецидивирующей бронхиальной обструкции, вызываемой SRV у грудных детей с бронхиолитом.

Были привлечены четырнадцать пациентов с бронхиолитом SRV и пять пациентов из контрольной группы. Грудные дети с бронхиолитом SRV были госпитализированы в среднем на период 4,5 дня (диапазон: 1-9 дней) со средним показателем тяжести, равным 4. Перед проведением процедуры всем пациентам была предоставлена возможность пройти кислородную терапию в первые два дня. У них не были обнаружены осложнения из-за процедуры, и они были выписаны в здоровом состоянии. За всеми пациентами осуществлялся контроль в течение трех лет без фактов госпитализации по другим причинам. Ведение контроля за одним пациентом в контрольной группе оказалось невозможным спустя 24 месяца. Оценочные клинические переменные были представлены: рецидивирующей бронхиальной обструкцией по врачебным данным, диагностикой астмы по врачебным данным и длительным применением терапии с кортикостероидами -признаками, между которыми не наблюдалось существенных различий в обеих группах в течение последующих клинических наблюдений. Критические признаки подытожены в таблице 1.

Выделение цитокинов и хемокинов в образцах BALF грудных детей с бронхиолитом SRV.

Уровни концентрации белков цитокинов и хемокинов в образцах BALF грудных младенцев с бронхиолитом SRV в сопоставлении с грудными детьми из контрольной группы измерялись путем люминесцентного анализа. В сравнении с контрольной группой повышенная концентрация наблюдалась в случаях IL-3, IL-4, IL-10, IL-13 (цитокины, относящиеся к Th2); IL-1β, IL-6, TNF-β (противовоспалительные цитокины); MCP-1/CCL2, MIP-1α/CCL3, IL-8 (хемокины); IL-12p40 (цитокины, относящиеся к Th1); и IL-7 (факторы возрастания) в образцах BALF грудных детей с бронхиолитом SRV. Также по сравнению с контрольной группой значительно пониженные показатели концентрации были обнаружены в отношении эотаксина (хемокин) и IL-12p70 в образцах BALF грудных детей с бронхиолитом SRV. Выработка IFN-γ (цитокин, относящийся к Th1) и IL-17 (цитокин, относящийся к Th17), в образцах BALF обнаружена не была ни у зараженных пациентов, ни у здоровых пациентов из контрольной группы (фиг. 1).

В образцах BALF пациентов, зараженных SRV, у которых развилась астма в период наблюдения, были обнаружены высокие показатели концентрации IL-12р40, IL-12p70 (цитокины, относящиеся к Th1), IL-3, IL-5 (цитокины, относящиеся к Th2), TNF-β (противовоспалительный цитокин), эотаксина (хемокин) и IL-7 (фактор возрастания) по сравнению с пациентами из контрольной группы, у которых она не развилась (фиг. 3). Кроме того, в носоглоточном аспирате пациентов с семейной историей атопии, зараженных SRV, наблюдалось существенное увеличение концентрации мессенджера ARN IL-33, приведенной к ГАФДГ, по сравнению с пациентами, у которых она не наблюдалась (фиг. 4).

1. Применение молекулярных маркеров IL-3, IL-12p40 и IL-33, отличающееся тем, что они служат для прогнозирования рецидивирующей бронхиальной обструкции и астмы после бронхиолита, вызванных респираторно-синцитиальным вирусом человека (SRV).

2. Применение по п. 1, отличающееся тем, что одна из респираторных инфекций представлена бронхиолитом.

3. Способ прогнозирования рецидивирующей бронхиальной обструкции и астмы после бронхиолита, вызванных респираторно-синцитиальным вирусом человека (SRV), отличающийся тем, что он включает:

амплификацию и обнаружение маркеров IL-3, IL-12p40 и IL-33 с помощью молекулярно-биологической процедуры, например, PCR и ELISA;

подсчет сверхэкспрессии последовательности-мишени в дополнение к маркерам IL-3, IL-33 или IL-12p40;

соотношение на основании количественного определения полученной сверхэкспрессии и развития болезни, вызванной SRV:

высокая вероятность развития бронхиальной обструкции, если концентрация в бронхоальвеолярных выделениях превышает 500 пг/мл IL-12p40 или IL-3;

высокая вероятность развития астмы, если концентрация в бронхоальвеолярных выделениях превышает 500 пг/мл IL-33.



 

Похожие патенты:

Группа изобретений относится к ускоренному и высокочувствительному способу обнаружения бактериальных патогенов. Раскрыт способ обнаружения бактерий, включающий обеспечение одной или более чем одной суспензии, причем каждая содержит по меньшей мере один вид меченых тестируемых бактериофагов, которые специфично связываются с видом бактерий, подлежащим обнаружению; добавление образца, подлежащего проверке на наличие по меньшей мере одного вида бактерий; фильтрацию полученной реакционной смеси; обнаружение комплексов бактерии-бактериофаги в концентрате; обнаружение несвязанных бактериофагов в фильтрате; обработку полученных сигналов, сгенерированных в результате обнаружения, и вывод результатов обнаружения пользователю.

Изобретение относится к области биотехнологии. Изобретение представляет собой штамм С/2014 вируса Мачупо - возбудителя Боливийской геморрагической лихорадки (БГЛ), вариант природного штамма Carvallo, адаптированный к морским свинкам и вызывающий у них зависимую от вводимой дозы вируса гибель.

Изобретение относится к области медицины, в частности к онкологии, и предназначено для прогнозирования безрецидивной и общей выживаемости у ВПЧ 16-позитивных больных раком шейки матки.

Изобретение относится к биотехнологии и вирусологии. Изобретение раскрывает способ определения специфической активности антирабического иммуноглобулина.

Изобретение относится к области пищевой промышленности. Описан способ получения заквасочной культуры, включающей по крайней мере два различных устойчивых к бактериофагам вариантных штамма Streptococcus thermophiles.

Изобретение относится к биотехнологии. Разработана кассета генов, несущая гены вируса гриппа субтипов А(Н1N1) и A(H3N2) и типа В - НА, M1 и NA, кодирующие белки вируса гриппа, предназначенная для последующего получения плазмидного вектора для трансдукции клеток млекопитающих, которые в дальнейшем использовались для создания клеток-продуцентов вирусоподобных частиц (ВПЧ) вируса гриппа.

Изобретение относится к биотехнологии. Разработаны лентивирусные векторы, несущие кассету генов белков вируса гриппа субтипов A(H1N1) и A(H3N2) и типа В, кодирующих последовательности белков вируса гриппа для трансдукции клеток млекопитающих.

Предложен способ проведения теста нейтрализации для оценки способности вакцины-кандидата противодействовать инфицированию HCMV (цитомегаловирус человека). Способ включает следующие стадии: (i) смешивание инактивированной нагреванием сыворотки от субъекта, иммунизированного вакциной-кандидатом HCMV, с HCMV, содержащим флуоресцентную метку, для получения смеси; (ii) добавление 2,5% комплемента кролика к смеси со стадии (i); (iii) контакт клетки-хозяина, восприимчивой к инфекции HCMV, где указанная клетка-хозяин представляет собой пигментированную эпителиальную клетку сетчатки клеточной линии ARPE-19, при условиях, подходящих для инфицирования смесью инактивированной нагреванием сыворотки в присутствии комплемента кролика со стадии (ii); (iv) оценку уровня флуоресценции клетки-хозяина, находившейся в контакте с указанной смесью, методом проточной цитометрии; и (v) определение уровня инфицирования клетки-хозяина на основе измеренного уровня флуоресценции.

Представленные изобретения касаются способа детектирования наличия аналита в жидком образце, способа детектирования наличия патогена в образце цельной крови, способа детектирования наличия вируса в образце цельной крови, способа детектирования присутствия нуклеиновой кислоты-мишени в образце цельной крови, способа детектирования наличия организмов, относящихся к видам Candida в жидком образце, системы для детектирования одного или более аналитов нуклеиновой кислоты в жидком образце и сменного картриджа для размещения реагентов для анализа и расходных материалов в указанной системе.

Изобретения относятся к способу скрининга биологического образца на присутствие вызывающих респираторную инфекцию микроорганизмов, выбранных из (i) респираторно-синцитиального вируса (RSV А & В), (ii) риновируса, (iii) метапневмовируса человека (hMPV), (iv) гриппа В (Flu В Quad), (v) гриппа A (Flu A CDC DC) и (vi) подтипа Н5 гриппа А (Н5 FRET), с использованием ПЦР реального времени и тест-карты, имеющей обнаруживающие пробы в отдельных лунках.

Изобретение относится к области биотехнологии, конкретно к способу отбора стабильной продуцирующей антитело под контролем промотора CMV человека с SEQ ID NO: 1 клетки яичника китайского хомячка СНО-К1.

Изобретение относится к биотехнологии, предоставлены специально сконструированные синтетические микро-РНК, направленные к BCL11A для экспрессии РНК-полимеразой II, и способы их применения для лечения гемоглобинопатий, таких как серповидноклеточная анемия или талассемия посредством увеличения уровней экспрессии фетального гемоглобина.7 н.

Данное изобретение относится к медицине. Предложены способы и применение ингибитора СЕТР, а именно дальцетрапиба, для лечения субъекта с острым коронарным синдромом, где субъект имеет нуклеотидные полиморфизмы в гене аденилатциклазы типа 9 (ADCY9) в хромосоме 16.

Изобретение относится к биотехнологии, и представляет собой способы противодействия онкогенной активности FGF19 у субъекта и, в конкретных вариантах осуществления, способы предотвращения или лечения заболевания, нарушения или состояния, такого как FGF19-зависимое заболевание, нарушение или состояние, или его симптомов.

Изобретение относится к биотехнологии. Описаны молекулярные детерминанты ответа раковой опухоли на иммунотерапию, а также системы и инструменты для идентификации и/или характеристики раковых опухолей, склонных отвечать на иммунотерапию.
Изобретение относится к области медицины, в частности к онкологии. Предложен способ комбинированного лечения немелкоклеточного рака легкого (НМРЛ) IB - III стадии.

Изобретение относится к областям биотехнологии, молекулярной биологии и медицинской микробиологии. Описан набор олигонуклеотидных праймеров для реакции петлевой изотермической амплификации (LAMP), который позволяет амплифицировать специфические для бактерий вида Francisella tularensis фрагменты ДНК из целевого гена, имеющего нуклеотидную последовательность SEQ ID №1.

Изобретение относится к областям биотехнологии, молекулярной биологии и медицинской микробиологии. Описан набор олигонуклеотидных праймеров для реакции петлевой изотермической амплификации (LAMP), который позволяет амплифицировать специфические для бактерий вида Francisella tularensis фрагменты ДНК из целевого гена, имеющего нуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 1.
Изобретение относится к медицине, а именно к педиатрии, и может быть использовано для диагностики контроля бронхиальной астмы (БА) у детей с атопическим дерматитом. Проводят обследование ребенка, определение его возраста и факторов наследственности.
Изобретение относится к области медицины и предназначено для диагностики активности сочетанной инфекции у детей с острыми респираторными инфекциями. У детей с идиопатической лейкопенией и фебрильными судорогами в крови определяют наличие, активность и серотип вируса герпеса 6 типа, его количественные характеристики, выявляют иммуноглобулины IgM, IgG класса, определяют авидность иммуноглобулинов IgG класса.

Изобретение относится к области биотехнологии, конкретно к способу отбора стабильной продуцирующей антитело под контролем промотора CMV человека с SEQ ID NO: 1 клетки яичника китайского хомячка СНО-К1.

Изобретение относится к биотехнологии и определению респираторных заболеваний с помощью молекулярных маркеров в качестве средства прогнозирования развития случаев респираторных инфекций. Профиль экспрессии гена молекулярных маркеров может определяться в биологических образцах посредством анализа ELISA, проточной цитометрии или PCR в реальном времени. На основании подтверждения этиологического фактора инфекции вместе с определением профиля молекулярных маркеров IL-3, IL-33 и IL12p40 будет прогнозироваться тяжесть заболевания. 2 н. и 1 з.п. ф-лы, 5 ил., 1 табл., 1 пр.

Наверх